Classification d’ARN codants et

d’ARN non-codants

THÈSE

présentée et soutenue publiquement le 31 mars 2009

pour l’obtention du

Doctorat de l’Université des Sciences et Technologies de Lille

(spécialité informatique)

par

Arnaud Fontaine

Composition du jury

Rapporteurs : Thomas Schiex, D.R. INRA INRA – Unité de Toulouse

Claude Thermes, D.R. CNRS Centre de Génétique Moléculaire – Gif-sur-Yvette

Examinateurs : Fabrice Leclerc, C.R. CNRS MAEM, Université Henri Poincaré – Nancy 1
Nouredine Melab, Professeur LIFL, Université des Sciences et Technologies de Lille
Fariza Tahi, Maı̂tre de conférences IBISC, Université d’Evry-Val d’Essonne

Directeur : Hélène Touzet, C.R. CNRS LIFL, Université des Sciences et Technologies de Lille

UNIVERSITÉ DES SCIENCES ET TECHNOLOGIES DE LILLE – LILLE 1

ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES POUR L’INGÉNIEUR
Laboratoire d’Informatique Fondamentale de Lille — UMR 8022
U.F.R. d’I.E.E.A. – Bât. M3 – 59655 VILLENEUVE D’ASCQ CEDEX
Tél. : +33 (0)3 28 77 85 41 – Télécopie : +33 (0)3 28 77 85 37 – email : [email protected]
 Table des matières

Introduction 1

1 Les Acides RiboNucléiques 5

1.1 L’ARN au sein de la cellule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.1 Les organismes vivants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.2 Le dogme central de la biologie moléculaire . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.1.3 Les acides nucléiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.1.4 La transcription d’un gène en un ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.1.5 La maturation de l’ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2 Les ARN codants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.1 Les protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.2 La traduction en protéine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.2.3 La régulation de la transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3 Les ARN non-codants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.3.1 La structure de l’ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.3.2 Les familles d’ARN non-codants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.4 L’évolution des acides nucléiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.4.1 Généralités . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.4.2 Les mécanismes de l’évolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.4.3 L’évolution des gènes codants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.4.4 L’évolution des gènes à ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.5 L’analyse comparative de séquences nucléiques . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.5.1 L’alignement de séquences comme support de l’analyse comparative . 24
1.5.2 L’analyse de séquences codantes et de séquences structurées . . . . . . 25
1.5.3 Mise en œuvre bio-informatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2 Recherche de gènes et régions codantes 31

2.1 Les méthodes ab initio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

i
Table des matières

2.1.1 Le cadre ouvert de lecture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.1.2 Les autres signaux liés à la structure du gène . . . . . . . . . . . . . . 32
2.1.3 Les biais de composition de la séquence codante . . . . . . . . . . . . 33
2.1.4 Les mises en œuvre logicielles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.2 Les approches par homologie de séquence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.2.1 Similarité avec des séquences peptidiques . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.2.2 Similarité avec des séquences transcrites . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.2.3 Séquences génomiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.3 Les approches par analyse comparative . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.4 Protea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.4.1 Le modèle sur deux séquences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.4.2 L’extension à une famille de séquences, le graphe des cadres de lecture 42
2.4.3 La classification à partir du graphe des cadres de lecture . . . . . . . . 44
2.4.4 Mise en œuvre logicielle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.5 Résultats expérimentaux de Protea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.5.1 L’évaluation des performances de Protea . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.5.2 Une application au génome humain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.5.3 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3 Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues 57

3.1 La prédiction de structures secondaires, état de l’art . . . . . . . . . . . . . . 57
3.1.1 La prédiction par approche thermodynamique . . . . . . . . . . . . . . 58
3.1.2 La prédiction par analyse comparative . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.1.3 BRAliBase I, le benchmark de référence . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.2 La prédiction de gènes à ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.2.1 Les biais de composition en séquence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.2.2 La stabilité thermodynamique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.2.3 L’homologie de séquence et de structure . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.2.4 L’approche comparative, l’existence d’une structure conservée . . . . . 84
3.3 Evolution et enrichissement du logiciel caRNAc . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.3.1 L’existant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.3.2 Introduction des méta-séquences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.4 Résultats expérimentaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
3.4.1 Validation sur BRAliBase I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.4.2 Vers la prédiction de gènes à ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

ii
4 Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc 113
4.1 L’alignement multiple de séquences nucléiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
4.1.1 L’alignement multiple de séquences codantes homologues . . . . . . . 114
4.1.2 L’alignement multiple de séquences partageant une structure commune 114
4.1.3 Magnolia, alignement de séquences fonctionnelles homologues . . . . 115
4.1.4 Les résultats expérimentaux de Magnolia . . . . . . . . . . . . . . . 120
4.2 L’annotation par génomique comparative . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
4.2.1 Le pipeline d’annotation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
4.2.2 Résultats expérimentaux du pipeline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

Conclusion 137

Bibliographie 141

iii
Table des matières

iv
 Introduction

Tous les organismes vivants, des plus simples aux plus complexes, sont composés de cellules
qui présentent des caractéristiques communes en terme de structure mais également de fonc-
tionnement. Trois types de macromolécules fondamentales sont impliquées dans cette unité
cellulaire et moléculaire du vivant : les ADN, les ARN et les protéines. Schématiquement,
la séquence des éléments qui composent ces molécules constitue la représentation minimale
permettant de décrire l’information qu’elles contiennent.
La séquence des ADN est responsable du stockage de l’information génétique qui détermine
le patrimoine génétique d’un organisme. L’information génétique est segmentée en gènes dont
l’expression est à l’origine de la synthèse d’ARN puis de protéines. La séquence d’une protéine
ne constitue qu’un premier niveau dans sa description. Les protéines se replient en effet dans
l’espace pour former une structure tridimensionnelle qui détermine leur fonction. Les ARN
sont quant à eux des acteurs plus polyvalents. Les ARN codants contiennent l’information
nécessaire à la synthèse d’une protéine, tandis que les ARN non-codants se comportent som-
mairement comme des protéines en se repliant sur eux-mêmes pour adopter une conformation
spatiale qui détermine leur fonction.
Alors que l’on dispose de plus en plus de séquences d’ADN et d’ARN provenant de la
génomique et de la transcriptomique, la signification de la plupart de ces séquences reste
encore à élucider. Les premiers travaux d’annotation automatique de séquences remontent au
début des années 80, suite au premier séquençage complet d’un génome. A l’heure actuelle,
près de 1 000 génomes d’organismes différents sont complètement séquencés et disponibles
publiquement, et plus de 4 000 projets de séquençage sont en cours 1 . De prime abord,
l’analyse systématique de ces séquences par des techniques expérimentales en vue de leur
annotation n’est plus envisagée à cause de leurs coûts humain et financier trop importants.
L’analyse automatique de séquences par des moyens informatiques est donc plus que jamais
un challenge majeur.
L’aboutissement de nombreux projets de séquençage ces dernières années a toutefois
quelque peu changé la donne en contribuant à l’émergence de la génomique comparative.
En effet, bien que portée par les mêmes supports et exprimée selon des mécanismes com-
muns, l’information génétique est également la source de la diversité des organismes vivants.
L’unicité cellulaire du vivant suggère ainsi l’évolution à partir d’ancêtres communs plus ou
moins éloignés durant laquelle les séquences génomiques se transforment, tout en préservant
certaines fonctions.
La génomique comparative consiste à étudier et analyser les ressemblances et les différences
apparues durant l’évolution entre des séquences génomiques. Ces séquences ne sont ainsi plus
considérées de manière individuelle mais reliées entre elles par l’évolution. Dans ce contexte,
1
http://www.genomesonline.org

1
Introduction

la ressemblance significative entre des séquences d’ADN ou d’ARN constitue un indicateur

sur une éventuelle fonction commune. Toutefois, la proposition réciproque est fausse. Une
absence de similarité significative entre plusieurs séquences d’ADN ou d’ARN n’implique pas
nécessairement l’absence d’une fonction partagée. Des séquences différentes d’ARN codants
peuvent en effet être à l’origine de protéines homologues, et des séquences différentes d’ARN
non-codants peuvent former des structures communes. En travaillant sur des ensembles de
séquences plutôt que sur des séquences isolées, les approches modernes de génomique compa-
rative qui prennent part à l’annotation de séquences fonctionnelles s’avèrent particulièrement
fécondes.
Les travaux que nous présentons dans ce manuscrit s’inscrivent dans ce contexte. D’un
côté, Protea, dédié à la prédiction de séquences codantes homologues, et de l’autre, caR-
NAc, dédié à la prédiction de structures secondaires conservées. Il existe plusieurs méthodes
fructueuses pour traiter ces deux problématiques par analyse comparative. Ces méthodes
s’appuient quasi systématiquement sur un alignement préalable des séquences supposé fiable.
Il est cependant difficile de produire un alignement de qualité sur des séquences faiblement
conservées. Les méthodes actuelles ne sont donc pas bien adaptées pour traiter ce type de
séquences. Nos méthodes, Protea et caRNAc, ont été conçues pour compléter l’arsenal
des méthodes existantes en palliant à ce problème avec un traitement adapté aux séquences
faiblement conservées. Toutes deux acceptent en entrée une famille de quelques séquences
non alignées, de moins d’une dizaine jusqu’à plusieurs dizaines, dont la longueur doit être
globalement homogène, mais peut atteindre jusqu’à plusieurs milliers de bases.

Plan de lecture
Ce document est organisé en quatre chapitres.
Le premier chapitre est consacré à l’introduction des notions biologiques nécessaires à la
bonne compréhension des méthodes présentées dans ce document. Ce chapitre débute par la
présentation des mécanismes en lien direct avec le stockage et l’expression de l’information
génétique communs à tous les organismes vivants. Ensuite, nous détaillons la transcription,
première étape de l’expression de l’information génétique, qui permet de synthétiser les ARN,
et la maturation des transcrits. Puis, nous nous intéressons plus en détails aux deux types
d’ARN existants : les ARN codants et les ARN non-codants. Enfin, la dernière partie de ce
chapitre est consacrée à la mise en place de notre fil conducteur : l’analyse comparative de
séquences avec notamment la définition de méta-séquence qui revient de manière récurrente
dans les chapitres suivants.
Le second chapitre porte sur la détection de séquences codantes. Tout d’abord, nous
présentons trois types de méthodes existantes : l’approche ab initio, l’approche par similarité
de séquence et enfin l’approche comparative. La littérature foisonne de méthodes dédiées à
ce problème. Nous n’en présentons qu’une sélection éclairée représentative de la diversité des
méthodes existantes. Ensuite, nous présentons Protea, notre contribution au problème. Par-
tant d’observations concrètes sur deux séquences, nous formalisons dans un premier temps
la détection d’une séquence d’acides aminés conservée sur deux séquences par la comparai-
son de leurs traductions potentielles. Puis, ce principe est étendu à des ensembles de taille
quelconque de séquences. Enfin, la dernière partie de ce chapitre est consacrée aux résultats
expérimentaux de Protea. Les performances de Protea sont évaluées sur un large éventail
de séquences, puis nous passons à un cas pratique en appliquant Protea à l’annotation de

2
nouvelles séquences codantes sur le génome humain.
Le troisième chapitre porte sur la prédiction de structures d’ARN et la prédiction de gènes
à ARN. Nous commençons par poser le problème de la prédiction de structures en introduisant
les deux grandes familles d’approches : l’approche thermodynamique et l’approche compara-
tive. Nous refermons ce rapide état de l’art sur la prédiction de structures par l’évaluation
de référence des méthodes existantes, BRAliBase I proposée par Gardner en 2004 [GG04].
Ensuite, nous nous intéressons à un problème étroitement lié à la prédiction de structures
d’ARN, la prédiction de gènes à ARN. Pour présenter ce problème, nous dressons un parallèle
avec les approches mises en œuvre pour la prédiction de gènes codants en partant des biais
de composition en séquence pour terminer par l’approche comparative. La troisième partie
qui compose ce chapitre décrit notre contribution au problème de la prédiction de structures.
Nous y présentons ainsi les évolutions apportées au logiciel caRNAc, dédié à la prédiction de
structures secondaires conservées, notamment l’introduction des méta-séquences. Enfin, les
résultats de caRNAc par rapport à ceux des méthodes existantes sur le jeu de données de
référence, BRAliBase I, sont exposés dans la dernière partie de ce chapitre. Avant de refer-
mer ce chapitre, nous décrivons les travaux que nous avons menés dans l’optique de définir
une méthode de prédiction de gènes à ARN basée sur l’existence de structure conservée signi-
ficative prédite par caRNAc.
Le quatrième et dernier chapitre de ce document est dédié à la présentation de deux tra-
vaux collaboratifs menés au sein de l’équipe qui intègrent Protea et caRNAc. La première
partie de ce chapitre est consacrée à l’alignement multiple de séquences codantes homologues
et de séquences qui partagent une structure commune, avec le logiciel Magnolia. Magnolia
est un logiciel d’alignement multiple qui résulte de la combinaison de Protea, caRNAc et
Gardenia, un logiciel d’alignement de structures d’ARN développé dans l’équipe. La seconde
partie de ce chapitre est dédiée à l’application de Protea et caRNAc pour l’annotation de
séquences génomiques. Nous présentons le pipeline logiciel développé dans l’équipe avant de
fournir quelques résultats expérimentaux.

3
Introduction

4
 Chapitre 1

Les Acides RiboNucléiques

Les travaux décrits dans ce manuscrit portent sur l’analyse des acides ribonucléiques
(ARN) codants et non-codants par des approches de bio-informatique. Dans ce premier cha-
pitre, nous présentons le contexte biologique général et les mécanismes moléculaires sur les-
quels s’appuient nos travaux.
Nous commençons par situer les ARN, leur synthèse et leurs fonctions au sein de la cellule,
en section 1.1. Nous nous intéressons ensuite plus précisément aux caractéristiques des ARN
codants dans la section 1.2, des ARN non-codants dans la section 1.3 et à leur évolution
dans la section 1.4. Etant informaticien, toute cette présentation n’est pas rédigée par un
spécialiste, et s’adresse en priorité à des non-spécialistes. Le but est de fournir les notions de
base en biologie moléculaire nécessaires à la compréhension du document et de légitimer les
choix de modèles que nous avons faits dans la suite du travail.
Enfin, dans la dernière section du chapitre, nous abordons les premiers formalismes et
méthodes de bio-informatique avec la génomique comparative, l’alignement de séquences et
l’introduction du concept de méta-séquence. Les méta-séquences et les ensembles de méta-
séquences nous serviront tout au long de ce document pour représenter des ensembles de
séquences d’ARN de distance évolutive hétérogène.

1.1 L’ARN au sein de la cellule

Les ARN font partie des molécules essentielles au bon fonctionnement d’un organisme
vivant, et plus précisément à celui de ses cellules. Nous nous intéressons donc en premier lieu
aux cellules des organismes vivants dans la section 1.1.1. Puis, dans la section 1.1.2, nous
nous intéressons au dogme central qui décrit le cycle de vie des ARN.

1.1.1 Les organismes vivants

Un organisme vivant est un être issu de l’assemblage d’une ou plusieures entités microsco-
piques : les cellules. Les organismes vivants font l’objet d’une classification selon une multitude
de critères dont le premier porte sur la structure de leurs cellules. Ce critère fait apparaı̂tre
deux domaines distincts : les eucaryotes et les procaryotes. Les cellules eucaryotes comportent
un noyau et plusieurs compartiments spécialisés alors que les cellules procaryotes n’ont pas
de noyau. La figure 1.1 présente de manière schématique la structure d’une cellule eucaryote
animale.

5
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

1. Nucléole
2. Noyau
3. Ribosome
4. Vésicule
5. Réticulum endoplasmique rugueux
6. Appareil de Golgi
7. Microtubule
8. Réticulum endoplasmique lisse
9. Mitochondrie
10. Vacuole
11. Cytoplasme
12. Lysosome
13. Centrosome
Source http://en.wikipedia.org/wiki/File:Biological_cell.svg

Fig. 1.1 – Schéma d’une cellule eucaryote animale.

Parmi les eucaryotes, on retrouve aussi bien des organismes unicellulaires, tels que les
levures, que des organismes pluricellulaires tels que les plantes et les animaux. La majorité des
procaryotes sont quant à eux des organismes unicellulaires microscopiques. Les procaryotes
sont divisés en deux règnes : les bactéries et les archées. Bien que la taille et la forme des
archées sont similaires à celles des bactéries, les archées s’en distinguent par des caractères
plus similaires à ceux des eucaryotes tels que la structure des gènes et les mécanismes relatifs
à leur expression.
Toute cellule est régie essentiellement par cinq types de macromolécules : les lipides, les glu-
cides, les acides désoxyribonucléiques (ADN), les acides ribonucléiques (ARN) et les protéines.
L’ADN assure le stockage de l’information génétique et sa transmission au fil des générations.
L’ensemble de l’ADN qui définit un organisme est appelé son génome. Chez les eucaryotes,
l’ADN est stocké dans le noyau. Les lipides sont les principaux constituants des membranes
cellulaires. Les glucides sont le soutien de la vie : ils servent de source et de stockage d’énergie,
ils participent aux paroies cellulaires, . . . Les protéines sont des molécules indispensables à la
structuration et au fonctionnement des cellules, et résultent de l’expression de l’information
génétique. Les acides ribonucléiques (ARN) sont quant à eux des protagonistes plus ambigus
qui peuvent endosser plusieurs rôles auxquels nous nous intéressons par la suite.

1.1.2 Le dogme central de la biologie moléculaire

Les mécanismes d’expression de l’information génétique sont formalisés dans le dogme
central, proposé par Francis Crick à la fin des années 50, puis repris dans Nature en 70 [Cri70].
Le dogme central définit deux principes fondamentaux, la transcription et la traduction dont
l’enchaı̂nement est illustré sur le schéma de la figure 1.2.
L’information génétique contenue dans l’ADN est organisée en segments appelés les gènes.
La première étape de l’expression de l’information génétique consiste à transcrire un gène en
un ARN. Cet ARN est ensuite traduit en protéine. Ce rôle de médiateur de l’information
génétique constitue le premier rôle de l’ARN que l’on nomme alors ARN messager.

6
 1.1. L’ARN au sein de la cellule

Fig. 1.2 – Le dogme central présentant la transcription de l’ADN en ARN messagers traduits
par la suite en protéine, et la transcription de l’ADN en ARN non-codants.

Le dogme central mentionne également deux autres types d’ARN : les ARN ribosomiques
et les ARN de transfert. Contrairement aux ARN messagers, ces ARN sont des molécules
fonctionnelles non traduites en protéine et que l’on regroupe sous le terme d’ARN non-codants.
Au moment de leurs découvertes, ces deux types d’ARN non-codants apparaissent comme
des exceptions au dogme central. Depuis, de nombreux autres ARN non-codants ont été
découverts, portant à plus de 600 le nombre de familles d’ARN non-codants connues à ce
jour. Ces ARN sont impliqués dans de nombreux processus essentiels des cellules tels que la
synthèse des protéines, la maturation des ARN messagers, les processus de régulation pré- et
post-transcriptionnelle, . . .
Afin de clarifier le discours, les gènes à l’origine d’ARN messagers seront par la suite
appelés des gènes codants, et par opposition, les gènes à l’origine d’ARN non-codants, des
gènes à ARN.

1.1.3 Les acides nucléiques

L’ADN et l’ARN sont tous deux des acides nucléiques, c’est-à-dire des chaı̂nes plus ou
moins longues de nucléotides. Chaque nucléotide est composé de trois substances fondamen-
tales : un sucre, un groupe phosphate et une base azotée. La composition du groupe phosphate
est constante pour tous les acides nucléiques, tandis que celle du sucre varie en fonction du
type d’acide nucléique : le désoxyribose pour les nucléotides de l’ADN, le ribose pour ceux de
l’ARN. Il existe en tout cinq types de nucléotides, induits par cinq bases azotées différentes :
l’adénine (A), la cytosine (C), la guanine (G), la thymine (T) et l’uracile (U). La thymine et
l’uracile sont très semblables, mais on ne rencontre la thymine que dans l’ADN, et l’uracile
que dans l’ARN. La structure chimique des bases azotées permet de distinguer deux groupes :

7
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

les purines, constituées de l’adénine et de la guanine, et les pyrimidines, constituées de la

cytosine, de la thymine et de l’uracile. L’alternance des phosphates et des sucres produit
le squelette des acides nucléiques sur lequel s’attachent les bases azotées. La molécule ainsi
formée est souvent appelée brin. Elle possède des extrémités différentes, notées 5′ et 3′ en
raison de notations relatives à la géométrie des sucres.
Au sein d’un brin ou entre deux brins différents les bases peuvent s’apparier au moyen
de liaisons hydrogène. La quantité de liaisons qui se forment entre deux bases détermine
la stabilité de leur appariement. Les appariements de type Watson-Crick désignent ainsi les
deux appariements les plus stables qui se forment entre l’adénine et la thymine (l’uracile
pour l’ARN) reliées par deux liaisons hydrogène, et la cytosine et la guanine reliées par trois
liaisons hydrogène. Pour faire référence à ces appariements, on parle également d’appariements
canoniques ou encore de complémentarité entre les bases : l’adénine et la thymine (l’uracile
pour l’ARN) sont complémentaires, de même que la cytosine et la guanine.
La composition des nucléotides n’est pas le seul élément qui diffère entre l’ADN et l’ARN.
L’ADN est en fait composé de deux brins reliés et stabilisés par les appariements qui se
forment entre leurs nucléotides respectifs. La figure 1.3 présente de manière schématique
la structure chimique de l’ADN. Les brins d’ADN sont antiparallèles, c’est-à-dire que les
extrémités chargées 5′ et 3′ de chacun des brins se font face sous la contrainte de leur pola-
rité. Ils sont également complémentaires car ils ne sont reliés que par des appariements de
type Watson-Crick. Ainsi assemblés, les deux brins se vrillent pour former une double hélice
comme illustré en figure 1.4. Contrairement à l’ADN, l’ARN est généralement simple brin,
sauf chez quelques organismes tels que les rétrovirus. Sous sa forme simple brin, l’ARN est
plus malléable, ce qui lui permet de se replier sur lui-même et aux bases des nucléotides qui
le composent de s’apparier.

(a) Schéma de l’Acide DésoxyriboNucléique. (b) Schéma de l’Acide RiboNucléique.

Fig. 1.3 – Structure des acides nucléiques. Chaque groupe phosphate (P) est lié à un sucre
(dR ou R) lui-même lié à une base azotée (A, C, G, T ou U).

8
 1.1. L’ARN au sein de la cellule

Source http://openclipart.org/media/files/hs/1771

Fig. 1.4 – Schéma de la structure en double hélice de l’ADN.

L’organisation de l’information génétique stockée dans l’ADN varie selon les organismes.
Le génome des eucaryotes est généralement organisé en plusieurs molécules d’ADN empa-
quetées, les chromosomes. Le génome des procaryotes et des archées n’est en général constitué
que d’un seul chromosome qui se présente sous forme circulaire, c’est-à-dire que les extrémités
5′ et 3′ de la molécule d’ADN sont liées ce qui a pour effet de fermer la molécule.

1.1.4 La transcription d’un gène en un ARN

La transcription est le processus qui synthétise un ARN en recopiant la séquence d’un
gène. Ce processus se décompose en trois étapes schématisées sur la figure 1.5 : l’initiation,
l’élongation et la terminaison.
Durant la phase d’initiation de la transcription, l’ARN polymérase, un complexe protéique,
se fixe sur une région particulière de l’ADN, située en amont du gène à transcrire : le site
promoteur. La liaison entre l’ADN et l’ARN polymérase permet d’une part d’ouvrir la double
hélice et d’autre part de catalyser l’insertion des ribonucléotides pour former un brin d’ARN.
Contrairement aux procaryotes, les eucaryotes et les archées disposent de quatre types d’ARN
polymérases recrutées en fonction du type d’ARN à synthétiser et/ou du compartiment cel-
lulaire de destination de l’ARN néo-synthétisé.
Le site promoteur diffère quelque peu selon les gènes et les organismes. Ce site comporte
deux boı̂tes, c’est-à-dire deux séquences spécifiques. Chez les bactéries, la boı̂te de PRIBNOW,
dont la séquence canonique est TATAAT, marque le début de transcription et se situe à une
dizaine de bases en amont du gène. Chez les eucaryotes et les archées, la boı̂te de PRIBNOW
est l’équivalente de la boı̂te TATA, dont la séquence canonique est TATAAAA, située une ving-
taine de bases en amont du gène. Pour tous les organismes, il existe la boı̂te CAAT située
70 à 80 nucléotides en amont du gène qui sert à la régulation de la vitesse de transcription
du gène. Lorsque l’ARN polymérase se fixe sur la boı̂te TATA, elle s’associe avec différentes
protéines, les facteurs de transcription, pour former une particule d’initiation. L’élongation de
la transcription correspond à l’incorporation des nucléotides sur le brin d’ARN. Durant cette
phase, l’ARN polymérase progresse de manière séquentielle de l’extrémité 3′ vers l’extrémité
5′ du brin d’ADN codant, c’est-à-dire le brin complémentaire du brin contenant le fragment
à recopier. L’incorporation des nucléotides se faisant par complémentarité entre nucléotides,
l’ARN synthétisé est une copie conforme de la région à transcrire. La terminaison de la trans-
cription intervient lorsque l’ARN polymérase rencontre un terminateur. Chez les procaryotes,
ce terminateur est le plus souvent une région riche en G et en C qui contient une petite struc-
ture en tige-boucle (section 1.3.1), suivie d’une série de A sur l’ADN. Chez les eucaryotes, les
mécanismes de terminaison de la transcription sont moins connus.
Chez les procaryotes, des groupes de gènes contiguës, appelés des opérons, peuvent parta-
ger un même promoteur et se retrouver ainsi transcrits simultanément en un seul ARN. Cette
organisation “optimisée” permet l’expression et la régulation simultanée de plusieurs gènes

9
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

(a) Initiation.

(b) Elongation.

(c) Terminaison.

Source http://en.wikipedia.org/wiki/File:Simple_transcription_initiation1.svg

Fig. 1.5 – Les trois étapes successives de la transcription.

10
 1.2. Les ARN codants

impliqués dans un même processus cellulaire.

1.1.5 La maturation de l’ARN

Un ARN nouvellement transcrit est appelé transcrit primaire. Chez les eucaryotes
et les archées les transcrits primaires d’ARN subissent quelques transformations post-
transcriptionnelles. Cette phase dite de maturation des transcrits comporte trois étapes
schématisées sur la figure 1.6 : l’addition d’une coiffe en 5′ du transcrit, l’addition d’une
queue poly A en 3′ et enfin l’épissage du transcrit primaire. L’épissage est le changement le
plus marquant au cours duquel des fragments de l’ARN sont excisés, et les fragments restants
sont raboutés. Les fragments excisés sont nommés des introns, les fragments conservés des
exons. Les jonctions intron/exon sont délimitées par deux sites, le site donneur GU qui marque
le début d’un intron, et le site accepteur AG qui en marque la fin. L’ablation des introns est
réalisée par des ribonucléoprotéines, complexes composés de protéines et de petits ARN, des
snRNA. Le découpage en exons et en introns n’est pas nécessairement unique. Ainsi, un même
transcrit primaire peut donner lieu à différents transcrits matures de longueurs différentes is-
sus d’épissages alternatifs. Aujourd’hui, il est admis que près de 60% des gènes chez l’être
humain subissent l’épissage alternatif. Quelques cas extrêmes d’épissage alternatif sont connus,
comme par exemple le gène Dscam de la Drosophile pour lequel il existe 38 016 ARN matures
différents [WFM+ 04, BK06, SC09].
La maturation concerne tous les transcrits issus de gènes codants chez les eucaryotes et
les archées.

1.2 Les ARN codants

Dans le cas des gènes codants, l’ARN messager issu de la transcription, puis de la matu-
ration éventuelle, contient toute l’information nécessaire à la production d’une protéine. La
traduction d’un ARN messager mature en une protéine est un processus complexe qui repose
sur une cascade d’assemblages de molécules en interaction avec l’ARN messager à traduire.

1.2.1 Les protéines

La traduction est un processus qui, comme son nom l’indique, traduit l’information portée
par un ARN messager en une protéine. Une protéine est une molécule formée par l’en-
chaı̂nement d’acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Il existe plus d’une cen-
taine d’acides aminés présents dans la nature [CPL+ 07], cependant, seuls vingt deux d’entre
eux peuvent être intégrés dans les protéines synthétisées par la traduction d’un ARN. La
figure 1.7 montre une classification de ces acides aminés selon leurs propriétés.
Les biochimistes distinguent quatre niveaux pour la structure d’une protéine, illustrés en
figure 1.8 :
– la structure primaire : la séquence d’acides aminés ;
– la structure secondaire : des éléments de structure locaux, stabilisés par des liens hy-
drogène. Les éléments les plus fréquents sont les hélices alpha et les feuillets bêta ;
– la structure tertiaire : la structure tridimensionnelle de la protéine, où les éléments de
la structure secondaire sont en interaction. La structure tertiaire peut être stabilisée
par la formation de quelques liaisons hydrogènes, ponts disulfides, . . . ;

11
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

Fig. 1.6 – Processus de maturation des transcrits primaires.

12
 1.2. Les ARN codants

Source http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:Acides_amin%E9s_propri%E9t%E9s_diagramme_Venn.svg

Fig. 1.7 – Diagramme de Venn des acides aminés selon leur propriétés.

– la structure quaternaire : la structure tertiaire d’une protéine dans une conformation

particulière, souvent en interaction avec une ou plusieurs autres molécules, notamment
lors d’assemblages plus conséquents ou lors de la formation d’un complexe de protéines.

1.2.2 La traduction en protéine

La traduction est un processus séquentiel et linéaire qui consiste à décoder l’information
contenue dans un ARN messager mature pour obtenir la protéine correspondante. Durant la
traduction, un complexe nommé le ribosome progresse le long de l’ARN messager à traduire en
lisant les triplets successifs de nucléotides appelés codons. A chaque lecture de chaque triplet,
l’acide aminé correspondant est ajouté à la protéine en cours d’assemblage. La correspondance
entre codons et acides aminés est presque universelle et régie par le code génétique donné en
figure 1.9. Dans la cellule, ce sont les ARN de transfert, des ARN non-codants, qui sont
garants de cette correspondance entre codons et acides aminés. La figure 1.10 présente un
exemple de traduction partielle d’une séquence codante.
Etant donné une séquence nucléique à traduire, il existe trois cadres de lecture potentiels
selon la position à laquelle débute la lecture des codons, auxquels s’ajoutent trois autres cadres
de lecture lorsque l’orientation de la molécule est indéterminée. Toutefois, un seul cadre de
lecture parmi les six permet d’obtenir la séquence de codons codant la protéine synthétisée.
Certains codons particuliers, les codons START et STOP, marquent respectivement le début
et la fin de la séquence de codons à traduire d’un ARN messager. Mises à part quelques
exceptions, les codons START et STOP sont bien déterminés : AUG pour le codon START,
UAA, UAG et UGA pour le codon STOP. L’enchaı̂nement ininterrompu de codons effectivement

13
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG
(a) Structure primaire.

(b) Structure secondaire.

(c) Structure tertiaire.

Fig. 1.8 – Structure de l’ubiquitine d’Homo sapiens. Les hélices alpha sont en rouge, les
feuillets bêta en jaune.

Fig. 1.9 – Le code génétique universel. Couleurs inspirées de RasMol.

Fig. 1.10 – Traduction du début d’un gène codant pour la poly-ubiquitine C. Source : Ref-
Seq, Homo sapiens, NM 021009.

14
 1.2. Les ARN codants

traduits correpond à la séquence codante d’un ARN messager et est appelé le cadre ouvert
de lecture.
Même si l’immense majorité des organismes vivants utilisent le code génétique standard,
on note toutefois quelques exceptions à cette règle chez certains organismes pour lesquels
les acides aminés codés ne sont pas les mêmes. Par exemple, chez les champignons Candida,
le codon CUG habituellement traduit par la leucine correspond à la sérine, ou encore chez
certains procaryotes où le codon STOP UAG code parfois pour un acide aminé supplémentaire,
la pyrrolysine.

1.2.3 La régulation de la transcription

L’orchestration de la traduction est avant tout conduite par la présence de signaux or-
ganisés dans l’ARN messager à traduire. La plupart de ces signaux sont des motifs ca-
ractéristiques qui permettent la fixation d’autres molécules. Parmi ces molécules, une par-
tie sont requises pour la traduction effective en protéine, alors que d’autres participent à sa
régulation.
La figure 1.11 représente de manière schématique l’organisation d’un ARN messager ma-
ture codant pour une protéine. Le cadre ouvert de lecture est flanqué de deux régions qui
ne sont pas traduites mais qui contiennent des signaux nécessaires à la machinerie traduc-
tionnelle. Certains sont communs à tous les ARN messagers, d’autres signaux sont variables
d’un ARN à un autre et sont le plus souvent impliqués dans la régulation de la traduction.
La région 5′ non traduite contient notamment le site de fixation du complexe responsable de
la traduction nommé le ribosome. Chez les procaryotes, la séquence du site de fixation du
ribosome a pour forme canonique AGGAGGU, et est également connue sous le nom de séquence
de Shine Dalgarno.

Fig. 1.11 – Organisation d’un ARN messager mature.

La région 3′ non traduite d’un ARN messager contient le signal de poly-adénylation utilisé
lors de la maturation, mais également des sites de fixation pour des protéines dont le rôle est
d’orienter vers sa destination finale dans la cellule l’ARN messager puis la protéine produite.
Les régions 5′ et 3′ non traduites peuvent en sus comporter d’autres signaux pour la régulation
traductionnelle, c’est-à-dire des sites destinées à la fixation d’autres molécules venant activer
ou au contraire éteindre la traduction.
La traduction est un processus séquentiel et linéaire. Certains éléments dans l’ARN mes-
sager peuvent parfois perturber la lecture des triplets par le ribosome allant jusqu’à entraı̂ner
un glissement du ribosome d’une ou plusieurs bases “en avant” ou “en arrière”. Le glisse-
ment du ribosome induit un changement de cadre de lecture, également appelé frameshift.
Ce processus est induit par certaines répétitions ou motifs dans la séquence souvent accom-
pagnés d’une petite structure locale formée par l’ARN messager. Bien qu’il s’agisse le plus
souvent d’une erreur, le glissement du ribosome peut être une action programmée. Plusieurs

15
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

études mettent en évidence des changements de cadre de lecture programmés chez les virus,
les éléments transposables (section 1.4.2) [Jac88, GA96].

1.3 Les ARN non-codants

A l’inverse des ARN messagers issus de la transcription de gènes codants, les ARN non-
codants issus de la transcription de gènes à ARN n’ont pas vocation à coder pour des protéines.
Les ARN non-codants assurent diverses fonctions pour la plupart déterminées par la structure
spatiale qu’adopte la molécule d’ARN en se repliant sur elle-même. Les ARN non-codants qui
ne se replient pas de manière spécifique s’associent le plus souvent à d’autres molécules telles
ques des protéines pour former des complexes. Les fonctions de ces ARN “non-structurés” sont
alors en lien étroit avec leur séquence. Dans la suite de cet ouvrage, nous nous intéressons
essentiellement aux ARN non-codants qui adoptent une structure caractéristique que nous
tentons de prédire par des moyens informatiques.

1.3.1 La structure de l’ARN

Contrairement à l’ADN, l’ARN est une molécule simple brin qui a la capacité de se replier
sur lui-même permettant ainsi à ses bases de s’apparier entre elles. Ces appariements se font
de manière contiguë pour former des tiges. Les régions non appariées forment alors des boucles
(figure 1.12).

tige
A
A C U C G
G

U
U G A G C A G boucle

Fig. 1.12 – Exemple de formation d’une tige-boucle.

(a) Tiges emboı̂tées. (b) Tiges juxtaposées.

Fig. 1.13 – Conformations possibles des tiges des structures secondaires.

Une structure est décrite par une classification en quatre niveaux hiérarchiques :
– la structure primaire est simplement la séquence, orientée de 5′ en 3′ , des bases qui
composent la molécule ;

16
 1.3. Les ARN non-codants

– la structure secondaire est l’ensemble des appariements sans croisement, formant des
tiges emboı̂tées ou juxtaposées comme illustré sur les schémas de la figure 1.13 ;
– la structure tertiaire est l’ensemble de tous les appariements. En plus des appariements
de la structure secondaire, les appariements suivants sont donc autorisés : les pseudo-
nœuds (appariements chevauchants), les triplets (appariements à trois), les quadruplets
(à quatre) et les appariements isolés ;
– la structure spatiale désigne la configuration de la molécule dans l’espace, généralement
en interaction avec d’autres molécules.
La figure 1.14 présente les différentes manières usuelles de représenter les structures d’ARN
selon cette hiérarchie. La figure 1.15 montre la structure tertiaire d’un ARN ribosomique 18S
de levure.
La stabilité d’une molécule d’ARN est mesurée par son énergie libre qui est issue des
principes de la thermodynamique. Plus l’énergie libre d’une structure est faible, plus celle-
ci est stable. Les tiges stabilisent une structure, tandis que les boucles la déstabilisent. La
stabilité apportée par une tige est fonction de sa longueur et de la nature de ses appariements :
les appariements canoniques (G≡C, A=U et G=U) sont plus stables que les appariements non
canoniques (G−A, C−U, . . .). Toutes ces caractéristiques sont reprises dans le modèle d’énergie
libre de Turner [TSF88, MSZT99].
La description d’une structure secondaire ou tertiaire d’un ARN par la simple énumération
de ses appariements peut s’avérer insuffisante pour décrire les interactions avec d’autres
molécules. Ces interactions font intervenir des motifs particuliers dont la description requiert le
plus souvent l’utilisation d’une représentation plus fine. A cet effet, la classification de Leontis-
Westhof [LW01] a largement été adoptée par la communauté pour la description d’intéractions
tridimensionnelles caractéristiques. L’observation de structures tridimensionnelles réelles a no-
tamment permis l’élaboration de la base de données Scor [KTHB02] contenant plus de 8 000
motifs récurrents.

1.3.2 Les familles d’ARN non-codants

Actuellement, plus de 600 familles d’ARN non-codants sont connues et répertoriées dans
des banques de données publiques généralistes comme Rfam [GJBM+ 03, GJMM+ 05], Non-
code [CBG+ 05] et fRNAdb [KYT+ 07, MYH+ 08], ou dans des banques plus spécifiques
dédiées à certaines familles d’ARN non-codants ou d’organismes. Les ARN non-codants in-
terviennent dans de nombreux processus essentiels de la cellule. En 1978, le premier ARN
présentant des propriétés catalytiques a été découvert, couplé à une protéine, la ribonucléase
P (RNase P). Cette découverte décisive d’ARN aux propriétés catalytiques, les ribozymes, a
été couronnée par un prix Nobel de chimie en 1989 [SKBA78]. Plus récemment, plusieurs
études ont révélé l’existence de nombreux petits ARN [Edd01, HSP05, WPK+ 07]. Déjà en
1979, de petits ARN inconnus avaient été isolés [LS79]. Ces ARN forment un complexe avec
une protéine, le complexe ribonucléoprotéique (RNP), responsable de l’altération de certains
ARN messagers. Ces ARN ont par la suite été nommés petits ARN nucléaires (snRNA) car on
les trouve exclusivement dans le noyau des cellules, lieu de la transcription. En 1997, d’autres
petits ARN ont été trouvés dans le nucléole, un pseudo-compartiment du noyau [MH97]. Ces
petits ARN nucléolaires (snoRNA), servent à guider une enzyme vers une base précise d’un
ARN ribosomique à modifier. A ce jour, deux sous-familles sont connues : les petits ARN
nucléolaires à boı̂te C/D et à boı̂te H/ACA. Chacune est caractérisée par un motif qui guide
avec précision l’enzyme vers la base qu’elle doit modifier. En 2001, une famille d’ARN im-

17
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

GUAUCUCGCACGGUUACACCCCAUCCUUCGGGAGGGCUUUAGGGGUGUGCUG
GAAGCACCACCGGACAGCCGGAACAUUGCCGAAAGGCAGCCC
(a) Structure primaire.
60

C A C C A
40 G C
A C
U U A G
U G G
C
A G A
G
G 50 U C
G G G
C G U C A
G C C G U
A A C A G G
U C A U C 70
G C 20

G U C
C
30 G G G
U
C U G G
C A
A A
10 C C
G A
C U
U G U 80
C C A
U C G
A U G C C
90 C
G C
5’ G G

A A
A

(b) Structure secondaire.

GUAUCUCGCACGGUUACACCCCAUCCUUCGGGAGGGCUUUAGGGGUGUGCUGGAAGCACCACCGGACAGCCGGAACAUUGCCGAAAGGCAGCCC
(c) Structure secondaire sous forme arc-annotée.

(d) Structure tertiaire.

Fig. 1.14 – Structures de l’ARN. Exemple d’un élément non traduit structuré de l’ARN
génomique du Tombusvirus. Source : Rfam, RF00176.

18
 1.3. Les ARN non-codants

Fig. 1.15 – L’ARN ribosomique 18S de Saccharomyces cerevisiae.

19
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

pliquée dans la régulation de la traduction, les micro ARN, a été découverte grâce à une
approche bio-informatique, l’analyse comparative de génomes, confirmée par des méthodes
plus classiques de biochimie [Ruv01].

1.4 L’évolution des acides nucléiques

Qu’il soit codant ou non-codant, la fonction d’un ARN est déterminée par la séquence de
ses bases, identique, au moins par morceaux, à celle du gène dont il est issu. Néanmoins, pour
un ARN non-codant ou une protéine donnée, la séquence du gène correspondant n’est pas
nécessairement identique d’un organisme à un autre, d’un individu à un autre. A l’origine de
cette diversité : l’évolution. Au fil des générations d’une population d’individus, et sous l’effet
de facteurs extérieurs, les séquences des gènes évoluent. L’évolution des séquences nucléiques
est ainsi le moteur de l’évolution des espèces.

1.4.1 Généralités
L’évolution est causée par la présence de variations parmi les traits héréditaires d’une
population, et par divers mécanismes qui favorisent la propagation de certains traits plutôt que
d’autres. Par la sélection naturelle, les traits héréditaires favorisant la survie et la reproduction
des individus d’une population voient leurs fréquences croı̂tre d’une génération à l’autre. La
pression de sélection correspond à un ensemble de contraintes environnementales auxquelles
est assujettie une population d’individus, comme par exemple la composition chimique d’un
milieu.
D’un point de vue génétique, l’évolution des espèces, guidée par la sélection naturelle et
la pression de sélection, est engendrée par une évolution des séquences génomiques. Plusieurs
mécanismes sont impliqués dans l’apparition de mutations dans les séquences génomiques,
c’est-à-dire des altérations induites ou spontanées des acides nucléiques.

1.4.2 Les mécanismes de l’évolution

Quelque soit l’origine des mutations, les conséquences varient en fonction non seulement
de leur nombre, mais également des positions altérées et de la nature même des changements
opérés. Nous allons distinguer deux classes de transformations : les transformations macro-
scopiques “visibles” à l’échelle génomique, et les transformations microscopiques qui altèrent
le contenu même des séquences.

A l’échelle génomique
Essentiellement trois familles de mécanismes interviennent dans l’évolution des acides
nucléiques à l’échelle génomique : les transferts horizontaux, les éléments transposables et
les recombinaisons chromosomiques. Ces mécanismes sont étroitement liés à la plasticité du
génome et produisent des insertions et/ou des délétions de séquences plus ou moins longues
de nucléotides dans l’ADN, soit délibérément, soit par erreur.
Un transfert horizontal est une intégration d’un fragment d’ADN au sein du matériel
génétique d’un organisme. Il peut prendre trois formes : la transformation, la conjugaison et
la transduction. La transformation consiste pour un organisme à insérer dans son génome du
matériel génétique présent dans son environnement proche. Ce matériel peut, par exemple,

20
 1.4. L’évolution des acides nucléiques

provenir d’un autre organisme mort dont l’ADN s’est retrouvé “libéré”. Les transferts ho-
rizontaux concernent principalement les organismes procaryotes mais ont déjà été observés
chez des eucaryotes unicellulaires comme les levures et les champignons. Comme son nom l’in-
dique, la conjugaison bactérienne ne s’applique qu’aux bactéries. Ce processus est un échange
unidirectionnel de matériel génétique d’une bactérie vers une autre bactérie. Après avoir re-
copié une portion de son ADN, appelée plasmide, une bactérie transfère cette copie à une
autre bactérie par le biais d’un canal chimique. Une fois transmise, cette copie peut ou non
être intégrée dans le génome de la bactérie receveuse. Le dernier type de transfert horizontal
est la transduction. L’intégration de matériel génétique étranger est ici réalisée par un virus.
Tous les virus ont un cycle lytique, ou infectieux, pendant lequel ils injectent leur matériel
génétique. La machinerie cellulaire de l’hôte est alors détournée pour produire des copies du
virus jusqu’à ce que la cellule hôte éclate. Chaque copie produite peut alors infecter une autre
cellule et soit suivre un nouveau cycle lytique, soit suivre un cycle lysogénique. Lors d’un
cycle lysogénique, le matériel génétique du virus s’intègre au matériel génétique de l’hôte qui
le transmet à ses descendants. Durant le cycle lytique du virus, une partie de l’ADN de l’hôte
peut être “emportée” avec une copie de l’ADN du virus. S’il s’en suit un cycle lysogénique,
alors le fragment d’ADN emporté est intégré au matériel génétique de l’hôte en même temps
que l’ADN du virus, ce qui constitue la transduction.
Un élément transposable est une séquence capable de se déplacer et/ou de se multiplier de
manière autonome dans un génome. On distingue couramment deux types d’éléments trans-
posables selon leur mode de transposition : les éléments à ARN, ou de classe I, et les éléments
à ADN, ou transposons de classe II. Les éléments de classe I, présents uniquement chez les
eucaryotes, fonctionnent selon le principe du “copier-coller”, c’est-à-dire qu’ils ne se déplacent
pas dans un génome mais qu’une copie de l’élément est insérée ailleurs dans le génome. Ce
processus, appelé transposition réplicative, fonctionne en trois temps : la séquence génomique
de l’élément est transcrite en ARN, puis l’ARN synthétisé est rétro-transcrit en ADN, et ce
fragment d’ADN est finalement inséré dans le génome. Les éléments de classe I sont ainsi
appelés rétro-transposons ou rétro-posons. Les éléments de classe II, également appelés trans-
posons, peuvent être sujets à une transposition réplicative ou conservative. La transposition
conservative suit alors le principe du “couper-coller”, c’est-à-dire que l’élément transposable
est excisé du génome puis réinséré ailleurs. Quelque soit la nature de la transposition, celle-
ci ne se fait pas de manière aléatoire, mais au niveau d’un court motif spécifique dans la
séquence génomique. Toutefois, l’identification du site peut être approximative provoquant
l’excision ou l’insertion d’un fragment de séquence voisin de l’élément transposable lors d’une
transposition.
Les recombinaisons chromosomiques interviennent exclusivement chez les organismes eu-
caryotes durant la reproduction sexuée des espèces, et plus particulièrement au cours de la
méı̈ose, c’est-à-dire la division d’une cellule permettant d’obtenir quatre cellules sexuelles.
Les recombinaisons assurent le brassage génétique par la formation de nouvelles combinai-
sons génétiques, essentielles à la diversité d’une population et à l’évolution des espèces. Il
existe deux principes complémentaires de recombinaisons chromosomiques : les recombinai-
sons inter-chromosomiques et les recombinaisons intra-chromosomiques. La recombinaison
inter-chromosomique désigne la séparation aléatoire des chromosomes homologues d’une cel-
lule au cours de sa méı̈ose. Etant donné une cellule comportant n paires de chromosomes
homologues, la méı̈ose de cette cellule produit quatre cellules comportant chacune un exem-
plaire de chaque paire. Le nombre de combinaisons de chromosomes possibles est donc de

21
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

2n ce qui, pour une cellule humaine composée de 23 paires de chromosomes, représente plus
de huit millions de combinaisons. La recombinaison intra-chromosomique, également appelée
enjambement, est un échange de segments entre deux chromosomes homologues au niveau de
sites précis des chromosomes, appelés chiasmas. On dénombre en moyenne entre un et cinq
sites possibles entre deux chromosomes homologues. La recombinaison intra-chromosomique
peut-être déséquilibrée, c’est-à-dire qu’un fragment d’ADN peut être inséré ou au contraire
délété dans les chromosomes. Dans ce cas, les conséquences varient selon la longueur du
fragment inséré ou délété, mais surtout de la région affectée.

