Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université des Frères Mentouri Constantine 1

Institut des Sciences Vétérinaires

TRAVAUX PRATIQUES EN
THERIOGENOLOGIE

Pour les étudiants de 3ème, 4ème et 5ème année docteur vétérinaire

Par

Prof. Sana HIRECHE

Année universitaire : 2022 – 2023

AVANT-PROPOS

Ce manuel constitue un outil pédagogique pour l’enseignement pratique de quelques

aspects de la thériogénologie.

Les séances de travaux pratiques de thériogénologie représentent un moment privilégié

de l’enseignement de cette discipline. Ils constituent un outil efficace de fixation des savoirs
acquis lors des cours magistraux. Totalisant 12 semaines, les TP de thériogénologie s’organisent
en 4 cycles.

Le module physiologie de la reproduction, en parallèle à ces enseignements à la

paillasse, est un apport méthodologique pratique essentiel, tant les notions qui y sont abordées
sont indispensables à la pratique en thériogénologie.

La rencontre avec les enseignants durant les travaux pratiques se déroule dans un cadre
différent de l’amphithéâtre. Cela permet des discussions autour de la matière, ainsi que la mise
en perspective de certaines pratiques en fonction des intérêts scientifiques des apprenants.

Les manipulations sont réalisées en binôme dans le premier et le deuxième cycle et

concernent la technique de collecte de sperme épididymaire, l’examen de la semence, la
technique d’écouvillonnage vaginal, la réalisation des frottis vaginaux et leur interprétation
dans la détermination du stade du cycle œstral des femelles domestiques, particulièrement la
chienne.

Les deux séries de TP suivantes sont réalisées à la ferme expérimentale de l’Institut

des Sciences Vétérinaires de Constantine. Les techniques qui y sont abordées sont la palpation
transrectale et l’échographie de l’appareil génital de la vache.

La rédaction d’un compte rendu est impérative à l’aboutissement de chaque cycle de TP.

Prof. Sana HIRECHE 1 Octobre, 2022

TECHNIQUES A REALISER ET COMPETENCES ACQUISES :

 Collecte du sperme épididymaire.

 Réalisation d’un spermogramme.
o Examen de la mobilité massale des spermatozoïdes.
o Examen de la mobilité individuelle des spermatozoïdes.
o Réalisation de la coloration MGG.
o Examen de la morphologie des spermatozoïdes.
o Comptage des spermatozoïdes sous microscope et calcul de la concentration du
sperme à l’aide de l’hématimètre de Thoma.
 Ecouvillonnage vaginal.
 Réalisation et interprétation des frottis vaginaux.
 Palpation transrectale de l’appareil génital de la vache.
 Détermination du stade du cycle œstral chez la vache.
 Echographie de l’appareil génital de la vache.
 Constat de la gestation chez la vache.
 Détermination de l’âge du fœtus bovin par palpation transrectale.
 Détermination de l’âge du fœtus bovin par échographie.
 Diagnostic des pathologies utérines et ovariennes.

Prof. Sana HIRECHE 2 Octobre, 2022

 TP 1 : COLLECTE ET ANALYSE DU SPERME EPIDIDYMAIRE DES
RUMINANTS

Public cible : Etudiants de troisième, quatrième et cinquième année docteur vétérinaire.

1. Introduction

Le recueil du sperme épididymaire est une nouvelle biotechnologie de la reproduction

employée lors de l’insémination artificielle (IA) ou de la fécondation in vitro (FIV) chez les
ovins, les cervidés, les félidés etc. En effet, le sperme épididymaire est une source importante
de spermatozoïdes qui permet de préparer plusieurs dizaines de doses d’IA ou de FIV.

Technique d’actualité, cette dernière vise principalement la récolte du sperme

épididymaire dans un but de sauvegarde des espèces ou des races en déclin. Elle permet
d’envisager aussi l’utilisation d’animaux non collectables (vivants ou morts depuis quelques
jours).

Le sperme épididymaire se conserve plusieurs jours à 4°C dans l’organe ou dans le

milieu épididymaire non dilué. La fertilité du sperme épididymaire diminue en fonction du
temps mais est encore utilisable après 72 heures de conservation, la fertilité étant alors encore
égale à environ la moitié de la fertilité initiale.

