Etude cytobactériologique du Liquide céphalorachidien

Introduction
La méningite est une inflammation le plus souvent aigue des méninges cérébrales provoquées
par des bactéries, des virus et des parasites.
C'est une urgence médicale au cours de laquelle le pronostic vital et fonctionnel sont engagés.
Le rôle du laboratoire est primordial aussi bien dans le diagnostic, conduite thérapeutique et la
surveillance de l'efficacité du traitement.

I- Germes en causes :
1- méningite purulentes :
a- adulte :
 Neisseria meningitidis A, B, C ..
 Haemophilus influenzae type b.
 Streptococcus pneumoniae.
b-méningite néonatale :
Streptocoque B hémolytique du groupe B.
 Listeria monocytogenes.
 Escherichia coli.
c- Méningite d’inoculation :
 Staphylococcus aureus.
 Entérobactéries.
 Pseudomonas aeruginosa.
 Acinetobacter sp.
2- Méningites à liquide clair :
Méningites virales :
-Enterovirus.
-Myxovirus .
- Rougeole
-Grippe.
- Herpes.

Méningite tuberculeuse.
Méningite décapitées.
Méningite à leptospire.

II- Etude cytobactériologique du LCR

1- Indications :
Chez l’adulte:
• syndrome infectieux d’apparition brutale par
- des céphalées violentes
- des frissons
- une élévation thermique supérieure à 39°C

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 - des vomissements.
• raideur de la nuque.
• purpura aigue fébrile évocateur d’infection à N.m, S.pn ou H.inf.
• trouble de la conscience accompagnée de fièvre.
Chez le nourrisson,
Devant des troubles divers non expliqués : altération de l’état général avec fièvre inexpliquée,
bombement de la fontanelle (non battante), et des troubles vasomoteurs et du comportement.
Chez le nouveau-né
Infection néonatale ; altération de l’état avec ou sans fièvre, cyanose, convulsion, anomalies
respiratoires.
2- Contre-indications :
- L’hypertension intracrânienne ; elle est marquée dans la méningite par des maux de tête et de
vomissements, mais elle est souvent non fébrile et apparue progressivement.
- L’existence d’un syndrome hémorragique (saignement diffus) contre indique également la
ponction lombaire qui pourrait provoquer une hémorragie méningée.

3- Technique du prélèvement :
Le prélèvement est effectué dans des conditions rigoureuses d'asepsie : au niveau lombaire,
grande citerne, dans le ventricule.
- Ponction lombaire :
le malade assis penché en avant, le dos rond, on trace une ligne joignant les crêtes iliaques on
repère les apophyses épineuses L4 L5 et S1.
La mise en place correcte est confirmée par l'écoulement des gouttes du LCR.

On recueilli le LCR dans 3 à 4 tubes stériles (2-5 ml/tube) :

- le premier tube : sera éliminé.
- le deuxième tube : numération cellulaire, l’examen direct et antigènes solubles.
- le troisième tube : l’ensemencement milieux de culture.
- le quatrième tube : l’étude biochimique : glycorachie et proteinorachie.
En outre, 5 gouttes de LCR sont ensemencées directement dans un tube de gélose au sang
inclinée (GSC),
Ces prélèvements enveloppés dans du couton cardé seront transportés rapidement au
laboratoire et immédiatement analysés, ils ne doivent pas être conservés au froid

4- Traitement du prélèvement
a) Etude macroscopique :
Le LCR normal est clair, limpide, qualifié (eau de roche), un LCR pathologique peut revêtir
divers aspects :
Trouble :
L’hyperleucocytose, à partir de 1000-10000 élément/µl dont 90% sont des neutrophiles,
en fonction de son intensité, tous les degrés existent depuis la légère turbidité jusqu’au pus,
en passant par le classique aspect (eau de riz).
Hémorragique : il s’agit soit
- d’un accident de prélèvement (ponction mal faite).

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 - soit une hémorragie méningée récente dans l’espace sous arachnoïdien et intra
ventriculaire, (GR plus de500 élément/µl).ce problème qui est d’une importance
clinique capitale justifié le recueil du LCR dans 3 tubes successifs.
Xanthochromique :
Teinté au jaune peut être limpide mais incolore avec culot hématique coagulé, en agitant
légèrement le tube, les hématies ne remettent pas en suspension ;il s’agit d’un liquide souillé
par du sang au cours d’une blessure vasculaire.
Cette modification peut s’observer à la suite d’une hémorragie méningée veillée de plus de 10
heures, ou au cours de certaines affections du névraxe (compression médullaire).
Toute hyperproteinorachie importante (supérieur à 1,5g /l) donne également cet aspect ou
ictère par présence de Bilirubine
b) Etude microscopique
Les examens microscopiques sont à effectuer sur LCR complet et sur culot de centrifugation, il permet
de confirmer le diagnostic dans 60% des cas.

1- Cytologie quantitative :
• Sur le LCR complet, non centrifugé, le nombre des cellules par mm3 du liquide
(leucocytes et hématies) est déterminé à l’aide d’un hématimètre : cellule de Nageotte
ou cellule de Malassez
• le LCR normal contient moins de 2 éléments cellulaires par mm3.L’addition d’une
goutte de solution alcoolique saturée de bleu de méthylène facilite la différenciation
entre hématies et cellules nucléées par coloration du noyau des cellules

2- Cytologie qualitative :
• L’étude morphologique des éléments du LCR est une aide précieuse du clinicien et
l’établissement de la formule à l’aide de la coloration au May-Grundwall-Giemsa est
obligatoire dès que le liquide est pathologique (nombre d’élément supérieur à10/mm3)

A partir du culot de centrifugation, trois frottis sont préparés sur lames.