A l’échelle nucléotidique
Les mécanismes décrits précédemment ont des conséquences à l’échelle des génomes en
provoquant des insertions ou des délétions de fragments de séquences entiers relativement
longs. Les mécanismes auxquels nous allons maintenant nous intéressés sont plus discrets et
portent sur l’insertion, la délétion et la substitution, c’est-à-dire le remplacement, de quelques
nucléotides.
Les insertions de nucléotides peuvent être le résultat de duplications de certains fragments,
à l’image des transpositions réplicatives à l’échelle du génome. Certains facteurs extérieurs
peuvent également à l’origine d’insertion ou la délétion de nucléotides, telle que l’exposition
à des rayons ultraviolets par exemple.
Les substitutions de nucléotides peuvent être classées en deux groupes : les transitions et
les transversions. Une transition est une substitution d’une purine par une autre purine, ou
d’une pyrimidine par une autre pyrimidine, tandis qu’une transversion est une substitution
d’une pyrimidine par une purine ou inversement. La transition d’un C en U est un phénomène
fréquent résultant de la dégradation spontanée par désamination de la cytosine. Cette modi-
fication est réversible grâce à un processus qui détecte l’uracile dans l’ADN. Cependant si la
réparation n’est pas effectuée avant la prochaine réplication de l’ADN, la guanine appariée à
la cytosine d’origine sur le brin opposé est substituée par une adénine lors de la réplication,
et l’uracile remplacée par une thymine. Le second type de mutation spontanée est lié au di-
nucléotide 5′ –CG, appelé un “point chaud”, car il est l’objet de fréquentes mutations lorsque
la cytosine en 5′ est sous sa forme méthylée. La désamination de la méthylcytosine produit
en effet une thymine, qui ne peut alors être reconnue par aucun mécanisme de réparation. Le
troisième type de mutation spontanée est l’oxydation des nucléotides par les radicaux libres
de l’oxygène, sous-produits du métabolisme oxydatif normal des cellules. Une guanine oxydée,
par exemple, s’apparie à tort avec une adénosine induisant une transversion de G-C en T-A.
Les probabilités d’apparition, de conservation et de transmission d’une mutation sont les
objets de nombreuses études [Rus93, Cro97, DCCC98]. Dans le cadre de nos travaux, nous
nous sommes plus particulièrement intéressés aux mutations dans les séquences des gènes
codants et des gènes à ARN car sous la pression de sélection, ces mutations suivent certains
schémas à l’origine de biais locaux.

1.4.3 L’évolution des gènes codants

Au cours de l’évolution, les séquences fonctionnelles d’un génome sont soumises à la pres-
sion de sélection. Pour les séquences codantes, cette pression de sélection porte sur la fonction-
nalité de la protéine produite. Les mutations dans une séquence codante ont en particulier
des effets très variables sur la protéine codée.

22
 1.4. L’évolution des acides nucléiques

Les substitutions dans une séquence codante sont classées en trois catégories en fonction
de leur impact sur le codon modifié :
– une mutation faux-sens : le codon affecté ne code plus pour le même acide aminé. L’im-
pact de ce type de mutation sur la protéine produite dépend du rôle de l’acide aminé
original dans la protéine et de l’acide aminé qui lui a été substitué. On parle parfois
de mutation synonyme lorsque le nouvel acide aminé codé a des propriétés physico-
chimiques proches de l’acide aminé codé avant la mutation (section 1.2.1) ;
– une mutation non-sens : le codon affecté ne code plus pour un acide aminé mais pour
un codon STOP. La protéine produite est alors tronquée comme cela peut se produire
avec une insertion ou une délétion décalante ;
– une mutation silencieuse : l’acide aminé codé reste le même, donc cette mutation n’a
aucune conséquence sur la protéine codée. Ce type de substitution est rendu possible
grâce aux nombreuses redondances dans le code génétique. Cette propriété est également
appelée dégénérescence du code génétique.
Une insertion ou une délétion dans une séquence codante peut allonger ou réduire la
longueur de la protéine codée. En particulier, on parle de mutation décalante si la séquence
insérée ou supprimée provoque un changement de cadre de lecture, c’est-à-dire lorsque la
longueur de la séquence en question n’est pas multiple de trois. Le plus souvent, une mutation
décalante entraı̂ne l’apparition d’un codon STOP prématuré dans le cadre de lecture, ce qui a
pour effet de produire une protéine tronquée lors de la traduction. Dans la plupart des cas, la
protéine ainsi tronquée n’est plus capable d’assurer sa fonction. Il existe des exemples où ce
type de mutation n’est pas létal et peut même conférer un avantage significatif aux individus
qui en sont porteurs, comme par exemple le variant CCR5-∆32 du gène CCR5 [GS03]. Le
gène CCR5 code pour une protéine qui se trouve à la surface de certaines cellules, notamment
des cellules immunitaires, servant de récepteur à chemokine. Le variant ∆32 du gène CCR5
est issu de la délétion décalante de 32 nucléotides dans le gène et dont la traduction génère
une protéine plus courte incapable d’assurer son rôle. Cependant, cette mutation prodigue
aux individus porteurs une immunité naturelle à certains virus comme la petite variole et le
HIV car ces virus sont alors incapables d’infecter les cellules immunitaires dont les récepteurs
à chemokine sont absents ou non fonctionnels. Le variant CCR5-∆32 est largement répandu
de nos jours en Europe où il touche entre 5 et 14% de la population, mais est beaucoup plus
rare en Afrique ou en Asie. L’hypothèse la plus vraissemblable est que ce variant a fait l’objet
d’une sélection naturelle au cours de la pandémie de peste noire qui a décimé plus d’un tiers
de la population européenne au XIVème siècle, les porteurs du variant CCR5-∆32 étant alors
plus résistants que les autres à la maladie.

1.4.4 L’évolution des gènes à ARN

A l’instar des séquences codantes, les séquences non-codantes fonctionnelles sont soumises
à la pression de sélection. Pour les séquences d’ARN non-codants, la pression s’exerce à
plusieurs niveaux : la conservation de la structure pour les régions appariées, et la conservation
de la séquence pour les régions non appariées correspond à des sites d’interaction avec d’autres
molécules.
Pour les bases appariées, la substitution d’une base par une autre peut avoir deux
conséquences : soit l’appariement est préservé, soit il est rompu. Lorsque deux bases appariées
sont individuellement substituées, mais que ces substitutions préservent l’appariement, on
parle de mutations compensées, ou mutations compensatoires.

23
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

Toutefois, contrairement aux mutations silencieuses dans les régions codantes qui n’ont
aucun effet sur la protéine codée, les substitutions qui préservent les appariements modifient
la stabilité locale et globale de la molécule. Par exemple, pour deux bases appariées G et C, la
transition de C en T peut préserver l’appariement puisque G et T peuvent s’apparier mais ce
nouvel appariement est moins stable que l’appariement original. Au delà de la stabilité des
structures d’ARN c’est la conformation spatiale locale et globale de la structure de l’ARN qui
est soumise à la pression de sélection. Au voisinage de certains motifs structuraux, certains
nucléotides, appariés ou non, sont en effet exposés d’une manière particulière. La conformation
de ces nucléotides est le plus souvent primordiale à la fonction de la molécule. Les séquences
de ces motifs structuraux, au même titre que les régions non appariées, sont donc contraintes
d’être conservées.

1.5 L’analyse comparative de séquences nucléiques

Au cours de l’évolution, les séquences nucléiques subissent des transformations et des
remaniements à différentes échelles. L’étude a posteriori de ces événements évolutifs fait appel
à l’analyse comparative de séquences dont le principe est d’extraire de l’information des
ressemblances et des différences observables entre plusieurs séquences. L’analyse comparative
est largement plébiscitée pour établir des phylogénies, c’est-à-dire le parcours évolutif et les
liens de parenté entre des espèces, pour transférer des informations connues d’une espèce
à une autre ou encore pour inférer de l’information à un ensemble de séquences supposées
partager une fonction commune.
L’analyse comparative de séquences s’appuie presque systématiquement sur un alignement
des séquences à analyser. Dans la section 1.5.1, nous introduisons les bases en matière d’ali-
gnement de séquences nécessaires à la bonne compréhension de la suite de cet ouvrage. Par
la suite, nous nous intéressons plus spécifiquement à l’utilisation d’alignements dans le cadre
d’une analyse comparative de séquences codantes et de séquences partageant une structure
commune (section 1.5.2). Enfin, nous présentons dans la section 1.5.3 un nouvel objet pour
l’analyse comparative, les méta-séquences, que nous avons introduit dans le but d’améliorer
l’analyse comparative de séquences hétérogènes en terme de conservation.

1.5.1 L’alignement de séquences comme support de l’analyse comparative

L’alignement de séquences consiste à établir une correspondance maximale entre les
éléments qui les composent. Les algorithmes à même d’accomplir cette tâche de manière
optimale sont issus de la communauté de l’algorithmique du texte. Ces algorithmes ne sont
pas l’objet de cette section centrée sur l’utilisation des alignements dans le cadre de l’analyse
comparative. Pour plus de détails sur ces algorithmes, on pourra se référer au chapitre 4 où
plusieurs sections leurs sont consacrées.
La représentation la plus courante d’un alignement, quelque soit la méthode de construc-
tion utilisée, est une matrice où les bases alignées sont empilées et les insertions/délétions
marquées par un tiret. Parfois, les séquences alignées sont séparées par des symboles qui fa-
cilitent la lecture de l’alignement : l’identité entre deux éléments est marquée par une barre
verticale, la substitution d’un élément par un autre est marquée par un point. La figure 1.16
présente un alignement semi-global de deux séquences nucléiques.
Toute une terminologie permet de décrire les ressemblances entre séquences selon différents

24
 1.5. L’analyse comparative de séquences nucléiques

AAN33049 1 CGAATGCCAGGCCCAGCCCTCA---CCTCTCGCTCCGCAGGGGGGAGTCG 47
||| ||||..|| ..||||||||| ||.||
AAA31576 1 ATG--------AGCCGGCAGAGTATCTCGCTCC--------GATTC- 30

AAN33049 48 CCTGCACCGGTGGCCGCTGCTCCTGCTGCTGCTGCTGCTGC-TCCC---- 92
||||||||.||.|||||||||..|| | ||||
AAA31576 31 -------------CCGCTGCTTCTCCTGCTGCTGTCGC--CATCCCCCGT 65

AAN33049 93 -------GCCGCCCCCGGTCCTGCCCGCG-----GAAGCC 120

||.|.||||||..| ||||||| |||.||
AAA31576 66 CTTCTCAGCGGACCCCGGGGC-GCCCGCGCCAGTGAACCCCTGCTGTTAC 114

Fig. 1.16 – Exemple d’alignement semi-global entre deux fragments de séquences homologues
de gènes codants pour la prostaglandine dont le pourcentage d’identité est de 44,9%.

points de vue : la similarité, l’identité et l’homologie. L’identité désigne la proportion de

nucléotides ou d’acides aminés identiques entre deux séquences. Elle est souvent exprimée
en pourcentage et s’obtient en calculant le ratio entre le nombre de nucléotides ou d’acides
aminés identiques et la longueur de l’alignement. La similarité désigne la proportion de sub-
stitutions, identités incluses, entre deux séquences alignées par rapport à la longueur de l’ali-
gnement. L’homologie a une connotation évolutive : deux séquences sont dites homologues si
elles sont issues d’un même ancêtre commun et partagent une même fonction. La similarité
est un indicateur d’homologie : on considère qu’une similarité significative est signe d’homo-
logie. L’inverse n’est cependant pas vrai : une absence de similarité significative entre deux
séquences n’implique pas nécessairement que ces séquences ne soient pas homologues.
Construire un alignement de deux ou plusieurs séquences est toujours possible. Sans
connaissance a priori sur la nature des séquences, l’exactitude d’un alignement est variable
en fonction du degré de similarité des séquences à aligner : plus les séquences sont similaires,
meilleur sera leur alignement, et inversement pour des séquences divergentes. Pour que les
résultats apportés par une analyse comparative de séquences menée à partir d’un alignement
fassent du sens, il est nécessaire que l’alignement employé soit fiable.

1.5.2 L’analyse de séquences codantes et de séquences structurées

L’analyse comparative de séquences nucléiques est de plus en plus employée à des fins
prédictives, par exemple pour déterminer si des séquences sont des séquences codantes homo-
logues, ou si elles partagent une structure commune. Sans connaissance a priori sur la fonction
des séquences, les aligner semble un bon point de départ. Sur l’alignement, on devrait voir
apparaı̂tre des mutations dont l’analyse permettra de déterminer si elles sont ou non corrélées
à la conservation d’une fonction particulière. Pour illustrer notre propos, nous avons produit
deux alignements de séquences homologues reportés sur la figure 1.17.
La sous-figure (a) de la figure 1.17 présente un alignement de deux fragments de séquences
codantes homologues. Les séquences d’acides aminés codées par chacune des séquences sont
également reportées. Sur cet alignement, on peut clairement voir apparaı̂tre les mutations
silencieuses et synonymes entre les codons car les bases de chaque séquence sont ici correc-
tement alignées avec leurs homologues dans l’autre séquence. Sans connaissance a priori de
la nature de ces séquences nucléiques ni des séquences d’acides aminés qu’elles codent, cet
alignement constitue donc un support fiable pour une analyse comparative dont le but est de
prédire la séquence conservée d’acides aminés.

25
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

(a) Alignement correct de deux fragments de séquences codant pour une prostaglandine dont le pourcentage
d’identité est 77,8%.

AE008837.1 CGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGGUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAA
||||||||.|||||| .||||||||||.|||||||||||||||.||||||..|||||.|.|||.||||||||||
X16759.1 CGCGGGGUAGAGCAG-UUGGUAGCUCGCCGGGCUCAUAACCCGGAGGUCGCAGGUUCGAGUCCUGCCCCCGCAA

(b) Alignement correct de deux séquences d’ARN de transfert dont le pourcentage d’identité est de 86,5%.

Fig. 1.17 – Deux alignements semi-globaux optimaux corrects de séquences codantes homo-
logues (a) et de séquences partageant une structure commune (b).

26
 1.5. L’analyse comparative de séquences nucléiques

La sous-figure (b) de la figure 1.17 présente un alignement de séquences homologues d’ARN

de transfert. Les structures secondaires individuelles de chaque séquence sont également re-
portées sous forme arc-annotée. Sur cet alignement se produit le phénomène analogue à celui
précédemment observé sur l’alignement des séquences codantes : les bases appariées de chaque
séquence sont bien alignées avec leurs homologues dans l’autre séquence. Les mutations qui
préservent les appariements, compensées ou non, sont ainsi clairement révélées. Sans connais-
sance a priori de la nature de ces séquences ni de leurs structures secondaires, cet alignement
constitue donc un support de qualité pour une analyse comparative dont le but est de prédire
la structure conservée.

1.5.3 Mise en œuvre bio-informatique

Sans en apporter la preuve ici, le raisonnement appliqué précédemment sur des alignements
de deux séquences reste valable pour des alignements de plus deux séquences. Intuitivement,
plus on dispose de séquences homologues à comparer, plus on détient d’information à même
de servir l’analyse comparative, quel qu’en soit l’objectif. Traditionnellement, une analyse
comparative portant sur un ensemble de plusieurs séquences s’appuie sur un alignement mul-
tiple de ces séquences. Selon le degré de conservation, l’alignement multiple n’est cependant
pas toujours un support pertinent pour analyser un ensemble de séquences.

Degré de conservation et alignement

Les exemples présentés dans la section 1.5.2 impliquent des couples de séquences plutôt
bien conservées. En effet, leurs pourcentages d’identité sont supérieurs à 75%, ce qui signifie
que plus de trois quarts de leurs nucléotides sont identiques. Le degré de conservation de ces
deux couples de séquences est suffisamment élevé pour pouvoir les aligner correctement sans
connaissance supplémentaire de leurs fonctions communes. Plus le pourcentage d’identité
entre deux séquences homologues est faible, plus il devient difficile de les aligner sans en
connaı̂tre la nature.
La figure 1.18 présente deux alignements optimaux de couples de séquences homologues
faiblement conservées. Sur l’alignement (a) de séquences codantes homologues, on peut remar-
quer qu’aucun nucléotide de la première séquence n’est correctement aligné avec son homo-
logue dans la seconde séquence, à l’exception des trois derniers. Cet alignement n’est donc pas
correct car il ne révèle aucune des mutations silencieuses et synonymes qui existent pourtant
entre ces séquences quant on connaı̂t les séquences d’acides aminés réellement codées. De plus,
on peut également remarquer que les insertions et délétions introduites durant l’alignement
sont décalantes et interviennent au beau milieu des codons véritablement traduits. Sur l’ali-
gnement (b) de séquences homologues d’ARN de transfert, aucune paire de bases appariées
dans une séquence n’est alignée avec son homologue dans l’autre séquence. Cet alignement ne
laisse donc pas apparaı̂tre les mutations qui préservent les appariements des deux structures
secondaires identiques de ces séquences.
Ces simples exemples sur des couples de séquences montrent qu’un alignement n’est un
support fiable pour une analyse comparative que si les séquences présentent un degré de conser-
vation suffisamment élevé pour être alignées correctement sans information supplémentaire sur
leur nature. Néanmoins, sur des ensembles de plus de deux séquences il n’est pas nécessaire
d’adopter un point de vue binaire en ce qui concerne l’utilisation ou non d’un alignement
multiple. Au sein d’un ensemble de séquences, tous les couples ne présentent en effet pas

27
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

(a) Alignement incorrect de deux fragments de séquences codant pour une intégrine dont le pourcentage d’iden-
tité est 37,8%.

M22657.1 ACUUUUAAAGGAUAGAAGU-----------AAUCCAUU--GGCCUUAGG-----AGCCAAAAAAUUGGUG--------CAACUCCAAAUAAAAGUA--
|| ||||..|| .||.||.|| |.||.|||.||||||| |.||.| |.|.|
K01921.1 -----------------GUCUCUGUGGCGCAAUCGGUUAGCGCGUUCGGCUGUUAACCGAAAGAUUGGUGGUUCGAGCCCACCC-------AGGGACG

(b) Alignement erroné de deux séquences d’ARN de transfert dont le pourcentage d’identité est de 34,7%.

Fig. 1.18 – Deux alignements semi-globaux optimaux incorrects de séquences codantes ho-
mologues (a) et de séquences partageant une structure commune (b).

28
 1.5. L’analyse comparative de séquences nucléiques

nécessairement le même degré de conservation.

Les méta-séquences
Afin d’analyser convenablement les ensembles de séquences hétérogènes en terme de
conservation, nous proposons de créer des sous-ensembles de séquences suffisamment simi-
laires pour pouvoir les aligner de manière fiable. Pour la construction des sous-ensembles de
séquences similaires, nous définissons une représentation des données sous forme de graphe.
Soit S = {s1 , . . . , sn } un ensemble de n séquences nucléiques et id(si , sj ) le pourcentage
d’identité entre deux séquences si et sj . Nous créons ensuite une partition P de S compor-
tant m parties {P1 , . . . , Pm }. Chaque partie Pk est composée d’un sous-ensemble de séquences
de S connectées par la relation de similarité id(si , sj ) ≥ α, où α est un seuil sur le pourcen-
tage d’identité au delà duquel on considère que les séquences présentent un degré de similarité
suffisant. Chaque partie de P est appelée une méta-séquence. Une méta-séquence fait ainsi
référence soit à une seule séquence, soit à un ensemble de plusieurs séquences qui seront
représentées par leur alignement. La figure 1.19 présente un exemple de quatre séquences
regroupées en deux méta-séquences, symbolisées par les parties grisées. Sur cet exemple, le
couple de séquences s1 et s2 d’une part, et le couple s1 et s3 d’autre part, présentent un
pourcentage d’identité supérieur à α. Les séquences s1 , s2 et s3 sont donc regroupées pour
former la partie P1 , et la séquence s4 forme à elle seule la partie P2 .

P1
s1 s2

s4 s3
P2
Fig. 1.19 – Exemple de création de deux méta-séquences à partir de quatre séquences. Chaque
sommet noir correspond à une séquence, les arêtes relient les séquences dont le pourcentage
d’identité est supérieur au seuil α. Les régions grisées correspondent aux méta-séquences
correspondantes.

A l’issue de ce processus, l’ensemble des séquences originales est partitionné en plusieurs

méta-séquences. La comparaison des méta-séquences entre elles dépend de l’analyse compa-
rative à produire. Dans la suite de ce manuscrit, nous présentons deux utilisations des méta-
séquences pour la prédiction par analyse comparative de séquences codantes homologues
(chapitre 2) et de structures secondaires communes (chapitre 3).

29
Chapitre 1. Les Acides RiboNucléiques

30
 Chapitre 2

Recherche de gènes et régions

codantes

Dans ce chapitre, nous abordons le problème de l’identification de régions codantes. His-

toriquement, c’est l’un des premiers problèmes sur lequel s’est penchée la communauté bio-
informatique. Ce problème constitue une partie importante de l’annotation structurale des
génomes : où se trouvent les gènes codant pour des protéines ? Quelle est leur structure ?
Pour répondre à ces questions, les informations utilisées peuvent être de nature différente : la
présence de signaux qui balisent et concourent à la structure du gène et à son expression, le
contenu de la séquence codante qui peut comporter des biais de composition, ou enfin la simi-
larité avec d’autres molécules connues. Nous regroupons ces informations en deux groupes : les
informations intrinsèques, c’est-à-dire les informations contenues dans la séquence nucléique
considérée, et les informations extrinsèques, c’est-à-dire les informations obtenues par com-
paraison de la séquence nucléique d’intérêt avec des séquences déjà connues. Cela donne lieu
à deux types d’approche de prédiction : les approches ab initio et les approches par homo-
logie de séquences. Un bon nombre d’approches ne se contentent pas d’une seule séquence
mais travaillent sur un alignement de deux ou plusieurs séquences. Ces méthodes exploitent
l’information évolutive entre les séquences pour détecter un schéma spécifique de mutations
qui pourrait trahir la présence d’une contrainte fonctionnelle codante (sections 1.4.3 et 1.5).
Nous les regroupons sous le terme générique d’analyse comparative.
Le contenu de ce chapitre est le suivant. Nous commençons par dresser un état de l’art
des principales méthodes de prédiction ab initio en section 2.1, par homologie en section 2.2
et par analyse comparative en section 2.3. Dans la section 2.4, nous présentons ensuite notre
contribution au problème, avec la méthode Protea [FT07, FT09] qui s’inscrit dans le cadre
de l’analyse comparative. La section 2.5 est consacrée à l’exposé des résultats expérimentaux
de Protea.

2.1 Les méthodes ab initio

Les approches ab initio ont pour objectif de prédire l’ensemble des gènes présents dans
une séquence nucléique sans autre connaissance extérieure. Pour cela, elles tirent parti des
signaux présents dans la séquence et des biais de composition des séquences codantes.

31
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

2.1.1 Le cadre ouvert de lecture

Le premier signal qui peut être exploité provient simplement des bornes des gène, en parti-
culier pour les organismes procaryotes. Nous avons vu dans le chapitre précédent (section 1.2)
qu’un élément essentiel d’un gène codant est son cadre ouvert de lecture, débutant par un co-
don START suivi d’un enchaı̂nement ininterrompu de codons et terminé par un codon STOP.
Cette information est souvent suffisante pour identifier un bonne partie des gènes au niveau
génomique quand le cadre ouvert de lecture est significativement long. L’absence de codon
STOP peut cependant être statistiquement peu significative pour des séquences courtes ou
lorsque la fréquence de ces codons est localement fortement réduite. A cause de l’épissage
chez les eucaryotes et certaines bactéries, rechercher au niveau génomique un codon STOP
après un codon START dans le même cadre de lecture n’a pas de sens à cause de la présence
des introns [Fic95].

2.1.2 Les autres signaux liés à la structure du gène

Des signaux plus fins que la détection d’un cadre ouvert de lecture peuvent être utilisés
pour identifier les séquences codantes. Nous avons vu que toute une batterie de signaux
balisent et concourent à la structuration d’un gène, que celui-ci soit d’origine eucaryote ou
procaryote (section 1.2). Ces signaux interviennent dans les processus mis en œuvre lors de
l’expression du gène. Les régions en amont et en aval de la région codante des gènes contiennent
ainsi des sites de fixation de facteurs de transcription, le site d’initiation de la transcription,
le signal de poly-adénylation, . . . Chez les eucaryotes, d’autres signaux sont présents dans la
région codante des gènes et servent à guider l’épissage des introns.
La grande majorité de ces signaux sont des motifs relativement courts, dont la lon-
gueur est inférieure à une vingtaine de nucléotides. Ce sont des motifs approchés, établis
à partir d’un certain nombre d’observations. Ils doivent donc être décrits au moyen d’une
représentation plus flexible qu’une simple séquence. Cela pose la question du modèle choisi
pour les représenter.
L’une des premières représentations adoptée est la matrice poids-position, ou PWM pour
Position Weight Matrix. La PWM associée à un motif contient pour chaque position du motif
la probabilité d’apparition de chacun des quatre nucléotides. Sur la figure 2.1 sont représentées
sous forme graphique deux PWM qui correspondent à des sites d’épissage.
La représentation par PWM est parfois insuffisante pour décrire certains signaux car
elle ne capture aucune relation entre les positions d’un motif : les positions sont considérées
comme indépendantes. Une représentation plus riche a donc été proposée : le modèle poids-
tableau, également appelé WAM pour Weight Array Models. Les WAM s’appuient sur un
théorie fréquemment utilisée dans l’analyse de séquences biologiques : les modèles de Mar-
kov [DEKM99].
Dans le cadre de la découverte de motifs dans une séquence nucléotidique, un modèle de
Markov d’ordre k peut être succinctement défini comme un processus stochastique dans lequel
la probabilité d’occurrence d’un nucléotide à une position donnée dépend uniquement des k
positions précédentes. En pratique, un WAM qui décrit un motif de longueur k est modélisé
par un modèle de Markov k-périodique d’ordre k − 1, c’est-à-dire un ensemble de k modèles
de Markov d’ordre k − 1. Construire un tel modèle revient à déterminer toutes les probabilités
conditionnelles du modèle. Par exemple, pour un modèle d’ordre 1 : quelle est la probabilité
d’observer un A à une position donnée sachant que le nucléotide précédent est un C ? Pour

32
 2.1. Les méthodes ab initio

Source http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0703773104

Fig. 2.1 – Représentation graphique de deux PWM décrivant les sites d’épissage. La fréquence
de chaque nucléotide à une position est proportionnelle à la taille dans la lettre qui le
représente. Sur la représentation du site donneur, à gauche, on voit clairement apparaı̂tre une
séquence consensus qui caractérise le début de l’intron GT. On remarque le même phénomène
pour le site accepteur qui marque la fin des introns et qui est caractérisé par la séquence
consensus AG.

obtenir ces probabilités, on procède par comptage sur un ensemble d’apprentissage constitué
de séquences contenant le motif à caractériser. Cet ensemble doit contenir suffisamment de
séquences pour que les observations réalisées fassent du sens. De plus, comme la forme des
signaux peut être propre à chaque espèce, il est nécessaire de disposer des séquences de même
provenance, ou dont on est sûr qu’elles sont biaisées de la même manière. Un modèle construit
sur une espèce ne pourra donc pas être directement appliqué à une autre espèce. Toutefois,
certains signaux comme les signaux liés à la transcription sont relativement bien conservés
entre les espèces. Un modèle descriptif d’un signal peut donc sous certaines conditions être
transféré d’une espèce à une autre. Plus l’ordre du modèle de Markov est important, plus
la quantité de données d’apprentissage nécessaire est importante. Etant donné que quatre
nucléotides différents sont possibles à une position donnée, il est nécessaire de déterminer
4k+1 probabilités pour un modèle d’ordre k. Une fois le modèle de Markov construit, son
exploitation est assez simple : étant donnés une séquence et un modèle de Markov, on peut
calculer la probabilité que la séquence ait été générée selon ce modèle avec, par exemple,
l’algorithme de Viterbi [Vit67]. A l’heure actuelle, les WAM sont très largement utilisés pour
décrire et détecter les sites d’épissage [TMM07, Sto90, Gel95].

2.1.3 Les biais de composition de la séquence codante

À côté des signaux liés à la structure d’un gène, on peut utiliser la composition de la
séquence codante elle-même [SM82]. De façon générale, les régions codantes ont des asymétries
et périodicités qui facilitent leur distinction des autres régions [GGG80]. Ces caractéristiques
sont propres à chaque espèce. Les premières analyses de régions codantes ont révélé chez
certaines bactéries un biais dans l’usage des codons [GG82]. Du fait de la redondance du code
génétique, des codons différents codent pour le même acide aminé. Pour coder un acide aminé,
plusieurs organismes affichent une préférence marquée pour un ou plusieurs codons. Pour un
organisme, cette préférence est en partie corrélée à l’abondance de copies des gènes d’ARN de
transfert correspondants dans son génome [Ike81b, Ike81a, Ike82]. Plusieurs autres mesures
ont par la suite été testées pour caractériser les régions codantes : la fréquence d’apparition
des nucléotides, des hexamers, la périodicité d’occurrence des nucléotides, . . . L’étude menée
par Fickett [FT92] a permis de mettre en évidence que la fréquence d’apparition des hexamers
est la mesure qui discrimine le mieux les régions codantes.

33
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

La méthode la plus couramment employée pour modéliser les biais de composition en

k-mers des régions codantes est un modèle de Markov 3-périodique d’ordre k − 1. Ce type
de modèle capturent simultanément plusieurs mesures “intuitives” : un modèle 3-périodique
d’ordre 5 capture le biais d’usage des codons mais aussi les dépendances entre les paires de
codons successifs.
L’utilisation de modèles de Markov ne se limite pas qu’à la caractérisation de régions
codantes. Il est ainsi possible de construire des modèles pour les régions introniques, les
régions non traduites ou encore les régions intergéniques. Pour ces régions, les modèles utilisés
sont plus simples car l’information à capturer est moindre : les modèles utilisés sont non
périodiques et d’ordre inférieur à 2. De plus, il est également fréquent de considérer toutes
les séquences qui ne codent pas pour des protéines simultanément et donc de ne construire
qu’un seul modèle de Markov pour les caractériser.

2.1.4 Les mises en œuvre logicielles

Les informations disponibles dans la séquence sont donc multiples, et complémentaires.
Pour les intégrer, chaque méthode ab initio adopte une modélisation plus ou moins fine des
éléments constitutifs d’un gène qui dépend directement de la nature et de la quantité des
signaux pris en compte. Les modélisations les plus simples ne discernent que deux types de
séquences, codantes ou non, tandis que les plus élaborées identifient également les extrémités
transcrites mais non traduites des gènes, les régions introniques, exoniques, le site d’initiation
de la transcription, le site de poly-adénylation, . . . Plus la modélisation est précise, plus la
segmentation de la séquence nucléique sera détaillée [RAG97]. Deux techniques majeures
ont été déployées pour segmenter la séquence nucléique suivant la modélisation [Gui98] : des
algorithmes ad hoc par programmation dynamique et les modèles de Markov cachés.
Les méthodes qui emploient la programmation dynamique pour obtenir une segmenta-
tion de la séquence nucléique se déroulent en deux temps [Sea92, DS94, SS95] : la détection
dans la séquence des éléments constitutifs considérés de manière indépendante, puis la re-
cherche d’un assemblage optimal de ces éléments par programmation dynamique qui res-
pecte des contraintes de dépendances entre les éléments. En fait, un score est attribué à
chaque élément, et un assemblage optimal correspond à une sélection d’éléments compatibles
entre eux dont la somme des scores est maximale. Plusieurs méthodes ab initio se servent
de cette technique, notamment Glimmer [DHK+ 99, SDKW98] pour les procaryotes, et Ge-
neID [PBG00], Fgenes [SS00], Grail [XMU94, XU97], GlimmerM [DBPS07, SPD+ 99]
et EuGène [SMR01] pour les eucaryotes. Les différences entre ces programmes se situent
au niveau des éléments constitutifs considérés et la manière de les détecter. Parmi ces pro-
grammes, EuGène, Glimmer et GlimmerM sont les seuls à intégrer une modélisation du
biais de composition dans les séquences codantes par modèle de Markov périodique. EuGène
est le programme dont la modélisation est la plus détaillée : il distingue les exons, les introns,
les régions intergéniques et les extrémités non traduites des gènes, et dispose d’un modèle de
Markov pour reconnaı̂tre chacune de ces régions.
Bon nombre de méthodes s’appuient sur les modèles de Markov cachés, ou HMM pour
Hidden Markov Model. Dans ce cadre, le modèle de Markov caché permet de segmenter la
séquence en combinant différents modèles de Markov, propre à chaque élément constitutif
du gène. La motivation principale à l’usage de cette technique est l’homogénéité apportée
par la confusion entre la modélisation de la structure du gène, c’est-à-dire l’alternance de
régions, et la caractérisation de ces régions. Par conséquent, pour toutes les méthodes à base

34
 2.2. Les approches par homologie de séquence

de HMM la détection des régions codantes et non codantes est confiée à des modèles Marko-
viens dont les caractéristiques varient selon la nature de la région modélisée. Historiquement,
EcoParse [KMH94] est le premier programme à avoir intégré un modèle de Markov caché.
D’autres ont suivi comme Genie [KHRE96], Fgenesh [SS00], Augustus [SW03, Sta03],
Genie [KHRE96], GeneMark.hmm [LB98, LTHCB05] et Genscan [BK97]. Genscan et
GeneMark.hmm sont les programmes les plus utilisés actuellement pour la richesse de leur
modélisation de la structure des gènes et parce qu’ils ont été paramétrés sur plus d’une cen-
taine d’organismes.

2.2 Les approches par homologie de séquence

Les méthodes par homologie de séquences utilisent comme première et principale source
d’information la similarité avec des séquences connues et déjà annotées. L’hypothèse de travail
est la suivante : deux séquences significativement similaires ont généralement une fonction
identique ou proche (section 1.4.3). En effet, durant l’évolution, les séquences fonctionnelles,
a fortiori les séquences codantes, sont soumises à une contrainte fonctionnelle. Sous cette
contrainte, les séquences codantes tendent à être plus conservées entre les espèces que les
séquences non fonctionnelles. D’après cette assertion, les informations disponibles à propos
d’une séquence connue peuvent être transférées à toute séquence significativement similaire.
Au moins trois types de séquences sont susceptibles d’apporter de l’information pour détecter
des régions codantes dans une séquence nucléique : des séquences de protéines, des séquences
d’ARN ou d’EST et des séquences génomiques annotées.

2.2.1 Similarité avec des séquences peptidiques

La manière la plus simple et la plus utilisée pour déterminer si une séquence nucléique
est codante est de chercher à identifier la protéine qu’elle code, si celle-ci est connue, ou une
protéine homologue dans le cas contraire.
Les banques de données les plus utilisées pour effectuer ce type de recherche sont
SwissProt [BAW+ 05] et Pir [BGH+ 98], car elles contiennent exclusivement des séquences
de protéines vérifiées expérimentalement. En complément, d’autres banques proposent des
séquences d’acides aminés issues de la traduction automatique de séquences codantes.
TrEMBL [HBB+ 02, BAB+ 04] contient ainsi uniquement les traductions automatiques des
séquences annotées codantes du projet Ensembl où toutes les séquences déjà présentes
dans SwissProt sont exclues. Afin de simplifier les recherches, UniProt [Con08] réunit
les banques SwissProt et TrEMBL. Au même titre qu’UniProt, RefSeq [WBB+ 08]
propose des séquences vérifiées expérimentalement et des séquences issues de l’annotation
automatique basée sur les données et l’expertise des membres du NCBI.
Pour effectuer la recherche dans toutes ces banques, on a recours en première approche
à des algorithmes d’alignement deux à deux, tels que Fasta et Blast. Il existe plusieurs
déclinaisons de ces méthodes qui permettent de fouiller une banque de séquences protéiques à
partir d’une séquence nucléique, telles que FastX, FastY et BlastX. L’idée est de compa-
rer indépendamment les six traductions potentielles d’une séquence nucléique contre toutes
les séquences d’acides aminés contenues d’une banque. FastX et FastY diffèrent dans leur
manière de traiter les éventuels décalages du cadre de lecture : FastX ne prend en compte
que les décalages positifs de cadre de lecture (+1 ou +2), tandis que FastY ne considère

35
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

que les décalages négatifs (-1 ou -2). Contrairement à ses homologues, BlastX ne gère pas
les décalages potentiels du cadre de lecture. Enfin, il existe une version enrichie de BlastX,
nommée BlastC [SG94], qui prend en compte dans son système de score les éventuels biais
d’usage des codons connus et avérés. On estime qu’environ 50% des gènes peuvent être iden-
tifiés à partir des séquences présentes dans SwissProt et Pir [MSSR02] à l’aide de ces
outils.
Même lorsque l’on dispose d’une protéine similaire, il est difficile de déterminer la structure
complète d’un gène, particulièrement les bornes des extrémités 5′ et 3′ non traduites. Qui plus
est, l’identification précise de la séquence codante peut également s’avérer incomplète : tous
les domaines protéiques ne sont pas nécessairement partagés, en cas d’épissage alternatif
notamment, et certains exons peuvent ne pas être attrapés à cause de leur petite taille.
La recherche de similarité peut ensuite donner lieu à des traitement plus sophistiqués.
Historiquement, Procrustes [GMP96] est la première méthode de prédiction de gènes à
exploiter la similarité de séquences au niveau peptidique. Etant donnée une protéine simi-
laire à la séquence nucléique d’intérêt, trouvée manuellement par FastX ou BlastX par
exemple, la méthode déployée par Procrustes consiste à aligner la séquence nucléique et la
séquence protéique. Dans un premier temps, Procrustes identifie tous les exons potentiels
en recherchant les bornes exons/introns selon leurs séquences consensus strictes. Les exons
potentiels sont ensuite traduits puis alignés sur la séquence peptidique fournie. Enfin, Pro-
crustes assemble par programmation dynamique un enchaı̂nement d’exons qui maximise le
score de similarité avec la protéine tout en respectant la structure minimale du gène, c’est-
à-dire une séquence codante qui commence par un codon START, ne contient pas de codon
STOP dans le cadre de lecture et se termine par un codon STOP. GeneWise [BCD04] ou
encore GenomeScan [YLB01] effectuent la même tâche que Procrustes. Ces derniers sont
globalement plus tolérants que Procrustes : ils n’interdisent pas strictement les décalages
de cadres de lecture ainsi que les codons STOP dans le cadre de lecture mais ces deux éléments
sont fortement pénalisés. De plus, les sites d’épissage dans GeneWise et GenomeScan sont
détectés à l’aide d’un HMM, fortement inspiré de celui de Genscan. Dans GenomeThrea-
der, les sites d’épissage sont décris par un représentation ad hoc équivalente aux HMM
précédents. La différence entre ces trois programmes réside essentiellement dans l’évaluation
de la similarité entre les séquences : GenomeScan utilise les résultats de BlastX, Gene-
Wise évalue leur similarité à l’aide d’un modèle pair-Markov caché (pair-HMM), et Ge-
nomeThreader utilise un algorithme d’alignement local par programmation dynamique.
ORFGene2 [RMK96] et PredictGenes [GHKB00] sont deux méthodes équivalentes à Ge-
neWise dans la modélisation adoptée. Toutefois elles intègrent la recherche de protéines
similaires en interrogeant la banque SwissProt. Toutes ces méthodes sont destinées à la
prédiction de gènes eucaryotes, en majorité entraı̂nées et testées chez l’Homme, la souris ou des
plantes. Elle ont été conçues pour travailler sur des séquences provenant d’organismes proches.
Elles fournissent d’ailleurs d’excellents résultats sur des séquences très conservées, mais leurs
performances se révèlent moyennes sur des séquences relativement peu conservées [TPP99].

2.2.2 Similarité avec des séquences transcrites

Le second type de séquences auquel on peut faire appel pour identifier des régions co-
dantes sont les séquences d’ARN matures, ou des fragments d’ARN matures. Pour des raisons
expérimentales de séquençage, la majorité des séquences d’ARN présentes dans les banques
de données comme RefSeq [WBB+ 08] ou dbEST [BLT93] se trouvent sous forme d’ADN

36
 2.2. Les approches par homologie de séquence

complémentaires. Ces ADN complémentaires, notés ADNc, sont obtenus par transcription in-
verse d’ARN matures. Il existent plusieurs protocoles pour obtenir les séquences d’ADNc rétro-
transcrits. Le séquençage “classique” d’un ADNc permet d’en obtenir la séquence complète
et ce de manière fiable. Avant que soit mis au point ce protocole, le séquençage des ARN
messagers se faisait par un protocole à haut débit moins fiable. Ce protocole consiste à
séquencer quelques centaines de nucléotides en une seule fois à chaque extrémité d’un ADNc.
Ces fragments nommés des EST, acronyme pour Expressed Sequence Tags, ne représentent
donc qu’une information partielle par rapport à la taille de certains ADNc qui peuvent at-
teindre plusieurs milliers de nucléotides. La figure 2.2 illustre de manière schématique des
séquences d’EST obtenues pour un ARN messager mature.

5’ EST 3’ EST

AAAAAAAAAA
5’ UTR Séquence codante 3’ UTR

Fig. 2.2 – Les EST sont issus du séquençage partiel des extrémités d’un ARN mature, ici un
ARN messager.

Les ADNc et les EST représentent les informations les plus pertinentes dont on peut
disposer pour établir la structure précise des gènes surtout s’ils sont issus du même orga-
nisme que la séquence nucléique à annoter [FSY+ 99]. En effet, comme les ADNc proviennent
d’ARN transcrits, ils contiennent en plus de la séquence codante les extrémités 5′ et 3′ non
traduites. Les données d’ADNc et d’EST disponibles dans les banques dépendent des condi-
tions expérimentales dans lesquelles les ARN ont été extraits : dans quel type de tissus ? A
quel stade de développement ? . . . Les données disponibles pour un organisme ne couvrent
donc qu’une partie de son transcriptome, elles ne sont pas nécessairement représentatives de
tous ses gènes. De plus, bien que les ADNc et les EST correspondent à des séquences trans-
crites, ces séquences ne sont pas obligatoirement traduites en protéines. Ces caractéristiques
des ADNc et des EST en font des indices précieux pour confirmer des prédictions effectuées
par ailleurs, notamment pour déterminer la structure des gènes. A ce titre, les ADNc sont,
par nature, une source d’information plus complète que les EST qui ne représentent qu’une
source d’information partielle.
Les banques de données d’EST sont fortement redondantes du fait de la technique em-
ployée pour les obtenir. Pour traiter ce problème de redondance, EbEST [JJ98] et Pa-
gan [KS01] procèdent à un regroupement des EST trouvés dans les banques. Les EST
chevauchants sont regroupés puis un EST représentatif de chaque groupe est sélectionné.
Les EST représentatifs sont enfin réalignés avec la séquence nucléique. Les séquences d’EST
comportent un certain nombre d’erreurs introduites durant leur séquençage. La procédure
d’alignement est donc paramétrée pour tolérer les substitutions, les insertions et les délétions
d’un nucléotide.
Quelques méthodes se servent des séquences d’ADN complémentaires présentes dans les
banques de données. Ces programmes, tels que Aat [HAZK97] ou Sim4 [FHZ+ 98] interrogent
les banques de données d’ADNc à la recherche d’ADNc similaires puis réalignent les ADNc
trouvés avec la séquence d’intérêt afin de localiser plus précisément les exons. Lorsque l’on
dispose d’ADNc complémentaires provenant du même organisme que la séquence à annoter,
l’identification des exons peut se révéler particulièrement fiable et précise [FSY+ 99].