2. Préalable (s) :
 Anatomie et physiologie de l’appareil génital mâle.
3. Objectifs d’apprentissage :

A l’issue de ce TP, l’apprenant devra être capable de :

 Décrire les méthodes de prélèvement du sperme épididymaire.

 Maitriser la technique de collecte du sperme épididymaire de testicules de ruminants
post-mortem.
 Enoncer les divers paramètres de l'examen macroscopique du sperme des ruminants.
 Enoncer les caractéristiques macroscopiques normales du sperme des ruminants.
 Enoncer les divers paramètres de l'examen microscopique du sperme des ruminants.
 Enoncer les caractéristiques microscopiques normales du sperme des ruminants.
 Enoncer la concentration normale en spermatozoïdes du sperme des ruminants.
 Citer les principales anomalies des spermatozoïdes.

Prof. Sana HIRECHE 3 Octobre, 2022

4. Domaines d’application :

Le présent TP traite des analyses de sperme collecté par technique d’aspiration visant à
évaluer la semence. Le spermogramme permet d’évaluer la qualité de la semence au niveau
macroscopique et microscopique. Celle-ci est fortement corrélée à sa fertilité, sa survie dans les
voies génitales femelles et sa résistance aux différentes techniques de conservation dont la
congélation.

Le prélèvement de sperme de l’épididyme est une technique très intéressante dans le cas
d’une blessure grave compromettant la capacité de se reproduire de l’animal, ou encore en cas
de castration pour des raisons médicales ou de décès. Elle est pratiquée dans l’espèce équine et
également chez les chiens et les félins. Cela permet de conserver le sperme d’animaux de grande
valeur génétique (notamment réalisée chez les félins sauvages). En effet, la semence récupérée
par flush épididymaire est capable de féconder des ovocytes in vitro (Zambelli et Cunto, 2006
; Korochkina et al., 2014).

On peut réaliser le prélèvement jusqu’à douze heures post-mortem sur des animaux
conservés au froid (environ 4 à 6 °C). Actuellement, certains propriétaires et éleveurs souhaitent
conserver le sperme de leurs animaux post-castrations ou post-mortem pour obtenir de
nouvelles descendances (Bruemmer, 2006).

Il est également possible de prélever du sperme épididymaire du vivant de l’animal sous

anesthésie locale ou générale par une microponction du canal déférent et l’introduction d’une
canule dont l’extrémité est conduite à l’extérieur à travers le scrotum pour la collection du
sperme dans une petite fiole.

5. Technique de prélèvement du sperme épididymaire en post-mortem :

Le TP est réalisé sur des testicules de taureau ou de bélier récupérés de l’abattoir tôt le
matin juste après l’abattage. Chaque épididyme est disséqué du testicule. La queue et le canal
déférent sont isolés et les spermatozoïdes peuvent être récupérés en utilisant deux méthodes :
la méthode de flottaison et la technique de flush rétrograde.

Dans la technique de flottaison encore appelée méthode d’incision, l’épididyme

caudal et le canal déférent sont incisés à plusieurs endroits, lavés avec 2.5 ml de solution (alcool
à 70°) chauffée à 37°C et suspendus dans un dilueur pour semence, ce qui permet la diffusion
des spermatozoïdes dans le dilueur en une dizaine de minutes environ.

Prof. Sana HIRECHE 4 Octobre, 2022

 Figure 1 : Technique de flottaison pour la récolte du sperme épididymaire (Bruemmer, 2006).

Dans la technique de flush rétrograde, le contenu de la lumière du tubule épididymaire

est recueilli en perfusant de l'huile de paraffine ou d’une solution de chlorure de sodium (NaCl)
dosé à 0,9 % à partir du canal déférent à l'aide d'une aiguille maintenue par un clamp. Le sperme
est collecté en incisant l'organe au niveau de la moitié de la partie caudale de la queue de
l’épididyme.

Figure 2 : Perfusion de la partie caudale de l'épididyme de bélier (technique de flush rétrograde).

