Med Star Cytologie 1er médecine
Méthodes d'études de la cellule
I/ Résolution/Pouvoir séparateur:La distance minimale séparant 2 points individualisable. Pour l’œil humain
elle est de 0.2mm à une distance de 25cm
II/ Les microscopes photoniques (optiques) :
A/ Microscope photonique à fond clair :
1/ Principe de fonctionnement: il fonctionne par transmission de lumière blanche; l’échantillon est traverse par
des photons, les lentilles de verres permettent l’obtention d’une image qui est reprise par l’oculaire
2/ Constituants: la source lumineuse, l’objectif qui donne une image grossie de la structure étudiée et la
lentille oculaire qui permet l’examen de l’image, statif (assure la stabilité de l’appareil), condenseur (condense
la lumière), platine en verre (porte l ‘échantillon)
3/ Domaines d’application: description structurale des tissus et des cellules (taille et forme, position de noyau)
et dans la Coloration de Gram.
Image foncée sur fond clair
4/ Les étapes préparatoires d’un échantillon: La Technique Histologique :
1. Prélèvement de l’organe à étudier.
2. Fixation au formole pour conserver les structures cellulaires
3. Déshydratation enlever l’eau intracellulaire.
4. Imprégnation remplacer e solvant par la paraffine
5. Inclusion de l’échantillon dans la paraffine pour les solidifier et obtenir des blocs.
6. Microtomie pour obtenir des coupes de 2 – 10µm d’épaisseur.
7. Réhydratation de l’échantillon pour une bonne pénétration du colorant.
8. Coloration chimique pour augmenter les contrastes
B/ Microscopie photonique à fluorescence:
La fluorescence: est une propriété d’une substance (fluorochrome) d’absorber une lumière de longueur d’onde
basse (lumière d’excitation) et de la remettre sous forme d’une longueur d’onde supérieur (lumière d’émission).
Ces molécules peuvent être :
Endogènes (naturelles): comme la chlorophylle qui colore les feuilles des végétaux.
Exogènes (artificielle): comme la fluorescéine et la rhodamine.
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Les marqueurs fluorescents les plus utilisés sont:
La rhodamine : absorbe une lumière verte et émet une lumière rouge.
La fluorescéine : absorbe une lumière bleue et émet une lumière verte.
Le DAPI : absorbe une lumière ultraviolette et émet une lumière bleue.
1/ Constituants et Principe de fonctionnement:
La source lumineuse (1) émet une lumière, d’énergie haute et de longueur d’onde
basse, qui passe par le filtre d’excitation (2) (ne laisse passer que la longueur
d’onde d’excitation). Le miroir dichroïque (3) réfléchit la longueur d’onde
d’excitation sur l’échantillon fluorescent (5)qui réfléchira à son rôle une lumière
de longueur d’onde d’émission qui, après être amplifiée par l’objectif (4), sera
filtrée par un filtre d’émission (6) qui sélectionne la longueur d’onde émise par le
fluorochrome. L’image est à la fin observée au niveau de l’oculaire (7).
2/ Domaines d’application: visualiser les objets naturellements fluorescents ou des mollecules rendus
fluorescents, etudie les interactions (division cellulaires - transport - sécrétion…..)
III/Les microscopes électroniques:
Présentation de la technique des coupes minces réaliser des coupes ultrafines permissives aux sels de
métaux lourds et aux faisceaux d’électrons. le procédé est le même que pour la technique histologique, la
différence est dans les produits et les outils utilisés :
1) Fixation double aux aldéhydes (fromaldéhyde et glutaraldéhyde) + tétroxyde d’osmium.
2) Déshydratation à l’alcool + solvant de la résine.
3) Imprégnation ou inclusion à la résine.
4) Etalage des coupes (pas encore fines) sur une grille métallique (en cuivre).
5) Réalisation de coupes ultrafines de 300 – 600 Å grâce à un Ultramicrotome.
A/ Le microscope électronique à transmission MET
1/ Mode de fonctionnement :
le faisceau d’électrons traverse l’échantillon pour donner une
image qui sera observé sur un écran de visualisation ou film
photographique (et pas directement à travers un oculaire
comme dans un MO).
2/ Les procédés de contraste électronique :
il existe trois méthodes de préparation de l’échantillon qui
permettent de l’observer sous un MET : le contraste positif
(une coloration où le fond est le plus foncé), le contraste
négatif (une coloration où l’objet est le plus foncé) et
l’ombrage métallique
3/ Domaines d’application:
L’ultrastructure de la cellule (organites cellulaires) après coloration positive.