37
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

2.2.3 Séquences génomiques

La similarité avec des séquences génomiques peut également permettre l’identification de
régions codantes, même si ces génomes ne sont pas annotés. L’idée est que sous la pression
de sélection (section 1.4) les séquences codantes présentent un niveau de conservation plus
élevé que les régions non fonctionnelles. Plusieurs protocoles de recherche peuvent être envi-
sagés : une comparaison intra-génomique à la recherche de séquences paralogues, c’est-à-dire
de séquences homologues au sein du même génome, ou une comparaison inter-génomique
pour trouver des séquences orthologues, c’est-à-dire des séquences homologues chez d’autres
organismes.
Les comparaisons de séquences peuvent être réalisées au niveau nucléotidique ou au niveau
peptidique, en traduisant “à la volée” selon les six cadres de lecture possibles. Quelque soit le
niveau de comparaison utilisé, l’exploitation des résultats est relativement plus laborieuse que
la comparaison avec des banques de protéines ou d’ARN messagers. En effet, les résultats sont
ici bruités par la présence d’autres types de séquences conservées dans les génomes que des
séquences codantes : des séquences non codantes fonctionnelles telles que des gènes à ARN
non-codants ou des éléments répétés, des séquences régulatrices, . . . De plus, la détection
d’une ou plusieurs séquences significativement similaires à une séquence nucléique d’intérêt
dépend essentiellement des génomes utilisés pour les comparaisons. Dans les faits, les résultats
que l’on peut espérer obtenir de comparaisons inter-génomiques varient selon les distances
évolutives qui séparent les organismes dont les séquences sont comparées. Entre deux espèces
distantes, il est plus facile de discriminer les régions codantes car celles-ci seront significati-
vement plus conservées que le reste des séquences génomiques. Inversement sur deux espèces
proches dont les séquences génomiques complètes sont globalement ressemblantes, il est plus
difficile de distinguer les régions plus conservées. Enfin, plus la distance évolutive entre les
espèces comparées est élevée, plus la recherche de séquences similaires dépend de la sensibilité
de la méthode d’alignement utilisée. Le choix de la méthode d’alignement et son paramétrage
sont donc des critères importants qui influencent la qualité des résultats obtenus lorsqu’on
compare des espèces séparées par une distance évolutive élevée.

2.3 Les approches par analyse comparative

Les approches de prédiction de gènes codants par analyse comparative travaillent sur des
alignements de deux ou plusieurs séquences (section 1.5.2). L’originalité de ces méthodes est
de caractériser des biais liés à l’évolution des séquences codantes observables entre un couple
ou une famille de séquences. Ces biais peuvent être de plusieurs nature : la synténie, c’est-à-
dire la conservation de l’ordre des gènes entre génomes, un biais de conservation de certaines
régions ou encore la caractérisation d’un biais dans les mutations entre des séquences codantes
homologues.
Syncod [RDM99] est la première méthode qui exploite réellement les biais de mutations
entre des séquences codantes homologues. La méthode calcule un ratio entre les mutations
silencieuses et les mutations faux-sens (section 1.4.3) observables entre deux cadres ouverts
de lecture alignés avec Blast. Les séquences correspondantes sont identifiées comme des
séquences codantes homologues si ce ratio est significativement plus élevé que ce qu’on pour-
rait observer par hasard sur des séquences ayant le même pourcentage d’identité. L’estimation
du comportement attendu par hasard est ici confiée à une procédure de type Monte-Carlo.
Qrna [RE01] s’appuie également sur un biais en mutations silencieuses et faux-sens entre les

38
 2.4. Protea

séquences codantes. Cependant, Qrna emploie trois modèles de Markov cachés différents pour
évaluer la probabilité de trois hypothèses : le modèle COD permet d’évaluer la probabilité
que les séquences alignées soient des séquences codantes homologues, le modèle RNA évalue
la probabilité que les séquences alignées soient des séquences non-codantes structurées homo-
logues, et enfin le modèle OTH qui évalue la probabilité que les mutations entre les séquences
soient fortuites. L’avantage certain de Qrna par rapport à Syncod est de distinguer dans son
modèle COD les mutations faux-sens qui produisent des acides aminés aux propriétés physico-
chimiques proches. Cette caractéristique lui permet de considérer des séquences séparées par
une distance évolutive plus importante.
Alors que Syncod et Qrna travaillent sur des séquences sorties de leur contexte
génomique, Rosetta [BPM+ 00a, BPM+ 00b] propose un point de vue différent en tra-
vaillant sur un alignement complet de deux génomes. Rosetta est cependant exclusive-
ment paramétré et destiné à la comparaison des génomes de l’Homme et de la souris.
Rosetta utilise deux critères essentiels pour effectuer ses prédictions : la synténie d’une
part, et la similarité au niveau nucléique et peptidique d’autre part. Les régions codantes
des deux organismes sont en effet exceptionnellement bien conservées, approximativement
85% d’identité au niveau nucléique, en comparaison de leurs séquences introniques, envi-
ron 35% d’identité [MZB96, MB98, LMS+ 95, KH94]. D’autres méthodes telles que TwinS-
can [KFDB01], AGenDA [TRG+ 03], Utopia [BRS03], Pro-Gen [NGM01], CEM [BH00]
et Sgp-1 [WGJMOG01] fonctionnent de manière analogue à Rosetta. Plus récemment, Pro-
jector [MD04] et GeneMapper [CP06] constituent un compromis entre Rosetta et Qrna.
Ces méthodes proposent une adaptation de la technique déployée dans Qrna en intégrant la
synténie comme le fait Rosetta pour la comparaison de deux génomes complets alignés.
Enfin, un dernier ensemble de méthodes travaille non plus sur deux séquences, mais sur un
ensemble de séquences alignées. ExoniPhy [SH04] et EvoGene [PH03] notamment étendent
et affinent l’approche de Qrna. Pour cela elles requièrent en plus de l’alignement multiple
un arbre phylogénétique correspondant aux séquences alignées. La connaissance des distances
évolutives permet d’estimer avec plus précision les taux de mutations attendus entre séquences
codantes, notamment le taux de mutations silencieuses. Ces deux méthodes utilisent des
modèles phylogénétiques de Markov cachés. Le principe est identique à celui d’un modèle
de Markov caché classique à la différence que les probabilités conditionnelles du modèle sont
obtenues par des fonctions paramétrées par l’arbre phylogénétique. Dans le cadre de la compa-
raison de génomes complets alignés, N-Scan [GB06] propose une adaptation de TwinScan
pour traiter des alignements multiples. L’approche de N-Scan, plus simple que celle de Exo-
niPhy et EvoGene, ne requiert pas d’arbre phylogénétique mais est limitée à la prédiction
de gènes pour l’Homme et la drosophile.

2.4 Protea
Dans cette section, nous présentons la méthode Protea, que nous avons développée pour
l’identification de séquences codantes. Par rapport aux approches existantes que nous venons
de présenter, Protea présente au moins deux caractéristiques qui font son originalité. En
premier lieu, Protea peut traiter un nombre quelconque de séquences sans nécessiter d’ali-
gnement multiple préalable entre ces séquences. Disposer d’un alignement multiple correct
est en effet une tâche délicate quand la distance évolutive entre les séquences est impor-
tante [Mar08], et peut se révéler une source d’erreurs comme nous l’avons mis en évidence

39
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

dans la section 1.5. En second lieu, Protea repose sur les principes de l’analyse comparative
avec une idée générale qui à notre connaissance n’a jamais été utilisée : il s’agit d’exploiter le
schéma évolutif observé entre séquences codantes à travers la conservation du cadre de lecture.
Les séquences non codantes ne sont pas censées présenter ce schéma évolutif particulier.
Nous commençons par illustrer et valider cet argument pour un couple de séquences. Nous
expliquons ensuite comment étendre ce principe à une famille comprenant un nombre quel-
conque de séquences, sans passer par un alignement multiple, mais en utilisant une structure
de graphe.

2.4.1 Le modèle sur deux séquences

Nous avons vu que lors de l’évolution, une séquence codante fonctionnelle pouvait être
altérée par un certain nombre de mutations ponctuelles dont les effets sur la séquence d’acides
aminés codée varient selon les positions affectées des codons et les bases substituées (sec-
tion 1.4.3). Cependant, sous la pression de sélection, la séquence d’acides aminés codée tend
à être préservée. Entre des séquences codantes homologues, les substitutions suivent donc un
schéma d’évolution spécifique à cause notamment de la redondance du code génétique : les
mutations silencieuses et les mutations qui ont pour effet de produire un acide aminé aux
propriétés physico-chimiques proches de l’acide aminé original sont privilégiées. Par nature,
ce schéma d’évolution n’affecte pas les séquences fonctionnelles non codantes ou non fonc-
tionnelles. Cette constatation laisse supposer qu’il est possible de distinguer des séquences
codantes homologues d’autres ensembles de séquences en comparant de manière systématique
toutes les séquences d’acides aminés potentielles obtenues par traduction selon les six cadres
de lecture.
Pour une séquence nucléique, il existe six cadres de lecture possibles : {1, 2, 3} sur le brin
donné, et {−1, −2, −3} sur le brin opposé. Etant données deux séquences nucléiques, il faut
donc comparer 36 couples de cadres de lecture, et donc 36 couples de séquences d’acides
aminés potentielles. La similarité entre chaque paire de séquences peut être estimée en les
alignant. L’hypothèse à vérifier est alors que pour deux séquences codantes homologues, le
score de similarité d’un couple de cadres de lecture se détache nettement des autres, et que
ce couple de cadres de lecture est celui qui permet d’obtenir la paire de séquences d’acides
aminés effectivement traduites. De plus, sur tout autre type de séquences, tous les scores
de similarité doivent être sensiblement les mêmes. Un exemple est donné en figure 2.3 : la
sous-figure (a) montre les résultats obtenus pour deux séquences similaires U = {u1 , u2 }
qui ne codent pas pour des séquences peptidiques homologues, tandis que la sous-figure (b)
montre les résultats obtenues pour deux séquences codantes homologues V = {v1 , v2 }. Ces
deux jeux de données présentent strictement les mêmes caractéristiques en terme de longueur
et de pourcentage d’identité. Dans ces deux exemples, on observe que six couples de cadres
de lecture obtiennent des scores positifs élevés. On parlera alors de couples compatibles :
(−3, −3), (−2, −2), (−1, −1), (1, 1), (2, 2), (3, 3). Ces couples s’obtiennent en incrémentant ou
décrémentant simultanément les cadres de lecture de chaque séquence. Les scores de similarité
positifs de ces couples sont la conséquence immédiate de la similarité au niveau nucléique des
séquences u1 et u2 d’une part, et des séquences v1 et v2 d’autre part. Concernant les séquences
u1 et u2 , on constate qu’aucun couple de traductions potentielles ne semble nettement plus
conservé que les autres. Au contraire, un couple de traductions se dégage clairement des
autres pour v1 et v2 . Le couple (1, 1) atteint un score de similarité (37) significativement plus
élevé que les autres couples. Ce couple correspond en effet aux cadres de lecture de v1 et v2

40
 2.4. Protea

 
u1 = TACCATAGTCGACATGA v1 = TACCACTGTCAACATGA
U V
u2 = TAGCACTGTCAACAGGA v2 = TACCATTGCCAGCACGA

Séquence u1 TACCATAGTCGACATGA Séquence v1 TACCACTGTCAACATGA

Cadre 1 Y H S R H Cadre 1 Y H C Q H
Cadre 2 T I V D M Cadre 2 T T V N M
Cadre 3 P * S T * Cadre 3 P L S T *
Compl. inv. u1 TCATGTCGACTATGGTA Compl. inv. v1 TCATGTTGACAGTGGTA
Cadre -1 S C R L W Cadre -1 S C * Q W
Cadre -2 H V D Y G Cadre -2 H V D S G
Cadre -3 M S T M V Cadre -3 M L T V V

Séquence u2 TACCACTGTCAACAGGA Séquence v2 TACCATTGCCAGCACGA

Cadre 1 Y H C Q Q Cadre -1 Y H C Q H
Cadre 2 T T V N R Cadre -2 T I A S M
Cadre 3 P L S T G Cadre -3 P L P A *
Compl. inv. u2 TCCTGTTGACAGTGGTA Compl. inv. v2 TCGTGCTGGCAATGGTA
Cadre -1 S C * Q W Cadre -1 S C W Q W
Cadre -2 P V D S G Cadre -2 P A G N G
Cadre -3 L L T V V Cadre -3 L L A M V

Cadre de u2 Cadre de v2
-3 -2 -1 1 2 3 -3 -2 -1 1 2 3
-3 10 2 -3 10
Cadre de u1

Cadre de v1

-2 1 12 -2 2 6 1
-1 2 1 18 -1 25
1 15 1 1 37
2 8 1 2 6
3 2 8 3 5 6
(a) Comparaison de toutes les paires de traductions (b) Comparaison de toutes les paires de traductions
de deux séquences similaires. de deux séquences codantes homologues.

Fig. 2.3 – On considère deux paires de séquence nucléiques, U = {u1 , u2 } et V = {v1 , v2 }.

Ces deux paires de séquences ont le même pourcentage d’identité, 76,5%. u1 et u2 sont des
séquences similaires quelconques, alors que v1 et v2 présentent un motif évolutif représentatif
de séquences codantes homologues. Pour chaque séquence, les six traductions en séquences
d’acides aminés sont données. Pour chacune des paires de séquences U et V, les 36 com-
paraisons entre les séquences d’acides aminés possibles sont produites. Le score de chaque
comparaison est calculé grâce à la matrice BLOSUM62. Les scores négatifs et nuls sont vo-
lontairement omis du tableau car ils dénotent un très faible degré de conservation.

41
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

qui permettent de produire les bonnes séquences d’acides aminés.

Pour valider notre hypothèse de conservation d’un cadre de lecture, nous avons mené
une expérience sur la base de données Pandit [WdBQ+ 06]. Dans sa version 17.0, cette base
répertorie 7 738 familles de séquences codantes homologues accompagnées des séquences pep-
tidiques correspondantes. Pour chaque famille, nous avons regroupé les séquences par paires
de manière aléatoire. Pour chaque paire de séquence, on réalise ensuite la comparaison des 36
couples de traductions potentielles. On compte enfin le nombre de couples de séquences pour
lesquels le couple de cadres de lecture correct obtient le meilleur score parmi les 36 couples
comparés. La comparaison des séquences peptidiques est réalisée par alignement semi-global
exact, une adaptation de l’algorithme de Needleman&Wunsch [NW70] où les insertions et
délétions aux extrémités des séquences ont un coup nul. Pour chaque comparaison, la matrice
BLOSUM appropriée est automatiquement choisie en fonction de la distance évolutive des
séquences nucléiques [HH92]. La figure 2.4 montre les résultats obtenus en fonction de la lon-
gueur moyenne et du pourcentage d’identité entre les séquences. Comme on pouvait l’espérer,
dans la majorité des cas le bon couple de cadres de lecture obtient le meilleur score parmi
les 36 couples de cadres de lecture possibles. Les quelques exceptions constatées apparaissent
pour des couples de séquences dont la longueur moyenne est inférieure à 300 nucléotides ou
le pourcentage d’identité est supérieur à 80%. Cependant, même dans ces cas de figure, la
fréquence où le couple correct obtient le meilleur score est significativement plus élevée que
ce que l’on pourrait observer par hasard.

100 100
Prédictions correctes (%)

Prédictions correctes (%)

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0
30 40 50 60 70 80 90 100 100 200 300 400 500
Identité moyenne (%) Longueur moyenne

Fig. 2.4 – Proportion de couples de cadres de lecture correctement prédits parmi tous les
couples de séquences de chaque famille de Pandit. Les résultats sont exprimés en fonction
du pourcentage d’identité des séquences (gauche) et de leur longueur moyenne (droite).

2.4.2 L’extension à une famille de séquences, le graphe des cadres de lec-

ture
Nous allons maintenant nous intéresser à la définition d’un algorithme pour identifier
les ensembles de séquences codantes homologues qui tire parti des observations précédentes
réalisées sur deux séquences.
La démarche proposée pour deux séquences ne peut pas être étendue directement à un
ensemble de séquences de taille quelconque en travaillant sur un alignement multiple. En
effet, comme il existe six cadres de lecture possibles pour une séquence, il existe 6n n-uplets
de cadres de lecture possibles pour un ensemble de n séquences. Pour chacun des n-uplets,

42
 2.4. Protea

il faudrait alors produire un alignement multiple des n traductions potentielles afin de les
comparer. Cette solution n’est évidemment pas praticable car elle requiert de générer une
quantité d’alignements multiples exponentielle par rapport au nombre de séquences à traiter.
Pour surmonter cette difficulté, il faut trouver une autre manière de généraliser l’approche
pour deux séquences à un ensemble de séquences de taille quelconque. Si l’on suppose qu’il
existe un cadre de lecture globalement conservé entre toutes les séquences homologues, alors on
doit pouvoir détecter cette conservation à partir des comparaisons des traductions potentielles
uniquement entre paires de séquences.
Soit S = {s1 , . . . , sn } un ensemble de n séquences. Nous utilisons la notion de méta-
séquence introduite dans la section 1.5.3. Selon ce processus, on crée une partition P des
séquences de S, où chaque partie correspond à une méta-séquence. On construit ensuite le
graphe des cadres de lecture à partir des m parties de P. Le but de cette structure est de
combiner les comparaisons deux à deux des traductions potentielles.

Définition 1 (Graphe des Cadres de Lecture (GCL)). Le graphe des cadres de lecture G =
(P, E, φ) est un 36-graphe valué non orienté tel que
– P est l’ensemble des m sommets de G correspondants aux m méta-séquences ;
– E ⊂ P × P × C × C est l’ensemble des arêtes du graphe où C = {−3, −2, −1, 1, 2, 3}
est l’ensemble des cadres de lecture possibles ;
– φ(Pi , Pj , c, c′ ) associe à chaque arête de E une valuation issue de la comparaison entre
la méta-séquence Pi traduite selon le cadre c et la méta-séquence Pj traduite selon c′ .

La définition de φ suppose que la traduction selon un cadre de lecture soit correctement

définie pour une séquence unique et pour une méta-séquence. La définition la plus naturelle de
la traduction d’une méta-séquence selon un cadre de lecture donné est de prendre l’ensemble
de séquences déduites de la traduction de leur alignement. La traduction de l’alignement se
fait ainsi de la même manière que pour une séquence unique, mais au lieu d’obtenir une seule
traduction on obtient une traduction par séquence alignée. Chaque triplet composé de trois
bases est traduit normalement. Les triplets composés de trois gaps produisent un gap. Les
triplets contenant un ou deux gaps sont traduits par un pseudo acide aminé X. Ce caractère
apparaı̂t dans toutes les matrices de substitution de type BLOSUM et les substitutions qui
l’impliquent sont fortement pénalisées. Grâce à cette définition de la traduction d’un aligne-
ment, les décalages de cadres de lecture positifs sont supportés entre les séquences regroupées
dans une même méta-séquence. Ainsi, à chaque cadre de lecture d’une méta-séquence cor-
respond un ensemble de séquences obtenues par traduction simultanée des séquences bases
alignées. La valuation par φ d’une arête du GCL est ainsi donnée par la formule suivante
X
φ(Pi , Pj , c, c′ ) = sim(u, v, c, c′ )
u∈Pi ,v∈Pj

où sim(u, v, c, c′ ) est le score d’alignement des séquences u et v traduites respectivement

selon les cadres de lecture c et c′ . A noter que lorsque Pi correspond à une méta-séquence,
la séquence u correspond à la séquence correspondante extraite de la traduction de la méta-
séquence Pi selon le cadre c. Et respectivement pour Pj . Dans l’approche mise en œuvre pour
deux séquences, les scores d’alignements négatifs ou nuls sont ignorés car ils ne reflètent pas
un degré de conservation suffisant pour notre investigation. Dans le GCL, cette propriété
est généralisée en omettant de placer une arête entre deux sommets lorsque sa valuation est
négative ou nulle.

43
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

2.4.3 La classification à partir du graphe des cadres de lecture

L’objectif d’un GCL est de pouvoir distinguer les familles de séquences codantes homo-
logues des autres types de séquences. Pour de telles séquences, on s’attend à ce que les com-
paraisons deux à deux des cadres de lecture soient globalement cohérentes entre elles : pour
chaque séquence, un seul cadre de lecture doit être impliqué dans les meilleures comparaisons
deux à deux. A l’inverse, sur tout autre type de séquences, on ne s’attend pas à trouver de
cohérence dans les comparaisons deux à deux.
On définit le score de consistance qui s’applique à un GCL et qui reflète la consistance
des prédictions deux à deux qu’il contient. Ce système de scores est cependant peu adapté
aux petits GCL. Pour les GCL construits à partir d’un faible nombre de séquences, on utilise
alors un autre système : le score d’alignement.

Score de consistance
Etant donnés deux sommets, les arêtes qui les relient sont triées par valuation décroissante.
On attribue alors à chacune un score qui dépend de son rang : l’arête dont la valuation est
la plus élevée se voit attribuée un score de 6, la seconde 5, jusqu’à 1. Seules les six meilleures
arêtes sont retenues, car comme il est mentionné en section 2.4.1, seuls six couples de cadres
de lecture sont censés émerger de la conservation au niveau nucléique.
On définit une affectation globale de cadres de lecture comme une fonction de P dans C =
{−3, −2, −1, 1, 2, 3} qui attribue un cadre de lecture à chaque sommet d’un GCL. Pour chaque
affectation globale A = (c1 , . . . , cm ), on définit le score de consistance noté consistance(A),
comme la somme des rangs des arêtes induites par A.
X
consistance(A) = rang(Pi , Pj , ci , cj )
1≤i<j≤m
La valeur de ce score est comprise entre M et 6M , où M est le nombre de sommets
connectés dans le GCL. Dans la plupart des cas, M = m(m−1) 2 car chaque couple de sommets
est au moins relié par une arête. La valeur optimale 6M est atteinte lorsqu’une affectation
globale couvre toutes les meilleures comparaisons deux à deux.
La qualité d’un GCL est donnée par le score de consistance le plus élevé obtenu par une
affectation globale. En pratique, il est rarement nécessaire d’énumérer toutes les affectations
pour trouver celle dont le score de consistance est maximal. Les scores des arêtes étant bornés,
on applique les techniques standards de rebroussement et d’élagage pour éviter des calculs
inutiles.

Significativité d’un score de consistance

Pour évaluer la significativité d’un score de consistance, on calcule sa P-valeur, c’est-à-dire
la probabilité d’observer un score de consistance égal ou plus grand étant donnée la topologie
du GCL. On suppose que le rang de chaque arête est une variable discrète uniformément
distribuée dans l’intervalle [1; 6]. On suppose également que les scores d’alignement obtenus
par deux paires différentes de séquences sont des variables aléatoires indépendantes. Selon
ces hypothèses, la distribution d’une somme de rangs est calculable au moyen d’un produit
de convolution discret d’un nombre fini de variables uniformément distribuées. La formule
analytique pour ce calcul a été établie par Uspensky [Usp37]. Cette formule nous permet
d’obtenir la formule de la P-valeur d’un score de consistance.

44
 2.4. Protea

6M ⌊(i−M )/6⌋   
X 1 X M i − 6j − 1
Pr[consistency score(A) ≥ s] = (−1)j
6M j M −1
i=s j=0

Preuve de la formule de Uspensky. On souhaite calculer la probabilité d’obtenir une somme

p de N variables aléatoires indépendantes identiquement distribuées selon une loi uniforme
discrète à valeurs dans [1; 6]. Le nombre d’arrangements permettant d’obtenir p est donné
par le coefficient c de xp dans

f (x) = (x + x2 + · · · + x6 )N ,

où chaque arrangement possible correspond à un terme. f (x) peut également s’écrire comme
une série multinômiale

5
!N
X
N i
f (x) = x x
i=0
 N
1 − x6
= xN
1−x
= xN (1 − x6 )N (1 − x)−N

Selon le théorème binômial,

N  
X N
xN (1 − x6 )N = (−1)k xN +6k
k
k=0
N  
N
X N k
= x (−1) x6k
k
k=0
∞
X N + l − 1 
(1 − x)−N = xl
N −1
l=0

D’où l’expression,
N   ∞  
N
X
k N 6k
X N +l−1
x (−1) x xl ,
k l
k=0 l=0
donc le coefficient c de xp inclus tous les termes où

p = N + 6k + l.

c est par conséquent donné par

N   
X
k N p − 6k − 1
c= (−1) .
k p − 6k − N
k=0
Cependant, p − 6k − N > 0 seulement si k < (p − N )/6, donc les autres termes ne
contribuent pas au calcul. De plus,

45
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

   
p − 6k − 1 p − 6k − 1
= ,
p − 6k − N N −1
donc
⌊(p−N )/6⌋   
X
k N p − 6k − 1
c= (−1) .
k N −1
k=0

La probabilité P (p, N ) que p soit la somme de N variables aléatoires indépendantes suivant

la même loi discrète uniforme dans [1; 6] est donc donnée par
⌊(p−N )/6⌋   
1 X
k N p − 6k − 1
P (p, N ) = N (−1) .
6 k N −1
k=0

En fixant un seuil sur la P-valeur de la meilleure affectation globale, on est en mesure

de déterminer la nature des séquences analysées. Si cette P-valeur est inférieure au seuil fixé,
on suppose alors être en présence de séquences codantes homologues. Dans le cas contraire,
on suppose que les séquences ne correspondent pas à des séquences codantes homologues.
Nous avons déterminé de manière empirique la valeur de ce seuil durant l’élaboration de la
méthode.

Petits GCL : z-score du score d’alignement

Le calcul d’un score de consistance n’est pas approprié pour des GCL ayant moins de
trois sommets. Sur de tels GCL, les P-valeurs des scores de consistance ont en effet toutes
des valeurs trop élevées. Pour évaluer la qualité des GCL comportant peu d’arêtes, on utilise
alors l’information des scores d’alignement. Comme il a déjà été remarqué précédemment, on
s’attend à ce que le meilleur alignement fasse intervenir les bons cadres de lecture sur des
séquences codantes homologues. Qui plus est, plus le score de cet alignement se détache des
autres, plus le biais en faveur d’une conservation de la séquence d’acide aminés est impor-
tant. On définit donc le score d’alignement d’une affectation globale A = (c1 , . . . , dm ), noté
alignment score(A), comme la somme des valuations des arêtes induites par A.
X
alignment score(A) = φ(Pi , Pj , fi , fj )
1≤i<j≤m

On sélectionne pour un GCL l’affectation globale de score d’alignement maximal. Contrai-

rement au score de consistance, un score d’alignement n’est pas informatif en soi car il reflète
partiellement la similarité entre les séquences nucléiques initiales. Ce score ne peut être in-
terprété que s’il est mis en relation avec les scores d’alignement atteints par les autres affecta-
tions globales. Plus précisément, son interprétation dépend des scores des autres affectations
globales qui lui sont compatibles. Pour une affectation globale, il existe cinq affectations com-
patibles obtenues par décalage simultané de tous les cadres de lecture. Par exemple, pour
une affectation globale (1, 2, 3, 1), il existe deux affectations compatibles sur le même brin,
(2, 3, 1, 2) et (3, 1, 2, 3), et trois sur l’autre brin qui dépendent des longueurs des séquences
modulo 3. La différence entre les scores d’alignements des affectations compatibles provient

46
 2.4. Protea

ainsi uniquement d’un motif évolutif particulier et non d’une similarité au niveau nucléique.
On exclut toutefois une autre affectation des affectations compatibles, l’affectation sur le
brin opposé où la troisième position des codons coı̈ncide avec celle de l’affectation à évaluer.
Le score de cette affectation est en effet clairement biaisé à cause d’une propriété du code
génétique. En effet, les mutations silencieuses apparaissent le plus souvent sur la troisième
base des codons (section 1.4.2). Lorsque l’on observe un grand nombre de mutations silen-
cieuses entre deux cadre de lecture, on peut donc naturellement obtenir deux cadres de lecture
sur les brins opposés qui présentent ce même biais, comme illustré sur la figure 2.5 où les trois
mutations silencieuses entre les cadres +1 produisent sur les brins opposés deux mutations
silencieuses fortuites. Sur l’exemple de la figure 2.3, le couple de cadres de lecture correct
pour les séquences de V est (1, 1). On constate un certain nombre de mutations silencieuses
entre ces deux cadres, c’est pourquoi le cadre (−1, −1) obtient également un bon score. Pour
interpréter le score d’alignement d’une affectation, on ne garde donc finalement que quatre
des cinq affectations compatibles. La significativité de la déviation du score d’alignement
de la meilleure affectation globale d’un GCL est mesuré par un z-score, même si le nombre
d’observations est faible.
Dans le cas des petits GCL, la détection d’ensembles de séquences codantes homologues se
fait au moyen d’un seuil sur le z-score du score de la meilleure affectation globale. A l’instar de
la classification réalisée sur les GCL de plus grande taille, la valeur de ce seuil a été déterminée
de manière empirique au cours de la validation de la méthode.

Cadre +1 V G N Cadre +1 V G N
GTAGGCAACCGA GTCGGTAATCG
P L R Cadre -2 P F R Cadre -1

Fig. 2.5 – Du fait de la redondance du code génétique, les mutations dites silencieuses (posi-
tions grisées) n’ont aucun effet sur les acides aminés codés. Ces mutations apparaissent plus
fréquemment à la troisième position des codons.

2.4.4 Mise en œuvre logicielle

Une implémentation de Protea a été réalisée en C. Protea est un logiciel quasiment
autonome qui s’appuie sur deux librairies, GMP (http://gmplib.org) et MPFR [FHL+ 07],
pour le calcul exact de la P-valeur d’un score d’affectation. En effet, bien que l’on dispose
d’une formule analytique pour ce calcul, celle-ci fait intervenir des calculs de combinaisons qui
dépassent rapidement les capacités des types primitifs disponibles en C. Grâce aux librairies
GMP et MPFR, il nous est possible de spécifier précisément la capacité nécessaire et suffisante
pour les variables servant au calcul des P-valeurs.
Les alignements deux à deux sont directement réalisés par Protea en utilisant les matrices
BLOSUM, tandis que la construction des alignements multiples est déléguée à un programme
externe. Actuellement, Protea offre la possibilité d’utiliser indifféremment trois programmes
d’alignement multiple : ClustalW [THG94], Dialign2-2 [Mor99] et T-Coffee [NHH00].
L’implémentation en C de Protea est complétée par un ensemble de scripts CGI écrits
en Python permettant une utilisation du logiciel via un navigateur Web. Cette interface, dis-
ponible à l’adresse http://bioinfo.lifl.fr/protea permet d’éviter aux utilisateurs l’ins-
tallation locale du logiciel et offre en plus une présentation plus lisible et efficace des résultats.

47
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

2.5 Résultats expérimentaux de Protea

Nous avons conduit une série d’expériences dans le but de valider notre méthode et
d’évaluer ses performances par rapport aux méthodes existantes (section 2.5.1). Nous nous
sommes par la suite intéressés à une application plus concrète de Protea : la prédiction
de nouvelles séquences codantes dans le génome humain (section 2.5.2). Au cours de cette
expérience, nous avons également pu confronter les prédictions de Protea à celles réalisées
par des méthodes ab initio et des méthodes destinées à l’annotation de séquences génomiques
complètes.

2.5.1 L’évaluation des performances de Protea

A l’heure actuelle, il n’existe aucun de jeu de données de référence pour évaluer la
prédiction de gènes ou de régions codantes [PAA+ 03]. Bien que plusieurs expériences aient
été menées dans ce sens [RMO01, BG96, KC07], leur objectif est d’évaluer la précision de
prédictions des bornes des gènes et des régions codantes dans des séquences génomiques indivi-
duelles et non par approche comparative sur plusieurs séquences. Les jeux de données utilisés
par les auteurs de méthodes de prédiction par analyse comparative sont limités exclusivement
à des paires de séquences conservées à plus de 75%. Bien que ce degrés de conservation est
adapté pour pouvoir utiliser des méthodes plus conventionnelles travaillant uniquement sur
des alignements, ces séquences ne peuvent constituer à elles seules un jeu de données adapté
et représentatif pour évaluer Protea. Pour mener à bien notre expérience, nous avons donc
constituer des jeux de données plus variés à partir de séquences disponibles dans les banques
publiques. Sur ces jeux de données, nous aurions souhaité pouvoir comparer les performances
de Protea à celles des trois méthodes apparentées : Qrna, Rosetta et Syncod. Rosetta
et Syncod sont relativement âgées et ne sont hélas plus maintenues depuis déjà quelques
années. De plus, elles ne sont plus disponibles ni en ligne, ni auprès de leurs auteurs. Pour
cette raison, les performances de Protea n’ont pu être comparées qu’à celles de Qrna.

Les jeux de données

Trois jeux de données ont été construits pour mesurer les performances de Protea :
des familles de séquences codantes, des ARN non-codants et des séquences aléatoires. Pour
chaque jeu de données, des sous-ensembles ont été construits aléatoirement de façon à ce que
chaque famille ne soit représentée qu’une seule fois et que les sous-ensembles soient les plus
équivalents possible en terme de pourcentage d’identité et de longueur.

Le jeu de données CODANT : des familles de séquences codantes. Ce jeu de

données est produit à partir de la banque de données Pandit (section 2.4.1) complétée
de séquences extraites de Popset [WBB+ 08]. La conservation moyenne des familles des
séquences de Pandit est relativement faible, c’est pourquoi nous avons ajouté dans ce jeu de
données des séquences provenant de Popset. Popset contient des ensembles de séquences
nucléiques collectées pour analyser les relations évolutives d’une population. Les populations
peuvent être de deux natures : intra-espèce ou inter-espèces. Nous avons ainsi sélectionné 58
familles de Popset qui présentent un degré de conservation élevé. Au total, le jeu de données
CODANT est composé de 7 796 familles de séquences codantes homologues.

48
 2.5. Résultats expérimentaux de Protea

Le jeu de données NONCODANT : des familles d’ARN non-codants. Pour

construire ce jeu de données, nous avons extrait des familles de séquences de Rfam, complétées
de séquences provenant de la banque européenne de données ribosomiques [WPVdP04]. Seule
une partie des séquences de Rfam a été utilisée car certaines séquences présentes dans cette
base recouvrent des séquences codantes. A partir de Rfam version 8.0, qui contient 574
familles d’ARN, nous avons filtré les familles qui contiennent ou recouvrent une séquence
codante. Le filtre appliqué consiste à éliminer toute famille contenant au moins une séquence
pour laquelle il existe une séquence peptidique hautement similaire dans SwissProt. La
recherche de séquence similaire a été conduite avec BlastX paramétré avec un seuil sur la
E-valeur à 10−4 et une couverture minimale de 50% de la séquence requête. 110 familles ont
ainsi été supprimées. La longueur moyenne des séquences des 464 familles restantes étant re-
lativement faible, nous avons donc ajouté 32 familles d’ARN ribosomiques (grosse sous-unité)
provenant de la banque européenne de données ribosomiques. Au final, le jeu de données
NONCODANT est composé des 496 familles.

Le jeu de données ALEATOIRE : des familles de séquences aléatoires. Ce jeu de

données est composé de séquences aléatoires générées à partir du jeu de données CODANT.
L’alignement multiple de chaque famille de CODANT fourni dans Pandit est mélangé se-
lon un processus conservatif [WH04]. Cette procédure assure que les deux jeux de données
CODANT et ALEATOIRE ont les mêmes propriétés en terme de longueur, de composition
nucléotidique et de conservation globale mais surtout de conservation locale. La figure 2.6
montre un exemple d’alignement mélangé où le degré de conservation locale de l’alignement
originale est préservé.

VGJ_BPG4 AAAAAATCAATTCGCCGCTCTGGT---------------------------------------GGCAAATCTAAGGGTGCCCGTCTCTGGTATGTAGGCGGAACACAATAC
Q9G087_BPS13 TCTAAAGGTAAAAAACGTTTTGGCGCTCGCTCCGGTCGTCCACAGCCGTTGCGAGGCACTAAAGGCAAGCGTAAAGGCGCTCGTCTTTGGTATGTAGGCGGTCAACAATTT
VGJ_BPAL3 ATGAAGAAAGCACGTCGTTCTCCT---------------------------------------AGTCGTCGTAAAGGTGCTCGCCTCTGGTATGTAGGCGGTTCTCAGTTT
** ** * * * *** ** ** ** ** ************** ** *

seq0 GACATGTTCAACAAATATGCGAAT---------------------------------------ATCAGATCTGACTACCGGTTAGGTAGTCAGGCGGTCGCACCGAGTCAC
seq1 ACGATGAGTACTTTTTACGAGAACCCGGGGTTCTGAATCTGGAGTGCCCCGAACCGCACCACTATCAGGAGTGATTATCGATTAGGCAGTCAGGCGGTCGCTAAGAGTCTT
seq2 GTAATACACGTTAAGTACGCGTGT---------------------------------------CTTGCTAGTGATTACCGATTGGGTAGTCAGGCGGTCGCTTCCAGCCTT
** ** * * * *** ** ** ** ** ************** ** *

Fig. 2.6 – En haut, l’alignement multiple de la famille PF04726 du jeu de données CO-
DANT ; en bas, un alignement multiple obtenu par la procédure de mélange conservative. Les
caractères ’*’ marquent les positions parfaitement conservées.

Les résultats de Protea

Les jeux de données décrits précédemment sont soumis à Protea qui les classifie selon
deux classes : “codant” pour les ensembles de séquences prédits comme étant des familles
de séquences codantes homologues, “autre” dans le cas contraire. Contrairement à Protea,
Qrna classifie les séquences selon trois classes : “codant”, “non-codant” ou “autre”. La clas-
sification “non-codant” correspond à l’identification de séquences présentant une structure
secondaire conservée (section 3.2.4). Etant donné que nous nous intéressons ici à la prédiction
de séquences codantes homologues, les prédictions “non-codant” sont considérées comme des
prédictions “autre”. Ce stratagème permet d’obtenir une classification des jeux de données
en deux classes équivalentes pour Protea et Qrna : “codant” et “autre”.

49
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

Mesure de performances. Pour évaluer la qualité des prédictions effectuées par un clas-
sifieur binaire, deux mesures sont couramment utilisées : la sensibilité et la spécificité. La
sensibilité de la méthode correspond ici à la proportion de séquences codantes homologues
classifiées “codant”, tandis que la spécificité correspond à la proportion de séquences d’un
autre type classifiées “autre”. La sensibilité Sn sur un jeu de données est donnée par

TP
Sn =
TP + FN
où T P désigne la quantité de vrais positifs, c’est-à-dire les prédictions “codant” correctes, et
F N la quantité de faux négatifs, c’est-à-dire les prédictions “autre” incorrectes. De manière
analogue, la spécificité Sp sur un jeu de données est donnée par

TN
Sp =
TN + FP
où T N désigne la quantité de vrais négatifs, c’est-à-dire les prédictions “autre” correctes, et
F P , c’est-à-dire les prédictions “codant” incorrectes.

Résultats généraux. Les résultats de Protea sur les jeux de données CODANT, NON-
CODANT et ALEATOIRE pour des ensembles de 3, 5 et 11 séquences sont répertoriés dans
la table 2.1 selon le pourcentage d’identité moyen et la longueur moyenne des séquences. Ces
résultats sont également présentés graphiquement sur la figure 2.7.

(a) Répartition des prédictions “codant” sur le jeu (b) Répartition des prédictions “codant” sur le jeu
de données CODANT. de données NONCODANT.

Fig. 2.7 – Répartition des prédictions “codant” de Protea sur les ensembles de 11 séquences
des jeux de données CODANT (a) et NONCODANT (b). Les histogrammes tracés en poin-
tillés représentent les ensembles de données initiaux, tandis que les histogrammes en trait
plein représentent les prédictions “codant” de Protea.

Dans la plupart des cas, la sensibilité et la spécificité sont supérieures à 80%. Comme
on pouvait l’espérer, les performances des Protea augmentent avec le nombre de séquences
ainsi que leur longueur. En dessous de 50% d’identité moyenne, Protea est particulièrement
performant et affiche une spécificité supérieure à 90%. En revanche, les performances de
Protea se dégradent au delà de 90% d’identité. Sur de telles séquences très conservées, la

50
 2.5. Résultats expérimentaux de Protea

quantité de mutations est insuffisante pour détecter un schéma de substitution en lien avec
la conservation d’une séquence d’acides aminés particulière. Le comportement de Protea
sur des courtes séquences est soumis à un biais causé par la présence d’acides aminés rares,
tel que le tryptophane par exemple, conservés entre des traductions potentielles. Les scores
de substitution de ces acides aminés dans les matrices BLOSUM sont relativement élevés
et la conservation fortuite d’un seul acide aminé de ce type sur des séquences de moins de
cinquante nucléotides entraı̂ne une élévation mécanique des scores lors de leur alignement.

Comparaison avec Qrna. Protea a été conçu pour traiter des ensembles de plusieurs
séquences non alignées. Néanmoins, il peut quand même être utilisé sur des paires de
séquences, bien qu’il ne soit pas spécialement conçu pour ce cas de figure.
Comme Qrna nécessite en entrée des séquences alignées, nous avons testés plusieurs
méthodes d’alignement : ClustalW, T-Coffee, Dialign2-2 et Blast. Les performances
de Qrna étant meilleures sur les alignements produits par ClustalW, seuls les résultats de
Qrna obtenus avec cette méthode sont présentés.
Les résultats de Qrna et de Protea sur les couples de séquences des jeux de données
CODANT et NONCODANT sont reportés dans la table 2.2. Globalement, Qrna est plus
spécifique que Protea, tandis que Protea est plus sensible sur les mêmes données. Si l’on
considère le compromis entre sensibilité et spécificité, Protea se montre plus performant
que Qrna qui dispose de plus, rappelons le, d’un modèle pour détecter les séquences non-
codantes homologues qui l’avantage sur le jeu de données NONCODANT. De plus, Protea
est clairement plus performant que Qrna en dessous de 50% d’identité : 38% de sensibilité et
100% de spécificité pour Qrna, contre 81,3% et 95,5% respectivement pour Protea. Cette
observation permet de mettre en évidence les limites intrinsèques des méthodes basées sur
des alignements en présence de séquences divergentes. En terme de temps de calculs, Qrna
s’avère beaucoup plus gourmand que Protea notamment à cause de l’évaluation du modèle
non-codant très coûteuse. Pour réaliser cette expérience, il a fallu moins d’une heure à Protea
contre plus de 40 heures à Qrna.

2.5.2 Une application au génome humain

L’annotation des éléments conservés des génomes nouvellement séquencés ou partiellement
annotés reste à l’heure actuelle une tâche difficile. En complément des approches de prédiction
classiques par homologie qui permettent de retrouver des séquences codantes connues, et des
approches ab initio qui permettent d’identifier de nouvelles séquences codantes putatives, les
approches comparatives peuvent jouer un rôle important en apportant des prédictions de
nouvelles séquences codantes plus fiables car supportées par plus d’une séquence. Nous avons
donc conduit une étude visant à découvrir de nouvelles séquences codantes sur le génome
humain grâce à Protea. Cette étude menée sur des séquences conservées entre le génome
humain et plus d’une dizaine d’organismes nous a permis d’identifier de nouvelles séquences
codantes putatives.

Les séquences conservées entre plusieurs espèces

L’UCSC GenomeBrowser propose des séquences conservées entre plusieurs

espèces [KBD+ 03, KHF+ 04] extractibles à partir de la piste nommée multiz17way. Ces

51
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

(a) Sensibilité sur le jeu de données CODANT.

Nb Longueur Pourcentage d’identité moyen
séq. moyenne <50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-95 >95
<100 57,1 68,9 71,9 77,8 62,9 41,7 38,2
100-200 72,8 91,7 87,3 85,2 70,0 61,3 44,4
3
200-300 78,9 93,4 92,8 92,1 71,4 66,7 58,8
>300 86,7 97,0 96,5 93,3 81,6 64,7 61,5
<100 70,5 76,6 81,8 83,3 63,6 57,1 56,1
100-200 86,9 96,1 91,1 89,3 71,4 55,6 64,3
5
200-300 88,1 98,3 97,3 95,0 78,7 60,0 66,7
>300 94,0 98,5 99,4 94,4 80,8 66,7 71,4
<100 82,2 92,0 92,6 89,0 74,1 65,1 55,6
100-200 93,2 96,6 93,8 92,8 75,0 65,6 56,8
11
200-300 95,1 98,5 96,3 95,4 79,2 66,4 61,7
>300 96,4 99,7 100 96,8 92,6 78,6 73,8

(b) Spécificité sur le jeu de données NONCODANT.

Nb Longueur Pourcentage d’identité moyen
séq. moyenne <50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-95 >95
<100 91,5 90,0 88,7 88,9 83,6 79,0 76,3
100-200 96,4 92,0 85,7 85,7 84,8 82,4 81,3
3
200-300 91,7 80,0 85,7 86,0 83,3 80,4 85,7
>300 100 93,0 81,8 90,0 87,7 76,3 78,6
<100 94,3 94,0 93,3 90,5 79,8 79,5 77,8
100-200 95,8 87,6 86,0 82,8 82,8 78,3 80,0
5
200-300 97,8 93,3 86,7 86,7 84,8 81,5 76,3
>300 100 91,7 90,6 90,6 81,8 83,8 78,4

(c) Spécificité sur le jeu de données ALEATOIRE.

Nb Longueur Pourcentage d’identité moyen
séq. moyenne <50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-95 >95
<100 96,8 93,2 81,1 80,7 80,0 78,1 60,0
100-200 97,4 97,2 83,3 81,1 83,3 66,7 61,9
3
200-300 97,9 95,7 86,6 87,0 85,2 70,2 62,5
>300 98,1 95,0 93,3 90,5 88,9 83,3 64,3
<100 97,4 95,1 87,5 74,8 77,6 68,4 61,4
100-200 98,3 95,9 94,3 93,2 86,9 78,7 62,5
5
200-300 98,3 97,5 96,4 95,8 93,4 81,8 68,1
>300 100 98,5 97,2 96,6 94,4 83,3 73,3
<100 99,9 98,1 99,6 97,9 89,0 87,5 61,7
100-200 100 100 99,8 98,6 88,9 80,0 61,1
11
200-300 100 100 100 100 100 81,8 64,3
>300 100 100 100 100 100 96,0 79,4

Tab. 2.1 – Les résultats de Protea sur les jeux de données CODANT, NONCODANT
et ALEATOIRE de 3, 5 et 11 séquences. Les résultats avec 11 séquences pour le jeu de
données NONCODANT ne sont pas mentionnés car très peu de familles de ce jeu de données
contiennent autant de séquences. Le tableau (a) contient la proportion de données correcte-
ment classifiées “codant”. Les tableaux (b) et (c) les proportions de données correctement
classifiées “autre” par Protea.

52
 2.5. Résultats expérimentaux de Protea

(a) Les résultats de Qrna. (b) Les résultats de Protea.