Prof. Sana HIRECHE 5 Octobre, 2022

 Figure 3 : Testicules ovins et section de la queue de l’épididyme (Marata et al., 2017).

Figure 4 : Technique de collecte du sperme épididymaire de flush rétrograde (Bruemmer, 2006).

6. Examen macroscopique du sperme

6.1. Volume

Le volume moyen de sperme épididymaire pouvant être collecté est de 0.64 ml pour le
taureau charolais et de 0,5ml pour le taureau limousin (Bencheikh et Kebbi, 2013). Ces volumes
sont de l’ordre de 0,83ml selon Goovaerts et al. (2006). Alapati et al. (2009) rapporte un volume
moyen de 4,86 ml par méthode de collecte par mouvement rétrograde (le volume de la semence
pure en plus du liquide de rinçage).

6.2. Couleur

Le sperme est un liquide épais, clair, crémeux et de couleur variable suivant les espèces
: blanchâtre chez le taureau, le chien et les rongeurs, blanc jaunâtre chez le bélier et le bouc,
blanc laiteux ou grisâtre chez le verrat et l’étalon. L’opacité est fonction de la concentration

Prof. Sana HIRECHE 6 Octobre, 2022

spermatique. Ainsi, chez le verrat, la couleur la plus blanche représente la plus forte
concentration.

6.3. Viscosité

La viscosité du sperme total dépend de la concentration en spermatozoïdes, de la charge

et, de la conductibilité électrique. La viscosité du sperme du bouc est bien supérieure à celle du
taureau. Le poids spécifique du sperme est aussi directement proportionnel à la concentration
en spermatozoïdes. La formation d’un filament glaireux à l’extrémité de la pipette signifie une
pathologie.

6.4. pH

La mesure du pH peut se faire à l’aide d’un papier pH ou d’un pH-mètre. Le pH du

sperme est proche de la neutralité. Un pH inférieur à 6.5 ou supérieur à 8 a comme conséquence
la diminution de la plupart des paramètres (paramètres cinétiques, viabilité, activité
mitochondriale, et morphologie) (Contri et al., 2012).

Tableau 1 : Valeurs de pH du sperme chez quelques espèces.

TAUREAU BELIER VERRAT ETALON

pH 6.5 – 6.9 5.9 – 7.3 7.3 – 7.9 6.2 – 7.8

7. Examen microscopique
7.1. Mobilité ou motilité des spermatozoïdes
7.1.1. Mobilité massale

Sur une goutte de sperme (5 µl) déposée sur une lame et observée à faible grossissement
(x 100) on observe les mouvements des spermatozoïdes. Ils forment des « vagues » à la surface
de la goutte.

Figure 5 : Dépôt d’une goutte de sperme sur lame pour examen de la mobilité massale.

Prof. Sana HIRECHE 7 Octobre, 2022

 L’intensité des vagues est évaluée. Une note de 0 à 5 est attribuée à l’échantillon. Cette
observation dépend à la fois des mouvements des spermatozoïdes et de la concentration de
l’échantillon. Il s’agit d’une méthode subjective, la note de 0 à 5 est semi-quantitative.
L’opérateur doit être expérimenté.

Consultez la ressource suivante afin de visualiser les vidéos correspondantes à chaque

score de notation de la mobilité massale.

Ressource : [Link]

Tableau 2 : Echelle d’appréciation de la motilité massale du sperme.

NOTE ASPECTS DU MOUVEMENT

0 Absence de mouvement

1 Mouvements individualisés

2 Mouvements d’ensemble circulaires très lents

3 Mobilité massale générale de faible amplitude

4 Mobilité massale rapide, sans tourbillons

5 Mobilité massale rapide, avec tourbillons

Prof. Sana HIRECHE 8 Octobre, 2022

 7.1.2. Mobilité individuelle

Le principe est d’examiner, à fort grossissement (x 400), une goutte de sperme déposée sur
une lame et recouverte d’une lamelle. Le sperme doit être relativement peu concentré, afin que
chaque spermatozoïde soit individualisable. Il est possible de le diluer dans une solution de
NaCl isotonique tiédie à 37°C. Le pourcentage de spermatozoïdes mobiles est évalué de façon
subjective. Les spermatozoïdes progressant en ligne droite (mobilité fléchante) sont distingués
des spermatozoïdes tournant en rond, à mobilité faible ou diminuée.

