Cours
III
LES AUTRES TESTS BIOCHIMIQUES
ET PHYSIOLOGIQUES
« GALERIE CLASSIQUE »
Recherche de la voie d’attaque des glucides « glucose »
Oxydative ou fermentative
Intérêt: « Test sur milieu Hugh et Leifson »
Ce test permet de déterminer la voie d’attaque du glucose comme source d’énergie par la
plupart des bactéries. C’est-à-dire est-ce que le métabolisme (dégradation) du glucose par la
bactérie se fait par oxydation (cycle de Krebs) ou par fermentation?
Pour synthétiser de l’énergie, les bactéries peuvent attaquer par deux voie différentes:
*Voie oxydative: Le glucose est utilisé uniquement en présence de dioxygène (faible libération
d’acides).
*Voie fermentative: le glucose est utilisé en absence et présence de dioxygène (forte libération
d’acides).
Ce test peut se faire sur plusieurs milieux:
Hugh et Leifson
MEVAG (Milieu d’étude de la voie d’attaque des glucides)
Ou CTA (Cystine Trypticase Agar).
C'est après la régénération qu'il faut ajouter une solution de glucose à 1% avant l’ensemencement
. Autrement, elle pourrait se caraméliser durant l’autoclavage.
Lecture de résultat après 24h d’incubation à 37°C:
Test sur milieu Mannitol-mobilité
1- La fermentation du mannitol: grâce à la présence d’un indicateur coloré
Ce milieu du pH (rouge de phénol),la fermentation du mannitol acidifie le milieu et
permet de l’indicateur coloré du pH va virer vers sa coloration acide (jaune).
rechercher :
2- La mobilité: La présence d’une faible teneur d’agar (milieu semi-solide
) permet le déplacement des bactéries mobiles autour de la piqure centrale
Technique ➢Ensemencer le milieu mannitol mobilité par une piqûre centrale.
➢Incuber à 37°C pendant 24 h.
Lecture
La fermentation du mannitol=
production d’acides=le milieu
vire au jaune (rouge de phénol)
Pas de fermentation du mannitol
= pas de production d’acides =
le milieu reste rouge Mannitol + Mannitol -
Le test de L’O.N.P.G (Recherche de la β-galactosidase=O.N.P.G Hydrolase)
Ce test permet de mettre en évidence la dégradation du lactose (glucose +galactose) grâce à
la présence de l’enzymes:β–galactosidase.
Technique
•Préparer une suspension dense à partir du germe qu’on désire
identifier dans un tube à essai stérile contenant 0.5ml d’eau
physiologique
•Ajouter un disque O.N.P.G
•Incuber au bain marie à 37°C/ minutes (jusqu’à 24heures).
Lecture :
Le test ONPG est positif lorsque la suspension
bactérienne se colore en jaune citron.
Test sur milieu TSI (Triple Sugar Iron)
Les critères biochimiques mis en évidence sur ce milieu:
- Fermentation du glucose
- Fermentation du lactose
- Production du H2S
- Production du gaz
Technique
-Ensemencer à l’aide d’une pipette pasteur stérile le milieu T.S.I. :
❖ La pente : par des stries
❖ Le culot : par une piqûre centrale.
-Ne serrer pas complètement le tube.
-Incuber le milieu à 37°C pendant 24 h.
Lecture
Fermentation des Production de
1 glucides 2 Production du H2S 3 gaz
Fermentation Un noircissement dû à la formation
Glucides Acides du sulfure de fer qui révèle la Décollement de la gélose
production d’H2S, ce qui signifie que
Rouge Jaune la bactérie possède la Déshulfydrase
Rouge
de
phénol
*Pente rouge+ culot rouge: la bactérie ne fermente ni le glucose ni le lactose
*Pente jaune+ culot jaune: la bactérie fermente le glucose et le lactose
*Pente rouge + culot jaune: la bactérie fermente le glucose provoquant ainsi un virage de couleur
du milieu du rouge vers le jaune, après épuisement de la quantité du glucose dans le milieu, la
bactérie utilise les peptones comme source de carbone et d’énergie dans le milieu provoquant une
Le test de L’O.N.P.G (Recherche de la β-galactosidase=O.N.P.G Hydrolase)
Ce test permet de mettre en évidence la dégradation du lactose (glucose +galactose) grâce à
la présence de l’enzymes:β–galactosidase.
La β–galactosidase: est une enzyme qui intervient dans le métabolisme du lactose. La recherche
de cette enzyme ne présente d’interet que pour les bactéries Lactose (-). En effet, toutes les
bactéries lactose (+) sont β–galactosidase (+).
L’utilisation du lactose par la bactérie dépend de deux enzymes:
*La lactose perméase : qui permet au lactose de pénétrer dans la
cellule bactérienne où il est ensuite décomposé en glucose et
galactose par la bêta-galactosidase. Le glucose et le galactose
peuvent alors être métabolisés par les bactéries.
*La β–galactosidase: qui catalyse l’hydrolyse du lactose en
glucose et galactose.