Id. Sensibilité (%) Spécificité (%) Id. Sensibilité (%) Spécificité (%)
moy. % CODANT NONCODANT moy. % CODANT NONCODANT
<50 38,0 100,0 <50 81,3 95,5
50-60 63,1 98,4 50-60 90,6 76,8
60-70 73,4 97,9 60-70 88,9 74,2
70-80 69,6 93,7 70-80 82,5 85,3
80-90 43,1 91,8 80-90 66,7 83,2
90-95 38,2 90,2 90-95 61,5 84,2
>95 30,7 88,9 >95 54,8 64,3

Tab. 2.2 – Les résultats de Qrna et Protea sur les couples de séquences.

ensembles de séquences sont construits à partir d’alignements multiples générés par Mul-
tiz [BKR+ 04] puis filtrés par phastCons [SH05]. Dix huit génomes d’eucaryotes supérieurs
dont l’Homme, la souris, le chien et le poulet ont ainsi été comparés.
L’objectif de notre expérience est de découvrir de nouvelles séquences codantes chez
l’Homme, c’est pourquoi nous avons retiré de ce jeu de données toute ensemble contenant une
séquence déjà identifiée comme telle de manière expérimentale. A cet effet, nous avons utilisé
les ressources fournies par l’UCSC TableBrowser pour filtrer les séquences chevauchantes
ou incluses dans les pistes KnownGene [HKC+ 06] ou MGC (Mammalian Gene Collection).
Etant donné les performances de Protea sur les séquences courtes ou trop conservées, les
éléments de moins de cinquante nucléotides ou dont le pourcentage d’identité est supérieur à
90% ont été écartés. Au total, 97 956 ensembles d’au moins douze séquences ont été soumis à
Protea. Ce jeu de données peut être séparé en deux groupes : les séquences annotées dont la
fonction putative a déjà été prédite par d’autres méthodes bio-informatiques, et les séquences
non annotées. Parmi les 97 956 ensembles analysés, on compte 37 318 ensembles contenant
des séquences annotées et 60 638 sans annotation. Les résultats obtenus sont schématisés sur
la figure 2.8.

Les séquences avec annotations putatives

Une partie des séquences traitées comportent des annotations réalisées par des méthodes
de prédiction ab initio ou par analyse comparative. L’UCSC Table Browser nous a permis
de récupérer les annotations réalisées par Augustus, ExoniPhy, ExonWalk, GeneID,
Genscan et N-Scan. Nous avons également réalisé des annotations en utilisant une approche
classique par homologie de séquences au niveau peptidique grâce à BlastX sur la base
SwissProt en filtrant les alignements dont la E-valeur est inférieure à 10−4 .
Globalement, 23 220 ensembles de séquences annotées sont confirmés par Protea, soit
62% des séquences annotées par d’autres méthodes. La table 2.3 explicite la répartition des
prédictions de Protea en fonction des autres méthodes. Cette table contient également le
cœfficient de corrélation entre les prédictions de chaque méthode et celles de Protea. Les
valeurs de ce cœfficient comprises entre 0,1 et 0,26 sont relativement faibles. Cette expérience
montre que l’approche comparative de Protea est complémentaire des approches existantes,
notamment des approches ab initio et par analyse comparative.

53
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

Familles

97 956

Annotées Non annotées

Augustus
ExoniPhy
37 318 60 638
ExonWalk
GeneID
Genscan
N-Scan
Protea Protea

23 200 6 023

Domaines Pfam Introns

232 2 950

Fig. 2.8 – Découpage des résultats de Protea sur les groupes de séquences similaires de
l’UCSC.

Nombre Prédictions Cœfficient

Annotation
d’éléments chevauchantes de corrélation
Augustus 8 383 6 702 0,20
ExonWalk 3 994 3 284 0,14
ExoniPhy 19 882 14 497 0,24
GeneID 20 410 13 919 0,14
Genscan 23 810 15 691 0,10
N-Scan 10 920 7 814 0,12
SwissProt 23 174 16 676 0,26

Tab. 2.3 – Les résultats de Protea sur les éléments conservés comportant des annotations
putatives.

54
 2.5. Résultats expérimentaux de Protea

Les séquences sans annotation

Protea prédit 6 023 des 60 638 ensembles de séquences comme des ensembles de
séquences codantes homologues, soit 9,93%. Afin d’estimer le taux de faux positifs, nous
avons construit un jeu de données de contrôle selon la même procédure que pour le jeu de
données ALEATOIRE construit pour la validation de Protea. Parmi ce jeu de données,
seuls 0,8% des ensembles de séquences sont prédits comme “codant”. Les prédictions posi-
tives de Protea sur les ensembles de séquences non annotées ne sont donc pas un artefact
de Protea. Si l’on s’intéresse plus en détails aux 6 023 prédictions positives de Protea, on
remarque que 232 d’entre elles contiennent des domaines protéiques connus répertoriés dans
Pfam [FMSB+ 06], contre 272 pour les 54 615 prédictions négatives de Protea. De plus, si
l’on s’intéresse aux positions dans le génome humain des prédictions positives, on en compte
2 050 dans des régions introniques de gènes vérifiés expérimentalement et 900 à proximité
immédiate d’exons prédits. Cette constatation laisse supposer qu’une partie des prédictions
de Protea sont impliquées dans l’épissage alternatif, ou correspondent à des exons non
annotés de gènes prédits.

2.5.3 Conclusions
Les expériences présentées dans la section 2.5.1 permettent d’apprécier en pratique les
forces et les faiblesses de Protea. Protea est une méthode efficace et performante, capable
de traiter des séquences non alignées très faiblement conservées. Les performances de Protea
sont, qui plus est, cohérentes avec le comportement attendu pour une méthode à base d’ana-
lyse comparative : ses performances croissent avec le nombre et la longueur des séquences
comparées. Au cours de ces expériences, nous avons noté que Protea n’était pas à l’aise sur
des séquences courtes ou très bien conservées. Ces faiblesses proviennent du principe même de
l’analyse comparative de séquences. Comparer des séquences quasiment identiques n’apporte
pas plus d’information qu’une seule séquence. Les séquences trop courtes ne contiennent pas
suffisamment d’information pour réaliser des observations significatives et pertinentes. L’appli-
cation de Protea à l’annotation de séquences codantes sur le génome humain (section 2.5.2)
a permis d’une part de mettre en évidence la complémentarité de Protea par rapport aux
méthodes de prédictions existantes, et d’autre part de détecter de nouveaux fragments de
séquences codantes putatives avec un degré de confiance élevé.

55
Chapitre 2. Recherche de gènes et régions codantes

56
 Chapitre 3

Prédiction de structures communes

d’ARN non-codants homologues

Dans le chapitre précédent, nous avons abordé le problème de l’identification des régions
codantes. Nous nous intéressons maintenant aux ARN non-codants. Comme pour les ARN
codants, plusieurs types d’informations peuvent être pris en compte tels que l’homologie et les
biais de composition. Toutefois, la majorité des ARN non-codants présentent une particularité
supplémentaire qui est la formation d’une structure spatiale stable (section 1.3.1), que l’on
peut capturer partiellement à travers la structure secondaire. C’est un signal important qui
s’avère fort utile pour la prédiction de gènes à ARN. De ce fait, nous commençons par présenter
dans la première section les approches principales pour la prédiction de structures secondaires.
En section 3.2, nous expliquons ensuite comment ces méthodes s’appliquent à la prédiction
de gènes à ARN. Enfin, dans la section 3.3, nous présentons notre contribution au problème,
avec une évolution du logiciel caRNAc et des premiers résultats pour la prédiction de gènes.

3.1 La prédiction de structures secondaires, état de l’art

La prédiction de la structure secondaire d’un ARN est un problème de bio-informatique
relativement ancien. Les premières approches virent le jour au début des années 80. En effet,
les techniques expérimentales pour obtenir des informations structurales de macromolécules
biologiques, en particulier d’acides nucléiques, sont délicates. La cristallographie aux rayons X,
qui est la technique de référence pour cela, nécessite par exemple d’emprisonner la molécule
d’intérêt dans un cristal afin de figer sa structure et de pouvoir l’observer. De plus, dans la
cellule, les molécules ne sont pas isolées dans leur milieu mais en interaction avec d’autres
molécules. Il est alors d’autant plus difficile de résoudre la structure d’un complexe entier.
Peu de structures d’ARN ont pu être caractérisées par cette méthode qui fait appel à des
techniques expérimentales lourdes et relativement coûteuses en temps et en argent.
Les méthodes bio-informatiques pour traiter ce problème se révèlent donc être une alter-
native peu coûteuse à mettre en œuvre. Plusieurs approches ont été proposées. Initialement,
on peut distinguer schématiquement deux écoles : approches thermodynamiques émanant
de la physique statistique basée sur la stabilité d’une molécule, et approches comparatives
qui exploitent le schéma évolutif d’un ensemble de séquences supposées homologues pour en
déterminer une structure commune. A ce tableau s’ajoutent les méthodes hybrides qui s’ap-
puient généralement sur un modèle thermodynamique soutenu par des signes d’évolution des

57
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

séquences selon le schéma évolutif des ARN non-codants. Nous détaillons dans la suite de
cette section les méthodes thermodynamiques, comparatives et hybrides.

3.1.1 La prédiction par approche thermodynamique

Hypothèses de travail

Le premier principe de la thermodynamique affirme qu’au cours d’une transformation

quelconque d’un système fermé, la variation de son énergie est égale à la quantité d’énergie
échangée avec le milieu extérieur, sous forme de chaleur et sous forme de travail. Autrement
dit, l’énergie totale d’un système isolé reste constante. Les événements qui s’y produisent ne
se traduisent que par des transformations de certaines formes d’énergie en d’autres formes
d’énergie. L’énergie ne peut donc pas être produite ex nihilo ; elle est en quantité invariable
dans la nature. L’énergie libre est une fonction d’état d’un système dont la variation permet
d’obtenir le travail utile susceptible d’être fourni par un système thermodynamique fermé,
à température constante. Dans un système composé uniquement d’une molécule d’ARN, la
stabilité structurale de cette molécule est mesurée par la perte d’énergie libre accompagnant
la transition d’un état non replié ou dénaturé à un état natif, à température constante. L’état
le plus stable pour une molécule d’ARN dans ce contexte est la structure dont l’énergie libre
est minimale. L’approche thermodynamique pour la prédiction de structures d’ARN consiste
par conséquent, étant donnée une séquence d’ARN, à trouver un repliement de cette molécule
dont l’énergie libre est minimale.
Ce contexte de travail s’accompagne de plusieurs choix et contraintes. La première limite
est que la quasi totalité des approches existantes se restreignent à la prédiction de struc-
tures secondaires, sans pseudonœuds, pour des raisons de complexité algorithmique et de
paramétrage du modèle thermodynamique. On suppose en effet que les interactions tertiaires
sont plus faibles que les interactions secondaires et que la somme des énergies libres des
éléments de structure secondaire constitue une approximation raisonnable de l’énergie libre
totale. Par nature, les pseudonœuds sont constitués d’appariements entre des bases relative-
ment éloignées, qui complètent en général une structure secondaire déjà stable. La formation
de pseudonœuds peut altérer la structure secondaire par quelques remaniements, mais ne la
modifie qu’à titre exceptionnel en une structure radicalement différente.
Une seconde limite est que les interactions potentielles avec d’autres molécules telles que
des protéines ou d’autres acides nucléiques ne sont pas prises en compte, bien que celles-ci
puissent concourir à la stabilité de la structure d’un ARN.
Enfin, l’existence sur le papier de plusieurs solutions avec des niveaux d’énergie proches de
l’optimal oblige à considérer un ensemble de solution potentielles, et non une unique solution.
Il faut donc raisonner en termes de solution sous-optimales, et pas simplement optimales.

L’algorithme de Nussinov et Jacobson

La première approche pour la prédiction de structures d’ARN suivant un modèle thermo-

dynamique a été introduite en 1978 par Nussinov [NPGK78]. Entant donnée une séquence
d’ARN, il s’agit de trouver une structure secondaire où le nombre d’appariements est maxi-
mal. Nussinov et Jacobson [NJ80] ont ensuite proposé une adaptation de cette méthode pour
intégrer un modèle énergétique simple où l’énergie libre d’une structure secondaire est obte-
nue en sommant la contribution énergétique (négative) des appariements individuels. Dans

58
 3.1. La prédiction de structures secondaires, état de l’art

les deux cas, le problème se résout par programmation dynamique. Le calcul de la struc-
ture d’énergie libre minimale se décompose ainsi en deux étapes : le remplissage de la table
de programmation dynamique afin de calculer l’énergie libre minimale atteignable, puis la
reconstruction d’une structure optimale par remontée dans la matrice.
Soit une séquence d’ARN s = s[1..n], c’est-à-dire un mot de longueur n sur l’alphabet
{A, C, G, U}. On définit une matrice carrée E de n × n cellules. Chaque cellule E(i, j) de la
matrice E correspond à l’énergie libre de la structure d’énergie libre minimale de la sous-
séquence s[i..j], avec i ≤ j, du mot s. Le remplissage de la matrice E s’effectue en suivant la
relation suivante, illustrée de manière schématique sur la figure 3.1
(
E(i + 1, j)
E(i, j) = min min {E(i + 1, k − 1) + E(k + 1, j) + α(i, k)}
i<k<j

où α(i, k) correspond à la contribution énergétique de l’appariement formé entre le

nucléotide i et le nucléotide j. En pratique, α(i, k) < 0 si les nucléotides aux positions i
et k forment un appariement canonique et si k − i > 3, α(i, k) = +∞ dans les autres cas.

i i+1 j i i+1 k−1 k k+1 j

(a) La base i est libre, l’énergie libre de la (b) La base i est appariée avec une certaine
séquence s[i..j] est alors celle de la séquence base k, l’énergie libre de la séquence s[i..j]
s[i + 1..j]. est alors la somme des énergies associées à
l’appariement de i avec k et aux séquences
s[i + 1..k − 1] et s[k + 1..j].

Fig. 3.1 – Les récurrences de Nussinov et Jacobson présentées de manière schématique.

Par construction, l’énergie libre de la structure d’énergie libre minimale de s se trouve dans
la cellule E(1, n). Pour reconstruire une structure optimale associée à cette valeur d’énergie
libre, on remonte la matrice en partant de la cellule E(1, n) afin de retracer le chemin suivi
dans la matrice pour obtenir cette valeur. La complexité spatiale de l’algorithme est en O(n2 )
à cause du stockage de la matrice carrée E. Chaque cellule de la matrice nécessite un calcul
en temps linéairement proportionnel à longueur de la sous-séquence correspondante. Cet
algorithme a donc une complexité temporelle en O(n3 ).
Bien que cette modélisation soit fortement limitée, l’algorithme défini par Nussinov et
Jacobson est la base de la plupart des algorithmes de prédiction de structures d’ARN qui
visent à déterminer une structure d’énergie libre minimale.

L’algorithme de Zuker
La modélisation adoptée par l’algorithme de Nussinov et Jacobson ne prend pas en compte
de nombreux éléments qui contribuent à stabiliser une structure, comme les empilements
d’appariements, ou à la déstabiliser, comme les régions non appariées.
L’algorithme proposé par Zuker [ZS81, JTZ89, JTZ90] est une extension de l’algorithme
de Nussinov et Jacobson pour le modèle d’énergie plus réaliste de Freier-Turner [TSF88,
MSZT99, MDC+ 04] : empilements d’appariements pour former des tiges, boucles terminant

59
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

une tige, branchements multiples,. . . La figure 3.2 montre une partie des éléments pris en
compte dans ce modèle d’énergie.
Quatre matrices F, C, M etM 1 sont nécessaires au découpage d’une structure dans ce
modèle, comme illustré en figure 3.3. Pour une séquence s = s[1..n],
– F (i, j) correspond à l’énergie libre de la structure d’énergie libre minimale de la sous-
séquence s[i..j] ;
– C(i, j) correspond à l’énergie libre de la structure d’énergie libre minimale de la sous-
séquence s[i..j] où l’appariement entre les nucléotides aux positions i et j est forcé ;
– M (i, j) correspond à l’énergie libre de la structure d’énergie libre minimale de la sous-
séquence s[i..j] sachant que cette sous-séquence fait partie d’un embranchement multiple
comportant au moins une composante, c’est-à-dire une structure quelconque fermée un
appariement ;
– M 1 (i, j) correspond à l’énergie libre de la structure d’énergie libre minimale de la sous-
séquence s[i..j] sachant que cette sous-séquence fait partie d’un embranchement multiple
comportant exactement une composante.
Les récurrences établies par Zuker sont les suivantes.
(
F (i + 1, j)
F (i, j) = min min {C(i, k) + F (k + 1, j)}
i<k<j



 H(i, j)

min {C(k, l) + I(i, j, k, l)}
C(i, j) = min i<k<l<j


 min M (i + 1, u) + M 1 (u + 1, j − 1) + a

i<u<j



 min {(u − i + 1).c + C(u + 1, j) + b}
 i<u<j
M (i, j) = min min {M (i, u) + C(u + 1, j) + b}

 i<u<j

M (i, j − 1) + c

M 1 (i, j − 1) + c
M 1 (i, j) = min
C(i, j) + b

où H(i, j) est l’énergie d’une boucle terminale fermée par l’appariement entre les
nucléotides en position i et j, I(i, j, k, l) est l’énergie d’une boucle interne formée des deux
sous-séquences s[i..j] et s[k..l] et où les variables a, b et c sont des constantes qui proviennent
du modèle d’énergie linéaire des embranchements multiples, à savoir que l’énergie d’un em-
branchement multiple de degré degree et de longueur size est E = a+b.degree+c.size. Le degré
d’un embranchement multiple est le nombre de sous-séquences non appariées qui séparent ses
composantes. La longueur d’un embranchement multiple est la somme des longueurs de ses
régions non appariées, comme illustré sur la figure 3.2.
L’algorithme de Zuker a une complexité temporelle en O(n4 ) et spatiale en O(n2 ). Histori-
quement, on compte deux implémentations strictes de l’algorithme de Zuker : Mfold [Zuk89]
et RNAfold [HFS+ 94]. Ces deux logiciels sont les plus utilisés pour la prédiction de struc-
tures secondaires. Toutefois, une complexité temporelle en O(n3 ) de l’algorithme a pu être
atteinte grâce à un traitement différent des boucles internes basé sur une fonction de coût
concave ou convexe [LZP99]. Des travaux récents de Roytberg et al ont permis d’améliorer

60
 3.1. La prédiction de structures secondaires, état de l’art

5′ 3′ 5′ 3′

i j i j

i+1 j−1

Boucle terminale (degré 1) Empilement (degré 2)

5′ 3′ 5′ 3′
5′ 3′
i j i j
i j

i+1 j−p i+2 j−2 i+3 j−3

Renflement (degré 2) Mésappariement(s) (degré 2)

5′ 3′

i j

i+k j − k′
5′ 3′
i i+k j − k′ j

Boucle interne (degré 2)

5′ 3′

i j

5′ 3′
i j

Embranchement multiple (degré ≥ 3)

Fig. 3.2 – Classification des composantes fermées par un appariement. Les empilements,
renflements et mésappariements sont des cas particuliers de boucles internes.

61
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

Source http://www.zbit.uni-tuebingen.de/pas/EMBO-RNACourse/handouts/HandoutBook.pdf

Fig. 3.3 – Schématisation des règles de décomposition appliquées dans l’algorithme de Zuker.
Les arcs pleins correspondent à des appariements entre des bases reliées. Les traits discontinus
indiquent des régions qui ne contiennent aucun appariement.

encore la complexité temporelle de l’algorithme en prenant en plus en compte les informa-

tions du modèle thermodynamique pour l’évaluation des boucles internes [OSKR06]. Leur
algorithme a une complexité temporelle en O(n2 log2 n). On compte plusieurs variantes heu-
ristiques de cet algorithme, notamment RDFolder [YLLL04] basé sur les simulations de
type Monte-Carlo, et SARNA-predict [TW06, TW07] où la technique retenue est le recuit
simulé.
Plusieurs études montrent que la structure d’énergie libre minimale ne correspond pas
toujours à la conformation adoptée par la molécule dans la cellule [ZS81, TSF88, JTZ89,
JTZ90, MSZT99]. Par exemple, la structure optimale prédite par l’algorithme de Zuker de
certaines séquences d’ARN de transfert n’est pas la structure secondaire correcte en feuille de
trèfle. Sur la figure 3.4 sont représentées la structure optimale et la structure correcte d’un
ARN de transfert qui se replie mal. L’énergie libre de la structure correcte est ici légèrement
plus élevée. Cette structure fait partie des structures sous-optimales.
RNAsubopt [WFHS99], basé sur RNAfold, permet l’énumération de toutes les struc-
tures sous-optimales distantes de l’optimale d’une certaine quantité d’énergie. Cependant,
parmi les structures sous-optimales beaucoup ne diffèrent que de quelques appariements et
il faut donc manuellement rechercher des structures dont l’aspect global est radicalement
différent. Mfold propose par défaut en plus de la structure d’énergie libre minimale, une
sélection de structures sous-optimales ayant un aspect général différent. Cette idée a été cristal-
lisée de manière plus formelle dans le logiciel RNAshapes [SVR+ 06]. Ce logiciel propose plu-
sieurs niveaux d’abstraction des tiges, avec ou sans renflement, avec ou sans mésappariements,
. . . Il utilise une représentation sous forme parenthésée des tiges détectées pour représenter les
structures et sélectionne ainsi des structures différentes, selon le niveau d’abstraction choisi,
parmi les résultats produits par RNAsubopt. Ainsi, pour l’exemple de l’ARN de transfert
présenté en figure 3.4, les trois résultats produits par RNAshapes avec un delta d’énergie de
−5 kcal/mol sont les suivants

62
 3.1. La prédiction de structures secondaires, état de l’art

Shape GGGCCCAUAGCUCAGUGGUAGAGUGCCUCCUUUGCAAGGAGGAUGCCCUGGGUUCGAAUCCCAGUGGGUCCA
[] (((((((((((((((.((((.....(((((((...))))))).))))))))))).........)))))))). -35.9 kcal/mol
[[][]] ((((((((.....((.((((.....(((((((...))))))).))))))(((.......))).)))))))). -32.2 kcal/mol
[[][][]] ((((((...((((.......)))).(((((((...))))))).....(((((.......))))).)))))). -31.7 kcal/mol

GGGCCCAUAGCUCAGUGGUAGAGUGCCUCCUUUGCAAGGAGGAUGCCCUGGGUUCGAAUCCCAGUGGGUCCA
(a) Structure primaire d’un ARN de transfert associé à l’alanine provenant du génome de Natronobac-
terium pharaonis (AB003409.1)

A A
GC
GC GC
GU
CG
GC
CG GU
CG CG
A UA C
UG C
C
CG
AU
CG
G UC
CG G AA
U
UGA UA U UAA
CUCG A C C C G
UG
CG
G GA
AU G GAGU C U G G GU C
UG C U A C U
GC G C
GC
UG C GAUG
G
A
AG U CG
U
GC A UA
G
CG CG
UA
CG
CG
CG UA
U U
U A A
A U C
U C
G G
(b) Structure secondaire d’énergie libre minimale (c) Structure secondaire sous-optimale prédite par
(−35.9 kcal/mol) prédite par RNAfold RNAfold (−31.7 kcal/mol) qui correspond à la
structure secondaire réelle de l’ARN de transfert

Fig. 3.4 – La structure secondaire de gauche correspond à la structure d’énergie libre minimale
prédite pour un ARN de transfert par l’algorithme de Zuker et le modèle d’énergie de Freier-
Turner. La structure de droite est la structure secondaire réelle des ARN de transfert.

L’algorithme de Zuker a été étendu par Eddy et Rivas [RE99] afin de permettre la
prédiction de structures tertiaires d’ARN incluant des pseudonœuds. Ces derniers ont ainsi
pu montrer que la prédiction de structures tertiaires est un problème dont la complexité
temporelle en O(n6 ) est quasiment impraticable sur des séquences de plus d’une centaine
de bases. Toutefois, en restreignant l’investigation à certaines classes de pseudonœuds, des
solutions algorithmiques exactes et efficaces ont été proposées telles que Pknots [RE99] et
Pknots-RG [RSG07]. Le modèle énergétique sous-jacent à la formation des pseudonœuds
reste néanmoins trop flou pour permettre d’établir des prédictions aussi pertinentes que pour
les structures secondaires.
Bon nombre d’approches se sont inspirées de l’algorithme de Zuker en utilisant d’autres
modèles énergétiques pour la prédiction de structures secondaires. CONTRAfold [DWB06]
est une méthode qui adopte un modèle d’énergie obtenu par apprentissage sur un ensemble
de séquences annotées par leur structure connue et vérifiée. Une méthode plus récente, MC-
fold [PM08], adopte un schéma différent du modèle d’énergie de Turner en utilisant une
base de motifs identifiés in silico sur des structures tertiaires d’ARN, les NCM, acronyme
pour Nucleotide Cyclic Motifs. Plusieurs structures jusqu’ici incorrectement prédites grâce

63
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

au modèle de Turner ont ainsi pu être prédites par ce logiciel. Cependant, la recherche de
ces motifs particuliers et leur assemblage pour former une structure secondaire a un coût
algorithmique non négligeable qui limite son utilisation à des séquences relativement courtes.

La fonction de partition
L’approche thermodynamique peut être abordée sous un autre angle avec la fonction de
partition. Le but n’est alors plus de minimiser l’énergie libre mais de maximiser la probabilité
d’une structure donnée d’ARN connaissant l’ensemble des structures que la séquence peut
adopter et la probabilité de formation d’un appariement dans ce contexte. Selon les prin-
cipes de la thermodynamique, la probabilité d’une structure Ψ dans un système équilibré est
proportionnelle à son facteur de Boltzmann
 
−E(Ψ)
exp
RT
où E(Ψ) est l’énergie libre de la structure Ψ, R est la constante du gaz parfait (en
Joules/(Kelvin mol)), T est la température absolue (en Kelvin). L’ensemble des structures
est déterminée par la fonction de partition notée Z. Cette fonction est une grandeur fonda-
mentale qui englobe les propriétés statistiques d’un système à l’équilibre thermodynamique.
Le système considéré ici étant l’ensemble des structures secondaires possibles, la fonction de
partition est définie par
 
X −E (Ψ)
Z= exp
RT
Ψ

Grâce à cette fonction, on peut déterminer la probabilité d’une structure Ψ dans l’ensemble
des structures possibles considérées :
 
exp −E(Ψ)
RT
p(Ψ) =
Z
Cette approche pour calculer la probabilité d’une structure nécessite de calculer la fonc-
tion de partition complète. Directement, ce calcul est impraticable car il demande de cal-
culer l’énergie libre de toutes les structures secondaires possibles dont le nombre croı̂t de
manière exponentielle en fonction de la longueur de la séquence [WFHS99]. Grâce aux tra-
vaux de McCaskill [McC90], la fonction de partition peut être calculée de manière partielle et
récursivement par programmation dynamique avec une complexité spatiale en O(n2 ) et tem-
porelle en O(n3 ). Pour expliquer l’idée mise en œuvre par McCaskill, on se place dans le cas
du modèle énergétique simple utilisé dans l’algorithme de Nussinov et Jacobson où l’énergie
d’un structure est obtenue en sommant les contribution des appariements individuels. Soit
Z(i, j) la fonction de partition pour toutes les structures de la séquence s[i..j]
 
X −α(i, j)
Z(i, j) = Z(i + 1, j) + Z(i + 1, k − 1)Z(k + 1, j) exp
RT
k

Cette formule peut être obtenue en transformant l’équation de récurrence utilisée dans
l’algorithme de Nussinov et Jacobson présentée à la page 58 en remplaçant les opérations
de minimisation par des sommes, les sommes par des multiplications, et les énergies par les

64
 3.1. La prédiction de structures secondaires, état de l’art

facteurs de Boltzmann correspondants. L’intérêt de cette décomposition est également de

pouvoir en dériver le calcul de la probabilité de la formation d’un appariement entre deux
nucléotides i et j.
X
p(i, j) = p(Ψ)
(i,j)∈Ψ
Toujours grâce aux travaux de McCaskill, cette probabilité peut être calculée
récursivement grâce à la relation suivante
 
exp −α(i,j)
RT
p(i, j) = Ẑ(i, j)Z(i + 1, j − 1)
Z
où Ẑ(i, j) est la fonction de partition de l’ensemble des structures qui ne font pas intervenir
la séquence s[i..j].
Il existe plusieurs implémentations de la fonction de partition pour la prédiction de struc-
ture secondaire : RNAfold, Sfold [DL99, DCL04] et une implémentation pour machines
massivement parallèles [FHS00]. Bien que l’algorithme de prédiction “classique” et la fonc-
tion de partition apportent des résultats équivalents en terme de prédiction de structure
secondaire [HGK97], la fonction de partition ouvre d’autres possibilités applicatives telle que
l’échantillonnage de structures et de motifs structuraux [DL01, DL03].

3.1.2 La prédiction par analyse comparative

L’analyse comparative aborde le problème de la prédiction de structure lorsque l’on dis-
pose de plusieurs séquences homologues. Dans ce contexte, le gain d’information apporté
par l’utilisation de plusieurs séquences est double. Des ARN non-codants homologues par-
tagent une fonction induite par une structure commune mieux conservée que leur structure
primaire durant l’évolution. Lorsque l’on dispose de plusieurs séquences dont on suppose
qu’elles partagent une fonction liée à leur structure, il est donc naturel de rechercher leur
structure commune, et les programmes de prédiction de structures communes sont donc plus
fiables et plus robustes que les programmes de prédiction de structures à partir d’une seule
séquence. De plus, les prédictions de structures communes peuvent être confortées par la
présence de mutations compensatoires induites par la conservation d’une structure au cours
de l’évolution (section 1.4.4). La figure 3.5 montre un exemple de mutations compensatoires
sur un alignement de sept séquences d’ARN de transfert.
On distingue deux approches dans les méthodes de prédiction par analyse comparative :
celles qui recherchent une structure commune sur des séquences préalablement alignées, et
celles qui travaillent sur des séquence non alignées. Ces deux approches sont complémentaires
et le choix d’une approche plutôt que l’autre dépend principalement du degré de conservation
des séquences à replier (section 1.5). Un approche plus récente et toute aussi originale, RNA-
cast [RG05], combine les prédictions individuelles de RNAshapes pour détecter parmi les
structures sous-optimales individuelles une structure globalement conservée selon son aspect
général.

Aligner et replier simultanément, l’algorithme de Sankoff

Une première manière d’exploiter l’information contenue dans un ensemble de séquences
est de rechercher à replier simultanément toutes les séquences. L’algorithme de Sankoff est

65
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

GUCCGAAUAGCUCAGCUGGAUAGAGCAA U AGCCUUCUAAGCU A UCGGUCGGGGGUUCGAAUCCCUCUUCGGACGCCA

GCACUCGUAGCUUAAC-GGAUAAAGCAU U UGACUACGGAUCA G AAGGUUGCAGGUUCGAAUCCUGCCGAGUGCA---
GUCCACGUAGCUCAGGAGGAUAGAGCAC A GGAUUCCUAAUCC U GGGGUUGGAGGUUCGAAUCCUCUCGUGGACACCA
GCGCCCGUAGCUCAAUUGGAUAGAGCGU U UGACUACGGAUCA A GAGGUUAUGGGUUCGACUCCUAUCGGGCGCG---
GCACCCAUAGCGCAACUGGAUAGAGUGU G UGACUACGAAUCA C AAGGUUGUAGGUUCGAGUCCUACUGGGUGCA---
GCGCCCGUAGCUCAAUUGGAUAGAGCGU U UGACUACGGAUCA A AAGGUUAGGGGUUCGACUCCUCUCGGGCGCGCCA
GCGCCCUUAGCUCAGUUGGAUAGAGCAA C GACCUUCUAAGUC G UGGGCCGCAGGUUCGAAUCCUGCAGGGCGCGCCA
↑ ↑ ↑ ↑
m1 c1 c2 m2

Fig. 3.5 – Alignement de sept séquences d’ARN de transfert, avec représentation de la struc-
ture commune. Les deux colonnes isolées c1 et c2 participent à un même appariement et font
apparaı̂tre des mutations compensatoires.

l’algorithme de référence pour ce problème [ZS84, San85]. Il procède au repliement simultané

de deux séquences par programmation dynamique et produit donc par la même un aligne-
ment de ces séquences. Par souci de clarté et de lisibilité, nous allons présenter la version
de l’algorithme de Sankoff basée sur le modèle énergétique utilisé par Nussinov et Jacobson
plus simple à appréhender que la version basée sur le modèle énergétique de Turner où la
multiplicité des décompositions rend les relations rapidement illisibles. Toutes les remarques
effectuées par la suite restent néanmoins valables, en particulier les notions de complexité.
Soient deux séquences d’ARN s1 = s1 [1..n] et s2 = s2 [1..m] et une matrice S de dimension
n×n×m×m. Chaque cellule S(i, j, k, l) de la matrice S correspond à l’énergie libre minimale
du repliement commun des sous-séquences s1 [i..j] et s2 [k..l]. Le remplissage de la matrice
s’effectue suivant la relation

S(i, j, k, l) = min

 S(i + 1, j, k, l)




 S(i, j, k + 1, l)

 min {S(i + 1, p − 1, k, l) + S(p + 1, j, 0, 0) + α(s1 [i], s1 [p])}


 i<p<j

 min {S(i + 1, p − 1, 0, 0) + S(p + 1, j, k, l) + α(s1 [i], s1 [p])}

i<p<j

 min {S(i, j, k + 1, q − 1) + S(0, 0, q + 1, l) + α(s2 [k], s2 [q])}

 k<q<l



 min {S(0, 0, k + 1, q − 1) + S(i, j, q + 1, l) + α(s2 [k], s2 [q])}

 k<q<l


 min {S(i + 1, p − 1, k + 1, q − 1) + S(p + 1, j, q + 1, l) + α′ (s1 [i], s1 [p], s2 [q], s2 [k])}
 i<p<j
k<q<l

où α(s1 [i], s1 [j]) correspond à la contribution énergétique apportée par l’appariement
entre s1 [i] et s1 [j] telle qu’elle est utilisée dans l’algorithme de Nussinov et Jacobson, et

66
 3.1. La prédiction de structures secondaires, état de l’art

α′ (s1 [i], s1 [j], s2 [k], s2 [l]) correspond à la contribution énergétique apportée par l’appariement
conjoint entre s1 [i] et s1 [j] d’une part, et s2 [k] et s2 [l] d’autre part. La définition la plus na-
turelle pour α′ consiste à prendre la somme des contributions énergétiques des appariements
individuels

α′ (s1 [i], s1 [j], s2 [k], s2 [l]) = α(s1 [i], s1 [j]) + α(s2 [k], s2 [l])

On peut introduire un facteur bonifiant les appariements conjoints afin de favoriser les
corepliements en présence de mutations, particulièrement en présence de mutations compen-
satoires. Un malus peut également être considéré en cas d’introduction d’insertion ou de
délétion, c’est-à-dire dans les deux premières règles.
L’algorithme de Sankoff a une complexité temporelle en O(n3 m3 ) et une complexité
spatiale en O(n2 m2 ). Cet algorithme peut être étendu à plus de deux séquences. Pour N
séquences, sa complexité temporelle est alors en O(l3N ) et sa complexité spatiale en O(l2N ),
où l est la longueur de la plus longue des séquences traitées.
La complexité élevée de l’algorithme de Sankoff, même sur deux séquences, le rend im-
praticable sur des séquences qui dépassent la centaine de nucléotides. Il existe cependant de
nombreuses déclinaisons de cet algorithme qui tentent de traiter ce problème. Seule une partie
d’entre elles sont présentées, les plus originales. FoldAlign [HLG05, HTG07] implante une
version où les embranchements multiples sont interdits et seules les tiges terminées par une
boucle terminale sont considérées. La restriction appliquée dans Dynalign [MT02, HSM07]
est une borne maximale sur la distance qui sépare des nucléotides alignés, ce qui permet
de restreindre l’exploration de la matrice S à son hyperdiagonale. Dans Consan [DE06] et
Stemloc [Hol05], des régions fortement conservées sont identifiées entre les séquences pour
produire un alignement grossier des séquences, ce qui permet de contraindre la formation
d’appariements respectueux de cet alignement.
Toujours inspirées de l’algorithme de Sankoff, d’autres heuristiques s’attachent à la
prédiction de structures communes à plus de deux séquences. FoldAlignM [THG07] réalise
un alignement global de manière progressive à partir des alignements deux à deux générés
par FoldAlign pour produire une structure globalement conservée. Cette manière de passer
de deux à plus de séquences est fortement inspirée de PMcomp/PMmulti [HBS04], nouvel-
lement LocaRNA [WRH+ 07], également repris dans StrAl [DWMS06]. Dans ces logiciels,
les repliements deux à deux sont réalisés par comparaison des matrices de probabilité d’appa-
riement produite à l’aide de la fonction de partition. Murlet [KTKA07] réalise de manière
itérative une alignement multiple des séquences à partir des repliements deux à deux calculés
par l’algorithme de Sankoff restreint à la manière de Consan, c’est-à-dire en établissant un
alignement préliminaire entre les séquences. Cette idée d’alignement préliminaire est reprise
dans MxscaRNA [TTKA06, TKKA08] où cette fois seules les parties ouvrantes et fermantes
des tiges sont alignées. L’alignement par morceaux ainsi obtenu est ensuite utilisé pour inférer
une structure globale.

Aligner puis replier

Nous avons vu que l’algorithme de Sankoff et ses déclinaisons permettent d’inférer une
structure commune pour un ensemble de séquences non alignées. On peut également aborder
le problème en commençant par aligner les séquences sur la base de la structure primaire,
puis en cherchant une structure commune compatible avec l’alignement. Cela présente deux

67
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

avantages : la complexité algorithmique est moindre, et on peut améliorer la prédiction en

utilisant la présence de mutations compensatoires, observables directement entre les couples
de positions de l’alignement.

La corrélation des colonnes, l’information mutuelle La mesure de corrélation des

colonnes la plus utilisée est tirée de la théorie de l’information de Shannon : elle mesure
l’information mutuelle entre deux colonnes [CK91]. Etant donné un alignement multiple, fi (x)
désigne la fréquence d’apparition du nucléotide x dans la colonne i de l’alignement et fij (x, y)
la fréquence d’apparition du couple de nucléotides (x, y) dans les colonnes i et j. L’information
mutuelle des deux colonnes i et j est définie par
 
X fij (x, y)
Mij = fij (x, y) log2
x,y
fi (x)fj (y)

La valeur de Mij varie entre 0 et 2 bits et mesure le degré de corrélation des deux co-
lonnes. Elle est maximale lorsque les deux colonnes sont parfaitement corrélées, c’est-à-dire
qu’un appariement est totalement absent ou conservé, et que leur contenu individuel est
pourtant totalement aléatoire, c’est-à-dire que toutes les nucléotides apparaissent de manière
équiprobable. Mij est nulle en l’absence de mutation dans les deux colonnes ou lorsque les
colonnes varient de façon indépendante, c’est-à-dire fij (x, y) = fi (x)fj (y). Des corrections
peuvent être apportées à cette mesure pour prendre en compte la composition globale des
séquences ou encore un arbre phylogénétique pour prendre en compte le taux de mutations
attendues par colonne [KH99, GHH+ 94]. Sur l’exemple de la figure 3.5, l’information mu-
tuelle des deux colonnes appariées c1 et c2 qui présentent des mutations compensatoires est
de 1,37 bit, alors qu’entre les colonnes non appariées m1 et m2 cette valeur est de 0,52 bit.
L’information mutuelle constitue la noyau de bon nombre de méthodes de prédiction de
structure à partir d’un alignement. La plupart de ces méthodes utilisent cette information
comme score soit à la place de l’information énergétique pour les méthodes à base de l’algo-
rithme de Zuker, soit comme bonus ou malus complémentaire à une approche énergétique.
RNAalifold [HFS02] est actuellement la méthode plus utilisée pour la prédiction de
structure secondaire à partir d’un alignement, car cette méthode est celle qui exploite le
modèle énergétique de Turner. Son fonctionnement repose sur l’algorithme de Zuker généralisé
à un alignement. La contribution énergétique d’un appariement entre deux colonnes est sim-
plement calculée en moyennant les contributions individuelles. Un bonus est appliqué en fonc-
tion de la corrélation entre les colonnes appariées. Ilm [RSZ04a, RSZ04b] est une méthode
strictement analogue à RNAalifold où l’algorithme de repliement adapté à l’alignement
multiple est celui de Nussinov et Jacobson. Plus récemment, RNAlishapes [Vos06] est en
fait une variante de RNAalifold où l’algorithme de repliement est une version modifiée
de RNAshapes : le repliement est effectué entre des représentations abstraites des struc-
tures optimales et sous-optimales prédites individuellement. L’algorithme travaille ainsi au
niveau des tiges en tentant de faire correspondre les parties ouvrantes d’une même tige
conservée d’une part, et les parties fermantes correspondantes d’autre part. Cove [ED94],
Pfold [KH99, KH03] et CMFinder [YWR06] sont trois méthodes à base de grammaire sto-
chastiques hors contexte entraı̂nées sur des séquences exemples et où l’information mutuelle
mesurée entre les colonnes est utilisée comme pondération des informations apprises. Pfold
présente toutefois une originalité supplémentaire : la mesure de l’information mutuelle peut

68
 3.1. La prédiction de structures secondaires, état de l’art

être affinée pour tenir compte de la distance évolutive qui sépare les espèces dont sont issues
les séquences.
P-DCfold [TGR02, TER03, TER05, Eng06, ET07] propose une alternative originale
aux méthodes citées précédemment. Le logiciel commence par chercher des séquences palin-
dromiques conservées et alignées qui exhibent une ou plusieurs mutations compensatoires.
Puis en appliquant une heuristique gloutonne, il construit successivement des ensembles de
palindromes tous compatibles entre eux, c’est-à-dire sans croisement ni chevauchement. Cette
approche de type “diviser pour régner” permet d’une part de réduire de manière drastique la
complexité du repliement et d’autre part d’autoriser la formation de pseudonœuds.

3.1.3 BRAliBase I, le benchmark de référence

En 2004, Gardner propose BRAliBase I [GG04], un benchmark pour évaluer les
méthodes de prédiction de structure. Dans un premier temps, nous présentons les données et
les critères sur lesquels sont évaluées les méthodes. Par la suite nous présentons les résultats
des méthodes testées dans BRAliBase I parmi lesquelles figure caRNAc, notre méthode
de prédiction de structure dont nous parlons plus en détails dans la section 3.3.

Description des données

BRAliBase I contient quatre familles d’ARN non-codants : des ARN ribosomiques, pe-
tite sous-unité et grosse sous-unité, des ARN de transfert et des ARN de RNase P. Chaque
famille est divisée en deux groupes dont les caractéristiques sont rappelées dans la table 3.1 :
un groupe de séquences moyennement conservées (medium) dont l’identité moyenne est com-
prise entre 60% et 80%, et un autre groupe de séquences bien conservées (high) dont l’identité
moyenne est supérieure à 80%. Pour chaque groupe, la structure correcte d’une séquence est
donnée pour permettre l’évaluation des prédictions réalisées. Ces structures sont déduites
d’alignements multiples construits manuellement accompagnés des structures individuelles
vérifiées provenant de la littérature.

Jeu de Longueur Identité moyenne (%) Nb. séq.

données moyenne medium high medium high
LSU 2904 72,0 88,1 11 11
SSU 1542 80,0 90,7 11 11
RNaseP 377 67,1 81,5 11 9
tRNA 73 60,0 84,4 11 11

Tab. 3.1 – Description générale des jeux de données de BRAliBase I.

Evaluation de la qualité des structures prédites

Les structures prédites sont évaluées par rapport à la structure de référence de chaque
groupe grâce à trois mesures : la sensibilité, la spécificité, le cœfficient de corrélation de
Matthews (M CC). La spécificité est calculée de la manière suivante

TP
Sp =
T P + (F P − ξ)

69
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

où T P est le nombre de vrais positifs, c’est-à-dire le nombre d’appariements correctement

prédits, et F P est le nombre de faux positifs, c’est-à-dire le nombre d’appariements prédits
qui n’existent pas dans la structure de référence. Les faux positifs sont ici séparés en trois
groupes : les appariements inconsistants, les appariements contrariant et les appariements
compatibles. Un appariement prédit entre deux bases i et j est inconsistant si, et seulement
si, i ou j est appariée avec une autre base dans la structure de référence. Un appariement
prédit entre deux bases i et j est contrariant si, et seulement si, il existe un appariement entre
deux bases k et l dans la structure de référence tel que k < i < l < j, c’est-à-dire que l’ajout
de l’appariement entre les bases i et j dans la structure de référence produit un pseudonœud.
Enfin, un appariement prédit entre deux bases i et j est compatible si, et seulement si, il
n’est pas inconsistant ou contrariant. Le paramètre ξ présent dans le calcul de la spécificité
désigne le nombre d’appariements compatibles.
Le cœfficient de corrélation de Matthews peut être vu comme une mesure synthétisant la
sensibilité et la spécificité, dont la définition adaptée dans BRAliBase I est

T P × F N − (F P − ξ) × F N
M CC = p
(T P + (F P − ξ))(T P + F N )(T N + (F P − ξ))(T N + F N )

Résultats des méthodes de prédiction testées

La figure 3.6 présente les résultats de BRAliBase I provenant de l’article de Gard-
ner [GG04]. Globalement, les méthodes qui travaillent sur des ensembles de séquences, quelque
soit leur approche, se distinguent nettement des approches purement thermodynamiques.
Parmi les méthodes les plus performantes, trois méthodes se dégagent significativement :
RNAalifold, Pfold et caRNAc. Les auteurs de BRAliBase I ont remarqué que caR-
NAc était une méthode particulièrement spécifique qui avait tendance à prédire moins d’ap-
pariements que les autres méthodes, mais qu’en contrepartie les appariements prédits étaient
plus fiables. Ils ont donc proposé un protocole pour compléter les structures prédites par
caRNAc. Pour cela ils effectuent un repliement purement thermodynamique avec RNA-
fold d’une séquence de chaque jeu de données où ils contraignent RNAfold d’intégrer
tous les appariements prédits par caRNAc. Ce protocole permet d’améliorer nettement la
sensibilité de caRNAc, sans altérer sa spécificité. Dans cette configuration, les résultats de
caRNAc sont comparables à ceux de RNAalifold et Pfold qui, rappelons le, travaillent
sur séquences alignées. De plus, les résultats de caRNAc sont beaucoup plus stables d’un
jeu de données à un autre avec une sensibilité et une spécificité minimum supérieure à 70%,
contre moins de 60% pour RNAalifold.