[Link]. La mobilité simple :

On considère tous les spermatozoïdes plus ou moins mobiles par opposition aux immobiles.
Deux comptages sont réalisés par observation de quatre champs microscopiques à fort
grossissement (X 400). Celle-ci s’exprime en pourcentage (note de 0 à 100%) et reflète
partiellement la qualité du sperme (sperme de bonne qualité : plus de 70% de spermatozoïdes
mobiles).

[Link]. La mobilité progressive :

Elle permet d’affiner le déplacement réel des spermatozoïdes. La vitesse de progression est
appréciée subjectivement par l’opérateur dans le champ de vision du microscope. Les
spermatozoïdes peuvent avoir des mouvements oscillants (ils vibrent et n’ont pas de direction
définie) et des mouvements fléchants (ils se déplacent de façon rapide et en ligne droite). Sur
une échelle de 1 à 5, on classe les spermatozoïdes en fonction de leur mouvement.

Tableau 3 : Note d’appréciation subjective de la mobilité progressive des spermatozoïdes dans un

échantillon (Fontbonne, 1992).

NOTE INTERPRETATION
0 Pas de mouvement
1 Mouvements oscillants légers sans progression
2 Mouvements oscillants et progression faible et intermittente
3 Mouvements oscillants fléchant et progression lente régulière
4 Mouvements fléchant et progression régulière vers l’avant
5 Mouvements fléchant avec progression rapide vers l’avant

Prof. Sana HIRECHE 9 Octobre, 2022

 L’examen de la motilité individuelle est intéressant car elle fournit indirectement des
informations intéressantes sur l’intégrité de la membrane du spermatozoïde et son intégrité
morphologique. Ainsi un pourcentage élevé de spermatozoïdes mobiles joint à un pourcentage
élevé de spermatozoïdes morts donnera à penser à une mauvaise manipulation du sperme plus
qu’à un sperme anormal. De même une faible motilité est souvent corrélée avec un pourcentage
élevé de formes anormales ou de spermatozoïdes morts.

Une diminution du pourcentage de spermatozoïdes mobiles peut aussi représenter un

indicateur précoce mais non spécifique d’une infection du tractus génital.

L’évaluation de la mobilité au microscope est simple, rapide et peu onéreuse. Elle est
cependant très subjective et présente d’importantes variations en fonction de l’opérateur (30 à
60%). Les biais sont nombreux (matériel sale, tube à essai non lavé avant son premier usage,
mauvaise manipulation…) et peuvent engendrer une baisse de la mobilité. Les différents biais
seront tout de même réduits si l’évaluation est toujours effectuée par la même personne
expérimentée (Eilts, 2005 ; Marc, 2015).

Figure 6 : Examen de la mobilité individuelle du sperme.

7.2. Morphologie des spermatozoïdes

L’examen morphologique des spermatozoïdes, consiste en l’observation au microscope

optique d’un frottis de semence coloré le plus souvent à l’éosine-nigrosine, au Giemsa, à la
MGG, à l’encre de Chine ou au rose Bengale.

7.2.1. Coloration au Giemsa :

– Déposer 3 à 5 gouttes de colorant Giemsa sur la lame sèche et fixée et 5 à 6 gouttes

d’eau distillée neutre pour neutraliser le colorant acide.

– Laisser le colorant agir 15 à 20 minutes puis rincer à l’eau du robinet.

Prof. Sana HIRECHE 10 Octobre, 2022

 – Laisser sécher les frottis à l’air libre avant la lecture sous microscope.

