EXAMEN MICROSCOPIQUE :
PAR COLORATION DE GRAM
1. Réalisation du frottis:
Etaler sur 1 à 2 cm par un mouvement circulaire en partant du centre de la lame
Le frottis réalisé doit être :
- MINCE et HOMOGENE, étendu sur la lame sans toucher les bords
- Réalisé sur une lame PROPRE et DEGRAISSEE, une goutte d'eau déposée en
surface doit s'y étaler complètement.
2. Séchage :
- à la température du laboratoire, si possible
- ou bien à chaleur douce : platine chauffante à 37° ou au-dessus de la veilleuse du bec bunsen, à
hauteur suffisante. NE JAMAIS CHAUFFER BRUTALEMENT
3. Fixation :
Passer la lame -frottis situé sur le dessus- dans la flamme chauffante, LENTEMENT et 3 à 4 fois de
suite (attention de bien tenir la lame avec une pince) et laisser refroidir.
4. Coloration :
Principe : Cette coloration est une coloration complexe qui permet de différencier les bactéries d'après
leur forme et leur affinité pour les colorants.
La coloration permet de distinguer les bactéries GRAM + des GRAM – grâce à leurs différences de
nature de paroi. Les bactéries à Gram négatif ont une paroi plus fine et riche en lipides, alors que les
bactéries Gram positifs ont une paroi épaisse et pauvre en lipide.
ETAPES MODE OPERATOIRE TEMPS PRINCIPE
- Recouvrir la lame de cristal violet ou Le colorant violet pénètre dans les
violet de gentiane cellules bactériennes
COLORATION
- Rincer à l’eau distillée et récupérer le 1 minute
PRIMAIRE
cristal violet dans un bêcher (ne pas le
jeter dans le bac à coloration)
Il se forme un complexe chimique
- Recouvrir de Lugol entre le violet et le Lugol qui fixe le
MORDANÇAGE 1 minute
violet et colore le cytoplasme de toutes
- Rincer à l’eau distillée et l’égoutter
les bactéries en violet.
L'alcool dissout le violet de gentiane, si
la paroi bactérienne est perméable à
l'alcool (les lipides sont dissous par
- Tenir la lame inclinée et faire couler l’alcool), celui-ci pénètre dans les
pendant quelques secondes de l'alcool à bactéries et décolore leur cytoplasme :
5 secondes
DÉCOLORATION 95° jusqu'à écoulement incolore. environ
les bactéries deviennent incolores.
- Rincer immédiatement à l’eau distillée et Si les bactéries ont une paroi
égoutter imperméable à l'alcool (épaisse et
sans lipides), elles restent colorées en
violet et elles sont dites GRAM + ou
positif.
- Recouvrir la lame de fuschine La fuschine recolore en rose les
COLORATION
1 minute bactéries précédemment décolorées :
SECONDAIRE - Rincer à l’eau distillée les bactéries Gram – ou négatif.
- Egoutter entre 2 morceaux de papier-
SÉCHAGE filtre et laisser sécher
5. Mise au point :
Repérer les bactéries à l’objectif x40.
Déposer une goutte d’huile à immersion sur le frottis
Faire la mise au point en forte luminosité ( condensateur levé et diaphragme ouvert) objectif x100.
Se placer dans un endroit où la répartition des bactéries est homogène et la coloration nette
Eliminer les lames dans le bocal déchets non infectieux
6. Observations :
On peut noter la morphologie des bactéries et la coloration de celles-ci : les bactéries violettes sont
dites Gram positives, celles qui sont roses sont dites Gram négatives. On peut également noter
l'homogénéité de coloration de la bactérie.
Présentation des résultats d’observation :
COLORATION DE GRAM objectif x 100 (grossissement 1000) + huile à immersion
FORME TAILLE GRAM GROUPEMENT POLYMORPHISME
Taille moyenne et fin - Paires - ou + de taille ou de coloration
Bacilles 3 µm x 1 µm homogène Isolés
Bouts arrondis et d’autres plus petits Chaînettes
Bords parallèles 2µm x 1µm amas