3.2 La prédiction de gènes à ARN

Dans le chapitre précédent, nous avons vu qu’il existait diverses approches pour la
prédiction de gènes à protéines ou plus généralement de régions codantes : les approches ab
initio (section 2.1), les approches par homologie (section 2.2), et les approches comparatives
(section 2.3). Des approches analogues sont disponibles pour la prédiction de gènes à ARN.
Chronologiquement, le schéma adopté montre également une certaine symétrie. Les premières
investigations menées ont porté sur la recherche de biais de composition dans les gènes à ARN
dont le perfectionnement a donné lieu à des approches de prédiction ab initio. En parallèle,
plusieurs méthodes de recherche par homologie avec des séquences connues contenues dans les

70
 3.2. La prédiction de gènes à ARN

(a) Résultats des approches qui suivent le para- (b) Résultats des approches qui suivent le para-
digme “Aligner puis replier” comparés aux ap- digme “Aligner et replier simultanément” com-
proches thermodynamiques. parés aux approches thermodynamiques.

Fig. 3.6 – Résultats de BRAliBase I présentés par type d’approche en fonction de la

spécificité, en abscisse, et de la sensibilité, en ordonnée.

banques de données se sont développées. Par la suite, les approches comparatives ont fait leur
apparition, intégrant à la fois des informations de similarité et des informations intrinsèques
aux séquences.
La prédiction de gènes à ARN est un problème plus complexe que la prédiction de gènes
codants pour plusieurs raisons. On ne dispose pas des signaux forts présents dans les gènes
codants : l’existence d’un cadre ouvert de lecture et les biais dans l’usage des codons. De plus,
contrairement aux gènes codants, la production de certains ARN non-codants ne suit pas
le schéma classique “un gène pour une molécule” : certains ARN non-codants sont localisés
dans les introns d’autres gènes ou encore dans les régions non traduites des ARN messagers.
A cause de ce type d’ARN, il devient plus compliqué d’exploiter les signaux qui balisent
traditionnellement les gènes. Enfin, les propriétés à l’origine de la fonction des ARN varient
d’une famille d’ARN à une autre : certaines familles sont caractérisées par la seule conserva-
tion d’un motif de séquence, d’autres par une structure commune. Pour toutes ces raisons,
des méthodes de prédiction d’ARN non-codants ad hoc ont été développées, c’est-à-dire des
méthodes qui ciblent une seule famille d’ARN non-codants. L’idée est alors de rechercher des
séquences ou de vérifier si des séquences respectent un ensemble de contraintes qui décrivent
les propriétés conservées au sein d’une famille particulière.
L’organisation de cet état de l’art est calquée sur celui des méthodes de prédiction de
séquences codantes du chapitre 2. Nous envisageons dans un premier temps les approches ab
initio, c’est-à-dire l’exploitation de signaux exclusivement présents dans les séquences d’ARN
non-codants. Dans la section 3.2.1, nous nous intéressons donc à l’analyse de différents biais
de composition des séquences d’ARN non-codants liés à la formation d’une structure. Cette
analyse nous conduit naturellement vers l’analyse de la stabilité des structures d’ARN non-
codants présentée dans la section 3.2.2. Ensuite, nous nous intéressons aux méthodes de
prédiction d’ARN non-codants par homologie, c’est-à-dire la recherche de séquences homo-
logues dans les banques de données. Dans la section 3.2.3, deux types de similarité sont ainsi
envisagées : au niveau nucléique et au niveau structural. Enfin, nous clôturons cet état de
l’art par les approches comparatives de prédiction d’ARN non-codants (section 3.2.4).

71
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

3.2.1 Les biais de composition en séquence

Comme il existe un biais de composition dans la séquence codante d’un gène à protéine, on
peut supposer qu’il existe également un biais de composition dans la séquence d’un ARN non-
codant structuré. Certains appariements sont plus stables que d’autres, ce qui peut introduire
un biais de composition en mono-nucléotides. L’adjacence des appariements est également
importante. Ces empilements contribuent en effet beaucoup à la stabilité des structures, ce
qui peut introduire un biais de composition en di-nucléotides (sections 1.3.1 et 3.1.1).
Dans [Sch02], Schattner s’est intéressé à l’existence de biais de composition dans les
séquences d’ARN non-codants dont la fonction dépend essentiellement de leurs structures.
Cette étude a été menée sur des ARN de transfert, des ARN ribosomiques, des ARN nucléaires,
des ARN nucléolaires et des SRP de trois organismes : la bactérie Methanococcus jannaschii,
le ver Caenorhabditis elegans et le parasite Plasmodium falciparum. Les mesures effectuées
sont la fréquence d’apparition des bases G et C et la fréquence d’apparition du di-nucléotide CG
normalisée par les fréquences d’apparition des nucléotides G et C notée ρ(CG). Les résultats
obtenus sont rapportés dans la table 3.2.
(a) Résultats sur les ARN non-codants.
Organisme Nb séq. (G+C)% ρ(CG)
Methanococcus jannaschii 44 63.1 (7.3) 0.75 (0.24)
Caenorhabditis elegans 59 32.1 (7.2) 0.94 (0.56)
Plasmodium falciparum 59 53.5 (8.2) 0.96 (0.23)
(b) Résultats sur les génomes.
Source (G+C)% ρ(CG)
Methanococcus jannaschii 31.4 (6.9) 0.34 (0.47)
Caenorhabditis elegans (chr. II) 20.0 (8.4) 0.75 (1.30)
Plasmodium falciparum (chr. I) 35.9 (8.8) 1.03 (0.68)

Tab. 3.2 – Résultats des mesures effectuées dans [Sch02]. (G+C)% correspond à la moyenne du
pourcentage en G et en C observé. ρ(CG) correspond à la moyenne de la fréquence normalisée
du di-nucléotide CG. Les valeurs entre parenthèses sont les écarts-types associés.

Dans chacun des trois organismes, le pourcentage en G et en C des séquences d’ARN

non-codants est en moyenne plus élevé que celui de leur génome. Pour Methanococcus janna-
schii et Caenorhabditis elegans, le di-nucléotide CG apparaı̂t plus fréquemment dans les ARN
non-codants que dans le reste de leur génome. Cependant, ce di-nucléotide est globalement
sous-représenté dans les génomes de ces organismes par rapport aux nucléotides C et G, c’est-
à-dire que les di-nucléotides CG et GC n’apparaissent pas de manière équiprobable, compte
tenu des fréquences d’apparition des nucléotides C et G. Dans Plasmodium falciparum, le
phénomène inverse se produit puisque le di-nucléotide CG est légèrement moins fréquent dans
les ARN non-codants que dans son génome. Globalement, ces observations font apparaı̂tre
une grande variabilité du pourcentage en G et C ainsi que de la fréquence d’apparition du
di-nucléotide CG entre les organismes. Les valeurs des écarts-types montrent également que
cette variabilité existe au sein même d’un organisme. Par la suite, les expériences ont été
focalisées sur la prédiction de gènes à ARN chez Methanococcus jannaschii en mesurant lo-
calement les fréquences en mono- et di-nucléotides. Après divers ajustements, les meilleurs
résultats obtenus permettent de retrouver les 44 ARN non-codants contenus dans le génome

72
 3.2. La prédiction de gènes à ARN

de Methanococcus jannaschii, mais également 28 régions supplémentaires, ce qui représente

tout de même près de 40% de prédictions fausses. Bien que peu d’organismes aient été pris
en compte dans ces expériences, les résultats de cette étude démontrent qu’il existe des biais
de composition significatifs en di-nucléotides dans les séquences d’ARN non-codants pour cer-
tains organismes mais que le signal apporté est à lui seul insuffisant pour détecter de manière
fiable des ARN non-codants.
En parallèle des travaux de Schattner, d’autres se sont intéressés aux organismes hyper-
thermophiles dont fait partie Methanococcus jannaschii. Le génome de ces organismes, riche
en A et en T, constitue un terrain plus propice à détecter des biais de composition dans les
séquences d’ARN non-codants structurés [KME02]. Les auteurs utilisent ici un modèle de Mar-
kov caché entraı̂né sur tous les ARN non-codants connus d’organismes hypertermophiles afin
de prédire des régions susceptibles de contenir de nouveaux ARN non-codants. Néanmoins,
cette étude utilise un logiciel supplémentaire pour confirmer ces prédictions, Qrna présenté
dans la section 3.2.4, dont les fondements dépassent la simple recherche par biais de compo-
sition.
En marge de la recherche de biais de composition en mono- et di-nucléotides, une autre
méthode, RNAGenie [CDH01], s’attache à la recherche de motifs structuraux qui pourraient
trahir la présence d’ARN non-codants. Des ARN fonctionnels partagent en effet des éléments
de structure dont une grande partie sont représentées par des motifs dans les séquences corres-
pondantes (section 1.3.1). L’idée maı̂tresse est que ces motifs apparaissent plus fréquemment
dans les séquences d’ARN non-codants que dans d’autres types de séquences. La classification
à partir des fréquences d’occurrences de toute une série de motifs, complétées par d’autres
mesures comme la composition en mono- et di-nucléotides, est confiée à un réseau de neu-
rones entraı̂né à partir de séquences de deux souches d’Escherichia coli. Les performances de
RNAGenie sont évaluées sur les génomes de huit organismes. Entre 80% et 90% des ARN
non-codants sont correctement détectés avec une proportion de prédictions positives erronées
en moyenne inférieure à 15%. Ces résultats restent néanmoins assez variables selon les or-
ganismes allant de 64% de spécificité pour 68% de sensibilité à plus de 90% de spécificité
pour 90% de sensibilité. Si l’on regarde de plus près ce que le réseau de neurones a appris,
on constate que les entrées les plus informatives sont les fréquences des nucléotides G et U,
ainsi que des fréquences d’apparition des di-nucléotides CU, GU et GG. Les motifs structuraux
ne participent que faiblement au processus de décision. Les résultats de RNAGenie sur Me-
thanococcus jannaschii sont meilleurs que les résultats obtenus par la méthode de Schattner.
L’amélioration provient essentiellement d’un processus d’apprentissage plus fin et de l’uti-
lisation des fréquences de tous les mono- et di-nucléotides. Ces travaux montrent que les
motifs structuraux apportent moins d’information que les biais de composition en mono- et
di-nucléotides pour la détection d’ARN non-codants. Le peu de variété des organismes utilisés
ne permet toutefois pas de tirer des conclusions générales. De plus, les résultats de RNAGe-
nie ne sont pas reproductibles car la méthode n’est pas disponible librement et les auteurs
ne sont pas disposés à le fournir à titre académique.

3.2.2 La stabilité thermodynamique

La recherche de biais de composition décrite précédemment n’offre pas un signal suffisant
pour une détection systématique des ARN non-codants structurés. L’une des raisons est que
les biais de composition recherchés porte sur la détection de régions susceptibles de contenir
des appariements particulièrement stables mais ne capte pas nécessairement le potentiel total

73
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

d’une région à former une structure complète fonctionnelle. Les programmes de prédiction
de structures qui adoptent une approche thermodynamique (section 3.1.1) sont conçus pour
fournir la structure d’énergie libre minimale qui peut se former à partir d’une séquence.
Quelque soit la séquence choisie, ces programmes prédisent toujours une structure. Seule,
l’existence d’une structure prédite n’est donc pas informative. C’est pourquoi il est nécessaire
de s’intéresser plus précisément à la qualité, en terme de stabilité thermodynamique, des
structures prédites.
Pour qu’une structure se forme, de nombreux appariements se font puis se défont jusqu’à
ce qu’un état stable soit atteint. On peut donc s’attendre à ce que les structures des ARN non-
codants soient remarquablement stables et caractérisées par une énergie libre particulièrement
faible. Evaluer la significativité de la stabilité d’une structure nécessite de disposer d’une
distribution de l’énergie libre avec laquelle effectuer la comparaison. Il n’existe cependant
aucune théorie pour la construire, elle est donc établie de manière empirique grâce à de
nombreuses séquences aléatoires équivalentes. Le protocole suivi pour évaluer la significativité
de la stabilité d’une structure est le suivant. A partir d’une séquence s,
1. calculer E, l’énergie libre minimale de la structure optimale prédite pour s ;
2. construire la distribution de l’énergie libre, c’est-à-dire inférer les structures d’un grand
nombre de séquences aléatoires obtenues par mélange de s ou en utilisant un processus
Markovien, de telle sorte que la composition en mono-nucléotides et/ou en di-nucléotides
de s soit conservée ;
3. évaluer la significativité de E à partir de la distribution obtenue grâce au z-score ou à
la P-valeur de E ; ces mesures sont équivalentes en terme d’information apportée.
Le z-score de E mesure l’écart de E par rapport à la distribution. On l’obtient en calculant
le rapport
E−µ
σ
où µ et σ sont respectivement la moyenne et l’écart-type de la distribution. Comme l’énergie
libre est à valeur négative, plus le z-score de E est faible, plus la structure optimale de s est
stable. La seconde mesure que l’on utilise est la P-valeur de E, qui correspond à la probabilité
d’obtenir une valeur d’énergie libre inférieure ou égale à E dans la distribution. Plus la P-
valeur de E est proche de 0, plus le nombre de structures prédites ayant une énergie libre
inférieure est faible. Par conséquent, plus la P-valeur de E est faible, plus la stabilité de la
structure optimale de s est significative.
Toute la difficulté dans ce processus d’évaluation réside dans la constitution de la distribu-
tion, et donc dans le choix de la composition des séquences. La conservation de la composition
mono-nucléotidique de s permet de tenir compte d’un éventuel biais de composition en G et
en C de s dû à l’existence d’une structure. La conservation de la composition di-nucléotidique
de s a une propriété supplémentaire : prendre en considération la formation éventuelle d’em-
pilements d’appariements.

Composition mono-nucléotidique équivalente

Dans un première étude de la stabilité des structures d’ARN non-codants [RE00], Rivas et
al ont cherché à estimer si l’énergie libre d’une structure optimale potentielle était significative
par rapport à des séquences de composition équivalente. Ils ont donc mesuré les variations du
pourcentage en G et en C et les variations de l’énergie libre d’une structure optimale locale

74
 3.2. La prédiction de gènes à ARN

sur un fragment du génome de Caenorhabditis elegans contenant deux ARN de transfert, et

sur le même fragment où les structures des ARN de transfert ont été détruites sans dénaturer
la composition locale en mono-nucléotides.
Les observations réalisées montrent que les variations de l’énergie libre d’une structure
optimale sont liées à un biais de composition en G et en C et n’apportent donc pas plus d’in-
formation que les variations de composition en mono-nucléotides. Cette affirmation est vérifiée
en plongeant un ARN de transfert de Caenorhabditis elegans dans une séquence aléatoire de
même composition mono-nucléotidique : l’ARN de transfert est alors indétectable en obser-
vant les variations locales de l’énergie libre.
Pour pouvoir généraliser leurs observations sur les ARN de transfert, ils ont calculé les z-
scores de l’énergie libre de 243 ARN non-codants. Ces ARN sont issus de diverses familles : des
SRP, des petits ARN nucléolaires, des RNaseP et des télomérases. La distribution des z-scores
obtenus est donnée en figure 3.7. Sur ce graphique, la négation des z-scores est représentée,
c’est-à-dire que les z-scores les plus élevés correspondent aux énergies libres les plus faibles.

Fig. 3.7 – Distribution de la négation des z-scores de l’énergie libre des structures de 243
ARN non-codants par rapport à des structures optimales de séquences aléatoires de même
composition en mono-nucléotides.

L’observation réalisée sur les ARN de transfert n’est pas valable pour toutes les familles
d’ARN non-codants : en moyenne, les structures d’ARN non-codants sont plus stables que
les structures optimales de séquences aléatoires équivalentes. Cependant, la stabilité moyenne
des ARN non-codants n’est pas assez significative pour constituer un signal suffisant pour
les détecter lorsque la distribution de référence est construite avec des séquences de même
longueur et de même composition en mono-nucléotides. Cette étude a tout de même donné lieu
au développement d’un logiciel, ncRNAScan, qui réalise des prédictions d’ARN non-codants
structurés selon ce procédé.

Composition di-nucléotidique équivalente

Les expériences précédentes ont été reprises dans [BWRVdP04] en considérant des
séquences de même composition en di-nucléotides pour 500 ARN de transfert, 581 ARN
ribosomiques et 506 micro ARN. Les résultats révèlent que les micro ARN possèdent
systématiquement des structures plus stables que des structures de séquences aléatoires de
même composition en di-nucléotides. Les structures des ARN ribosomiques et des ARN de
transfert ne sont pas systématiquement plus stables, mais en moyenne plus stables.

75
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

Ces investigations ont été étendues à 300 familles d’ARN non-codants [CFKK05]. Cette
étude ouvre des perspectives intéressantes quant à la conservation de la composition di-
nucléotidique pour mesurer la significativité de la stabilité des structures d’ARN non-codants.
Le tableau 3.3 reprend une partie de leurs résultats.

z-score Ecart-type z-score z-score P-valeur

Famille Nb. séq.
moyen des z-scores maxi mini moyenne
ARNt 530 −1,591 0,890 0,732 −4,035 0,123
Hammerhead III 114 −3,188 0,871 −1,203 −5,345 0,008
SECIS 5 −4,736 1,123 −3,482 −6,694 0,000
SRP 94 −3,564 2,140 −0,099 −9,255 0,046
U1 53 −1,750 0,931 0,157 −4,041 0,102
U2 62 −4,225 1,216 −1,831 −7,068 0,002

Tab. 3.3 – Extraits des résultats de Clote et al [CFKK05]. Les z-scores et P-valeurs sont ceux
de l’énergie libre des structures.

Les structures des ARN non-codants sont en moyenne plus stables que ce qui est at-
tendu par hasard. Pour certaines familles, comme les ARN de transfert et les petits ARN
nucléolaires U1, les résultats sont plus modérés : la stabilité moyenne des structures n’est pas
aussi significative que pour les autres familles d’ARN. A l’instar de l’étude de Rivas et al,
cette étude a donné lieu au développement d’un logiciel, RANDfold, qui évalue la stabilité
thermodynamique d’une structure par rapport à une distribution d’énergie libre construite à
partir de séquences aléatoires de même longueur et composition en di-nucléotides.

3.2.3 L’homologie de séquence et de structure

A l’image de techniques déployées pour les séquences codantes présentées dans la sec-
tion 2.2, la recherche d’ARN non-codants peut se faire par homologie à deux niveaux. D’une
part l’homologie au niveau nucléotidique, d’autre part l’homologie en lien étroit avec la fonc-
tion des séquences nucléotidiques, c’est-à-dire l’homologie au niveau peptidique dans le cas des
séquences codantes et l’homologie au niveau de la structure pour les séquences d’ARN non-
codants. Dans un premier temps, nous présentons rapidement comment mener une recherche
d’ARN non-codants par homologie de séquences. Ensuite, nous nous intéressons plus longue-
ment à la recherche d’ARN non-codants par homologie de structures. Enfin, pour conclure
nous présentons une évaluation des méthodes pour la recherche d’ARN non-codants par ho-
mologie menée par Gardner.

Recherche par pure similarité de séquences

La recherche d’ARN non-codants par similarité de séquences fait intervenir les outils
d’alignement de séquences déjà évoqués dans les sections 1.5 et 2.2. La similarité avec
d’autres ARN non-codants fait cependant appel à d’autres bases de données. Il existe à
cet effet des bases généralistes : Rfam [GJBM+ 03, GJMM+ 05], Noncode [CBG+ 05] et fR-
NAdb [KYT+ 07, MYH+ 08], et des bases spécifiques pour quelques familles d’ARN non-
codants ou pour certains organismes comme par exemple miRBase [GJGvD+ 06, GJ06] pour
les microARN, RNAdb [PSE+ 05, PSD+ 07] pour les ARN de mammifères, RNase P data-
base [BHGP94] pour les RNase P ou encore Ribosomal Database Project [CWC+ 09]

76
 3.2. La prédiction de gènes à ARN

pour les différentes sous-familles d’ARN ribosomiques. De manière générale, une similarité
significative entre des régions non codantes peut également constituer une information perti-
nente sur la présence de séquences soumises à une contrainte fonctionnelle.

Recherche par similarité de séquences et de structures

Les méthodes de recherche d’ARN non-codants par similarité de structures font interve-
nir deux processus : la construction manuelle ou automatique d’un profil représentatif d’un
ensemble d’ARN non-codants homologues, et la recherche effective de séquences similaires au
regard d’un profil. Le profil intègre des informations sur la formation d’appariements mais
également des informations de séquence dans les régions appariées et non appariées, c’est
pourquoi on parle d’homologie de séquences et de structures. On peut distinguer deux types
d’approches pour ce problème : les méthodes probabilistes et les méthodes déterministes.

Méthodes à base de modèles probabilistes. Les méthodes à base de modèles pro-

babilistes sont analogues aux méthodes d’alignement classiques. Globalement, leur objectif
est d’établir un alignement optimal au regard d’un système de score entre une structure et
une séquence. La mise en œuvre de ce type d’alignement repose sur plusieurs opérations
d’édition relatives aux structures d’ARN : la substitution d’un nucléotide non apparié, la
substitution d’une paire de nucléotides appariés, l’insertion et la délétion de nucléotides et
d’appariements. Concrètement la construction de ce type d’alignement est plus complexe que
l’alignement “classique” de séquences à cause des interactions créées entre les nucléotides.
L’espace des alignements possibles est, dans la majorité des cas, modélisé par une grammaire
stochastique hors contexte, c’est-à-dire un ensemble d’états et de règles pour transiter entre
les états étiquetés par une opération d’édition. Chaque alignement possible correspond alors
à une dérivation de ces règles. Un alignement optimal dans ce système correspond donc à une
dérivation de score maximal. L’obtention d’un alignement optimal au regard du système de
score fixé est déléguée à un algorithme de programmation dynamique, comme l’algorithme
CYK, dont la complexité temporelle est en O(mn3 ) et la complexité spatiale en O(mn2 ) où n
est la longueur de la séquence à aligner, et m le nombre de règles de la grammaire [DEKM99].
L’une des premières méthodes d’alignement structure/séquence à base de modèles proba-
bilistes est Rsearch [KE03]. Cette méthode repose sur les matrices RIBOSUM conçues pour
évaluer la substitution d’appariements. A l’image des matrices BLOSUM pour les séquences
d’acides aminés, ces matrices sont construites à partir d’alignements multiples d’excellente
qualité d’ARN non-codants. Rsearch est relativement gourmand en ressources et s’avère par
conséquent difficilement praticable pour traiter des génomes entiers d’eucaryotes supérieurs.
Inspiré de Rsearch, RSmatch [LWHT05] propose un découpage en modules élémentaires
de la structure d’origine : multiboucle, tige, région non appariée. Les modules sont évalués
indépendamment à l’aide des matrices RIBOSUM, puis sont assemblés pour former une
structure complète. Cette heuristique s’avère légèrement plus rapide que Rsearch, mais
à spécificité égale elle se montre en moyenne moins sensible. L’algorithme déployé dans
FastR [BZ04] applique un filtre pour ne conserver que les régions susceptibles de donner
de bons alignements. Le filtrage repose sur l’expression de contraintes sur la formation de
tiges aux propriétés ressemblantes aux tiges présentes dans la structure à aligner. Ces pro-
priétés sont la distance qui sépare les parties ouvrante et fermante d’une tige et la longueur
de la tige. Aucune information de séquence n’est prise en compte à ce niveau. Une fois les
régions d’intérêts filtrées, l’alignement est réalisé par programmation dynamique à l’aide des

77
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

matrices RIBOSUM. HomoStRscan [LMZ04] est une méthode en tout point équivalente
à Rsearch adaptée au traitement du génome humain : les matrices de substitutions sont
construites à partir de séquences d’ARN non-codants provenant du génome humain.
Rsearch et FastR ont la propriété d’être génériques au regard des structures recherchées
grâce à l’utilisation des matrices RIBOSUM. Toutefois, cette approche générale ne permet pas
de prendre en compte certaines caractéristiques propres à un ensemble de séquences struc-
turées homologues, telle que la conservation locale de motifs de séquence ou de structure
(section 1.3.1). Si l’on souhaite cibler les recherches à un ensemble de séquences homologues
particulier, les modèles de covariance sont alors plus appropriés [ED94, DEKM99]. Sans entrer
dans les détails, un modèle de covariance est une grammaire stochastique hors contexte pro-
filée par plusieurs matrices de substitutions de nucléotides et d’appariements. A partir d’un
alignement multiple de séquences homologues annoté par la structure commune partagée par
les séquences, on construit une matrice de substitutions d’appariements pour chaque couple
de colonnes appariées et une matrice de substitutions de nucléotides pour chaque colonne
non appariée. Ainsi, un modèle de covariance capture à la fois des informations locales sur la
structure, mais également sur la séquence dans les régions appariées et non appariées.
Plusieurs méthodes s’appuient sur les modèles de covariance, notamment Infer-
nal [GJBM+ 03] utilisée pour maintenir la banque Rfam. Un modèle de covariance est en effet
disponible pour chaque famille de Rfam, construit à partir d’un alignement multiple vérifié
manuellement et annoté par la structure conservée. Infernal est une implémentation stricte
et rigoureuse des modèles de covariance, c’est-à-dire qu’aucun traitement ne précède l’aligne-
ment. L’alignement à l’aide d’un modèle de covariance est une tâche plus gourmande en temps
de calculs et en espace mémoire qu’un alignement basé sur une grammaire “générique”, telle
que celle utilisée dans Rsearch. L’exploitation des modèles de covariance est particulièrement
gourmande en ressources, d’autant plus que la taille d’un modèle de covariance, c’est-à-dire
le nombre de règles dans la grammaire associée, est proportionnelle à la longueur de l’aligne-
ment multiple ayant servi à sa construction et au nombre d’appariements impliqués dans la
structure commune.
Plusieurs manières de contourner ce problème ont été envisagées. Dans RNAcad [Bro99],
un modèle de Markov caché sert à détecter des régions non appariées précises de la séquence
à aligner. Ce marquage permet d’imposer des contraintes lors de l’évaluation du modèle de co-
variance, sous forme de points de passage forcés dans la dérivation des règles de la grammaire
associée au modèle. Cette solution s’avère extrêmement efficace, bien qu’elle nécessite beau-
coup de données supplémentaires pour entraı̂ner le modèle de Markov. Dans le même esprit,
RaveNnA [WR04, WR06] construit un modèle de Markov particulier, un profile HMM, à par-
tir d’un modèle de covariance. Un profile HMM est un modèle de Markov caché adapté pour
modéliser un alignement multiple et non une simple séquence comme les modèles de Markov
cachés classiques. Comme les modèles de Markov classiques, ce type de modèle ne permet pas
de décrire la formation d’appariements entre nucléotides. Dans RaveNnA, le profile HMM est
construit à l’aide d’une heuristique basée sur le principe du maximum de vraisemblance pour
approximer au mieux le modèle de covariance original. Le filtrage à l’aide du profile HMM
permet de cibler les régions dont l’évaluation à l’aide du modèle de covariance est susceptible
de donner un score significatif. En moyenne, 90% des alignements trouvés avec un modèle de
covariance peuvent ainsi être retrouvés avec le profile HMM correspondant dans RaveNnA,
et ce environ 600 fois plus rapidement. Jusqu’ici nous n’avons qu’une seule facette des modèles
de covariance : construire un alignement structure/séquence. CMFinder [YWR06] propose

78
 3.2. La prédiction de gènes à ARN

d’utiliser ce type de modèles pour tenter d’améliorer un alignement classique réalisé unique-
ment sur la séquence primaire. A partir d’un ensemble d’alignements classiques, CMFinder
sélectionne des bons candidats potentiels sur la base de critères énergétiques, puis affinent les
alignements retenus grâce au modèle de covariance selon le principe de maximum de vraisem-
blance. Dans sa première version, Infernal était relativement gourmand en ressources car il
ne procédait à aucune optimisation spécifique ou filtrage particulier en amont. Récemment, In-
fernal a évolué [NE07] et intègre maintenant un filtre qui permet de déterminer de manière
exacte les dérivations de la grammaire qui n’aboutiront pas à un alignement significatif étant
donné un modèle de covariance. Cette optimisation permet de diminuer de manière dras-
tique les ressources physiques et temporelles nécessaires à Infernal, et par extension, aux
approches à base de modèles de covariance.
Comme nous venons de le voir, le modèle de covariance est un outil puissant pour
modéliser des séquences homologues partageant une structure commune. L’exploitation de
cette modélisation s’avère cependant généralement coûteuse sans un filtrage approprié de
l’espace des dérivations à explorer. Erpin [GL01, LFL+ 04, LLFG05] propose une version
simplifiée des modèles de covariance : une matrice de score pour la substitution d’apparie-
ments est calculée pour chaque tige, et non pour chaque appariement, et une matrice pour
la substitution de nucléotides non appariées pour chaque sous-séquence non appariée. A la
manière de FastR, un ensemble de contraintes est associé à chaque tige, notamment l’inter-
valle des distances autorisées entre la partie ouvrante et la partie fermante. Les tiges sont
détectées de manière indépendante, puis assemblées pour former un alignement par program-
mation dynamique : il n’y a donc pas de notion de structure globale dans l’algorithme, ce qui
réduit drastiquement sa complexité. Le facteur déterminant de la complexité de Erpin est la
distance maximale autorisée qui sépare les parties ouvrante et fermante des tiges.

Méthodes à base de descripteurs abstraits. Les méthodes d’alignements struc-

ture/séquence décrites précédemment permettent de retrouver des séquences similaires à un
ensemble de séquences structurées homologues. Pour ce faire, elles tirent parti d’un alignement
fiable annoté par une structure commune. Toutefois, cet alignement n’est pas toujours dispo-
nible, ou ne contient pas suffisamment de séquences pour former un échantillon statistique-
ment représentatif de la famille de séquences ciblée. La structure d’une famille peut également
n’être connue que partiellement auquel cas les informations capturées dans le modèle de co-
variance ne reflètent pas la structure réelle. Dans ces cas de figure, on pourra alors se tourner
vers les méthodes à base de descripteurs abstraits à base de descripteurs. Le principe général
de ses méthodes est de rechercher toutes les régions d’une séquence qui répondent à un en-
semble de contraintes formalisées sur la formation d’éléments structuraux ou de séquence. Par
exemple, la formation d’une tige de trois nucléotides dont les parties ouvrante et fermante
sont séparées d’au plus dix nucléotides contenant la séquence ACGU. Les différences entre
les méthodes basées sur des descripteurs proviennent du pouvoir d’expression du formalisme
adopté. Nous nous focaliserons donc principalement sur cette caractéristique dont l’évolution
suit l’ordre chronologique d’apparition des méthodes.
RNAMot [GMC90, LGC94] est le premier véritable outil à base de descripteurs appli-
cable à la recherche de séquences structurées. Trois types d’éléments sont définissables dans les
descripteurs de RNAMot : les mots, les espaceurs et les tiges. Les mots servent à décrire des
régions de taille fixe, tandis que les espaceurs décrivent des régions de taille variable. Les tiges
ont une longueur variable bornée, peuvent contenir un nombre variable de mésappariements

79
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

et des boucles internes symétriques ou non, et peuvent former des pseudo-œuds. Les mots sont
systématiquement décrits par une séquence, contrairement aux espaceurs et aux tiges dont la
description du contenu en nucléotides est facultative. Quelque soit le type d’élément décrit, le
contenu en nucléotides peut être approximatif, c’est-à-dire que les erreurs sont tolérées dans
une certaine mesure variable d’un élément à un autre. De plus, pour les tiges il est possible
d’autoriser certaines liaisons bancales et d’en préciser la quantité maximale autorisée. Pour
trouver les séquences qui satisfont un descripteur, RNAMot ordonne les éléments du des-
cripteur en fonction de leur probabilité marginale d’apparition estimée de manière empirique,
puis tente de placer les éléments récursivement, du moins probable au plus probable. Lorsque
deux occurrences chevauchantes satisfont un descripteur, RNAMot calcule un score qui per-
met de déterminer la meilleure occurrence, c’est-à-dire celle qui remplie au mieux les éléments
décrits : les tiges plus longues sont favorisées, les mésappariements et les erreurs défavorisées,
...
Inspiré de RNAMot, Palingol [BKV96] reprend les mêmes types d’éléments descriptifs.
Toutefois, Palingol est beaucoup plus expressif car il offre la possibilité de définir des expres-
sions logiques et de construire des branchements. Par exemple, il devient possible de décrire :
« si cette tige n’est pas présente ou qu’elle contient plus d’un mésappariement, alors appliquer
une pénalité ». Le programme s’avère également plus souple dans la gestion des mots ; un mot
peut être décrit par une matrice poids-position, comme celle utilisée pour modéliser les sites
d’épissage (section 2.1.2). Pour trouver les séquences qui satisfont un descripteur, l’algorithme
de Palingol comporte une phase préliminaire d’indexation de toutes les tiges présentent dans
la séquence afin de ne pas rejouer plusieurs fois inutilement des calculs coûteux.
PatScan [DLO97] offrent les mêmes possibilités que Palingol, bien que la gestion des
erreurs diffère : les substitutions, les insertions et les délétions sont considérées comme des
erreurs différentes, sans aucun moyen simple de les banaliser. Cette caractéristique peut rendre
l’élaboration du descripteur particulièrement difficile puisque qu’il faut alors explicitement
écrire les expressions conditionnelles qui simulent ce comportement. PatSearch [PLD00,
GLL+ 03] est le descendant de PatScan. Outre certains aspects syntaxiques différents dans la
définition des descripteurs, PatSearch estime le nombre d’occurrences attendues par hasard
avec un descripteur. Cette valeur est obtenue par simulation, en exécutant PatSearch avec
le même descripteur sur des séquences aléatoires de même composition en mono-nucléotides.
L’espérance du nombre d’occurrences attendues donne une indication sur la “qualité” d’un
descripteur afin de relativiser le nombre d’occurrences réellement observées.
RNAMotif [MEG+ 01], le descendant de RNAMot, est actuellement le logiciel le plus
utilisé. La principale nouveauté apportée dans RNAMotif est la totale liberté laissée à
l’utilisateur pour définir son propre système de score. La définition de ce système peut très
sophistiquée et faire appel à des structures algorithmiques relativement évoluées, telles que
des expressions conditionnelles et des boucles.
MilPat [TdGSG06] est une méthode récente qui se distingue des autres à deux points de
vue : la possibilité de décrire des interactions inter-séquences, et l’algorithme d’énumération
des occurrences. La fonction de bon nombre d’ARN non-codants implique une interaction
avec une autre séquence nucléique (section 1.3) qui se traduit par la formation d’apparie-
ments. MilPat permet de décrire ce type d’interactions comme la formation d’une “tige”
dont une partie se trouve sur la séquence cible et l’autre partie sur une séquence fournie
en plus du descripteur. L’autre originalité de MilPat est l’algorithme d’énumération des
occurrences. Le problème de trouver les occurrences qui satisfont un descripteur est ici for-

80
 3.2. La prédiction de gènes à ARN

mellement défini comme un problème de satisfaction de contraintes, une classe de problèmes

mathématiques largement étudiée. Cette formalisation permet ainsi d’hériter des algorithmes
de résolution classiques de ce type de problèmes qui font de MilPat l’une des méthodes
les plus rapides actuellement. Récemment, MilPat a été décliné en une nouvelle version,
Darn ! [Zyt07, ZGS08], où le formalisme a été étendu aux réseaux de contraintes pondérés
qui permet d’intégrer un système de score évolué. Cette modification a également conduit à
l’intégration d’un module de gestion des solutions chevauchantes.

BRAliBase III, benchmark de recherche d’ARN non-codants par homologie

Dans les deux sections précédentes, nous avons vu qu’il existait de nombreux logiciels pour
retrouver des ARN non-codants sur la base d’une similarité de séquence et/ou de structure.
Nous présentons maintenant un benchmark de référence d’une partie de ces méthodes nommé
BRAliBase III [FBG07].
BRAliBase III est un jeu de données qui contient trois familles de séquences : 1114 ARN
de transfert, 602 ARN ribosomiques 5S et 235 petits ARN U5. Chaque famille est représentée
par un alignement structural extrait de la littérature. Au sein de chaque famille, le pourcentage
d’identité entre couples de séquences varie de 40% à 95%. Le protocole expérimental mis en
place pour tester les méthodes est le suivant. Pour chaque famille, cinq sous-alignements de
cinq et vingt séquences sont extraits aléatoirement et utilisés pour retrouver les séquences
homologues restantes. Pour les méthodes qui ne travaillent qu’à partir d’une seule séquence,
les séquences extraites sont utilisées successivement et les résultats agrégés. Ensuite, pour
mesurer la spécificité, un jeu de données de dix alignements est construit pour chaque famille
en mélangeant l’alignement structural selon la procédure utilisée dans AlifoldZ [WH04].
Les résultats de BRAliBase III sont synthétisés, toutes familles confondues, dans les
tables 3.4 et 3.5. La sensibilité et la spécificité présentées dans ces tables représentent respec-
tivement la proportion de séquences d’ARN non-codants prédites comme telles et la propor-
tion de séquences aléatoires non prédites comme étant des ARN non-codants. Ces proportions
sont calculées en fonction du nombre de séquences uniques prédites par les logiciels, et non
à partir du nombre de bases impliquées dans les prédictions. Par conséquent, une séquence
d’ARN est considérée comme prédite dès lors que le logiciel prédit au moins une base de
cette séquence comme faisant partie de la famille recherchée. La plupart des logiciels n’effec-
tuent pas a proprement parler de prédiction “ARN non-codants homologues”/“autre”, mais
calculent un score d’alignement selon un système propre. Ainsi, pour chacun de ces logiciels
un seuil sur le score qu’ils calculent a été ajusté manuellement afin d’optimiser le cœfficient
de corrélation de Matthews (noté M CC) en fonction du jeu de données.
Globalement, l’élément qui ressort de cette étude est que toutes les méthodes testées sont
remarquablement spécifiques puisqu’aucune ne descend en dessous de 98% de spécificité. Le
deuxième élément important est la grande variabilité de la sensibilité en fonction de la famille
d’ARN recherchée. En l’occurrence, les résultats font clairement apparaı̂tre qu’Infernal et
Rsearch sont les méthodes les plus robustes et les plus stables d’une famille d’ARN à une
autre. Les ARN de transfert semblent particulièrement difficiles à détecter, notamment par
simple homologie de séquence où la sensibilité ne dépasse pas 32% sur les ensembles de cinq
séquences et 62% sur les ensembles de vingt séquences. Toujours sur les ARN de transfert,
l’approche par homologie de structure semble plus appropriée bien que les résultats sont très
variables d’une méthode à une autre : Infernal et Rsearch surpassent largement leurs
homologues avec une sensibilité supérieure à 85% contre moins de 50% pour les autres sur

81
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

ARN ribo. 5S Petits ARN U5 ARN de transfert

Logiciel
Sens. Spéc. MCC Sens. Spéc. MCC Sens. Spéc. MCC
Homologie de séquence
Blast w = 11 54,64 99,66 0,698 90,45 99,43 0,915 16,54 99,87 0,374
Blast w = 7 85,85 99,91 0,914 95,44 99,77 0,962 29,12 99,98 0,519
Fasta 88,16 99,90 0,927 95,99 99,75 0,964 31,40 99,98 0,540
Homologie de structure et de séquence
Erpin 19,30 99,77 0,395 28,47 99,90 0,505 13,88 100,00 0,357
Infernal 97,80 99,95 0,985 94,73 99,87 0,964 86,68 100,00 0,925
RaveNnA 88,77 99,80 0,925 95,07 99,58 0,950 47,72 99,90 0,665
Rsearch 98,78 99,93 0,989 95,37 99,99 0,974 87,13 99,92 0,923
RSmatch 32,05 99,94 0,542 66,95 99,59 0,778 33,64 99,94 0,556

Tab. 3.4 – Résultats de BRAliBase III sur les ensembles de cinq séquences. La sensibilité
et la spécificité sont exprimées en pourcentage.

ARN ribo. 5S Petits ARN U5 ARN de transfert

Logiciel
Sens. Spéc. MCC Sens. Spéc. MCC Sens. Spéc. MCC
Homologie de séquence
Blast w = 11 71,23 98,86 0,765 94,43 97,60 0,854 48,34 99,48 0,639
Blast w = 7 94,66 99,68 0,953 98,37 98,98 0,938 59,89 99,93 0,753
Fasta 96,07 99,65 0,959 98,61 98,59 0,922 61,98 99,91 0,767
Homologie de structure et de séquence
Erpin 24,06 100,00 0,473 40,57 100,00 0,619 15,90 100,00 0,383
Infernal 98,54 99,96 0,990 96,71 99,89 0,975 96,60 99,97 0,979
RaveNnA 91,51 99,78 0,940 96,33 99,41 0,948 75,07 99,85 0,847
Rsearch 92,81 99,97 0,958 92,59 99,95 0,956 81,06 99,99 0,892
RSmatch 54,38 99,77 0,704 93,10 98,71 0,894 59,39 99,81 0,742

Tab. 3.5 – Résultats de BRAliBase III sur les ensembles de vingt séquences. La sensibilité
et la spécificité sont exprimées en pourcentage.

82
 3.2. La prédiction de gènes à ARN

les alignements de cinq séquences. A l’opposé des ARN de transfert, les petits ARN U5 sont
plutôt bien prédits par les deux types d’approches, à l’exception de Erpin dont la sensibilité ne
dépasse pas 41%. Dans les faits, les ARN U5 comportent des sites de fixation très conservés
qui, à eux seuls, constituent un signal suffisant pour les prédire. La figure 3.8 montre la
structure d’un ARN U5 où les bases sont colorées en fonction de leur degré de conservation
au sein de la famille. Trois sites sont particulièrement conservés : la boucle terminale et une
des boucles internes de la tige en 3′ ainsi que la multiboucle.

Fig. 3.8 – Structure d’un petit ARN U5 composée de deux tiges juxtaposées. Les couleurs
indiquent le degré conservation de chaque base au sein des séquences connues de la famille.

Le nombre de séquences utilisées pour réaliser les prédictions influe particulièrement sur le
comportement des méthodes à base d’homologie de séquences : leur sensibilité double lorsque
l’on passe de cinq à vingt séquences. Bien qu’on ne dispose pas des résultats en fonction du
pourcentage d’identité, les auteurs de BRAliBase III mentionnent que la faible sensibilité
des méthodes par pure homologie de séquences provient de la divergence entre les séquences
requêtes et la séquence ciblée. En pratique, ils notent une nette dégradation de la sensibilité
de ce type d’approche lorsque l’ensemble des séquences utilisé ne comporte aucune séquence
dont le pourcentage d’identité avec la séquence à prédire est supérieur à 65%.
Les résultats en terme d’efficacité sont donnés dans la table 3.6. Sans surprise, les méthodes
les plus rapides sont celles qui n’intègrent pas ou peu d’information sur la structure à savoir
Blast, Fasta et Erpin. Si l’on omet les temps d’initialisation, les méthodes les plus per-
formantes Infernal et Rsearch sont également les plus lentes. A titre de comparaison, In-
fernal et Rsearch traitent en moyenne entre mille et deux milles fois moins de nucléotides
par seconde que Erpin, Blast et Fasta. Bien que négligeable pour évaluer des banques de
données conséquentes, le temps d’initialisation qui précède la phase de recherche des méthodes

83
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

Temps d’initialisation Rapidité

Logiciel
moyen pour 20 séq. (sec.) (nucléotides/sec.)
Homologie de séquence
Blast 0,42 575 440
Fasta 0,15 758 578
Homologie de séquence et de structure
Erpin 0,23 363 078
Infernal 209 363
RaveNnA 1 479 20 893
Rsearch 1 380 573
RSmatch 41,7 3 631

Tab. 3.6 – Efficacité des méthodes testées dans BRAliBase III.

les plus sophistiquées comme RaveNnA, Infernal et Rsearch est relativement élevé.