7.2.2. Coloration au May Grunwald Giemsa:

– Fixer et sécher la lame.
– Recouvrir la lame totalement en versant 15 gouttes de colorant May Grunwald.
– Laisser agir 2 minutes.
– Rincer avec de l’eau du robinet.
– Recouvrir la lame par le colorant Giemsa dilué (30 gouttes de Giemsa dans 20 ml
d’eau).
– Laisser agir 20 minutes.
– Rincer à l’eau du robinet.
– Laisser sécher puis observer les lames sous microscope.
7.2.3. Coloration à l’éosine-nigrosine :
[Link]. Préparation de la solution éosine-nigrosine :
– Eosine 3.3 g.
– Nigrosine 20.0 g.
– Citrate de sodium 1.5 g (pour réduire l’effet hypotonique du colorant vital).
– Eau distillée : 300 ml.
– Mélanger et chauffer la solution jusque dissolution.
– Ajuster le pH à 6.8-7 si nécessaire.
– Laisser reposer quelques jours, filtrer et maintenir au réfrigérateur.
[Link].Principe de la coloration vitale à l’éosine-nigrosine
– Solution d’éosine-nigrosine maintenue au réfrigérateur.
– Placer huit gouttes de la solution dans un tube au bain-marie à 37°C.
– Placer deux gouttes de sperme dans le même tube.
– Agiter.
– Après 5 minutes d’équilibration, faire un frottis sur une lame à 37°C.
– Sécher la préparation aussi vite que possible pour réduire l’effet du choc hypotonique
induite par le colorant.

Remarque : il existe de nombreuses variations de ce protocole portant sur les doses, les
concentrations et les temps de contact différents.

Prof. Sana HIRECHE 11 Octobre, 2022

 Figure 7 : Technique de réalisation du frottis de semence coloré à l’éosine-nigrosine.

7.2.4. Observation au microscope :

Sous microscope à contraste de phase ou sous immersion (grossissement x 400 à 600),

les anomalies sont comptées sur au moins 200 spermatozoïdes. Un sperme normal comporte 10
à 20 % de spermatozoïdes anormaux, présentant des anomalies des différentes parties
principalement de la tête.

Figure 8 : Observation des spermatozoïdes au fort grossissement.

Prof. Sana HIRECHE 12 Octobre, 2022

 Figure 9 : Anomalies morphologiques de la tête du spermatozoïde (coloration à l’éosine-
nigrosine) (Tibary et al., 2018).

Prof. Sana HIRECHE 13 Octobre, 2022

 Figure 10 : Anomalies morphologiques de la pièce intermédiaire et de la queue du spermatozoïde
(coloration à l’éosine-nigrosine) (Tibary et al., 2018).

Prof. Sana HIRECHE 14 Octobre, 2022

 Figure 11 : Spermatozoïdes d’un bélier infertile avec une incidence élevée de double pièce
intermédiaire et queue et gaine mitochondriale anormale (Tibary et al., 2018).

Prof. Sana HIRECHE 15 Octobre, 2022

 Figure 12 : Gouttelettes protoplasmiques : proximale (en bas) et distale (en haut) (Tibary et al.,
2018).

Prof. Sana HIRECHE 16 Octobre, 2022

 Figure 13 : Acrosomes anormaux : acrosome en bouton (en haut), acrosome détaché / enflé (en
bas) (Tibary et al., 2018).

Prof. Sana HIRECHE 17 Octobre, 2022

 a b

Figure 14 : Spermatides sphéroïdes ou ronds (a) et cellules en méduses (b) ou bordure ciliée de
l’épithélium épididymaire. Leur présence dans l’éjaculat témoigne d’un processus dégénératif sévère
(Tibary et al., 2018).

Détermination de la concentration

La détermination de la concentration peut être effectuée par des méthodes manuelles ou par
des méthodes automatisées réservées aux centres spécialisés (utilisation d’un système CASA).

Cette analyse n’a pas de valeur prédictive quant à la qualité de la semence sauf si l’animal
présente une azoospermie c’est-à-dire une absence totale de spermatozoïdes. La taille de
l’animal doit être prise en compte lors de cet examen car le nombre de spermatozoïdes dans
l’éjaculat est proportionnel au poids des testicules lui-même corrélé à la taille de l’animal.

Une numération à l’hématimètre Thoma est une méthode simple et précise. Cependant,
des cellules de Malassez, de Neubauer conviennent aussi bien, il suffit d’adapter les dilutions
et le calcul au volume de la cellule employée.

Figure 15 : Hématimètre de Thoma.