Coloration de Gram :
La coloration de Gram différencie les bactéries à Gram positif et négatif.

Coloration au bleu de méthylène :

Toutes les structures colorables sont bleues, et les méningocoques sont mieux visualisés
à l’intérieur des polynucléaires neutrophiles.
Coloration au May Grunewald Giemsa :
• Elle permet à la fois l’étude morphologique de principales cellules rencontrées dans le
LCR (cellules provenant du sang périphérique, des méninges et du tissu nerveux)
• l’établissement de la formule leucocytaire pour 100 éléments.

c) Etude antigénique de LCR

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 - Les antigènes bactériens sont libérés dans le LCR, et du fait de leur caractère soluble
et diffusible, ils peuvent être retrouves dans d’autres compartiments (sérum, urines)
- ces techniques permettent de rechercher dans le LCR particulièrement les antigènes
solubles de : N.M, S.P, S du groupe B, E.coli K1, et L.M.
- Parmi les techniques les plus utilisées on distingue la contre immunoélectrophorèse ou
éléctrosynérèse et l’agglutination ou latex.
1. La contre immunoélectrophorèse :
• Son principe repose sur la migration éléctrophorétique en gel d’agarose des
polysaccharides bactériens, fortement électronégatifs, la révélation de la réaction
antigène - anticorps se traduit par l’apparition d’un arc de précipitation.
2. Agglutination au latex :
• C’est une méthode qui utilise un support inerte (particules de latex) sensibilisé par un
immusérum spécifique monoclonal ou polyclonal.

• La réponse est positive s’il se forme des agglutinations.

• Elle permet le diagnostic des méningites décapitées par la mise en évidence des
antigènes bactériens dans les prélèvements du malade même après traitement
antibiotique.
• Le suivi de l’évolution de l’infection sous traitement et la surveillance de l’efficacité de
ce dernier se fait par la négativation des antigènes solubles respectivement dans le LCR,
le sérum puis les urines.

3. Technique de coagglutination :
• Similaire à l’agglutination au latex, la technique de coagglutination utilise comme
support les staphylocoques portant la protéine A à leur surface ; ces staphylocoques
fixent les immunoglobulines G par leur fraction Fc, le fragment Fab laissé libre
s’attachera ainsi à l’antigène. Un tel support sensibilisé, mis en présence de l’antigène
correspondant à l’immunoglobuline fixée (anti-méningococcique, anti-
pneumococcique, anti-Haemophilus) permettra de déceler les antigènes dans les
cultures ou LCR.
• La réaction de coagglutination est très spécifique, mais peu sensible, car elle ne permet
pas la détection d’une faible quantité d’antigène comparativement à la technique
d’agglutination au latex.

d) La mise en culture :
1- La mise en culture systématique :
• Les ensemencements du LCR non centrifugé au niveau du laboratoire seront faits
richement (3 gouttes au moins de LCR) sur les milieux suivants :
• Gélose au sang additionnée de 5% sang de mouton incubée à 35°C pendant 48 heures
en aérobiose.
• Gélose au sang cuit additionnée soit d’un supplément poly vitaminique soit de
polyvitex® soit d’extrait globulaire et incubée à 35°C pendant sous atmosphère enrichie
de CO2 pendant 48 heures.
• Bouillon d’enrichissement HIB additionné de l’un des additifs mentionnés
précédemment et incubé à 35°C pendant 48 heures.

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 • Une hémoculture devra être faite. Il est recommandé d’ensemencer chez l’enfant 1 à 5
cc de sang (en micro-hémoculture) et 10 cc de sang par flacon chez l’adulte. Le tube de
gélose au sang cuit et le flacon d’hémoculture seront incubés 24 à 48h à 37°C.
2-La mise en culture orientée :
• La recherche de Mycobacterium tuberculosis doit être faite sur tout liquide clair,
lymphocytaire ou présentant une diminution de la chlorurorachie. Un important volume
(4 à 8 gouttes) de LCR non centrifugé doit être ensemencé sur une pente de 2 tubes de
Lowenstein Jensen. Les cultures seront conservées deux mois à 35°C.
• La recherche de bactéries anaérobies sera effectuée en cas d’abcès du cerveau en
ensemençant une gélose Columbia au sang frais incubée à 35°C en anaérobiose pendant
48h et une deuxième, incubée pendant 5 jours.
• L’isolement de champignons pathogènes (Candida, Cryptococcus, Aspergillus mucor)
est obtenu par ensemencement du liquide sur milieu de Sabouraud sans actidione ; deux
milieux gélosés sont inoculés : l’un sera incubé à 35°C, l’autre à 20 – 22°C, pendant 7
jours.

e) Identification
Après culture, l’identification se fait à base des caractères biochimiques et antigéniques

f) L’antibiogramme :
• L’antibiogramme doit être tenté le premier jour à partir du LCR total purulent.
• L’ensemencement se fait par écouvillonnage, à partir d’un inoculum de 0,5 Mc
Farland sur gélose Muller Hinton. Après le dépôt des disques d’antibiotiques à tester,
les boites sont incubées 18 à 24 heures.
• Après culture les antibiotiques à tester sont choisi en fonction du germe isolé.
• Il ne faut pas appliquer plus de 4 disques sur une boite de 90 mm de diamètre.

« L’examen cytobactériologique du LCR révèle de l’urgence que le laboratoire

de bactériologie doit traiter avec rigueur et rapidité »