3.2.4 L’approche comparative, l’existence d’une structure conservée

Bien que les approches par homologie de séquences décrites dans la section précédente
peuvent se montrer relativement performantes pour retrouver des séquences appartenant à
des familles d’ARN non-codants connues, elles ne permettent pas de réaliser de prédictions
de novo. Nous nous intéressons maintenant aux méthodes qui tentent de traiter ce problème
qui demeure encore à l’heure actuelle un problème ouvert.
Dans la section 3.2.2, nous avons vu que l’existence d’une structure secondaire prédite
à partir d’une séquence n’est pas un indice suffisant pour permettre de détecter des ARN
non-codants, même lorsque cette structure est significativement stable. Dans le cadre de la
prédiction de structure secondaire, le recours à une analyse comparative permet d’améliorer
significativement les prédictions en s’appuyant sur les informations évolutives qui relient entre
elles des séquences homologues qui partagent une structure commune (section 3.1.2). Au
carrefour de ces deux idées se situe la prédiction d’ARN non-codants par analyse comparative.
L’idée est de prédire une structure commune à plusieurs séquences puis d’évaluer la “qualité”
de cette structure par rapport à ce qui pourrait être attendu par hasard.
La première méthode dédiée à ce problème est Qrna [RE01]. Qrna envisage trois hy-
pothèses pour expliquer la similarité de deux séquences alignées : les séquences sont des
séquences codantes homologues ou des séquences non-codantes homologues qui partagent
une structure, ou bien leur similarité est fortuite sans rapport avec la préservation d’une fonc-
tion commune. Pour évaluer chacune de ces hypothèses, Qrna s’appuie sur trois modèles qui
caractérisent chacun un schéma évolutif : le modèle RNA pour les séquences non-codantes ho-
mologues où les mutations compensatoires sont privilégiées, le modèle COD pour les séquences
codantes homologues où les mutations silencieuses et synonymes sont favorisées, et enfin le
modèle OTH où aucun type de mutation n’est favorisé. En pratique, le modèle RNA est une
grammaire stochastique profilée, identique à celle de Rsearch. Les modèles COD et OTH
sont quant à eux des modèles de Markov cachés paramétrés par apprentissage. A l’issue de
l’évaluation d’un alignement selon les trois modèles, Qrna émet une prédiction sur la nature
des séquences en fonction du modèle ayant obtenu la probabilité la plus élevée. Le modèle
RNA de Qrna a été repris et étendu dans EvoFold [PBS+ 06] pour traiter des alignements
multiples. EvoFold utilise un type particulier de grammaires stochastiques. Afin d’ajuster

84
 3.2. La prédiction de gènes à ARN

les probabilités du modèle, EvoFold s’appuie sur un arbre phylogénétique contenant les
distances évolutives qui sépare les organismes dont sont extraites les séquences alignées.
Qrna et EvoFold procèdent à une analyse comparative plutôt fine des mutations entre
les séquences. MSARi [CKB04] adopte la même démarche à base de modèles probabilistes
mais de manière heuristique. MSARi procède entre trois temps. Premièrement, les probabi-
lités d’appariement de tous les couples de nucléotides sont calculées individuellement pour
chaque séquence grâce à la fonction de partition (section 3.1.1). A partir des résultats obtenus,
MSARi recherche des tiges conservées grossièrement cohérentes avec l’alignement multiple,
c’est-à-dire que les tiges mises en correspondance ne respectent pas nécessairement stricte-
ment l’alignement multiple. MSARi suppose en effet que l’alignement peut contenir quelques
erreurs et que les bases appariées ne sont pas nécessairement correctement alignées. Enfin,
MSARi sélectionne les tiges conservées de manière gloutonne, par nombre de mutations com-
pensatoires décroissant, pour former une structure secondaire commune. La classification est
enfin réalisée en fonction de la significativité de la structure obtenue, évaluée en fonction du
nombre de mutations compensatoires globalement observées.
Contrairement aux approches précédentes, une autre classe de méthodes s’attache à la sta-
bilité thermodynamique d’une éventuelle structure secondaire commune. Cette approche suit
le même schéma que celle présentée dans la section 3.2.2 où l’on évalue la stabilité d’une struc-
ture d’énergie minimale prédite sur une seule séquence. La difficulté supplémentaire ici est de
construire une distribution de l’énergie libre de structures obtenues non plus sur des séquences
individuelles de composition équivalente, mais sur des ensembles de séquences alignées ou non.
AlifoldZ [WH04] et ddbRNA [DBDH03] procèdent ainsi à l’évaluation de la stabilité d’une
structure commune par rapport à une distribution d’énergie libre construite à partir d’aligne-
ments générés en mélangeant les positions de l’alignement multiple original. Par construction,
un alignement obtenu par mélange de ses positions respecte deux propriétés : la composition
en mono-nucléotides de chaque séquence est préservée et la conservation globale des séquences.
Dans ddbRNA, la structure commune est calculée en assemblant de manière gloutonne des
tiges conservées, et la procédure de mélange s’efforce en plus de détruire au moins partiel-
lement cette structure commune. Dans AlifoldZ en revanche, la prédiction de la structure
commune est déléguée à RNAalifold, et la procédure de mélange est plus complexe car elle
respecte le degré de conservation locale, c’est-à-dire que le degré de conservation de chaque
position est préservé entre tous les couples de séquences. Cette propriété est particulièrement
importante pour préserver les longues insertions/délétions qui pourraient alors être éclatées
en plusieurs petites régions et empêcher la formation de tiges lors du repliement commun.
La figure 3.9 montre la distribution du z-score de l’énergie libre de la structure commune
prédite par RNAalifold sur des alignements d’ARN de transfert comportant de une à quatre
séquences. La distribution de l’énergie libre tracée en trait plein, est comparée à la distribu-
tion de l’énergie libre de la structure commune prédite par RNAalifold à partir du même
alignement mélangé par la procédure de AlifoldZ. D’après ces résultats, la structure secon-
daire commune à plusieurs séquences semble significativement plus stable qu’une structure
d’ARN non-codant prédite à partir d’une seule séquence. En fait, plus l’alignement comporte
de séquences, plus l’énergie libre de la structure commune prédite est faible. RNAalifold
intègre en effet dans son calcul de l’énergie libre de la structure commune un bonus négatif
pour chaque covariation. Le nombre de covariations observables augmente avec le nombre
de séquences homologues différentes, par conséquent l’énergie libre de la structure commune
prédite diminue. En revanche, on ne s’attend pas à trouver de covariations sur les alignements

85
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

mélangés, quelque soit le nombre de séquences de l’alignement. En fixant un seuil sur la valeur
du z-score de l’énergie de la structure prédite à −4, il devient alors possible de distinguer clai-
rement les alignements d’ARN de transfert des alignements de séquences aléatoires. Plus le
nombre de séquences alignées est élevé, plus cette classification s’avère efficace : pour quatre
séquences, 98,36% des alignements d’ARN de transfert peuvent ainsi être discriminés sans
prédire à tort un alignement de séquences aléatoires.

Fig. 3.9 – Distribution du z-score de l’énergie libre de la structure commune prédite par
RNAalifold sur des alignements de plusieurs familles d’ARN non-codants évaluée par rap-
port à une distribution empirique de l’énergie libre des structures prédites par RNAali-
fold sur des alignements générés par mélange des séquences originales selon la procédure
d’AlifoldZ. N est le nombre de séquences présentent dans les alignements. Pour N = 1, les
structures sont prédites par RNAfold.

RNAz [WHS05] est une amélioration de AlifoldZ qui intègre une mesure supplémentaire
de la stabilité de la structure commune : le SCI (Structure Conservation Index). Le SCI évalue
la stabilité de la structure commune par rapport aux structures prédites individuellement. Il
s’obtient en calculant le rapport EA /Ē, où EA est l’énergie libre de la structure commune
prédite par RNAalifold, et Ē est la moyenne de l’énergie libre des structures individuelles
prédites par RNAfold. Lorsque le SCI est proche de 0, la structure trouvée par RNAalifold
a une énergie libre plus faible que la moyenne de l’énergie libre des structures individuelles : la
structure trouvée pour l’alignement n’est pas significative ; les structures sont mal conservées.
Un SCI proche de 1 indique au contraire que les structures sont parfaitement conservées. Un
SCI plus grand que 1 indique non seulement que les structures sont parfaitement conservées,

86
 3.3. Evolution et enrichissement du logiciel caRNAc

mais qu’il existe en plus des mutations compensatoires. Afin d’éviter la construction em-
pirique coûteuse d’une distribution d’énergie libre, les paramètres de cette distribution sont
approximés au moyen d’un processus d’apprentissage supervisé, les SVM (Support Vector Ma-
chine). Ce même type de processus est utilisé pour effectuer la classification de l’alignement
en fonction du SCI et du z-score de l’énergie libre de la structure commune. Actuellement,
RNAz est la méthode la plus utilisée pour la prédiction d’ARN non-codants.
Comme nous l’avons déjà remarqué dans la section 3.2.2, évaluer la stabilité d’une struc-
ture par rapport à une distribution d’énergie libre établie à partir de séquences de même
composition en di-nucléotides apporte de meilleurs résultats qu’en ne préservant que la compo-
sition en mono-nucléotides. Récemment, Sissiz [GW08] reprend le protocole employé jusqu’ici
mais avec une procédure de génération d’alignements multiples qui préserve une composition
en di-nucléotides donnée en plus de toutes les propriétés déjà évoquées, notamment la conser-
vation locale. La distribution d’énergie libre obtenue à partir des alignements générés par
cette procédure est selon les auteurs plus proche de la distribution réelle.

3.3 Evolution et enrichissement du logiciel caRNAc

Nous présentons maintenant notre contribution en matière de prédiction de structure
secondaire, caRNAc, basée sur les travaux initiés en 2003 par Olivier Perriquet. caR-
NAc [PTD03, TP04, Per03] est une méthode de prédiction de structure secondaire qui suit
le paradigme “aligner et replier simultanément” décrit à la page 65. A ce titre, il prédit une
structure secondaire conservée entre plusieurs séquences non alignées. Le point fort de caR-
NAc est d’adapter l’algorithme de Sankoff de manière heuristique pour le rendre praticable,
tout en adoptant le parti pris d’éviter la sur-prédiction des appariements, afin de garantir
des prédictions sûres. caRNAc intègre également des informations évolutives, en prenant en
compte les mutations compensatoires. caRNAc a fait l’objet d’une évaluation sur le bench-
mark de référence en la matière et a depuis été adopté par la communauté [GG04, Tou07].
Dans cette section, nous présentons les évolutions que nous avons apportées au logiciel.
Le but de nos travaux a été de concilier au sein de caRNAc les approches “aligner et replier
simultanément” et “aligner puis replier”. Pour cela, nous avons utilisé le concept de méta-
séquences 1.5.3, à l’image de ce qui a été mis en œuvre dans Protea (section 2.4). Ce faisant,
nous avons également cherché à optimiser le cœur algorithmique de caRNAc, afin d’améliorer
les temps de calcul et d’ouvrir des perspectives de traitements à grande échelle. Nous com-
mençons par décrire la version initiale de caRNAc, puis nous présentons nos contributions,
et enfin nous refermons cette section par des résultats expérimentaux et une illustration de
l’utilisation de caRNAc pour la prédiction d’ARN non-codants.

3.3.1 L’existant
caRNAc admet en entrée n séquences d’ARN non alignées et produit pour chaque
séquence un structure secondaire sous forme d’une liste de tiges conservées. Cela se fait en
deux temps. La première phase de l’algorithme consiste à procéder à tous les repliements deux
à deux suivant une adaptation de l’algorithme de Sankoff. Ensuite, ces prédictions sont com-
binées à l’aide d’une structure de graphe pour obtenir une structure secondaire pour chaque
séquence.

87
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

La prédiction d’une structure secondaire commune à deux séquences

L’algorithme déployé dans caRNAc pour la prédiction d’une structure commune à deux
séquences produit pour chaque séquence une liste de tiges formant une structure secondaire.
Cet algorithme est composé de quatre étapes dont l’enchaı̂nement est décrit schématiquement
en figure 3.10 :
1. l’énumération de toutes les tiges potentielles maximales pour chaque séquence selon les
paramètres énergétiques du modèle thermodynamique ;
2. la recherche de points d’ancrage entre les séquences, c’est-à-dire des régions très
conservées ;
3. l’énumération des couples de tiges compatibles avec les points d’ancrage, et filtrage des
couples de tiges copliables, c’est-à-dire des tiges entre lesquelles on observe au moins
une covariation ;
4. la recherche d’un ensemble de couples de tiges d’énergie minimale selon une adaptation
des récurrences de Sankoff pour former une structure secondaire.

modèle programmation dynamique

séquence A thermodynamique (à la Sankoff)
1

2
tiges
potentielles
paires 3 paires de structure
3
de tiges secondaire
motifs tiges compatibles 4 commune
conservés
tiges
potentielles
2
covariations
1 cohérence
séquence B des motifs
conservés
Fig. 3.10 – Déroulement de la prédiction d’une structure secondaire conservée entre deux
séquences dans caRNAc

La recherche de tiges Les tiges potentielles énumérées lors de cette étape contiennent
aux moins trois appariements canoniques consécutifs, peuvent contenir des mésappariements
et sont systématiquement fermées par un appariement canonique A-U, C-G ou G-U. Ces tiges
sont dites maximales car elles ne peuvent être étendues pour obtenir des tiges d’énergie libre
inférieure selon ces règles. L’énergie associée à une tige est calculée en utilisant le modèle de
Turner restreint aux empilements d’appariements, aux motifs des boucles terminales et aux
mésappariements symétriques. Comme les tiges sont prédites indépendamment les unes des
autres, les règles relatives aux boucles internes et aux embranchements ne peuvent pas être
appliquées à cette étape. De même, seules les boucles internes d’une longueur inférieure à huit

88
 3.3. Evolution et enrichissement du logiciel caRNAc

nucléotides sont évaluées car on peut déjà affirmer à cette étape qu’aucune tige ne pourra être
prédite dans cette région non appariée. Toutes les tiges sont énumérées par programmation
dynamique avec une complexité spatiale et temporelle quadratique par rapport à la longueur
de la séquence, puis filtrées selon leur valeur d’énergie libre grâce à une fonction de seuil.
Cette fonction, établie de manière empirique, admet deux paramètres : la longueur de la tige
et le taux en G et en C de la séquence pour tenir compte d’un éventuel biais favorisant la
formation de tiges particulièrement stables.

Les points d’ancrage. caRNAc s’appuie sur des points d’ancrage entre les séquences
pour guider et accélérer le repliement et l’alignement des séquences. Ces points d’ancrage sont
des régions significativement conservées entre les deux séquences, sans insertion ni délétion.
L’algorithme se déroule de la manière suivante :
1. la recherche de tous les blocs maximaux conservés entre les deux séquences ;
2. le tri des blocs trouvés par score décroissant et filtrage des blocs chevauchants ;
3. la sélection gloutonne des blocs compatibles pour former des points d’ancrage.
Le système de score utilisé pour l’alignement est +1 en cas d’identité, −2 en cas de
substitution. Un bloc maximal est un bloc qui ne peut être étendu pour atteindre un score
plus élevé sans que ce score prenne une valeur négative ou nulle durant l’extension. Tout bloc
maximal dont la taille et le score sont supérieurs à 8 est ainsi conservé. Les blocs conservés
sont ensuite triés et filtrés pour éliminer les blocs qui impliquent au moins une même base
d’une des deux séquences. Bien que drastique, ce critère permet d’éviter de trancher entre
deux blocs qui pourraient a priori être corrects mais qui pourraient introduire une contrainte
erronée dans la suite du déroulement de l’algorithme. Une fois triés, les blocs sont sélectionnés
de manière gloutonne par score décroissant pour former des points d’ancrage. Un bloc est ainsi
sélectionné s’il est compatible avec l’alignement local déjà construit. Sur l’exemple suivant,
les blocs conservés rouges et bleus ne peuvent sélectionnés simultanément comme points
d’ancrage car ils introduiraient une incohérence dans l’alignement des deux séquences.

Séquence 1

Séquence 2

Le filtrage des tiges En fonction des points d’ancrage déterminés à l’étape précédente,
les couples de tiges copliables sont énumérés. Deux tiges sont copliables si elles présentent au
moins une covariation et si elles respectent les contraintes introduites par les points d’ancrage.
Le terme de covariation est ici à prendre au sens fort du terme, c’est-à-dire en présence d’une
mutation compensée : une covariation est comptée lorsque les deux bases d’un appariement
sont mutées d’une tige à l’autre. La recherche de covariations s’effectue sur les deux tiges
alignées sur leur structure primaire. Lorsqu’un couple de tiges présente au moins une cova-
riation, les deux tiges sont dites copliables si elles sont compatibles avec les points d’ancrage,
c’est-à-dire si les replier simultanément ne contredit pas l’alignement local des séquences selon
les points d’ancrage. Deux tiges ne sont donc pas copliables si elles correspondent à l’un de
ces trois cas :

89
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

1. violation d’un point d’ancrage : si (t1 , t1 ) et (t2 , t2 ) étaient repliées simultanément, alors
l’alignement de t1 et t2 contredirait l’alignement local au niveau du point d’ancrage.

t1
t1

t2

t2

2. décalage trop large à l’extérieur d’un point d’ancrage : lorsque l’ouverture ou la ferme-
ture d’une tige tombe entre deux points d’ancrage, un décalage borné est autorisé. Ce
décalage est variable selon les zones. Il dépend de la différence de longueur des fragments
de séquences entre les points d’ancrage. Sur cet exemple, le décalage entre t1 et t2 est
trop large.

t1
t1

t2 t2

3. décalage à l’intérieur d’un point d’ancrage : lorsque l’ouverture ou la fermeture d’une

tige tombe à l’intérieur d’un point d’ancrage, aucun décalage n’est autorisé. Sur cet
exemple, il y a un léger décalage entre t1 et t2 .
t1

t1

t2

t2

A ce niveau, toute tige copliable avec une autre tige est conservée pour l’étape suivante.
Une tige qui ne peut est copliée avec aucune tige est supprimée sauf si elle satisfait certains
critères :
– il s’agit d’une tige-boucle, c’est-à-dire si la taille de la boucle est d’une longueur
inférieure ou égale à huit nucléotides ;
– son énergie libre est relativement faible, en pratique le seuil est fixé à -1500 cal/mol ;
– elle se situe dans une région d’insertion potentielle, c’est-à-dire une région située
entre deux points d’ancrage consécutifs significativement plus longue que dans l’autre
séquence.

90
 3.3. Evolution et enrichissement du logiciel caRNAc

Le corepliement des tiges copliables Le corepliement des tiges est le cœur algorith-
mique de la prédiction de structure secondaire commune de caRNAc, c’est aussi son origina-
lité. L’algorithme de repliement est une adaptation des récurrences de Sankoff, normalement
appliquées au niveau nucléotidique, au repliement de tiges complètes. La complexité de l’algo-
rithme de Sankoff n’est alors plus fonction de la taille des séquences mais du nombre de tiges
potentielles. De plus, comme seuls les couples de tiges copliables sont considérés, la taille du
problème se retrouve alors encore considérablement réduite.
Une tige t est caractérisée par les positions des extrémités de sa partie ouvrante, t.lef topen
et t.lef tclose, et de sa partie fermante, t.rightopen et t.rightclose, comme illustré sur la
figure 3.11. Les récurrences de caRNAc reposent sur trois applications next, last et prev
permettant à l’algorithme de naviguer entre les tiges, comme illustré sur la figure 3.12. A
partir de l’ensemble A des n tiges potentielles d’une séquence sa , on définit deux listes A→
et A← ordonnées des tiges de A.

AU ... CG CG ... AU
↑ ↑ ↑ ↑
t.lef topen t.lef tclose t.rightopen t.rightclose

Fig. 3.11 – Chaque tige t est décrite par les positions des extrémités de sa partie ou-
vrante (gauche), t.lef topen et t.lef tclose, et de sa partie fermante (droite), t.rightopen et
t.rightclose.

a1 a2 a3 a2 a4 a3 a4

prev(2) next(2) last(4)

Fig. 3.12 –

A→ = (a1 , a2 , . . . , an ) désigne la liste des tiges potentielles ordonnées par ordre crois-
sant d’ouverture : ai ≤ aj si et seulement si ai .lef topen ≤ aj .lef topen. L’application
next : [1..n] −→ [1..n] permet d’obtenir pour une tige t la prochaine tige dont la partie
ouvrante ne chevauche pas celle de t :

next(i) = min{k ∈ [i + 1..n] | ai .lef tclose < ak .lef topen}

A← = (a1 , a2 , . . . , an ) désigne la liste des tiges potentielles réordonnées par ordre croissant
de fermeture : ai ≤ aj si et seulement si ai .rightclose ≤ aj .rightclose. L’application last :
[1..n] −→ [1..n] permet d’obtenir pour une tige t la la dernière tige dont la partie fermante
ne chevauche pas celle de t :

last(j) = max{k ∈ [1..j − 1] | ak .rightclose < aj .rightopen}

91
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

L’application prev : [1..n] −→ [1..n] permet d’obtenir pour une tige t la tige précédente
dont la partie fermante ne chevauche pas la partie ouvrante de t :

prev(i) = max{k ∈ [1..n] | ak .rightclose < ai .lef topen}

Les listes B← et B→ sont respectivement analogues à A← et A→ pour l’ensemble B des m
tiges d’une seconde séquence sb . Les applications next et last sont également étendues pour
ces listes.

S(i, j, k, l) = min

 S(i, j, k, l − 1)



 S(i, j − 1, k, l)



 min {S(i, prev(x), k, l) + S(next(x), last(j), 0, 0) + bind(ax = aj , −)}

 1≤x≤n

 min {S(i, prev(x), 0, 0) + S(next(x), last(j), k, l) + bind(ax = aj , −)}

1≤x≤n 

 min S(i, j, k, prev(y)) + S(0, 0, next(y), last(l)) + bind(−, by = bl )
 1≤y≤m 




 min S(0, 0, k, prev(y)) + S(i, j, next(y), last(l)) + bind(−, by = bl )

 1≤y≤m 


 min S(i, prev(x), k, prev(y)) + S(next(x), last(j), next(y), last(l)) + bind(ax = aj , by = bl )
 1≤x≤n
1≤y≤m

La complexité spatiale de cet algorithme est en O(n2 m2 ) et sa complexité temporelle

en O(n3 m3 ). Cependant, en pratique la complexité spatiale de l’algorithme est réduite à
l’hyperdiagonale de la matrice grâce à un examen des tiges qui ne pourront être copliées et
des points d’ancrage.

La combinaison des prédictions deux à deux

Pour n séquences, la première étape de caRNAc produit n(n−1)/2 couples de prédictions.
Ces repliements sont ensuite combinés à l’aide d’un graphe afin d’obtenir une structure unique
pour chaque séquence. Cette tâche se déroule en quatre étapes :
1. construction du graphe des tiges ;
2. remaniement et simplification du graphe ;
3. recherche de composantes connexes dans le graphe ;
4. sélection gloutonne pour chaque séquence des tiges pour former la structure finale.

Construction du graphe des tiges Le graphe des tiges est un graphe non dirigé où
chaque nœud correspond à une tige apparaissant dans au moins un corepliement, et une
arête entre deux nœuds indique que les tiges associées aux nœuds reliés ont été copliées. La
figure 3.13 montre un exemple de graphe des tiges obtenu sur cinq ARN de transfert.

Remaniement et simplification du graphe Les tiges prédites par caRNAc ne peuvent

pas comporter de renflement ni de boucle interne asymétrique. Une vraie tige peut donc avoir
été scindée en deux tiges différentes lors de l’énumération des tiges potentielles. Pour pallier
ce problème et par la même simplifier le graphe, les tiges emboı̂tées sont donc regroupées et
les nœuds correspondants du graphe fusionnés, comme illustré sur la figure 3.14.

92
 3.3. Evolution et enrichissement du logiciel caRNAc

graphe associé
2 3 z }| {
4

a
2 3 4
1 e
a a a
a e e
b e
c → b b
b
d d
d
e c c c

Fig. 3.13 – Graphe des tiges construit après les corepliements de cinq ARN de transfert.

b
b1
a b2
a
a
1 2 2 1
b
c2
1 2 2 1 c
c1
c

Fig. 3.14 – Regroupement de tiges lorsqu’elles sont emboı̂tées. La tige de la séquence a s’est
repliée avec la tige b1 et la tige c2 tandis que les tiges b2 et c1 ont été copliées. Toutes ces tiges
sont correctes, mais celles des séquences b et c sont considérées comme deux tiges distinctes
emboı̂tées. Dans le graphe, elles sont fusionnées et les arêtes correspondantes sont regroupées.

93
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

Pour qu’un couple de tiges soit copliable, il est nécessaire que les tiges présentent au moins
une covariation. Lorsque qu’un jeu de données comporte deux séquences proches partageant
une structure commune, il est fort probable qu’une partie des tiges communes ne présentent
aucune covariation et n’aient donc pas été copliées. Toutefois, ces tiges peuvent avoir été
copliées par ailleurs et se retrouvent donc dans le graphe des tiges. Un deuxième type d’arête
est donc introduit pour identifier les couples de tiges qui ne présentent pas de covariation :
les arêtes étiquetées identité. Les arêtes qui correspondent à un corepliement de deux tiges
seront étiquetées coplié. Cette modification permet d’améliorer la connexité du graphe en
présence de tiges qui n’ont pas pu être copliées car elles ne présentaient pas de mutations
compensatoires.

La recherche de composantes connexes dans le graphe Les composantes connexes

du graphe des tiges correspondent à des ensembles de tiges qui ont pu être copliées et qui
sont donc susceptibles de faire partie d’une éventuelle structure commune. Une composante
connexe idéale dans le graphe des tiges est alors une clique comportant autant de nœuds que
de séquences. Pour évaluer la qualité d’une composante connexe, un indice est calculé pour
chacune en fonction du nombre de nœuds qu’elle contient, du nombre de séquences impliquées
ainsi que du nombre d’arêtes étiquetées coplié et identité. L’indice d’une composante est le
produit de deux indices : node index qui mesure l’écart en terme de nombre observé de nœuds
et le nombre idéal de nœuds, edge index qui mesure l’écart entre terme d’arêtes par rapport
au cas idéal.
 2
N s − (N − N s)
node index =
sq
où N s est le nombre de séquences impliquées dans la composante, N est le nombre de
nœuds dans la composante et sq est le nombre initial de séquences.
co
edge index =
me − id
où co est le nombre d’arêtes étiquetées coplié, id le nombre d’arêtes étiquetées id et me le
nombre d’arêtes possibles dans une clique comportant N nœuds, c’est-à-dire N (N2−1) .

La sélection des tiges séquence par séquence Comme chaque tige appartient à une
et une seule composante connexe, on attribue à une tige l’indice de la composante qui la
contient. Pour chaque séquence, les tiges sont ensuite incorporées de manière gloutonne par
indice décroissant jusqu’à un certain seuil. L’incorporation se fait également sous la contrainte
de ne pas entrer de conflit avec la structure secondaire en cours de construction : les croise-
ments d’appariements et les chevauchements de tiges sont ainsi interdits. Toutefois, un léger
chevauchement est autorisé entre les tiges, et résolu en tronquant la tige la plus longue. Cette
liberté par rapport aux contraintes initiales permet de récupérer a posteriori des tiges maxi-
males légèrement chevauchantes qui n’auraient pas pu être repliées simultanément.

3.3.2 Introduction des méta-séquences

Le premier but de l’enrichissement de caRNAc est de mieux prendre en compte le schéma
évolutif entre les séquences, quelque soit la distance évolutive qui les sépare. Les propriétés

94
 3.3. Evolution et enrichissement du logiciel caRNAc

qui ont guidé notre démarche sont que les approches “aligner puis replier” sont très perfor-
mantes quand les séquences sont proches, alors que les approches “aligner et replier simul-
tanément” sont plus robustes quand les séquences sont plus éloignées. Cela a été clairement
établi dans [GG04]. L’idéal serait donc d’avoir une approche tout terrain, qui permette de
traiter correctement des jeux de données hétérogènes, contenant des séquences à des distances
évolutives quelconques. Pour cela, nous proposons une solution basée sur les méta-séquences,
à l’image de ce que nous avons fait dans Protea.

Introduction des méta-séquences

Dans l’algorithme original de caRNAc, il existe une contrainte forte au repliement si-
multané de deux tiges : pour pouvoir être copliées, deux tiges doivent présenter une cova-
riation. Ce critère permet de prédire des tiges pour lesquelles il existe une réelle évidence
d’une évolution sous contrainte fonctionnelle. Cependant, ce critère de sélection peut poser
problème face à un jeu de données qui comporte un sous ensemble de séquences fortement
conservées. La redondance d’information apportée par des séquences proches perturbe ainsi le
fonctionnement de l’algorithme. Pour traiter ce problème, on propose de regrouper en amont
les séquences ressemblantes sous forme d’un alignement multiple, et d’adapter caRNAc pour
ne plus travailler uniquement sur des séquences individuelles, mais sur des méta-séquences,
c’est-à-dire des séquences individuelles et/ou des ensembles de séquences représentées par des
alignements multiples.

La méta-tige L’introduction des méta-séquences nécessite la définition de la notion de tige

sur un alignement multiple. Ceci nous amène à introduire le concept de méta-tige. Pour une
méta-séquence simple, c’est-à-dire une méta-séquence correspondant à une séquence indivi-
duelle, une méta-tige est simplement une tige. Pour une méta-séquence représentée par un
alignement multiple de n séquences, une méta-tige correspond à un ensemble de tiges, une sur
chaque séquence, comme illustré sur l’exemple de la figure 3.15. Afin de construire un nombre
raisonnable de méta-tiges à partir des tiges individuelles prédites sur les séquences qui com-
posent une méta-séquence, on impose que les tiges formant une méta-tige partagent au moins
trois appariements contiguës communs. Cette contrainte assure que chaque méta-tige contient
au moins une tige par séquence qui répond à la contrainte imposée dans la version originale
de caRNAc sur longueur minimale des tiges.

Définition 2 (Méta-tige). Une méta-tige T = {t1 , t2 , . . . , tn } d’une méta-séquence P =

{s1 , s2 , . . . sn } est un ensemble comportant exactement n tiges tel que chaque tige ti est une
tige individuelle de la séquence si et

∀(ti , tj ) ∈ T × T (ti .lef topen − tj .lef topen = tj .rightclose − ti .rightclose)

∧ (min(ti .lef tclose, tj .lef tclose) − max(ti .lef topen, tj .lef topen)) ≥ 3

L’énergie associée à une méta-tige est définie comme la moyenne des énergies des tiges
individuelles qu’elle contient. Toutefois, on bonifie cette énergie pour chaque mutation qui
préserve un appariement.

95
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

AAUGGCCGUGUCAUCGGCCGGG
−−AGGCCGAGUCAUCGGCC−GG
ACUGGCCGAGUCAUCGGCCGGG

Fig. 3.15 – Exemple d’une méta-tige formée de trois tiges individuelles

La recherche de méta-tiges potentielles La recherche de méta-tiges dans une méta-

séquence s’effectue en deux temps : l’identification des tiges potentielles individuellement dans
chaque séquence représentée par la méta-séquence selon la procédure originale de caRNAc,
puis le regroupement des tiges individuelles pour former les méta-tiges. Etant donné que l’on
suppose fiable l’alignement multiple qui représente une méta-séquence, on s’appuie sur cet
alignement pour regrouper les tiges individuelles. Une fois les tiges potentielles individuelles
identifiées, les positions de ces tiges sont corrigées pour refléter leurs positions effectives
dans l’alignement. Le création des méta-tiges se fait de manière progressive en partant de
l’ensemble des tiges potentielles identifiées sur la séquence comportant le moins de tiges.
Pour chacune de ces tiges on crée une méta-tige la contenant. On complète ensuite, séquence
par séquence, les méta-tiges créées en incorporant à chaque méta-tige la tige qui partage un
maximum d’appariements identiques en terme de positions sur l’alignement, et au minimum
trois appariements communs. A la fin de ce processus, les méta-tiges incomplètes, c’est-à-dire
celles qui ne contiennent pas exactement une tige par séquence représentée, sont détruites.
Cette procédure a pour intérêt principal d’assurer que le nombre de méta-tiges potentielles
n’explose pas avec le nombre de séquences puisque leur nombre est borné par le nombre de
tiges d’une séquence.

Les points d’ancrage entre méta-séquences La recherche de points d’ancrage est elle
aussi adaptée pour traiter les méta-séquences et s’effectue directement entre les alignements
multiples. La comparaison intra-méta-séquence n’est pas nécessaire car les séquences sont déjà
alignées. Etant données deux méta-séquences représentées par deux alignements multiples
U = {u1 , . . . , um } composé de m séquences alignées u1 , . . . , um et V = {v1 , . . . , vn } composé
de n séquences alignées v1 , . . . , vn , le score attribué à la comparaison de deux colonnes i et
j respectives de U et V est obtenu en sommant les scores de toutes les comparaisons deux à
deux entre la position i d’une séquence alignée de U et la position j d’une séquence alignée
de V . Plus formellement, ce score est calculé par la relation suivante

X X
s(i, j) = score(uk [i], vl [j])
1≤k≤m 1≤l≤n

où score(uk [i], vl [j]) est le score attribué dans la version originale de caRNAc lors de la
recherche de blocs conservés, c’est-à-dire +1 en cas d’identité entre uk [i] et vl [j] et −2 dans
le cas contraire. On assimile la comparaison entre un gap et un nucléotide à une substitution.
La procédure de sélection gloutonne des points d’ancrage reste identique à ceci près que le
seuil sur le score est corrigé. Dans la version originale, le seuil minimal pour retenir un bloc
est de 8. Comme le nombre de comparaisons réalisées est ici de m.n, ce seuil est maintenant
de 8m.n.

96
 3.3. Evolution et enrichissement du logiciel caRNAc

Le filtrage des méta-tiges Pour que deux tiges soient décrétées copliables dans caRNAc,
il est nécessaire qu’elles présentent au moins une covariation et que leur repliement simul-
tané soit compatible avec les points d’ancrage. Pour un couple de méta-tiges, ces définitions
s’adaptent naturellement. Aucune covariation n’est attendue entre les tiges contenues dans
une même méta-tige. Entre deux méta-tiges T1 et T2 , on considère donc qu’une covariation
existe si au moins une tige de T1 présente une covariation avec au moins une tige de T2 . On
pourrait exiger que chaque tige de T1 présente au moins une covariation avec une tige de
T2 , cependant, dans les faits le premier critère est suffisamment sélectif pour retenir les bons
couples de méta-tiges. Pour la compatibilité avec les points d’ancrage en revanche, la modifi-
cation obéit aux mêmes contraintes que si on avait à faire à des séquences individuelles : on
impose que tous les couples de tiges (t1 , t2 ) issus d’un couple de méta-tiges (T1 , T2 ) soient
compatibles avec les points d’ancrage.

Le chevauchement de tiges maximales L’algorithme tel qu’il est conçu ne permet pas
de prédire simultanément deux tiges qui se chevauchent ne serait-ce que d’une base. Cette res-
triction peut poser un problème lorsque les vraies tiges d’une structure ne sont pas maximales
et que leur extension entraı̂ne un chevauchement comme illustré sur la figure 3.16.

G G G C C C A U A G ... ... U C A U G G G A U C G A A U C C C A U G G G C C C

(a) Deux tiges réelles non maximales.

G G G C C C A U A G ... ... U C A U G G G A U C G A A U C C C A U G G G C C C

(b) Tiges maximales correspondantes.

Fig. 3.16 – Les tiges réelles ne sont pas nécessairement maximales. Les tiges maximales (b)
qui correspondent aux tiges de l’exemple (a) se chevauchent de deux bases et sont donc
incompatibles entre elles.

Les tiges potentielles considérées dans caRNAc à l’issue de la première étape sont
systématiquement des tiges maximales. Par conséquent, sur l’exemple de la figure 3.16 une
seule des deux tiges pourrait donc être prédite.
La gestion des chevauchements est introduite dans l’algorithme en modifiant les définitions
des applications next, last et prev (page 91). Soit δ le nombre de bases autorisées à se che-
vaucher, on redéfinit ces applications de la manière suivante

next(i) = min{k ∈ [i + 1..n] | ai .rightopen < ak .lef topen + δ}

last(j) = max{k ∈ [1..j − 1] | ak .rightclose < aj .lef tclose + δ}
prev(i) = max{k ∈ [1..n] | ak .rightclose < ai .lef topen + δ}

En pratique, on fixe δ = 2, ce qui est suffisant pour rattraper les vraies tiges à partir de
tiges maximales correspondantes, sans pour autant introduire de fausses tiges.

97
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

Le corepliement de méta-séquences L’adaptation de l’algorithme de Sankoff proposée

dans caRNAc n’a pas à être modifiée pour pouvoir gérer les méta-séquences. Il est simplement
nécessaire de définir une manière d’ordonner les méta-tiges afin de construire les ensembles
A→ et A← , de définir l’énergie associée au repliement d’une méta-tige et au corepliement de
deux méta-tiges.
A→ désigne la liste des méta-tiges potentielles, rangées par ordre croissant de position
d’ouverture. Pour deux méta-tiges Ti = {t1i , t2i , . . . , tni } et Tj = {t1j , t2j , . . . , tnj } sur un aligne-
ment de n séquences, Ti ≤ Tj si et seulement si toutes les tiges individuelles vérifient cette
relation

Ti ≤ Tj ⇔ ∀k ∈ [1; n] tki .lef topen ≤ tkj .lef topen

De même pour construire la liste A← des méta-tiges potentielles réordonnées par position
de fermeture

Ti′ ≤ Tj′ ⇔ ∀k ∈ [1; n] t′k ′k

i .rightclose ≤ tj .rightclose

L’énergie associée au repliement d’une méta-tige, ou au corepliement de deux méta-

tiges, est égale à la somme des énergies des tiges individuelles repliées simultanément. Cette
définition pose un problème car elle favorise les repliements individuels dans les méta-
séquences qui représentent un grand nombre de séquences surtout lorsqu’elles sont comparées
à des séquences classiques. On normalise donc l’énergie associée à une méta-tige en prenant
la moyenne des énergies des tiges individuelles plutôt que leur somme.

Révision de l’implémentation de l’algorithme de Sankoff

Le corepliement de deux séquences dans caRNAc est une adaptation de l’algorithme de
Sankoff réécrit pour travailler sur des tiges entières et non au niveau nucléotidique. Dans la
section précédente, nous avons vu comment enrichir la version existante de cette heuristique
pour traiter des méta-tiges. Le corepliement de tous les couples de séquences est l’étape la
plus coûteuse de caRNAc. Nous présentons une révision de cet algorithme qui s’avère plus
efficace en pratique.
L’un des choix opérés dans caRNAc est de ne prédire que les tiges “sûres”, c’est-à-dire
les tiges communes qui présentent des covariations. Dans les faits, caRNAc n’autorise donc
le repliement de tiges individuelles que pour des petites tiges terminales dans des régions
d’insertion, c’est-à-dire entre deux points d’ancrage séparés par des séquences de longueurs
très différentes. Partant de cette constatation, nous proposons une implémentation de l’algo-
rithme de corepliement de deux séquences restreint au corepliement de tiges. Cette restriction
permet d’optimiser substantiellement l’efficacité de caRNAc sans pour autant diminuer ses
performances.
Notre révision de l’algorithme est dérivée de Gardenia [BT06], une méthode d’alignement
multiple de structures d’ARN développée dans l’équipe. L’idée est de ne pas stocker tous
les calcul intermédiaires et de recalculer au besoin l’énergie optimale de deux fragments de
séquences. Sur le papier la complexité spatiale est ainsi diminuée au détriment de la complexité
temporelle. En pratique ce choix s’avère cependant plus judicieux car il permet de tirer plus
aisément partie des différents mécanismes de mise en cache des machines actuelles.
L’implémentation que nous avons réalisée repose sur deux tables S et ST de dimension n×
m indexées par les listes des tiges ordonnées A← et B← . Chaque cellule S(j, l) contient l’énergie

98
 3.4. Résultats expérimentaux

optimale du repliement simultané des tiges a′j et a′l , c’est-à-dire l’énergie du corepliement de b′j
et b′l ajoutée à l’énergie optimale du repliement des deux séquences entre les parties ouvrantes
et fermantes de ces tiges. La table T est une table de travail pour les calculs intermédiaires.
Etant donné que seules les parties fermantes des tiges sont indexées dans les tables S et ST ,
on défini l’application open(i) : [1..n] −→ [1..n] qui permet de localiser la partie ouvrante
d’une tige ai dans la liste A→ .

open(i) = {k ∈ [1..n]|ak = ai }

Cette application est également définie pour l’ensemble des tiges B de la seconde séquence.
La table S est remplie par position d’ouverture de tige décroissante selon la règle suivante

S(j, l) = ST (last(j), last(l)) + bind(aj , bl )

où la table ST est partiellement recalculée pour chaque couple (j, l). Les règles de remplis-
sage de ST dans le couple d’intervalles ([prev(open(j)); last(l)], [prev(open(j)); last(l)]) sont
les suivantes



 ST (i − 1, k)

ST (i, k − 1)
ST (i, k) = min
 si open(i) ≥ next(open(j))
 ST (prev(open(i)), prev(open(k))) + S(i, k)

et open(k) ≥ next(open(l))

La dernière étape de l’algorithme consiste à remplir complètement la table ST sans res-

triction particulière. A l’issue du remplissage, la cellule ST (n, m) contient l’énergie optimale
du repliement simultané des tiges des deux séquences. Le rebroussement permettant de re-
trouver les structures s’effectue alors à l’aide d’une pile afin d’utiliser pleinement la table déjà
calculée.

3.4 Résultats expérimentaux

Dans la section précédente, nous avons présenté les modifications apportées à caRNAc.
Tout d’abord, la gestion de méta-séquences d’un bout à l’autre permet maintenant de traiter
les ensembles de séquences hétérogènes en terme de conservation. Ensuite, la tolérance de
petits chevauchements entre les tiges permet de pallier au problème inhérent à l’utilisation
de tiges maximales alors que les tiges réelles ne le sont pas nécessairement. Enfin, la révision
de l’algorithme de corepliement permet de trouver beaucoup plus rapidement une structure
commune optimale. Cette dernière modification est particulièrement importante car elle nous
offre la liberté de relâcher quelque peu les contraintes de filtrage des tiges potentielles et donc
de considérer plus de tiges dans la suite de l’algorithme.
Afin d’apprécier les effets de ces modifications sur le comportement global de la méthode,
nous l’avons évaluée sur BRAliBase I, le benchmark de référence des méthodes dédiée
à la prédiction de structures communes. En fin de section, nous présentons nos résultats
expérimentaux, à caractère plus exploratoire, en matière de prédiction d’ARN non-codants
basée sur l’existence d’une structure commune prédite par caRNAc.

99
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

3.4.1 Validation sur BRAliBase I

Dans la section 3.1.3, nous avons présenté les résultats de la version 2004 de caRNAc sur
le benchmark de référence BRAliBase I. Nous avons repris les données de BRAliBase I
afin d’apprécier l’impact des modifications apportées à la version originale de caRNAc, no-
tamment les méta-séquences.

caRNAc 2004 versus caRNAc 2008

Les résultats obtenus sur BRAliBase I par les deux versions de caRNAc sont synthétisés
dans les tables 3.7 et 3.8. Globalement, on constate qu’on obtient de meilleurs résultats avec
la nouvelle version de caRNAc, quelque soit le jeu de données et le degré de conservation.
Le M CC est en effet toujours supérieur ou égal à celui atteint par la version 2004. En terme
d’efficacité, la version 2008 de caRNAc s’avère beaucoup plus rapide, en particulier sur les
séquences longues où le temps de calcul est au minimum divisé par 7.
Pour les ARN de transfert et les RNAse P, la sensibilité et la spécificité des struc-
tures prédites sont systématiquement supérieures ou égales aux anciennes valeurs. Pour les
ARN ribosomiques en revanche, bien que le compromis sensibilité/spécificité soit globalement
amélioré, on constate une légère perte de spécificité. Si l’on observe plus finement les struc-
tures prédites pour ces séquences, on remarque que les faux positifs supplémentaires sont des
appariements qui appartiennent à la structure tertiaire. caRNAc prédit en réalité une tige
de la structure tertiaire au détriment d’une autre tige moins stable de la structure secondaire.
La tige prédite par caRNAc n’est pas considérée comme correcte dans le benchmark, bien
qu’elle existe dans la structure réelle.
L’évolution des performances varie en fonction du degré moyen de conservation du jeu de
données. Sur les jeux de données très conservés en moyenne, les résultats n’évoluent quasiment
pas. C’est ici la faible quantité de mutations qui est en cause : une tige ne peut en effet être
prédite que si elle présente au moins une covariation. En revanche sur les jeux de données
moyennement conservés, les résultats sont nettement meilleurs grâce à l’utilisation des méta-
séquences. Ces jeux de données comportent en effet des sous-ensembles de séquences très
conservées qui, lorsqu’ils ne font pas l’objet d’un traitement particulier, perturbent la méthode.
D’une part ces séquences présentent peu, voire pas du tout, de covariations et d’autre part
introduisent une redondance d’information qui fausse les statistiques du graphe des tiges.

caRNAc 2004 caRNAc 2008

Famille Conservation
Sens. Spé. MCC Corrél. Sens. Spé. MCC Corrél.
medium 75,0 93,8 0,836 84,4 100,0 100,0 1,000 100,0
tRNA
high 76,2 100,0 0,871 88,1 76,2 100,0 0,871 88,1
medium 59,4 95,0 0,750 77,2 61,5 96,7 0,770 79,1
RNaseP
high 51,4 100,0 0,716 75,7 51,4 100,0 0,716 75,7
medium 39,9 93,2 0,610 66,6 53,4 91,5 0,699 72,5
SSU
high 39,3 94,7 0,610 67,0 41,9 94,1 0,628 68,0
medium 46,8 97,8 0,676 72,3 50,0 95,8 0,692 72,9
LSU
high 43,1 98,6 0,652 70,9 50,9 94,1 0,692 72,5

Tab. 3.7 – Résultats de caRNAc version 2004 et version 2008 sur BRAliBase I.

100
 3.4. Résultats expérimentaux

caRNAc caRNAc
Famille Conservation Longueur Accélération
2004 2008
medium 73 0,125 s 0,052 s 2,40
tRNA
high 73 0,515 s 0,043 s 11,98
medium 377 48 s 0,941 s 51,00
RNaseP
high 377 0,831 s 0,500 s 1,67
medium 1542 153 s 20 s 7,65
SSU
high 1542 1149 s 22 s 52,23
medium 2904 2916 s 116 s 25,14
LSU
high 2904 1394 s 97 s 14,37

Tab. 3.8 – Temps d’exécution de caRNAc sur BRAliBase I.

Les résultats obtenus avant et après modification de caRNAc sont donnés dans la
table 3.9. Le repliement complémentaire par RNAfold permet d’améliorer les résultats glo-
baux. RNAfold a en effet tendance à compléter les structures prédites par caRNAc par
plus d’appariements corrects que de mauvais appariements. Cela se traduit par un meilleur
M CC, c’est-à-dire un meilleur compromis sensibilité/spécificité, provenant d’une sensibilité
qui augmente en moyenne de 22% alors que la spécificité ne diminue que de 15% en moyenne.
Par rapport à la version 2004 de caRNAc, tous les résultats vont dans le sens de ces obser-
vations. Toutefois, pour les petites sous-unités ribosomiques, la tige de la structure tertiaire
prédite par caRNAc induit en erreur le repliement thermodynamique en structure secondaire
de RNAfold, ce qui diminue de facto la sensibilité et la spécificité.

caRNAc 2004+RNAfold caRNAc 2008+RNAfold

Famille Conservation
Sens. Spé. MCC Corrél. Sens. Spé. MCC Corrél.
medium 90,0 94,7 0,922 92,4 100,0 100,0 1,000 100,0
tRNA
high 100,0 100,0 1,000 100,0 100,0 100,0 1,000 100,0
medium 87,5 83,2 0,852 85,3 89,6 89,6 0,895 89,6
RNaseP
high 70,8 66,2 0,684 68,5 70,8 66,2 0,684 68,5
medium 74,4 74,1 0,742 74,3 71,3 71,8 0,715 71,5
SSU
high 78,6 79,5 0,790 79,0 72,7 74,8 0,737 73,8
medium 83,3 81,2 0,822 82,2 86,3 85,6 0,859 85,9
LSU
high 80,9 79,3 0,801 80,1 83,9 82,5 0,832 83,2

Tab. 3.9 – Résultats de caRNAc dont les structures prédites sont complétées par RNAfold.

caRNAc et les méthodes existantes

Les modifications apportées à caRNAc améliorent ses performances sur BRAliBase I.
Quand est-il des résultats de cette nouvelle version face aux autres méthodes ?
Les résultats des méthodes testées dans BRAliBase I sont reportées par jeu de données
dans les tables 3.10 et 3.11. Les résultats de caRNAc présentées dans ces tables sont ceux de
la version qui intègre les méta-séquences. Globalement, RNAalifold et caRNAc sont les
deux méthodes les plus performantes, tous jeux de données confondus, surtout lorsque l’on
considère les structures complétées par RNAfold. Bien que Pfold produise de meilleurs

101
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

(a) Résultats sur les ARN de transfert (b) Résultats sur les ARN de RNase P
Méthode Conserv. Sens. Spé. MCC Méthode Conserv. Sens. Spé. MCC
medium 77,8 100,0 0,880 medium 57,4 57,4 0,571
RNAalifold RNAalifold
high 90,5 100,0 0,950 high 78,9 77,8 0,782
medium 100,0 75,0 0,863 medium 70,4 55,1 0,620
Ilm Ilm
high 76,2 69,6 0,722 high 43,7 36,5 0,395
medium 100,0 100,0 1,000 medium 87,0 92,2 0,895
Pfold Pfold
high 95,2 100,0 0,975 high 66,2 88,7 0,765
medium 100,0 100,0 1,000 medium 61,5 96,7 0,770
caRNAc caRNAc
high 76,2 100,0 0,871 high 51,4 100,0 0,716
medium 94,3 95,0 0,945 medium 32,0 32,8 0,321
Dynalign Dynalign
high 54,8 54,5 0,535 high 40,3 39,6 0,397
medium 23,8 33,3 0,268 medium 5,2 22,7 0,107
FoldAlign FoldAlign
high 23,8 31,2 0,259 high 19,7 35,9 0,265

Structures prédites complétées par RNAfold Structures prédites complétées par RNAfold
medium 100,0 100,0 1,000 medium 61,1 67,3 0,639
RNAalifold RNAalifold
high 100,0 100,0 1,000 high 77,5 77,5 0,773
medium 100,0 100,0 1,000 medium 89,6 89,6 0,895
caRNAc caRNAc
high 100,0 100,0 1,000 high 70,8 66,2 0,684

Tab. 3.10 – Résultats de BRAliBase I sur les ARN de transfert et sur les ARN de RNase
P.