Mode opératoire :

 Si le sperme est très peu concentré (translucide), une dilution au 1/10ième ou 1/20ième sera
effectuée. Par contre si le sperme est concentré (aspect laiteux) une dilution au 1/100ième ou
1/200ième sera préférable. La dilution se fait avec une solution de chlorure de sodium

Prof. Sana HIRECHE 18 Octobre, 2022

 hypertonique à 3%, cette solution hypertonique engendre la mort des spermatozoïdes sans
provoquer leur lyse. Ainsi, les spermatozoïdes sont immobiles et le comptage est facilité.
 Après homogénéisation du mélange, la solution est déposée à l’aide d’une micropipette afin
de remplir par capillarité, sans bulle d’air, la chambre de l’hématimètre. La goutte ne doit
pas déborder dans les rigoles de l'hématimètre et elle doit recouvrir complètement et d'un
seul coup toute la surface quadrillée de l’hématimètre.

Figure 16 : Dépôt d’une goutte de sperme dans les rigoles de l’hématimètre.

 Coller la lamelle sur l’hématimètre, en humectant les deux bords de celui-ci avec un
petit chiffon légèrement humide. Puis faire glisser la lamelle sur la largeur de
l’hématimètre et vérifier la bonne adhésion.

Figure 17 : Collage de lamelle sur l’hématimètre.

 Vérifier la propreté de la cellule sous le microscope.

 Laisser reposer l'hématimètre à plat, en "chambre" humide (une boîte de Pétri avec un
chiffon humide) pendant 10 minutes avant de procéder au comptage des spermatozoïdes.
 Ne jamais compter les éléments dans une chambre de comptage desséchée.
 Avant le comptage, il faut bien vérifier à faible grossissement, que la répartition des éléments
soit homogène, au moindre doute, le mélange sera homogénéisé de nouveau et le montage
recommencé.
 Compter dans le quadrillage, selon une procédure bien établie, les têtes de spermatozoïdes.

Prof. Sana HIRECHE 19 Octobre, 2022

 Après repérage des limites de la cellule (grossissement x100), les éléments sont comptés au
microscope au grossissement x400. La lame est balayée de façon méthodique, de gauche à
droite et du haut vers le bas.
 En général les spermatozoïdes sont comptés sur 5 grands carrés. Afin d’éviter de surévaluer
le nombre de spermatozoïdes, pour les éléments situés entre deux carrés, ne sont comptés
que ceux qui sont à cheval sur les graduations, en général celles formant la lettre L. Le calcul
du nombre de spermatozoïdes est présenté dans la formule ci-dessous :

Nombre de spermatozoïdes comptés x facteur de dilution

Concentration (Nbre de spz par ml) =
Surface considérée (mm2) x profondeur des chambres

Quadrillage de la cellule de Thoma

Dans la cellule de Thoma, le grand carré central : 1 mm² est formée de 16 grands carrés
composés chacun de 16 petits carrés. 1 grand carré : dimension 0.2 mm x 0.2 mm, Profondeur
: 0.1 mm.

Surface : 0.2 x 0.2 x 0.1 = 0.004 mm3 = 4 x 10-3 = 4 x 10-6 cm3 = 4 x 10-6 ml.

Figure 18 : Quadrillage de la cellule de Thoma.

Prof. Sana HIRECHE 20 Octobre, 2022

 Figure 19 : Méthode de comptage des spermatozoïdes à l’aide de l’hématimètre de Thoma.

Entretien d‘un hématimètre :

– Rincer la cellule et la lamelle à l’eau courante puis à l’alcool à 70 %.

– Sécher la cellule et la lamelle avec un torchon sec, doux et non pelucheux (éviter de la
rayer)

Principales sources d’erreurs :

– Cellule à numération non nettoyée et/ou non dégraissée.

– Empreinte de doigt sur la lamelle.
– Mauvaise homogénéisation.
– Erreur de pipetage.
– Temps non respectés.
– Comptage dans une chambre de comptage desséchée.
– Présence de bulles d’air dans la cellule.
– Absorption du liquide en cas de débordement.
– Mauvais réglage du microscope.
– Erreurs de dilutions.
– Erreurs de calculs / erreurs d’unités.

Prof. Sana HIRECHE 21 Octobre, 2022