Le Príncipe:
L’ortho-nitro-phényl-galactoside (ONPG): est
un substrat artificiel structurellement similaire a
u lactose à l'exception du fait que l'ortho-nitro-
phényl a été substitué au glucose. Contrairemen
t au lactose, l’ONPG est capable de pénétrer da
ns la cellule bactérienne sans la présence de
perméase.
Lors de l'hydrolyse, par l'action de l'enzyme
β-galactosidase, l'ONPG se scinde en deux
résidus, le galactose et l’ortho-nitro-phényl.
L'ONPG est un composé incolor, l’ortho-nitro-
phénol est jaune, fournissant une preuve visuell
e de l'hydrolyse.
Technique
•Préparer une suspension dense à partir du germe qu’on désire identifier dans un tube à essai
stérile contenant 0.5ml d’eau physiologique
•Ajouter un disque O.N.P.G
•Incuber au bain marie à 37°C/ minutes (jusqu’à 24heures).
Lecture :
Si l'organisme possède de la bêta-galactosidase,
l'enzyme divisera la liaison bêta-galactoside, libérant
de l’ortho-nitrophénol qui est un composé de couleur
jaune. Cela indique un test positif.
Les organismes à forte activité bêta-galactosidase peuvent
produire une réaction positive quelques minutes après
l'ensemencement du milieu ONPG ; d'autres organismes
peuvent prendre jusqu'à 24 heures.
TEST VP RM SUR MILIEU CLARK ET LUBS
Ce test permet d’étudier la voie de fermentation du glucose. Il existe la voie butanediolique ou la
fermentation du lactose aboutit à la production d’un seul composé (l’acétoÏne= butylène glycol ) dans ce
cas la on parle d’une bactérie homo-ferementaire, et la voie des acides mixtes, ou la fermentation du
glucose aboutit à la production d’un mélange d’acides , on parle d’une bactérie hétéro-fermentaitre.
1- acides mixtes 2- Acetoïne= butylène glycol
(Réaction rouge de méthyle : RM) (Réaction Voges- Proskauer, VP)
Technique
➢Ensemencer le milieu Clark et Lubs (1ml) avec quelques gouttes d’une suspension bactérienne.
➢Incuber 24 à 48h à 37°C.
➢Apres l’incubation la croissance bactérienne se manifeste par l’apparition d’un trouble.
➢Partager la suspension en deux tubes de 0,5ml:
Le tube (1)= Test RM Ajouter 1 à 2 gouttes de rouge de méthyl (Lecture immédiate)
Le tube (2)= Test VP ▪Ajouter 0,5 mL de chaque réactif (ᾳ-naphtol « VP1 » et NaoH
ou KoH « VP2 »). Laisser le tube incliné et attendre 10 à 15 min
Lecture
Anneau rouge
violacé
en surface
RM - RM+ VP - VP+
Uréase – TDA – indole
sur milieu urée indole (Urée tryptophane)
Le milieu urée-tryptophane est un milieu synthétique qui permet la recherche de:
1- L'uréase 2-La production d'indole = tryptophanase 3- La tryptophane désaminase (TDA)
1- Recherche de l’uréase:
C’est une enzyme importante chez les bactéries qui utilisent l’urée comme source d’azote.
Technique ➢Ensemencer richement le milieu urée-tryptophane à partir de cultures solides.
➢Incuber à 37°C/24heures.
Lecture
2. Désamination (tryptophane désaminase TDA) et formation d’indole:
Apres avoir effectuer la lecture, répartir le milieu urée-tryptophane dans 2 tubes et réaliser les tests suivants:
l’un servira à la recherche de l’indole par l’adjonction de 03 gouttes du réactif de KOVACS.
l’autre servira à la recherche de TDA par l’adjonction de 03 gouttes de chlorure de fer III en
solution acide.
Lecture
Apparition d’un anneau rouge =le tryptophane a été hydrolysé=présence d’indole
Tube 1
Absence d’anneau rouge =le tryptophane n’a pas été hydrolysé=absence d’indole
Coloration marron foncé = le tryptophane a été désaminé=la bactérie possède la
Tube 2 tryptophane désaminase= elle est dite TDA+
Le milieu reste inchangé = le tryptophane n’a pas été désaminé=la bactérie ne
possède la tryptophane désaminase= elle est dite TDA-.
Test sur milieu Citrate de Simmons
(L‘utilisation du Citrate)
Le citrate de Simmons est un milieu qui ne contient que le citrate comme source de carbone. Seules les
bactéries possédant l’enzyme citrate perméase seront donc capables de se développer sur ce milieu.
Technique
-Ensemencer la pente avec une strie longitudinale à l’aide d’une anse de platine chargée.
-Le bouchon ne doit pas être vissé à fond.
-Incuber le milieu à 37°C pendant 24 h.
Lecture
Si le milieu devient bleu = Utilisation de citrate et alcalinisation du
milieu= Citrate perméase+
Si le milieu reste inchangé (vert) = Pas d’utilisation de citrate =
Citrate perméase-
RECHERCHE DE LDC, ODC (DECARBOXYLASES) ET
ADH (DIHYDROLASE)