(a) Résultats sur les petites sous-unités ribosomiques (b) Résultats sur les grosses sous-unités ribosomiques
Méthode Conserv. Sens. Spé. MCC Méthode Conserv. Sens. Spé. MCC
medium 84,4 92,1 0,881 medium 75,0 92,1 0,831
RNAalifold RNAalifold
high 59,8 60,6 0,601 high 79,0 76,3 0,776
medium 59,9 51,5 0,554 medium 68,4 58,0 0,630
Ilm Ilm
high 51,3 43,0 0,469 high 49,0 39,3 0,438
medium - - - medium - - -
Pfold Pfold
high 70,9 92,6 0,810 high - - -
medium 53,4 91,5 0,699 medium 50,0 95,8 0,692
caRNAc caRNAc
high 41,9 94,1 0,628 high 50,9 94,1 0,692
medium - - - medium - - -
Dynalign Dynalign
high - - - high - - -
medium - - - medium - - -
FoldAlign FoldAlign
high - - - high - - -

Structures prédites complétées par RNAfold Structures prédites complétées par RNAfold
medium 88,0 89,8 0,889 medium 84,4 89,9 0,871
RNAalifold RNAalifold
high 59,3 58,3 0,588 high 79,2 77,3 0,782
medium 71,3 71,8 0,715 medium 86,3 85,6 0,859
caRNAc caRNAc
high 72,7 74,8 0,737 high 83,9 82,5 0,832

Tab. 3.11 – Résultats de BRAliBase I sur les ARN des petites et grosses sous-unités ribo-
somiques.

102
 3.4. Résultats expérimentaux

résultats sur les séquences courtes, c’est-à-dire les ARN de transfert, et de longueur moyenne,
les RNase P, il s’avère incapable de traiter les séquences plus longues pour des raisons de
complexité et de applications numériques. En effet, pour effectuer une prédiction Pfold
calcule des probabilités qui peuvent être très faibles jusqu’à descendre sous la capacité du
type primitif utilisé dans l’implémentation de Pfold.
Sur les ARN de transfert, RNAalifold et Pfold sont globalement meilleurs que caR-
NAc. Pour Pfold, ses excellents résultats sur ce jeu de données sont biaisés car ces séquences
ont été utilisés pour entraı̂ner la méthode. Sur les ARN de RNase P, caRNAc et Pfold ob-
tiennent les meilleurs résultats sur le jeu de données medium avec un M CC respectif de 0,77 et
0,895. caRNAc est légèrement plus spécifique que Pfold avec une spécificité de 96,7% contre
92,2% pour Pfold, mais Pfold se montre beaucoup plus sensible. Si l’on compare les struc-
tures de caRNAc repliées par RNAfold à Pfold, les compromis sensibilité/spécificité des
deux méthodes sont strictement équivalents. Sur les ARN de RNase P très conservés (high),
les meilleures prédictions sont produites par RNAalifold avec un M CC de 0,782. On note
cependant sur ces données que caRNAc est le seul à ne prédire aucun appariement incorrect
puisque sa spécificité est de 100%, tout en prédisant plus d’un appariement sur deux de la
structure réelle. De plus, sur cette structure prédite par caRNAc les appariements ajoutés
par RNAfold n’améliore pas le compromis sensibilité/spécificité puisque le M CC passe de
0,716 à 0,684.
Les ARN ribosomiques sont des séquences particulièrement longues qui posent des
problèmes de complexité à Dynalign et FoldAlign. La mémoire requise par ces méthodes
pour replier ces séquences dépasse largement les capacités offertes par la machine utilisée
pour le benchmark, c’est à dire 1Go. A l’exception du jeu de données ssu high où caRNAc
s’avère la méthode la plus performante avec un M CC à 0,628, RNAalifold est la méthode
dont le compromis sensibilité/spécificité est meilleur sur les ARN ribosomiques. caRNAc
tient ses objectifs puisque la spécificité des structures qu’il prédit ne descend jamais en des-
sous de 90%. Cette spécificité accrue est un atout important : les appariements prédits par
caRNAc constituent des contraintes sûres pour guider un repliement purement thermodyna-
mique. Sur les données très conservées, cette stratégie permet d’atteindre un M CC supérieur
à RNAalifold. Notamment dans le cas des petites sous-unités très conservées, le M CC de
caRNAc+RNAfold vaut 0,737 contre 0,601 pour RNAalifold et 0,588 pour RNAali-
fold+RNAfold .

3.4.2 Vers la prédiction de gènes à ARN

Comme nous l’avons vu dans la section 3.2, l’existence d’une structure secondaire
conservée représente une information majeure dans la prédiction de gène à ARN. Nous avons
notamment vu comment RNAz exploite cette information pour tenter de détecter des ARN
non-codants homologues. AlifoldZ et RNAz évaluent en effet la stabilité d’une structure
commune prédite par RNAalifold par rapport à une distribution d’énergie libre construite
de manière empirique dans le cas d’AlifoldZ, approximée par apprentissage dans RNAz.
Le principal inconvénient lié à l’emploi de RNAalifold est qu’il procède à une analyse
comparative sur un alignement multiple, quelque soit le degré de conservation des séquences.
Or, nous avons déjà montré à plusieurs reprises que les alignements de séquences faiblement
conservées sont rarement fiables. Comme nous l’avons vu dans la section précédente, caR-
NAc fait partie des méthodes de prédiction de structure conservée les plus performantes. Nous
proposons donc d’adapter le protocole d’AlifoldZ en exploitant les prédictions de caRNAc.

103
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

Cette expérience nous amène à confronter nos résultats à ceux des méthodes existantes qui
procèdent à la prédiction d’ARN non-codants par analyse comparative.

L’existence d’une structure commune prédite par caRNAc

Nous avons dû adapter le protocole d’AlifoldZ pour deux raisons : caRNAc travaille
sur des séquences non alignées, et caRNAc ne calcule pas une structure commune consensus
mais une structure par séquence globalement partagée par toutes les séquences. Le protocole
que nous utilisons est donc le suivant pour un ensemble S de n séquences :
– prédiction par caRNAc de la structure commune des séquences de S qui se traduit par
l’obtention de n structures ;
– production d’un alignement A des séquences de S avec ClustalW ;
– mélange des positions de A à l’aide du script shuffle aln.pl d’AlifoldZ afin d’obtenir
100 alignements mélangés ;
– prédiction par caRNAc de la structure commune des séquences de chacun des aligne-
ments mélangés ;
– calcul d’un z-score individuel des structures prédites pour les séquences de S.
A l’aide des n z-scores individuels obtenus pour chaque séquence de S, on réalise enfin
une prédiction suivant un vote majoritaire : si plus de la moitié des n z-scores associés aux
n structures prédites par caRNAc sont inférieurs à un certain seuil α, alors on prédit un
ensemble d’ARN non-codants homologues. Dans le cas contraire, on considère que l’on ne se
trouve pas en présence d’ARN non-codants homologues.
Afin d’évaluer le potentiel de cette approche, nous avons sélectionné de manière aléatoire
quatre séquences de chaque famille présente dans Rfam. Pour chaque famille, nous avons
calculé le z-score moyen des structures prédites par caRNAc par rapport à cinquante aligne-
ments mélangés de ces séquences. Pour apporter un contrôle négatif, nous avons constitué un
jeu de données composé des “familles” de séquences extraites de dix alignements aléatoires
générés par famille en mélangeant l’alignement structural des séquences originales. Les
résultats obtenus sur ces deux jeux de données sont présentés sur la figure 3.17. Sur les
familles d’ARN non-codants homologues, le z-score moyen des structures prédites par caR-
NAc est en moyenne inférieur à celui calculé sur les ensembles de séquences aléatoires. Les
deux distributions du z-score moyen observées ne se détachent toutefois pas complètement,
et leur intersection est relativement importante. En fixant à −1 le seuil sur le z-score calculé,
environ 20% des séquences aléatoires sont prédits ARN non-codants à tort, et un peu moins
de 70% ARN non-codants sont correctement détectés.
Nous avons également envisagé l’utilisation de Sissiz pour obtenir des alignements mul-
tiples de même composition en di-nucléotides (section 3.2.4). Toutefois, l’implémentation de
Sissiz pose plusieurs problèmes. Sissiz approxime la distribution en di-nucléotides de l’ali-
gnement original de manière asymptotique, ce qui ne garantit pas d’obtenir strictement la
même distribution, en particulier sur des séquences courtes comme c’est souvent le cas pour
les ARN non-codants. D’autre part, Sissiz rencontre quelques problèmes numériques gênants
pour une utilisation systématique. L’absence complète d’un di-nuléotide provoque sous cer-
taines conditions une erreur fatale, de même qu’une répartition totalement équiprobable de
tous les di-nucléotides qui est considérée comme une “absence de signature” significative. Pour
toutes ces raisons, nous n’avons pas poussé nos investigations avec ce logiciel.

104
 3.4. Résultats expérimentaux

0.18
ARN
0.16 Autre
0.14

0.12
Fréquence

0.1

0.08

0.06

0.04

0.02

0
-15 -10 -5 0 5 10
z-score

Fig. 3.17 – Répartition du z-score moyen observé de l’énergie libre des structures prédites
par caRNAc sur les familles d’ARN non-codants de Rfam (trait plein), et sur des familles
de séquences aléatoires (trait discontinu).

Les jeux de données d’évaluation

Nous avons décidé de faire varier plusieurs propriétés susceptibles d’influencer les per-
formances des méthodes : la méthode d’alignement employée, la degré de conservation des
séquences, le nombre de séquences et la qualité des structures des ARN non-codants. Les
choix des séquences a donc été réalisé avec l’objectif de pouvoir construire des ensembles de
séquences dont le pourcentage d’identité moyen varie de 40 à plus de 95%. Afin de mesurer
le gain d’information apporté par l’utilisation de plusieurs séquences similaires, nous avons
réalisé des alignements comportant de deux à cinq séquences. Nous n’avons pas construit d’ali-
gnement de plus de cinq séquences pour une raison simple : lorsque l’on dispose d’autant de
séquences similaires, les outils d’inférence de structures communes peuvent suffire à détecter
des ARN non-codants homologues. En effet, l’existence d’une structure commune à plus de
dix séquences constitue un signal fort pour identifier des ARN non-codants homologues. Dans
la section 3.2, nous avons vu que la détection des ARN non-codants à partir d’une séquence
dépend de la qualité des structures des ARN à détecter. Pour évaluer l’influence de la qualité
des structures sur la détection à partir de plusieurs séquences, nous avons sélectionné des
familles d’ARN non-codants dont les structures communes ont une stabilité variable. Nous
avons également retenu quelques familles dont les structures communes comportent des pseu-
donœuds pouvant gêner la prédiction.
A partir de ces propriétés, nous avons recueilli trois types de données provenant de
plusieurs organismes : des ARN non-codants homologues pour évaluer la sensibilité, des
fragments codants homologues d’ARN messagers et des séquence aléatoires pour évaluer
la spécificité. La répartition des données est la suivante : 21 familles d’ARN non-codants,
15 familles d’ARN messagers et 21 “familles” de séquences aléatoires. La majorité des fa-

105
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

milles d’ARN non-codants retenues proviennent de Rfam. Afin d’assurer la variabilité des
paramètres définies précédemment nous avons ajouté deux familles de micro ARN provenant
de miRBase. Dans la section 1.3, nous avons vu que des fragments d’ARN messagers, les
introns et les extrémités 3′ et 5′ non traduites, sont susceptibles de contenir des structures.
Pour produire des séquences qui ne contiennent a priori pas de structure, nous avons re-
tiré ces fragments des ARN messagers que nous avons utilisés. Les ARN messagers sont en
général composés de plusieurs milliers de bases, contrairement aux ARN non-codants dont
la longueur dépasse rarement les 300 bases. Pour constituer un jeu de données comparable
au jeu de données positif d’ARN non-codants, certains alignements ont par conséquent été
tronqués. Le second jeu de données négatives, les shuffles, est composé d’alignements positifs
mélangés par la procédure employée dans AlifoldZ [WH04] (section 3.2.4).

Le protocole expérimental
Trois des méthodes les plus récentes ont été testées sur les jeux de données ainsi constitués :
Qrna [RE01], ddbRNA [DBDH03] et RNAz [WHS05]. Contrairement à ddbRNA et RNAz
qui effectuent une classification binaire “ARN non-codants homologues”/“autre”, Qrna ef-
fectue une classification en trois classes : “codant”, “non-codant” et “autre”. L’objectif de
nos tests est d’évaluer les performances de détection des ARN non-codants. De notre point
de vue, les classes “codant” et “autre” sont équivalentes car elles ne correspondent pas à
la prédiction d’ARN non-codants homologues. Ces deux classes sont donc fusionnées. Pour
évaluer les performances des méthodes nous utilisons les trois notions classiques, à savoir la
sensibilité, la spécificité et le cœfficient de corrélation de Matthews. La sensibilité désigne ici
la proportion d’ARN non-codants homologues détectés, la spécificité la proportion d’ARN
messagers et d’alignements mélangés non prédits comme des ARN non-codants homologues.
Pour chaque famille, des ensembles de deux, trois et cinq séquences sont créés
aléatoirement. Chaque ensemble de séquences est ensuite aligné et soumis aux différentes
méthodes, caRNAc étant la seule méthode qui ne nécessite pas d’alignement préalable. Au
total, plus de 80 000 alignements ont ainsi été constitués.

L’influence de l’alignement
Nous avons fait appel à cinq méthodes d’alignement largement utilisées :
Blast [WBB+ 08] et Needleman&Wunsch [NW70] pour les alignements deux à deux,
ClustalW [THG94], T-Coffee [NHH00] et Dialign2-2 [Mor99] pour les alignements
de deux séquences et plus. Selon la méthode utilisée, les résultats varient sensiblement. En
moyenne, les meilleurs résultats sont obtenus sur les alignements produits par ClustalW
(figure 3.18). Cette observation globale se vérifie sur les résultats moyens de chaque méthode
de détection, quelque soit le nombre de séquences utilisées.
RNAz a été entraı̂né à reconnaı̂tre les ARN non-codants sur des alignements produits par
ClustalW. Il est donc normal qu’il obtienne de meilleurs résultats sur ce type d’alignements.
Les performances de ddbRNA sur les alignements de ClustalW s’expliquent par un nombre
moyen de gaps moins important dans ces alignements que dans les alignements de Dialign2-
2 et T-Coffee. En effet, les gaps sont une entrave à la recherche de tiges pratiquée dans
ddbRNA : les positions qui contiennent au moins un gap sont ignorées et ne contribuent
donc pas à la formation des tiges. Les résultats obtenus sur les alignements produits par
Blast et Needleman&Wunsch sont en moyenne inférieurs aux alignements de deux séquences

106
 3.4. Résultats expérimentaux

0.8

0.6
MCC

0.4

0.2
ClustalW
Dialign2-2
T-Coffee
0
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Pourcentage d’identité moyen

Fig. 3.18 – Résultats moyens des méthodes de détection selon la méthode d’alignement mul-
tiple utilisée. Les résultats sont exprimés en fonction du pourcentage d’identité des aligne-
ments. Ces résultats sont calculés à partir de tous les alignements de deux, trois et cinq
séquences.

produits par ClustalW (table 3.12). Cette observation est notamment valable pour Qrna
qui a pourtant été entraı̂né à reconnaı̂tre les ARN non-codants sur des alignements produits
par Blast. Ces résultats nous amènent à nous focaliser sur les alignements générés par
ClustalW.

Méthode Sensibilité moyenne (en %) Spécificité moyenne (en %)

d’alignement ddbRNA RNAz Qrna ddbRNA RNAz Qrna
Blast 12,3 42,0 36,1 98,5 93,8 93,4
Needleman&Wunsch 18,3 55,1 23,6 97,5 95,5 98,1
ClustalW 26,7 71,9 41,3 97,2 95,4 98,2

Tab. 3.12 – Résultats moyens obtenus sur des alignements produits par Blast, Needle-
man&Wunsch et ClustalW avec deux séquences.

L’influence du nombre de séquences

Le table 3.13 et la figure 3.19 donnent les résultats obtenus selon le nombre de séquences
utilisées. Les performances de ddbRNA et de RNAz sont en moyenne meilleures sur des
alignements de trois séquences. Toutefois, pour RNAz, la sensibilité est bien plus élevée en
utilisant cinq séquences. Quant à caRNAc, ses résultats croissent strictement avec le nombre
de séquences utilisées.

107
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

0.8

0.6
caRNAc (shuffle-aln.pl)
MCC

ddbRNA
RNAz
0.4 Qrna

0.2

0
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Pourcentage d’identité moyen

(a) Alignements de deux séquences.

0.8

0.6
caRNAc (shuffle-aln.pl)
MCC

ddbRNA
RNAz
0.4

0.2

0
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Pourcentage d’identité moyen

(b) Alignements de trois séquences.

0.8

0.6
caRNAc (shuffle-aln.pl)
MCC

ddbRNA
RNAz
0.4

0.2

0
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Pourcentage d’identité moyen

(c) Alignements de cinq séquences.

Fig. 3.19 – Résultats de Qrna, ddbRNA, RNAz et caRNAc en fonction du nombre de

séquences utilisées. Les résultats sont exprimés à l’aide du cœfficient de corrélation de Mat-
thews, en fonction du pourcentage d’identité des alignements.

108
 3.4. Résultats expérimentaux

(a) Résultats de ddbRNA

Nb séq. Sensibilité (en %) Spécificité (en %) MCC
2 27,1 97,1 0,309
3 31,5 97,1 0,335
5 27,0 98,3 0,252
(b) Résultats de RNAz
Nb séq. Sensibilité (en %) Spécificité (en %) MCC
2 78,9 90,4 0,697
3 78,2 93,6 0,704
5 76,6 93,9 0,639
(c) Résultats de caRNAc
Nb séq. Sensibilité (en %) Spécificité (en %) MCC
2 46,4 89,7 0,409
3 63,3 82,9 0,472
5 70,2 90,6 0,628

Tab. 3.13 – Résultats selon le nombre de séquences utilisées. Ces résultats sont établis sur
les alignements réalisés avec ClustalW, et exprimés en pourcentage pour la sensibilité et la
spécificité. La spécificité moyenne est calculée sur les ARN messagers et les shuffles.

L’influence de la conservation

La conservation entre les séquences est un paramètre dont l’influence varie suivant la
méthode employée. En moyenne, les meilleurs résultats proviennent des alignements dont le
pourcentage d’identité moyen est compris entre 60% et 85%. caRNAc est la seule méthode
capable de traiter convenablement des jeux de données dont la conservation moyenne est
inférieure à 60% d’identité. Entre 60% et 85% d’identité, toutes les méthodes ont une
spécificité moyenne supérieure à 80%. Néanmoins, hors de cet intervalle la spécificité moyenne
reste élevée et ne descend pas en dessous de 75%. Par contre, la sensibilité de Qrna et de
ddbRNA se dégrade rapidement lorsque l’on dépasse 90% d’identité moyenne.
La spécificité moyenne sur les shuffles est à peu près équivalente à la spécificité moyenne
sur les ARN messagers. Lorsque le pourcentage d’identité est inférieur à 80%, la spécificité
moyenne sur les shuffles est très légèrement inférieure à celle des ARN messagers ; la situation
s’inverse au delà de 80% d’identité.
L’influence de la conservation est en réalité étroitement liée à la qualité d’alignement.
En effet, des séquences homologues mal conservées partagent une structure commune que
toutes les méthodes ont dû mal à prédire à partir d’un alignement qui n’est pas correct. C’est
également la raison pour laquelle caRNAc est la seule méthode qui produise des résultats
probants en dessous de 60% d’identité moyenne. Sur la figure 3.20 est représentée à gauche
la structure secondaire d’un ARN non-codant présent dans la partie 3′ de l’ARN des virus
de la famille des pomovirus. Sur cette figure est également présenté un alignement de trois
séquences homologues de ce type d’ARN non-codant produit ClustalW et extrait de notre
jeu de données. Bien que plus de 90% des positions de cet alignement soient correctes, seul
caRNAc prédit des séquences d’ARN non-codants homologues. La structure prédite par
caRNAc sur ces séquences est présentée en partie droite de la figure 3.20.

109
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

40
50 G U A
A A A
A
C A
C U
G C
U U G
A 50
G C G
A
C A C U A
G C A G G C A C
30 U U
U C G C
G C 60 C C
C C
G C C
U G U C
40 A U
30
A C U C
A C
C G G 60
A U C
A A A C 70
C U
A G U
C U U G U C
C C U C C C A C
C C G A C C
G G G
G G C
20
G U
20 U U
G A G A C
A 80
A C C
C C A C C G 70
G G C G C
C U G C G U A A G
C U U 80 G
U G A A C C A A
G U U C
G G U C
G C U 5’
C G
A C G A
5’ U
A C C
10 10

(a) Structure réelle. (b) Structure prédite par caRNAc.

T91413.1 UUAGCUCGC-CAGUGCGAGGCCUCUUCCUACACAAGAGGUAU---UGG-GGUGCGACUCCCCCGUCUAUCCUGAACGUCAUCAGGACCA
X54354.1 UUAGCUCGC-CAGUGCGAGGCUCGUUCCCACACAACAAGUAA---UGGUGGUGCAACUCCCCCGUCC-UCCCGAACGUCAUCGGGACCA
Y16104.1 UAAUUGAGGACAGUUCCUCUCCCUCUAGCACACAGA-GGUCAAACUGGGUG--CAACUCCCCCC-CCUUCCGUGG-GUAACGGAAACC-
(c) Alignement extrait de Rfam.

T91413.1 UUAGCUC--GCCAGUGCGAGGCCUCUUCCUACACAAGAGGUAUUGG-GGUGCGACUCCCCCGUCUAUCCUGAACGUCAUCAGGACCA
X54354.1 UUAGCUC--GCCAGUGCGAGGCUCGUUCCCACACAACAAGUAAUGGUGGUGCAACUCCCCCGUCC-UCCCGAACGUCAUCGGGACCA
Y16104.1 -UAAUUGAGGACAGUUCCUCUCCCUCUAGCACACAGAGGUCAAACUGGGUGCAACUCCCCC--CCCUUCCGUGGGUAACGGAAACC-
************************** ********** *************
(d) Alignement produit par ClustalW. Le symbole * marque les positions correctes.

Fig. 3.20 – Structure secondaire réelle (à gauche) et structure prédite par caRNAc (à droite)
d’un ARN non-codant présent dans l’ARN des pomovirus, ici celle du Cacao yellow mo-
saic virus. En partie inférieure, l’alignement produit par ClustalW de ladite séquence et
de deux séquences homologues ainsi que l’alignement structural correspondant extrait de
Rfam (RF00233). Ces séquences ont un pourcentage d’identité moyen est de 66%.

110
 3.4. Résultats expérimentaux

Les conclusions
Face à ses concurrents, caRNAc tire son épingle du jeu sur les séquences faiblement
conservées où il est le seul à fournir des résultats pertinents. Sur ce type de données, les autres
méthodes sont induites en erreur par un alignement incorrect. Sur les séquences relativement
bien conservées en revanche, RNAz se dégage nettement de toutes les méthodes existantes
en terme de sensibilité. Au niveau spécificité, Qrna, ddbRNA et RNAz sont à peu près
équivalentes, bien que Qrna soit nettement plus spécifique sur les ARN messagers grâce à
son modèle pour détecter les séquences codantes homologues.
Contrairement à caRNAc, la conception de RNAz repose sur un système d’apprentissage
très sophistiqué entraı̂né sur un très grand nombre de séquences issues d’un large éventail de
familles d’ARN non-codants. Cette caractéristique est un point fort pour RNAz lorsque le
jeu de données qu’on lui soumet répond aux critères pour lesquels il a été entraı̂né. Cet atout
peut toutefois s’avérer limitant, notamment en ce qui concerne le nombre de séquences. En
effet, RNAz ne peut pas traiter de jeux de données comportant plus de dix séquences car son
processus d’apprentissage a été limité à des jeux de données contenant au plus dix séquences.
caRNAc en revanche n’est pas limité en nombre de séquences. Qui plus est, les différentes
expériences que nous avons présentées montre que les performances de caRNAc augmentent
avec le nombre de séquences. Cette propriété lui confère un net avantage par rapport aux
méthodes existantes dont les performances sont limitées par les difficultés à produire un
alignement multiple d’un grand nombre de séquences.

111
Chapitre 3. Prédiction de structures communes d’ARN non-codants homologues

112
 Chapitre 4

Deux exemples d’intégration de

Protea et caRNAc

Au cours des chapitres 2 et 3 nous avons présenté deux méthodes que nous avons mis au
point pour la prédiction de séquences codantes homologues et de séquences non codantes qui
partagent une structure. L’originalité de ces méthodes réside dans le traitement d’ensembles de
séquences non alignées par analyse comparative qui permet d’obtenir des résultats significatifs
sur des séquences faiblement conservées. De plus, ces méthodes tirent parti du concept que
nous avons introduit, les méta-séquences (section 1.5.3), qui permet d’éliminer les redondances
de séquences au sein d’un jeu de données et donc de traiter des ensembles de séquences
hétérogènes en terme de conservation.
Dans ce chapitre, nous nous intéressons à l’intégration de ces méthodes dans deux projets
collaboratifs réalisés au sein de l’équipe. Dans la section 4.1, nous présentons Magnolia, une
méthode d’alignement multiple de séquences nucléiques fonctionnelles basée sur les prédictions
de Protea et de caRNAc. Dans la section 4.2, nous présentons un pipeline d’annotation
par génomique comparative.

4.1 L’alignement multiple de séquences nucléiques

Au cours des chapitres précédents, nous avons fait mention de bon nombre d’outils d’ali-
gnement pour identifier des séquences similaires dans un banque de données (sections 2.2 et
3.2.3) ou pour fournir un objet d’étude en vue d’une analyse comparative (section 1.5). On
peut regrouper les outils d’alignement de séquences nucléiques en deux groupes. D’une part,
les outils génériques qui cherchent à maximiser les ressemblances entre les séquences d’un
point du vue syntaxique, c’est-à-dire à mettre en relation un maximum d’acides nucléiques
identiques. Ces méthodes, exactes ou heuristiques, ne nécessitent aucune connaissance a priori
sur les séquences à aligner. D’autre part, les outils plus spécifiques et sophistiqués qui sup-
posent l’existence d’une fonction commune partagée par les séquences à aligner pour proposer
un alignement respectueux de cette fonction. C’est ce dernier type de méthode auquel nous
nous intéressons ici.
Dans un premier, nous présentons les méthodes dédiées à l’alignement de séquences co-
dantes homologues. Ensuite, nous présentons les méthodes dédiées à l’alignement de séquences
qui partagent une structure commune. Puis, nous présentons Magnolia, la méthode d’aligne-
ment multiple de séquences codantes homologues et non codantes qui partagent une structure

113
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

commune que nous avons développée. Enfin, nous terminons cette section par une évaluation
des performances de Magnolia.

4.1.1 L’alignement multiple de séquences codantes homologues

Parmi les méthodes de prédiction de séquences codantes présentées dans la section 2.2,
certaines proposent en sortie un alignement qui tient compte des séquences d’acides aminés
codées. Toutefois, toutes ces méthodes (Procrustes [GMP96], GeneWise [BCD04], Ge-
nomeScan [YLB01], ORFGene2 [RMK96], PredictGenes [GHKB00], GenomeThrea-
der [GBSK05]) nécessitent une connaissance a priori de la séquence d’acides aminés, ou
extraient cette séquence des banques publiques. Leur fonctionnement consiste à réaliser un
alignement d’une séquence d’acides aminés de référence contre une séquence nucléique sup-
posée codée une séquence d’acides aminés identique ou similaire.
En ce qui concerne les méthodes de prédiction par analyse comparative (section 2.3), la
situation est différente car la quasi totalité de ces méthodes travaillent sur des séquences
déjà alignées et ne proposent donc pas d’alignement en sortie. Les seules méthodes qui pro-
duisent en sortie des alignements des séquences nucléiques prédites comme des séquences co-
dantes homologues sont les méthodes qui travaillent sur des séquences génomiques complètes.
Néanmoins, ces méthodes sont toutes restreintes à l’analyse des couples d’espèces précis et ne
savent pas traiter des séquences hors de leur contexte génomique.
A notre connaissance, il n’existe finalement qu’un seul logiciel, Dialign2-2 [Mor99] qui
réalise l’alignement d’un ensemble de séquences nucléiques en fonction des séquences d’acides
aminés potentielles qu’elles peuvent coder. Le principe de Dialign2-2 repose sur l’identifi-
cation de segments conservés, c’est-à-dire des fragments de séquences qui s’alignent correcte-
ment sans insertion ni délétion, incorporés de manière gloutonne pour former un alignement
complet. Pour un ensemble de n séquences, Dialign2-2 commence par rechercher tous les
segments conservés entre tous les couples de séquences. Pour chaque couple de séquences,
les segments obtenus sont regrouper pour former des ensembles cohérents sans croisement
ni chevauchement, c’est-à-dire qu’ils doivent pouvoir faire partie d’un même alignement, ap-
pelés des diagonales. Ensuite, les diagonales obtenues pour tous les couples de séquences sont
incorporées de manière gloutonne pour former un alignement multiple. En plus de pouvoir
identifier les segments entre les séquences nucléiques fournies, Dialign2-2 propose d’identi-
fier ces segments au niveau peptidique. Chaque séquence est alors traduite systématiquement
selon les trois cadres de lecture possibles pour le brin donné, puis les segments sont identifiés
entre les couples de traductions en utilisant la matrice BLOSUM62. La construction des dia-
gonales se fait ensuite à partir de l’ensemble des segments provenant des trente six couples
de traductions potentielles obtenus pour un couple de séquences, ce qui permet de supporter
la présence de décalages de cadres de lecture. La suite de l’algorithme est inchangée, et le
retour aux séquences nucléiques se fait à l’issue de la construction de l’alignement multiple
au niveau peptidique.

4.1.2 L’alignement multiple de séquences partageant une structure com-

mune
L’alignement de séquences possédant une structure secondaire commune est un problème
qui a beaucoup intéressé la communauté ces cinq dernières années, en partie à cause des
nombreuses découvertes de petits ARN non-codants. A l’heure actuelle on dénombre plus

114
 4.1. L’alignement multiple de séquences nucléiques

d’une dizaine de méthodes dédiées à ce problème de produire un alignement structural mul-

tiple avec inférence de la structure. Parmi ces méthodes, certaines ont déjà été mentionnées
dans la section 3.1.2 car en plus d’aligner les séquences, elle réalise une prédiction expli-
cite de la structure secondaire conservée : Dynalign, FoldAlignM, Stemloc, PMmulti,
Mlocarna, StrAl, Murlet et MxscaRNA. Il existe cependant d’autres méthodes qui
réalisent un alignement mais qui ne produisent pas en sortie la structure détectée telles que
R-Coffee [WHN08, MWH+ 08] et Lara [BKR07]. Sans entrer dans les détails, R-Coffee
et Lara sont deux méthodes qui utilisent T-Coffee pour réaliser un alignement multiple
en faisant varier son système de score en fonction des structures prédites sur les séquences
individuelles par approche thermodynamique (section 3.1.1).
En marge des méthodes qui intègrent dans leur processus la prédiction de structures
individuelles ou communes, il existe une autre famille de méthodes qui s’appuient sur des
structures connues ou des prédites : RNAforester [HTGK03, HVG04], Marna [SB05],
MiGaL [AS05] ou encore Gardenia [BT06]. Contrairement aux autres, MiGaL est limité à
l’alignement de deux séquences.

4.1.3 Magnolia, alignement de séquences fonctionnelles homologues

Magnolia [FdMT08] admet en entrée un ensemble de séquences nucléiques non alignées

et produit en sortie un alignement multiple de ces séquences en fonction de leur nature.
Magnolia est en réalité l’agrégation de trois méthodes développées dans l’équipe : Protea
(section 2.4), caRNAc (section 3.3) et Gardenia [BT06]. La figure 4.1 résume de manière
schématique le fonctionnement de Magnolia. Dans un premier temps, la fonction commune
des séquences est prédite au moyen de Protea et de caRNAc+Gardenia . En fonction
des prédictions réalisées, Magnolia produit les alignements multiples correspondants générés
par Protea pour les séquences codantes et par Gardenia pour les séquences non codantes
qui possèdent une structure commune.

ClustalW,
Dialign2-2,
Protea T-Coffee

cadre de lecture graphe des classification alignement

conservé cadres de lecture codant/autre multiple
E N T R É E 2 séquences toutes les séquences séquences
SORTIE

d’acides aminés
séquences couples de
nucléiques séquences
structures
2 séquences toutes les séquences primaire et secondaire

structure secondaire graphe alignement classification

conservée des tiges multiple structuré/autre

caRNAc Gardenia

Fig. 4.1 – L’enchaı̂nement des modules qui composent Magnolia.

115
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

Prédiction et alignement de séquences codantes

Protea (section 2.4) peut être utilisé pour améliorer l’alignement de séquences codantes
homologues, en particulier sur des séquences nucléiques divergentes. Pour ce faire, nous avons
défini le protocole suivant constitué de trois étapes. La première étape consiste à utiliser
Protea pour rechercher un cadre de lecture conservé. Si Protea détecte des séquences
codantes homologues, alors les séquences d’acides aminés codées par les cadres de lectures
prédits sont alignées à l’aide d’une méthode d’alignement multiple classique. La méthode
d’alignement utilisée ici est indépendante du reste de notre procédure. Enfin, l’alignement
multiple des séquences d’acides aminés est rétro-transcrit pour obtenir un alignement multiple
des séquences nucléiques initiales. Cette rétro-transcription fait appel à un algorithme ad hoc
qui permet de gérer les éventuels décalages du cadre de lecture introduits lors de l’analyse par
Protea. La figure 4.2 présente un exemple de transcription inverse d’un alignement multiple
de séquences d’acides aminés. Cet exemple est construit à partir de trois séquences de la
famille PF07974 de Pandit dont le pourcentage d’identité moyen est de 44,3%. Les séquences
d’acides aminés prédites par Protea ont ici été alignées par ClustalW avant d’être rétro-
transcrites. Sur cette figure sont également présentés trois alignements multiples produits
par ClustalW [THG94], Dialign2-2 [Mor99] et MultAlin [Cor88] à partir des séquences
nucléiques d’origine. La qualité de chacun de ces alignements par rapport à l’alignement
correct fourni dans Pandit est évaluée grâce à deux mesures : la somme des scores deux à
deux (SPS) et la somme des scores par colonne (CS). Soit un alignement multiple A de N
séquences comportant M colonnes, on note Aij la base ou le gap présent à la ième colonne de
la jème séquence. On définit pijk tel que pijk vaut 1 si Aij et Aik sont alignés dans l’alignement
de référence, 0 sinon. Les scores Si et Ci de la ième colonne de A selon l’alignement de référence
sont alors donnés par

N
X N
X
Si = pijk
j=1,j6=k k=1

1 si Si = N (N − 1)
Ci =
0

Les valeurs du SPS et du CS de A se calculent alors de la manière suivante

PM
i=1 Si
SP S = PM r
i=1 Sri
PM
i=1 Ci
CS =
M

où Mr est le nombre de colonnes de l’alignement de référence et Sri est le score de la ième
colonne de l’alignement de référence. Le SPS et le CS prennent leurs valeurs dans l’intervalle
[0; 1], 1 étant la valeur maximale où l’alignement A correspond exactement à l’alignement de
référence. Sur l’exemple de la figure 4.2, l’alignement par Protea +ClustalW est signifi-
cativement plus proche de l’alignement de référence de Pandit que les alignements générés
par ClustalW, Dialign2-2 et MultAlin.

116
 4.1. L’alignement multiple de séquences nucléiques

O97702_CANFA TGCAGCCCCCGGGAGGGCCAGCCCGCCTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTG------TGTGGCCAATGTGTCTGCCATAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGC
Q86G85_PSEIC TGCCGGTCACCTGAAAACAACGAAATCTGCAGTGGAAACGGACAATGTGTA------TGTGGACAATGTATGTGTAACTCTGACGATGACCGCCACTATAGTGGCAAATACTGC
Q19267_CAEEL TGTTTTGGAAAAGGATCC---------TGTCATGGAGATGGAAGCCGCGAAGGCAGT---GGAAAGTGTAAATGTGAGACTGGA------------TATACTGGAAATCTATGC
** * * ** ** * ** * *** ** * * ** ** ***

(a) Alignement de référence de Pandit.

O97702_CANFA TGCAGCCCCCGGGAGGGCCAGCCCGCCTGCAGCCAGCGGGGC---GAGTGCCTGTGTGGCCAATGTGTCTGCCATAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGC
Q86G85_PSEIC TGCCGGTCACCTGAAAACAACGAAATCTGCAGTGGAAACGGA---CAATGTGTATGTGGACAATGTATGTGTAACTCTGACGATGACCGCCACTATAGTGGCAAATACTGC
Q19267_CAEEL TGTTTT---------GGAAAAGGATCCTGTCATGGAGATGGAAGCCGCGAAGGCAGTGGAAAGTGTAAATGTGAGACTGGA------------TATACTGGAAATCTATGC
** * *** ** **** * *** ** * * ** ** ***

(b) Alignement de Protea. L’alignement au niveau peptidique a été confié à ClustalW. Le SPS de cet
alignement vaut 0,83 et son CS 0,75.

O97702_CANFA TGCAGCCCCCGGGAGGGCCAGCCCGCCTGCAG-CCAGCGGGGCGAGTGCCTGTGTGGCCAATGTGTCTGCCATAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGC
Q86G85_PSEIC TGCCGGTCACCTGAAAACAACGAAATCTGCAG-TGGAAACGGACAATGTGTATGTGGACAATGTATGTGTAACTCTGACGATGACCGCCACTATAGTGGCAAATACTGC
Q19267_CAEEL ----TGTTTTGGAAAAGGATCCTGTCATGGAGATGGAAGCCGCGAAGGCA---GTGGAAAGTGTAAATGTGAGACTGGATATACTGGAAATCTATGC------------
* ** ** * * * **** * *** ** * * * *

(c) Alignement de ClustalW des séquences nucléiques. Le SPS de cet alignement vaut 0,524 et son CS 0,286.

O97702_CANFA TGCAGCCCCCGGGAGGGCCAGCCCGCCTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTGTGTGGCCAATGTGTCTGCCATAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGC
Q86G85_PSEIC TGCCGGTCACCTGAAAACAACGAAATCTGCAGTGGAAACGGACAATGTGTATGTGGACAATGTATGTGTAACTCTGACGATGACCGCCACTATAGTGGCAAATACTGC
Q19267_CAEEL ----TGTTTTGGAAAAGGATCCTGTCATGGAGATGGAAGCCGCGAAGGCAGTGGAAAGTGTAAATGTGAGACTGGA--------------TATACTGGAAATCTATGC
* ***** * ** * **** * * ** ** ***

(d) Alignement de MultAlin des séquences nucléiques en utilisant des informations au niveau peptidique. Le
SPS de cet alignement vaut 0,476 et son CS 0,210.

O97702_CANFA TGCAGCCCCCGGGAGGGCCAGCCCGCCTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTGTGTGGCCAATGTGTCTGCCATAGCAGTGACTTTGGCAAG--------------------
Q86G85_PSEIC TGCCGGTCACCTGAAAACAACGAAATCTGCAGTGGAAACGGACAATGTGTATGTGGACAATGTATGTGTAACTCTGACGATGACCGCCAC--------------------
Q19267_CAEEL ---------------------------TGTTTTGGAAAAGGATCCTGTca------------------------TGGAGATGGAAGCCGcgaaggcagtggaaagtgtaa
** ** ** ** **

O97702_CANFA -------------ATCACGGGCAAGTACTGC
Q86G85_PSEIC -------------TATAGTGGCAAATACTGC
Q19267_CAEEL atgtgagactggaTATACTGGAAATCTATGC
* ** ** ***

(e) Alignement de Dialign2-2 des séquences nucléiques en utilisant des informations au niveau peptidique. Le
SPS de cet alignement vaut 0,476 et son CS 0,210.

Fig. 4.2 – Un exemple de trois séquences de la famille PF07974 de Pandit alignées par
Protea +ClustalW, ClustalW, Dialign2-2 et MultAlin. Le pourcentage d’identité
moyen de ces séquences est de 44,3%. Le pourcentage d’identité moyen au niveau peptidique
est de 30,3%. Le SPS et le CS de chaque alignement est calculé en utilisant l’alignement fourni
dans Pandit comme référence.

117
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

Prédiction et alignement de séquences non codantes partageant une structure

commune
A l’image de la démarche mise en œuvre à partir des prédictions de Protea pour aligner
des séquences codantes homologues, la combinaison de caRNAc (section 3.3) et de Garde-
nia [BT06] permet de produire un alignement de séquences partageant une structure putative.
A partir des structures prédites par caRNAc, Gardenia réalise un alignement multiple des
séquences en utilisant à la fois les informations des structures primaires et secondaires. Les
structures secondaires de chaque séquence sont représentées sous forme arc-annotée. L’aligne-
ment multiple d’un ensemble de séquences arc-annotées est alors une super-séquence com-
mune incluse. Le schéma d’édition adopté intègre des opérations d’évolution entre les bases
non appariées et entre les paires de bases appariées originellement définies dans [JLMZ02]. La
construction de la super-séquence est un problème NP-dur. Dans Gardenia, une approche
heuristique est donc mise en œuvre. Dans un premier temps, Gardenia procède au calcul de
la super-séquence de chaque couple de séquences. Ensuite, l’incorporation des super-séquences
se fait de manière progressive en utilisant un clustering hiérarchique ascendant en fonction du
degré de similarité des couples de séquences. L’alignement des super-séquences est réalisé avec
le même algorithme que pour la construction des super-séquences deux à deux. Enfin, l’espace
de recherche de l’algorithme d’alignement est contraint à chaque étape par les points d’an-
crage trouvés par caRNAc (section 3.3). Ces contraintes permettent d’accélérer de manière
significative l’alignement. La prédiction de séquences structurées homologues est réalisée en
fixant un seuil déterminé de manière empirique sur la valeur du score d’alignement calculé
par Gardenia.

Implantation de Magnolia
Magnolia est développé sous forme d’un site Web qui fait appel aux différentes com-
posantes et synthétise les résultats. Lorsqu’une prédiction “codant” est réalisée par Pro-
tea, deux alignements sont produits : l’alignement multiple des séquences d’acides aminées
prédites, et la rétro-transcription de cet alignement. Plusieurs méthodes sont proposées à
l’utilisateur pour l’alignement au niveau peptidique : ClustalW, Dialign2-2 et T-Coffee.
La mise en couleur des acides aminés du premier alignement et des codons correspondants
dans le second alignement est inspirée des couleurs de RasMol2 . La figure 4.3 montre un
exemple des alignements produits par Magnolia pour une famille de séquences codantes
homologues.

Fig. 4.3 – L’alignement par Magnolia (Protea) du domaine Zn-finger des protéines Ran
(Pfam PF00641). La longueur moyenne des séquences est de 92 nucléotides et leur pourcen-
tage d’identité moyen de 45,1%. Les triplets de bases sont coloriés en fonction de l’acide aminé
codé. L’alignement de référence est quasiment identique à celui fourni dans Pandit.

Lorsqu’une prédiction “structuré” est produite par caRNAc+Gardenia , un alignement

2
http://www.rasmol.org

118
 4.1. L’alignement multiple de séquences nucléiques

multiple des séquences annoté par la structure est généré. Chaque tige prédite par caRNAc
est coloriée. La figure 4.4 montre un exemple d’alignement pour une famille de séquences
non codantes homologues partageant une structure commune. Les structures secondaires de
chaque séquences sont également représentées sous forme graphique à l’aide du programme
NaView [BH88].

Fig. 4.4 – L’alignement par Magnolia (caRNAc+Gardenia ) de cinq séquence d’ARN de

transfert (Rfam RF00005). La longueur moyenne des séquences est de 76 nucléotides et leur
pourcentage d’identité moyen de 51,0%. Trois des quatre tiges sont retrouvées et coloriées
en bleu, en vert et en orange. Tous les appariements prédits sont corrects et l’alignement
multiple est consistent avec l’alignement de référence de Rfam.