L’aspect morphologique de macromolécules (ATP), de microorganismes (bactéries ..) de virus isolés après
coloration négative.
Les surfaces de structures cellulaires isolées ou de macromolécules, de virus ou de bactéries par ombrage
métallique.
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4/ La technique des coupes minces + contraste positif: Après la réalisation
des coupes minces, la coloration contraste positif est appliqué en deux étapes :
-1- Imprégnation des coupes ultrafines aux sels de métaux lourds (tel l’acétate
d’uranyl et le citrate de plomb).
-2- Observation en noir et blanc.
5/ La technique de coupes minces + contraste négatif : permet d’assombrir
le fond sans colorer l’objet lui-même. Les structures apparaissent en « négatif ».
6/ La technique d’ombrage métallique : vaporiser sous vide et sous un angle
donné une très fine couche métallique (ex : platine) se déposant sur la surface de
petites particules isolées, créant un effet d’ombre.
B/ Le microscope électronique à balayage
1/ Mode de fonctionnement : le MEB utilise un faisceau d’électrons très fin qui balaie, point par point, la
surface de l’échantillon à observer et transmet le signal recueilli via un détecteur à un écran cathodique
2/ Domaines d’application: Etude morphologique en 3D, observer et étudier les surfaces externes, et les
surfaces internes.
La technique d’ombrage métallique directe (métallisation de l’échantillon entier) permet d’étudier les
surfaces externes, on peut observer en 3D l’aspect biconcave des globules rouges et les chromosomes humains.
3/ La technique de cryodécapage: casser l’échantillon et analyser sa structure 3D.
1. Congélation dans l’azote liquide –192°
2. La cryofracture se fait a vide grâce a une lame métallique très fine
3. Le décapage par sublimation pour faire évaporer l’eau
4. L’ombrage métallique en vaporisant le carbone et la platine sous un angle précis.
5. Destruction du matériel biologique avec un acide fort
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IV/Techniques de détection et de localisation des composés cellulaires:
A/ Technique d’immunofluorescence ou immunomarquage Un fluorochrome est lié à un anticorps qui va
se fixer sur un antigène (molécules recherché) selon le principe de la réaction immunitaire (AC – AG).
Intérêt: détecter et suivre la fluidité des protéines membranaires. Détecter, localiser et quantifier d’autres
protéines cellulaires (les hormones, les protéines du cytosquelette….)
B/ Technique d’autoradiographie Cette technique concerne le marquage de précurseurs métaboliques (aa,
bases azotées, sucres..) par des isotopes radioactifs pour étudier la cinétique d’un métabolisme cellulaire, et
localiser des molécules organiques (protéines, acide nucléiques…).
V/ Les procédés d’isolement des composants cellulaires:
A/ Principe de fractionnement
/ homogénéisation cellulaire:
- Détruire la membrane plasmique
puis désorganisation de la cellule.
- On obtient un homogénat avec
tous les constituants de la cellule
La plupart des organites restent
intactes, l’appareil de Golgi et le
réticulum endoplasmique vont
être fragmentés sous forme de
vésicules appelées microsomes
lisses et rugueux).
B/ L’Ultracentrifugation cellulaire:
est un procédé de séparation des composés de l’homogénat en fonction de leur
différence de densité en les soumettant à une force centrifuge. Pour cela on
centrifuge l’homogénat à différentes vitesses; à chaque vitesse, différents
organites se déposent dans le culot .
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1/ La centrifugation différentielle UCD: Les constituants de l’homogénat se déposent selon leur densité poids
et leur taille à des vitesses de centrifugation différentes (croissantes )
2/ La centrifugation sur gradient de densité de saccharose ou UGD: La centrifugation entraine le
déplacement des composants du culot (récupéré à l’UCD) à travers le gradient de densité de saccharose et
s’arrêtent en une bande à leur densité .Le contenu de chaque culot après:
Culot 1 = noyaux + éléments du cytosquelette
Culot 2 = mitochondries + lysosomes + peroxysomes.
Culot 3 = grands polysomes + microsomes rugueux (REG) + microsomes lisses (REL, Appareil de Golgi,
Membrane Plasmique).
Culot 4 = Petits polysomes + sous unités ribosomales + macromolécules (glycogène, triglycérides) + virus (si la
cellule fractionnée est infectée).
Le surnageant 4 correspond à la solution aqueuse de l’hyaloplasme.
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Notes
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