Dans Magnolia, les prédictions de Protea et de caRNAc+Gardenia sont considérées

comme indépendantes. Magnolia peut donc réaliser une double prédiction, “codant” et
“structuré”, pour un même ensemble de séquences, auquel cas les alignements de Protea
et de Gardenia sont produits. Certaines familles d’ARN non codants présentent en effet
à la fois une structure commune conservée et un cadre de lecture conservé. C’est le cas
notamment des tmRNA (Rfam RF00023), aussi connus sous les noms ARN 10Sa et SsrA,
qui ont des propriétés d’ARN de transfert et d’ARN messager. Le rôle des tmRNA est de
libérer un ribosome “bloqué” en cours de traduction. A cet effet, les tmRNA comportent un
court cadre de lecture terminé par un codon STOP et comporte une région structurée imitant
partiellement la structure d’un ARN de transfert. L’ARN messager sur lequel le ribosome
est bloqué est remplacé par un tmRNA et la traduction du tmRNA conduit à l’ajout d’un
signal de protéolyse au peptide incomplètement synthétisé afin qu’il soit dégradé. Les tmRNA
existent dans tous les génomes bactériens séquencés, et ont récemment été identifié dans des
chloroplastes, mais semblent absents chez les eucaryotes. Outre des ARN non codants, d’autres
types de familles de séquences partageant une structure commune sont réputées pour contenir
un cadre de lecture conservé ou à l’inverse apparaı̂tre dans des cadres de lecture. Par exemple,
l’élément cis-régulateur des rhinovirus humains (Rfam RF00220) se situe dans le cadre de
lecture codant pour la protéine capside, c’est-à-dire la protéine qui constitue l’enveloppe du
virus (section 1.4.2), ou encore la tige boucle numéro VII du virus de l’hépatite C (Rfam
RF00468) dans la région codante du gène NS5B.
Magnolia est spécifiquement conçu pour aligner des séquences fonctionnelles divergentes.
Sur des séquences trop proches, l’approche comparative des composantes sous-jacentes, Pro-
tea et caRNAc, n’est alors pas appropriée. De plus, des séquences proches peuvent être
alignées avec des outils d’alignement classiques, qui ne présument d’aucune fonction com-
mune. Par conséquent, lorsque le pourcentage d’identité moyen des séquences dépasse 90%,
Magnolia bascule sur une méthode d’alignement plus traditionnelle et propose donc au-
tomatiquement un alignement multiple réalisé par ClustalW, Dialign2-2 ou T-Coffee
selon le choix de l’utilisateur.

119
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

4.1.4 Les résultats expérimentaux de Magnolia

Pour évaluer les performances de Magnolia nous avons sélectionné deux jeux de données :
Pandit [WdBQ+ 06] et BRAliBase 2.1 [WMS06]. Pandit est un ensemble de familles de
séquences codantes déjà utilisé pour évaluer Protea (section 2.5). BRAliBase 2.1 est un
ensemble de familles d’ARN non codants construit dans le but d’évaluer les performances
des méthodes d’alignement multiple d’ARN structurés. BRAliBase 2.1 reprend les familles
initialement proposées par Gardner dans BRAliBase II [GWW05], le premier benchmark
pour l’alignement structural, et étend ce jeu de données à plus d’une trentaine de familles
d’ARN non-codants. De plus, BRAliBase 2.1 propose des ensembles de séquences contenant
deux, trois, cinq, sept, dix et quinze séquences, contrairement à BRAliBase II qui ne propose
que des ensembles de cinq séquences.

Les résultats de Magnolia sur les familles de séquences codantes de Pandit

Fig. 4.5 – Comparaison des alignements de Magnolia, ClustalW, Dialign2-2 et T-

Coffee sur les ensembles de quatre séquences extraites des familles de Pandit. Le SPS est
donné en fonction du pourcentage d’identité moyen des séquences nucléiques. Pour Dialign2-
2 seul, l’option permettant d’effectuer les comparaisons au niveau peptidique a été activée.

Pour chaque famille de Pandit, un sous-ensemble de quatre séquences ont été choisies
aléatoirement. Sur les 6 491 ensembles ainsi construits, 6 122 (94,3%) sont correctement
prédites “codant” par Magnolia, et pour plus de 99% d’entre elles les cadres de lecture
prédits sont corrects. Moins de 3% des familles sont prédites “structurés” par Magnolia.
Pour estimer la qualité des alignements multiples produits, nous utilisons le SPS décrit à la
page 116. Comme Magnolia s’appuie sur une méthode d’alignement multiple externe pour
aligner les séquences d’acides aminés prédites, nous avons testé trois méthodes différentes :
ClustalW, Dialign2-2 et T-Coffee. Les alignements de Magnolia sont comparés aux

120
 4.2. L’annotation par génomique comparative

alignements produits par ces mêmes méthodes utilisées sur les séquences nucléiques initiales.
Les résultats sont présentés en figure 4.5 en fonction du pourcentage d’identité moyen des
séquences nucléiques. Quelque soit le degré de conservation des séquences, les alignements de
Magnolia sont plus proches des alignements de référence de Pandit que les autres méthodes
d’alignement multiple testées. Plus les séquences sont divergentes, plus l’écart se creuse entre
les alignements de Magnolia et les autres, quelque soit la méthode d’alignement sous-jacente
utilisée.

Les résultats de Magnolia sur le benchmark BRAliBase 2.1

BRAliBase 2.1 contient des ensembles de séquences dont le pourcentage d’identité

moyen varie d’environ 30% à 95%. Pour chaque ensemble de séquences, un alignement de
référence extrait de la littérature est fourni. Pour nos tests, nous nous sommes focalisés
sur les ensembles de séquences faiblement conservées avec un pourcentage d’identité moyen
inférieur à 50%. Nos expériences ont donc portés sur 510 ensembles de cinq séquences, 318
de sept séquences, et 174 de dix séquences. Un peu moins de 20% des ensembles testés ont
été incorrectement prédits “autre” par Magnolia, et 5% ont été classifiés “codant”. Ce
taux relativement élevé de prédictions “codant” s’explique par la faiblesse de l’analyse de
Protea sur les séquences courtes abondantes et dont la longueur moyenne est ici inférieure
à 80 nucléotides. Dans BRAliBase 2.1, deux mesures sont utilisées pour mesurer la qua-
lité des alignements produits : le SPS, déjà utilisé dans la section précédent pour évaluer la
qualité des alignements produits par Protea, et l’index de conservation de structure (SCI)
utilisé dans RNAz (section 3.2.4). Le SCI est un indice qui mesure le degré de conservation
en terme d’énergie d’une structure conservée par rapport aux structures optimales indivi-
duelles. Les résultats obtenus par Magnolia comparés à ceux des méthodes d’alignement
traditionnelles sont présentées sur la figure 4.6 en fonction du pourcentage d’identité moyen
et du nombre de séquences. Ces résultats montrent que les alignements produits par Ma-
gnolia sont plus proches des alignements de référence que ceux générés par les approches
traditionnelles quelque soit le nombre de séquences alignées. Sur la figure 4.7, les résultats de
Magnolia sont comparés à ceux produits par les autres méthodes d’alignement structural.
Ces graphiques font apparaı̂tre que les performances de Magnolia se situent dans la moyenne
des autres méthodes quelque soit le nombre de séquences utilisées. Toutefois, les méthodes
qui produisent de meilleurs alignements que Magnolia sont aussi beaucoup plus lentes. Ces
tests, réalisés sur une machine de bureau classique, ont pris moins d’une demi heure pour
Magnolia contre plus de quatre heures pour Mlocarna, Lara et MxscaRNA.

4.2 L’annotation par génomique comparative

Précédemment, nous avons vu comment utiliser les prédictions de caRNAc et de Protea

pour produire des alignements multiples. Nous nous intéressons maintenant à la mise en œuvre
d’une plate-forme d’annotation par génomique comparative qui combine plusieurs logiciels
développés dans l’équipe : caRNAc, Protea et Yass [NK05], un logiciel d’alignement local
de séquences. Cette plate-forme se présente sous la forme d’un pipeline logiciel modulaire.

121
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

BRAliBase 2.1 (5 séquences) BRAliBase 2.1 (5 séquences)

1 1.4
Magnolia
ClustalW
1.2 Poa
0.8 ProAlign
1 Pcma
0.6 0.8
SPS

SCI
0.4 0.6

Magnolia 0.4
0.2 ClustalW
Poa 0.2
ProAlign
Pcma
0 0
32 34 36 38 40 42 44 46 48 32 34 36 38 40 42 44 46 48
Pourcentage d’identité moyen Pourcentage d’identité moyen

BRAliBase 2.1 (7 séquences) BRAliBase 2.1 (7 séquences)

1 1.4
Magnolia
ClustalW
1.2 Poa
0.8 ProAlign
1 Pcma
0.6 0.8
SPS

SCI

0.4 0.6

Magnolia 0.4
0.2 ClustalW
Poa 0.2
ProAlign
Pcma
0 0
34 36 38 40 42 44 46 48 34 36 38 40 42 44 46 48
Pourcentage d’identité moyen Pourcentage d’identité moyen

BRAliBase 2.1 (10 séquences) BRAliBase 2.1 (10 séquences)

1 1.4
Magnolia
ClustalW
1.2 Poa
0.8 ProAlign
1 Pcma
0.6 0.8
SPS

SCI

0.4 0.6

Magnolia 0.4
0.2 ClustalW
Poa 0.2
ProAlign
Pcma
0 0
38 40 42 44 46 48 38 40 42 44 46 48
Pourcentage d’identité moyen Pourcentage d’identité moyen

Fig. 4.6 – Résultats de Magnolia sur BRAliBase 2.1 comparés aux résultats des méthodes
d’alignement multiple traditionnelles. Le SPS et le SCI des alignements sont présentés en
fonction du pourcentage d’identité moyen des séquences alignées et du nombre de séquences
utilisées.

122
 4.2. L’annotation par génomique comparative

BRAliBase 2.1 (5 séquences) BRAliBase 2.1 (5 séquences)

1 1.4

1.2
0.8
1
0.6 0.8
SPS

SCI
0.4 Magnolia 0.6
FoldAlignM
Lara
Mlocarna 0.4
0.2 StrAl
Marna
MxscaRNA 0.2
PMmulti
R-Coffee
0 0
32 34 36 38 40 42 44 46 48 32 34 36 38 40 42 44 46 48
Pourcentage d’identité moyen Pourcentage d’identité moyen

BRAliBase 2.1 (7 séquences) BRAliBase 2.1 (7 séquences)

1 1.4

1.2
0.8
1
0.6 0.8
SPS

SCI

0.4 Magnolia 0.6

FoldAlignM
Lara
Mlocarna 0.4
0.2 StrAl
Marna
MxscaRNA 0.2
PMmulti
R-Coffee
0 0
34 36 38 40 42 44 46 48 34 36 38 40 42 44 46 48
Pourcentage d’identité moyen Pourcentage d’identité moyen

BRAliBase 2.1 (10 séquences) BRAliBase 2.1 (10 séquences)

1 1.4

1.2
0.8
1
0.6 0.8
SPS

SCI

0.4 Magnolia 0.6

FoldAlignM
Lara
Mlocarna 0.4
0.2 StrAl
Marna
MxscaRNA 0.2
PMmulti
R-Coffee
0 0
38 40 42 44 46 48 38 40 42 44 46 48
Pourcentage d’identité moyen Pourcentage d’identité moyen

Fig. 4.7 – Résultats de Magnolia sur BRAliBase 2.1 comparés aux résultats des méthodes
qui construisent un alignement multiple structural. Le SPS et le SCI des alignements sont
présentés en fonction du pourcentage d’identité moyen des séquences alignées et du nombre
de séquences utilisées.

123
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

4.2.1 Le pipeline d’annotation

Globalement, le pipeline accepte en entrée une séquence génomique à annoter et une
banque de séquences susceptible de contenir des régions homologues avec la séquence à an-
noter, et produit en sortie des annotations de séquences codantes et d’ARN non-codants
hypothétiques. Le fonctionnement global du pipeline est schématisé sur la figure 4.8. Dans
un premier temps, la séquence à annoter est comparée à celles présentes dans la banque de
données par une méthode d’alignement deux à deux. Ensuite, la totalité des alignements obte-
nus sont reportés sur la séquence à annoter afin de détecter des régions conservées, c’est-à-dire
des régions de la séquence à annoter pour laquelle il existe plusieurs séquences similaires dans
la banque. Pour chaque région conservée, les séquences similaires trouvées sont soumises à un
ultime traitement afin d’extraire un sous-ensemble pertinent pour un traitement par analyse
comparative.

Séquence à Banque de
annoter séquences

Yass Comparaisons 2 à 2

Régions conservées

caRNAc Protea

R S Y L
Structure conservée Séquence d’acides
GGGGGTAACCCC aminés conservés CGATCCTATTTA
CGCGGCAACGCG CGCAGTTACTTG
TGGGGTAACTCG AGAAGCTACCTA

ARN non-codants Séquences codantes

putatifs putatives

Fig. 4.8 – Pipeline d’annotation automatique de séquences codantes par Protea et d’ARN
non-codants par caRNAc dans une séquence génomique.

Le choix des génomes à comparer est cruciale car la qualité des prédictions qui peuvent être
réalisées dépend pleinement de ces séquences. De manière générale, le facteur déterminant est
les distances évolutives qui séparent les organismes dont elles sont issues de l’organisme dont
provient la séquence à annoter. Prenons l’exemple du génome d’Escherichia coli dans lequel
on cherche à identifier de nouvelles séquences codantes ou d’ARN non-codants. La séquence à

124
 4.2. L’annotation par génomique comparative

annoter sera alors la séquence génomique d’une souche d’Escherichia coli, et la banque pourra
alors être constituée de séquences génomiques d’autres bactéries plus ou moins éloignées en
terme d’évolution. Avec des séquences génomiques très proches de celle de l’organisme ciblé,
le risque majeur est que les séquences homologues exhibent trop peu de mutations pour
qu’elles puissent à elles seules faire l’objet d’une analyse comparative pertinente. A l’inverse,
si l’on choisit des séquences d’organismes trop éloignés, on risque de ne pas être en mesure
d’identifier les séquences homologues trop peu conservées, ou pire, que les organismes choisis
ne possèdent pas d’homologue pour une séquence fonctionnelle putative du génome à annoter.
Bien qu’il n’existe pas de critère absolu pour déterminer les séquences génomiques à choisir,
certaines situations font naturellement émerger des contraintes. Par exemple, si on cherche
à identifier une séquence liée à un phénotype particulier tel que la production d’un agent
pathogène, il apparaı̂t alors nécessaire de considérer d’autres souches du même organisme qui
partagent ce même phénotype.
Dans le cas où l’on souhaite découvrir de nouvelles séquences codantes ou d’ARN non-
codants, il apparaı̂t naturel de vouloir masquer les régions qui comportent déjà des annotations
de la séquence à annoter, ou les régions susceptibles de parasiter les comparaisons telles que
des régions hautement conservées (plus de 95%) ou des éléments répétés. Le pipeline offre ainsi
la possibilité de masquer automatiquement des régions à ignorer durant la comparaison avec
la banque. Le masquage des régions déjà annotées permet de diminuer de manière radicale
le nombre de régions à comparer et par conséquent le nombre de prédictions à traiter en
sortie du pipeline. Toutefois, cette mesure drastique peut également conduire à manquer des
séquences codantes ou d’ARN non-codants inconnues qui chevaucheraient ou seraient incluses
dans des régions déjà annotées pour une autre fonction.

Comparaison de séquences génomiques

La comparaison de la séquence à annoter avec les séquences présentes dans la banque est
la première étape du pipeline. Au cours des chapitres précédents, nous avons déjà fait mention
de plusieurs algorithmes permettant de fouiller une banque de séquences à la recherche de
séquences similaires tels que l’algorithme de Smith&Waterman, Blast et Fasta. Nous allons
nous intéresser plus en détails à ces outils, l’objectif étant de pouvoir apprécier leurs différences
par rapport à l’outil que nous utilisons dans le pipeline : Yass.
L’algorithme de Smith&Waterman construit par programmation dynamique l’alignement
local optimal de deux séquences. L’équation de récurrence servant à remplir la matrice M de
programmation dynamique est


 0

M [i − 1][j − 1] + s(Ai , Bj )
M [i][j] = max

 M [i − 1][j] + s(Ai , −)

M [i][j − 1] + s(−, Bj )
où s(Ai , Bj ) est le coût de substitution du ième nucléotide de la séquence A par le jème
nucléotide de la séquence B, s(Ai , −) est le coût d’insertion du ième nucléotide de la séquence
A dans la séquence B et s(−, Bj ) le coût l’insertion du j ème nucléotide de B dans A. La
remontée dans cette matrice à partir de la valeur maximale quelle contient permet d’obtenir
l’alignement local optimal des séquences A et B. La complexité en O(n2 ) en espace et en
temps de cet algorithme est inadaptée à l’exploration complète d’une banque de données,
surtout si celle-ci contient de très longues séquences telles que des génomes entiers ou des

125
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

chromosomes eucaryotes. Néanmoins, il existe plusieurs heuristiques pour l’alignement local

qui permettent de traiter des banques de données de manière efficace, sans perte significative
de sensibilité. Ces heuristiques reposent toutes sur le même principe : les graines, c’est-à-
dire des séquences ou des sous-séquences d’une longueur donnée parfaitement conservées
entre deux séquences. Dans un premier temps, ces heuristiques procèdent à la recherche
de ces graines puis les étendent pour former un alignement local complet. Les différences
entre ces heuristiques apparaissent à deux niveaux : le type de graine utilisé et la manière
de reconstruire un alignement à partir de ces graines. Nous allons aux heuristiques à base
de graines contiguës, Fasta et Blast, puis aux heuristiques à base de graines espacées,
PatternHunter et Yass.

(a) Identification des k-mers puis des (b) Evaluation puis filtrage des 10
enchaı̂nements de k-mers compatibles meilleures chaı̂nes de k-mers selon leur
entre eux, c’est-à-dire les diagonales score
qui apparaissent sur le dotplot

(c) Sélection gloutonne des meilleures (d) Alignement optimal par

régions qui peuvent coexister dans un Smith&Waterman restreint à la
même alignement zone délimitée par les régions
conservées

Fig. 4.9 – Schéma des étapes principales de Fasta pour deux séquences A et B.

Chronologiquement, Fasta [LP85] est la première heuristique d’alignement local qui uti-
lise le principe des graines contiguës. Une graine contiguë est une séquence d’une certaine
longueur k, un k-mer, parfaitement conservée entre deux séquences. La valeur de k consti-
tue un paramètre crucial de la méthode qui affecte à la fois sa sensibilité et son efficacité.

126
 4.2. L’annotation par génomique comparative

Plus k est grand, plus la méthode est rapide au détriment de sa sensibilité. L’heuristique de
Fasta se décompose en quatre grandes étapes illustrées par les schémas de la figure 4.9. La
première étape consiste à rechercher à l’aide d’une graine contiguë les k-mers conservés. Fasta
cherche ensuite à créer des régions locales similaires, c’est-à-dire à regrouper des k-mers afin
de détecter des séquences conservées plus longues, pouvant contenir des substitutions mais
n’introduisant aucun gap. Pour chaque région, Fasta calcule ensuite un score puis filtre les
meilleures régions afin de ne garder que les dix meilleures. Le calcul de ce score fait intervenir
une matrice de substitution triviale, la matrice identité. Les régions trouvées sont ensuite
incorporées de manière gloutonne par score décroissant afin de ne garder que les régions com-
patibles entre elles, c’est-à-dire des régions qui peuvent faire partie d’un même alignement.
L’alignement local est enfin produit par l’algorithme de Smith&Waterman où la matrice de
programmation dynamique est réduite à la zone qui englobe les régions retenues à l’étape
précédente.
L’heuristique de Blast [AGM+ 90] est globalement identique à celle de Fasta. La
différence majeure entre Blast et Fasta se situe au niveau du passage des k-mers à un
alignement. Pour chaque k-mer trouvé, Blast procède à son extension de part et d’autre
de façon à trouver une région conservée la plus longue possible. Blast continue d’étendre la
région tant que le score cumulé calculé au fur et à mesure de l’extension ne descend pas en
dessous d’un certain seuil. Contrairement à Fasta, Blast applique des coûts variables aux
substitutions : 5 pour un match et −4 pour un mismatch. Les régions ainsi obtenues, appelées
des HSP (High-scoring Segment Pairs), sont ensuite filtrées en fonction de l’espérance statis-
tique de leurs scores. Dans la version “avec gap” de Blast les k-mers trouvés peuvent être
groupés pour former une HSP avant leur extension si la distance qui les sépare ne dépasse
pas un certain seuil.
PatternHunter [MTL02] et Yass [NK05] sont des heuristiques qui fonctionnent selon le
même schéma global que Blast. Leur originalité tient à l’utilisation des graines espacées, c’est-
à-dire des sous-séquences conservées. Les graines espacées apportent une meilleure sensibilité
que les graines contiguës, permettant ainsi de trouver des régions moins conservées, sans pour
autant dégrader ni la spécificité ni l’efficacité apportées par les graines contiguës. Le graphique
de la figure 4.10 montre le gain de sensibilité théorique apporté par l’utilisation d’une graine
espacée par rapport à une graine contiguë de même contenu informationnel, c’est-à-dire où
le nombre de nucléotides comparés est identique et appelé poids d’une graine. La figure 4.11
montre un exemple d’alignement qui ne pourrait être obtenu avec une graine contiguë de
même poids que la graine espacée utilisée. En effet, bien que ces séquences soient similaires,
celles-ci ne contiennent pas de mot de longueur 6 qui soit parfaitement conservé.
Quelque soit la méthode d’alignement utilisée, il est nécessaire d’évaluer la significativité
des alignements trouvés. Le score d’un alignement n’est en soi pas un critère de décision pour
plusieurs raisons : il dépend du système de score utilisé mais également de la longueur des
séquences comparées. Pour évaluer la significativité d’un alignement, il est donc nécessaire
d’évaluer sa probabilité d’occurrence afin de répondre à la question suivante : quelle était la
probabilité de trouver cet alignement “par hasard” en comparant des séquences ne possédant
aucune homologie a priori ? Cette question suppose que les séquences ont été générées selon un
modèle aléatoire. Les travaux de Karlin et Altschul [KO87, KO88, KA90, KB92] ont permis
d’établir le modèle actuellement utilisé par toutes les méthodes et selon lequel, pour un
système de score fixé, la distribution des scores d’alignements locaux suit une loi de Gumbel
[Gum58]. Dès lors, on est en mesure d’évaluer la significativité d’un alignement de score s en

127
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

1
Graine contiguë (#########)
Graine espacée (###---#-#-##-##)

0.8

0.6
Sensibilité

0.4

0.2

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Identité

Fig. 4.10 – Comparaison de la sensibilité théorique des graines contiguës et espacées.

GACTGAACTCAT TAGACTCGACGA
|.||.||||.|| |||.||.|||.|
GGCTAAACTAAT TAGGCTAGACTA
Graine contiguë ####
Graine espacée ##-## ##-##

Fig. 4.11 – Les deux alignements présentent une identité de 9/12 = 75%. On considère deux
graines de poids 4 : la graine contiguë #### et la graine espacée ##-##. La graine contiguë ne
détecte que le premier alignement, alors que la graine espacée détecte les deux. Le symbole #
correspond à une position d’identité et le symbole - à une position quelconque.

128
 4.2. L’annotation par génomique comparative

calculant sa E-valeur, c’est-à-dire le nombre d’alignements de score supérieur à s attendus

par hasard lorsque l’on aligne une séquence de longueur m avec une séquence de longueur n,
donnée par :

E-valeur(s, m, n) = K.m.n. exp(−λ.s)

où K et λ sont des paramètres de la loi de distribution qui proviennent du système de score
choisi et de la composition en mono-nucléotides des séquences, m et n sont les longueurs des
deux séquences comparées. Dans notre cas où l’on compare une séquence requête contre une
banque de données, m est la longueur de la séquence requête et n est la somme des longueurs
de toutes les séquences de la banque. Une fois calculée, l’interprétation d’une E-valeur est
assez simple : plus la E-valeur associée à un alignement est proche de 0, plus la similarité
obtenue est significative.

Afin d’évaluer le gain pratique que peuvent apporter les heuristiques à base de graines
espacées, nous avons cherché à comparer systématiquement les résultats de Blast et de
Yass. Nous nous sommes restreints à ces deux logiciels pour plusieurs raisons. Blast reporte
toutes les similitudes locales détectées sous forme de plusieurs alignements, contrairement à
Fasta qui n’en sélectionne qu’une partie pour former un seul et même alignement “global”.
Fasta peu donc être amené à écarter certaines séquences localement similaires qu’il n’arrive
pas à regrouper pour former son alignement, telles que des séquences distantes, répétées,
permutées ou inversées. Des différences minimes séparent Yass et PatternHunter. Pour
comparer les performances pratiques en terme de sensibilité des approches à base de graines
contiguës et espacées, nous avons choisi de travailler sur la comparaison de séquences d’ARN
non-codants car leurs séquences tendent à être moins bien conservées que celles des régions
codantes. A cet effet, nous avons comparé les performances de Blast et de Yass sur deux
jeux de données : les 574 familles d’ARN non-codants de Rfam, et les trois familles d’ARN
non-codants de BRAliBase III (page 81). Le protocole expérimental est identique à celui de
BRAliBase III : chaque séquence de chaque famille est utilisée comme séquence “requête”
pour retrouver ses homologues, soit dans Rfam, soit dans BRAliBase III selon le jeu de
données dont elle est issue. Le compromis sensibilité/spécificité de Yass et de Blast sur Rfam
est présenté en figure 4.12, toutes familles confondues. Ce compromis est calculé en faisant
varier le seuil sur la E-valeur des alignements produits par les deux logiciels. Cette expérience
fait clairement apparaı̂tre que Yass est plus sensible que Blast à spécificité équivalente. La
table 4.1 présente la sensibilité de Blast et de Yass sur chaque famille de BRAliBase III
obtenue en fixant à seuil à 10−4 sur la E-valeur des alignements produits. Cette seconde
expérience confirme les résultats précédents. A spécificité équivalente, Yass détecte quatre
fois plus d’ARN de transfert que Blast, presque deux fois plus d’ARN ribosomiques 5S, et 8%
d’ARN U5 supplémentaires. En terme de temps d’exécution, Blast et Yass sont équivalents.
Cependant, Blast est entre 5 et 10% plus rapide que Yass dans ces expériences simplement
car Yass produit plus d’alignements que Blast. Les résultats obtenus par Yass dans ces
expériences nous ont conduit à le choisir pour la première étape du pipeline.

Détection de régions conservées

La production des alignements deux à deux par Yass entre la séquence à annoter et les
séquences présentes dans la banque constitue la première étape du pipeline. La seconde étape
du pipeline consiste à former les groupes de séquences similaires qui serviront par la suite à

129
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

Fig. 4.12 – Compromis sensibilité/spécificité de Blast (croix) et de Yass (ronds) sur Rfam,
toutes familles confondues, avec des graines de poids 9. Chaque rond correspond à une
exécution de Yass avec une graine espacée différente de même poids.

Méthode ARN de transfert Petits ARN U5 ARN ribo. 5S

Blast 0,04 0,85 0,32
Yass 0,18 0,93 0,59

Tab. 4.1 – Sensibilité de Blast et de Yass sur les familles d’ARN non-codants de BRAli-
Base III avec des graines de poids 9 . Le seuil sur la E-valeur est ici fixé à 10−4 .

130
 4.2. L’annotation par génomique comparative

effectuer les prédictions par analyse comparative sur la séquence à annoter. Chaque groupe de
séquences doit donc comporter un fragment de la séquence à annoter et un nombre suffisant
de séquences similaires. Les alignements deux à deux produits à l’étape précédente impliquent
chacun un fragment de la séquence à annoter et une fragment de séquence provenant de la
banque de données. La constitution des groupes de séquences à partir de ces alignements
revient à identifier sur la séquence à annoter des régions particulièrement conservées, c’est-à-
dire des régions pour lesquelles un nombre significatif de séquences similaires ont été trouvées.
L’identification de ces régions et la génération des groupes de séquences similaires est réalisée
par un logiciel développé dans l’équipe selon un protocole en trois temps. Premièrement,
l’ensemble des alignements deux à deux produits à l’étape précédente sont repositionnés sur
la séquence à annoter, comme illustré sur la figure 4.13. Ensuite, on calcule pour chaque base
de cette séquence son score cumulé de densité grâce auquel on délimite les régions les plus
conservées. Enfin, on extrait les séquences impliquées dans les régions conservées pour former
des groupes de séquences pertinents pour la suite du pipeline.

GACAACCGAAACTCG
ACGACAACCGAA
GATACGACAAC
Alignements 2 à 2 CCGCCCACATCTGCGAGGGTA TCGGA−−−GACAA
TCCGTCCGCACCTTCGCGGATATTC CGATCGGATACGAC
ATCCGGCCGCAT−−−−−−GGCTATTCTCAGC CCCGATCGGATACGA
Séquence S ...CGGATCCGACCACATCTGCGCGGGTATTCTCAGCGA...ACCCGATCGGATACGACAACCGAAACTCGACTCAGCTCACCC...

Fig. 4.13 – Repositionnement des alignements deux à deux sur la séquence à annoter.

Chaque position i de la séquence S à annoter est caractérisée par une densité en aligne-
ments, notée di , donné par la formule suivante
ni
di =
A
où ni est le nombre d’alignements présents à la position i de la séquence S et A est le
nombre moyen d’alignements par base de S. La valeur de di représente la quantité d’aligne-
ments qui impliquent la base en position i de la séquence S par rapport au nombre d’ali-
gnements moyens par base pour la séquence S. Par nature, la densité en alignements d’une
position ne dépend pas de celle des positions voisines. L’interprétation de sa valeur dépend
donc du contexte dans lequel on l’observe et ne représente donc pas un indicateur suffisant
pour repérer des régions denses en alignements. Afin de simplifier l’identification des régions
conservées, on calcule pour chaque position i de S son score cumulé de densité Di selon la
relation suivante

0
Di = max
Di−1 + log( dλi )
où λ est un paramètre strictement supérieur à 1 qui permet d’ajuster le seuil de détection
des régions conservées. La valeur de Di inclus non seulement la densité en alignements de
la position i mais également le score Di−1 de la position précédente. Ce dernier élément est
très important car il introduit une certaine inertie dans les variations du score qui va nous
permettre de détecter simplement les régions denses en alignements. La figure 4.14 illustre la

131
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

variation du score cumulé sur un exemple fictif. Cet exemple fait apparaı̂tre trois pics du score
cumulé qui correspondent chacun à une région particulièrement dense en alignements. On
définit une région conservée par un intervalle de positions [i; j] sur la séquence S. Cet intervalle
est déterminé de la manière suivante : Dj est un maximum global du score cumulé et i est la
plus grande valeur inférieure à j telle que Di−1 = 0. Sur l’exemple de la figure 4.14, les trois
zones grisées correspondent aux trois régions conservées identifiées définies par les intervalles
de positions [11; 26], [50; 83] et [122; 130] sur la séquence S. Pour cet exemple, le paramètre λ
est fixé à 1, 3. Dans les faits, ce paramètre permet de jouer sur la sensibilité de détection des
régions conservées en modifiant l’amplitude de la valeur du score cumulé de densité. Lorsque
λ augmente les valeurs du score diminuent, et inversement. Cependant, comme la valeur du
score est majorée par zéro, plus λ augmente moins on observe de maximums, et inversement.
Augmenter la valeur de λ permet donc de diminuer le nombre de régions conservées détectées ;
diminuer sa valeur permet au contraire d’augmenter le nombre de régions détectées.

Alignements 2 à 2
Séquence S

10

7
Score cumulé de densité

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Position sur S

Fig. 4.14 – Variation du score cumulé de densité le long de la séquence à annoter S. Le

paramètre λ est ici fixé à 1, 3.

Lorsque les intervalles des régions conservées sont déterminés, les séquences correspon-
dantes des alignements qui intersectent ces intervalles sont extraites. Il arrive que les aligne-
ments soient incomplets, notamment lorsque les génomes contiennent des séquences similaires

132
 4.2. L’annotation par génomique comparative

faiblement conservées. Sur l’exemple de la figure 4.14, la seconde région identifiée correspond
à une accumulation de plusieurs alignements dont la majorité ne couvrent que partiellement
le fragment de S en cause. Pour régler ce problème a posteriori, on étend de part et d’autre
chaque séquence de la région afin d’obtenir une séquence de longueur identique au fragment
de S. C’est étape n’est possible que si l’on dispose dans la banque de données du contexte
des séquences à étendre.
A ce niveau du pipeline, plusieurs traitements peuvent être appliqués aux groupes de
séquences détectés. Ces traitements dépendent essentiellement des méthodes de prédictions
auxquelles on souhaite les soumettre. Si l’on souhaite les soumettre à Protea et/ou à caR-
NAc pour prédire des séquences codantes ou d’ARN non-codants homologues, aucun trai-
tement particulier supplémentaire n’est requis. Ces deux logiciels travaillent en effet sur des
séquences non alignées et intègrent un pré-traitement pour éliminer les séquences redondantes.
Si toutefois l’on souhaite utiliser d’autres méthodes basées sur une analyse comparative, il
convient de vérifier certaines propriétés sur les groupes de séquences. Notamment pour les
méthodes qui s’appuient sur un alignement, il est nécessaire de s’assurer qu’il est possible de
construire un alignement fiable. Dans cette optique, on propose d’épurer chaque groupe de
séquences en éliminant les séquences trop divergentes selon un procédé strictement analogue
à celui mis en œuvre dans Protea et caRNAc pour construire les méta-séquences (sec-
tion 1.5.3). On propose également de filtrer les groupes de séquences en fonction du nombre
de séquences qu’ils contiennent.

4.2.2 Résultats expérimentaux du pipeline

Afin de tester le pipeline, nous sommes partis de l’annotation automatique d’ARN non-
codants par analyse comparative conduite par Eddy et al [RKJE01] visant à découvrir de
nouveaux gènes à ARN dans le génome d’Escherichia coli. Dans un premier temps, nous
avons repris les données utilisées par Eddy et al et adapté l’expérience pour notre pipeline
d’annotation. Par la suite, nous avons complété cette expérience en utilisant des séquences pro-
venant d’organismes plus éloignés d’Escherichia coli en terme d’évolution que les organismes
initiaux.

L’annotation d’ARN non-codants avec Qrna

L’expérience d’Eddy et al porte sur la découverte de nouveaux gènes à ARN dans
la séquence génomique d’Escherichia coli prédits par analyse comparative puis vérifiés
expérimentalement. La prédiction d’ARN non-codants est confiée à Qrna (section 3.2.4) sur
des alignements obtenus par comparaison des régions inter-géniques du génome d’Escherichia
coli et de génomes complets de quatre autres organismes.
La séquence génomique d’Escherichia coli utilisée est celle d’Escherichia coli K12
(MG1655). Escherichia coli K12 est une bactérie “modèle” qui se cultive et se manipule
facilement en laboratoire. Très étudiée depuis plus de soixante dix ans, son génome fait partie
des génomes les mieux annotés en terme de quantité et de qualité d’annotations. Comme la
plupart des bactéries, son génome est plutôt court et compact. Composé de moins de cinq
millions de bases, il comporte peu de régions a priori non fonctionnelles vierges de toute
annotation. Toutes ces caractéristiques font d’Escherichia coli K12 un sujet idéal pour cette
expérience. La quantité de régions inter-géniques à traiter est faible, et par conséquent le
nombre de gènes à ARN candidats à vérifier par la suite aussi.

133
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

Les régions inter-géniques du génome d’Escherichia coli sont déterminées à partir des 115
gènes à ARN et des 4 290 gènes codants annotés. Seules les régions dont la longueur dépasse
cinquante nucléotides sont retenues, ce qui représente au total 2 367 séquences couvrant 500
kilobases. La longueur moyenne de ces séquences est de 211 nucléotides, et la séquence la plus
longue fait 1 729 nucléotides. Quatre gènes à ARN n’ont volontairement pas été exclus pour
fournir un contrôle positif.
Les régions inter-géniques ainsi déterminées sont comparées aux séquences génomiques
complètes de quatre organismes proches d’Escherichia coli en terme d’évolution :
– Klebsiella pneumoniae, souche 342 ;
– Salmonella enterica enteridis, souche PT4 ;
– Salmonella enterica serovar Paratyphi A, souche AKU 12601 ;
– Salmonella enterica serovar Typhi, souche CT18.
Les comparaisons sont réalisées par Blast et les alignements obtenus filtrés pour
répondre à trois critères : une E-valeur inférieure à 0,01, une longueur supérieure à cinquante
nucléotides, et un pourcentage d’identité supérieur à 65%. Ces critères sont fixés pour fournir
des alignements pertinents à Qrna. Au total, 23 674 alignements sont produits par Blast,
dont plus de la moitié proviennent de Salmonella enterica serovar Typhi.
Pour optimiser le traitement par Qrna, les alignements dont la longueur dépasse deux
cents nucléotides sont découpés en fragments de deux cents nucléotides qui se chevauchent de
cinquante nucléotides. Parmi ces alignements, Qrna prédit 556 couples de séquences d’ARN
non-codants homologues. Ces 556 candidats contiennent les quatre gènes à ARN laissés vo-
lontairement. Parmi ces candidats, 281 correspondent à des éléments reconnus a posteriori
comme n’étant pas des ARN non-codants mais des éléments possédant une structure se-
condaire caractéristique tels que des terminateurs de gènes, des séquences répétées et des
séquences régulatrices. Parmi les 275 candidats restants, 49 ont été choisis manuellement en
fonction de l’aspect général de la structure secondaire prédite et de la proximité avec des
gènes connus par ailleurs. Après vérification expérimentale par Nothern Blot, il apparaı̂t que
11 des 49 candidats retenus sont effectivement transcrits en ARN de longueurs inférieures à
quatre cents nucléotides, et 6 semblent faire partie d’ARN plus longs supposés être des ARN
messagers. Les 32 candidats restants n’apparaissent pas être transcrits, au moins dans les
conditions expérimentales observées.

L’application du pipeline sur des séquences proches

Nous avons repris les données utilisées dans l’expérience précédente afin d’appliquer le
pipeline et d’évaluer son potentiel à retrouver des gènes à ARN connus. C’est pourquoi nous
avons laissé tous les gènes à ARN connus au moment de notre expérience, c’est-à-dire 171
gènes à ARN car depuis la parution la parution de l’article d’Eddy, les annotations du génome
d’Escherichia coli K12 ont évolué. Filtrées selon la même procédure qu’Eddy, nous obtenons
ainsi 4 353 séquences inter-géniques à comparer aux séquences génomiques des quatre orga-
nismes.
A l’issue de la première étape du pipeline, 49 673 alignements sont produits par Yass en
filtrant les résultats de la même manière en terme de E-valeur et de longueur, mais en abaissant
le seuil sur le pourcentage d’identité à 60%. En effet, contrairement à Qrna, caRNAc traite
efficacement les séquences faiblement conservées. Les 171 gènes à ARN présents initialement
font partie des alignements retenus. A partir de ces alignements, nous sommes passés à la
deuxième étape du pipeline, c’est-à-dire la détection de régions conservées en limitant la

134
 4.2. L’annotation par génomique comparative

taille des régions à 1 000 nucléotides. A l’issue de cette étape, 309 groupes de séquences sont
constitués, dont 113 contiennent au moins un fragment des 171 gènes présents à l’origine :
22 ARN ribosomiques, 80 des 89 ARN de transfert et 11 des 60 autres types de gène à ARN
restants.

L’application du pipeline sur des séquences éloignées

Pour compléter les résultats obtenus avec l’expérience précédente, nous avons rejoué
cette expérience à partir de séquences génomiques d’organismes plus éloignés d’Escherichia
coli. La figure 4.15 présente l’arbre phylogénétique des quatre organismes sélectionnés dans
l’expérience précédente, et des quatre organismes plus éloignés que nous avons choisis :
– Geobacter sulfurreducens, souche PCA ;
– Legionella pneumophila, souche Corby ;
– Mycobacterium tuberculosis, souche F11 ;
– Rhizobium etli, souche CIAT 652.

Fig. 4.15 – Arbre phylogénétique reliant les deux groupes de quatre organismes utilisés dans
les comparaisons avec Escherichia coli.

Les résultats que nous avons obtenus sont les suivants. 1 844 alignements sont générés par
Yass à la première étape du pipeline, et 71 groupes de séquences conservées sont détectés. Au
sein de ces groupes de séquences on retrouve 87 des 171 gènes à ARN présents dans le génome
d’Escherichia coli : les 22 ARN ribosomiques, 64 des 89 ARN de transfert et seulement 1 des
60 autres types de gènes à ARN. Parmi les 71 groupes de séquences, 65 présentent au moins
une tige conservée par toutes les séquences détectée par caRNAc. Ces 65 groupes intersectent
exactement la même quantité de gènes à ARN qu’à l’étape précédente, soit 87 gènes à ARN.
Le volume de données circulant dans le pipeline est drastiquement réduit par rapport à
l’expérience précédente, sans pour autant que la quantité de gènes à ARN détectés en sortie

135
Chapitre 4. Deux exemples d’intégration de Protea et caRNAc

soit réduite dans les mêmes proportions. En effet, près de 27 fois moins d’alignements deux à
deux sont produits au cours de la première étape et quatre fois moins de régions conservées
sont identifiées, mais on retrouve néanmoins 92% des gènes à ARN déjà prédits à partir des
séquences proches.

136
 Conclusion

La génomique comparative a connu un essort important au cours de la dernière décennie.

En travaillant sur des ensembles de séquences plutôt que sur des séquences isolées, les ap-
proches modernes qui prennent part à l’annotation de séquences fonctionnelles s’avèrent par-
ticulièrement fécondes. Nos méthodes, Protea et caRNAc, s’inscrivent dans cette dyna-
mique, avec la volonté de réaliser des prédictions de qualité sur des ensembles de séquences
hétérogènes en terme de conservation. Protea est dédié à la prédiction de séquences co-
dantes homologues, tandis que caRNAc est dédié à la prédiction de structures secondaires
conservées. Protea est une méthode que nous avons développée de bout en bout, alors que
caRNAc est le fruit d’un travail initié par Olivier Perriquet durant sa thèse. Nous avons pro-
longé son travail afin de faire évoluer la méthode et d’y intégrer de nouvelles fonctionnalités.
Protea et caRNAc sont capables de traiter efficacement des ensembles de taille quel-
conque de séquences dont la longueur peut dépasser plusieurs milliers de bases. Contrairement
à la majorité des méthodes existantes qui travaillent sur des séquences alignées, Protea et
caRNAc travaillent sur des ensembles de séquences non alignées, évitant ainsi d’être piégés
par un alignement de mauvaise qualité. Grâce au concept de méta-séquence que nous avons in-
troduit, les séquences fortement similaires ne constituent plus une redondance d’informations
qui pourrait perturber l’analyse comparative et qui est à l’origine de calculs inutiles. Protea
et caRNAc procèdent selon un schéma analogue. Dans un premier temps, les séquences sont
comparées deux à deux à la recherche d’une séquence d’acides aminés conservée pour Pro-
tea, d’une structure secondaire commune pour caRNAc. Puis, chaque méthode combine les
résultats obtenus dans un graphe qui lui est spécifique : le graphe des cadres de lecture pour
Protea, le graphe des tiges pour caRNAc. Les prédictions sont ensuite réalisées en fonction
de certains critères statistiques et propriétés de ces graphes. Les expériences conduites sur
les jeux de données de référence ont produit des résultats significatifs, plaçant Protea et
caRNAc parmi les méthodes les plus efficaces et les plus performantes dans leurs domaines
respectifs, et particulièrement sur les séquences faiblement conservées.

Pistes de recherche à explorer pour Protea

Les comparaisons de séquences d’acides aminés dans Protea sont confiées à un algorithme
d’alignement semi-global et aux matrices de substitutions BLOSUM. Il existe d’autres moyens
de comparer des séquences d’acides aminés. Dans un premier temps, il serait intéressant de
tester d’autres matrices de substitutions, comme les matrices PAM par exemple, et d’autres
méthodes de comparaison. Dans l’état actuel, effectuer ces changements n’affecterait en aucun
cas le reste de la méthode. A plus long terme, il serait intéressant de proposer un module
de comparaison plus fin. Pour cela, on pourrait par exemple avoir recours aux modèles pair-

137
Conclusion

Markov cachés pour réaliser l’alignement des séquences nucléiques en travaillant au niveau des
acides aminés codés et en supportant les changements éventuels du cadre de lecture. Il serait
également intéressant de travailler plus finement sur les mutations silencieuses et synonymes
attendues et observées entre les séquences. Par exemple, il serait intéressant de proposer
système de bonification pour les mutations silencieuses afin de prendre en compte les acides
aminés identiques produits par des codons différents.

Pistes de recherche à explorer pour caRNAc

Concernant caRNAc, plusieurs perspectives sont envisageables. La fiabilité des
prédictions pourrait être améliorée en fournissant une mesure statistique précise des struc-
tures prédites. Pour cela, il faudrait disposer d’une mesure statistique fine pour estimer la
qualité des couples de tiges, en fonction de leurs longueurs, de leurs compositions, et sur-
tout de la quantité de mutations simples et compensées qui préservent les appariements. Les
améliorations apportées à caRNAc ouvrent également de nouvelles pistes. La version sim-
plifiée de l’algorithme de Sankoff est maintenant suffisamment efficace pour pouvoir envisager
un repliement au niveau des nucléotides et non des tiges. Suivre cette voie permettrait no-
tamment de résoudre de manière définitive le problème des tiges maximales chevauchantes
qui nous a conduit à modifier l’ordre d’énumération des tiges.
La prédiction des ARN non-codants structurés est un problème complexe. Les méthodes
les plus performantes dans ce domaine, telles que RNAz, tirent leur épingle du jeu en ayant
recours à des techniques d’apprentissage sophistiquées. Nous avons la conviction qu’il est
possible de concevoir une méthode complémentaire des méthodes existantes pour les séquences
moyennement et faiblement conservées car les prédictions de caRNAc sont de meilleure
qualité que celles de RNAalifold sur lesquelles s’appuie RNAz.

Pistes de recherche communes à Protea et caRNAc

Protea et caRNAc sont bâtis selon des schémas analogues qui reposent sur des compa-
raisons globales des séquences deux à deux. Dans Protea, on recherche une séquence d’acides
aminés conservée à l’aide d’une méthode d’alignement semi-global. L’inconvénient de cette
approche est de ne pas prendre en compte la présence d’éventuelles régions non codantes
comme les introns ou les extrémités non traduites des ARN. Dans caRNAc, l’adaptation
de l’algorithme de Sankoff permet de trouver une structure globalement conservée. caRNAc
ne peut donc pas détecter certains éléments de structure conservés dont la localisation varie
fortement entre les séquences. Ces choix font que Protea et caRNAc sont bien adaptés à
l’analyse de séquences bien “découpées” telles que des séquences provenant de transcriptomes,
mais qu’ils ne se sont pas appropriés au traitement de séquences trop “bruitées”. Pour dres-
ser un parallèle avec l’alignement classique de séquences, Protea et caRNAc fonctionnent
actuellement selon le même procédé que l’alignement global. Il serait intéressant à plusieurs
points de vue de les adapter pour qu’ils puissent travailler au niveau local. Protea ne serait
ainsi plus sensible au bruit en bordure des séquences ni à la présence de régions non-codantes,
potentiellement longues, au sein des séquences. caRNAc ne serait quant à lui plus soumis au
phénomène de localisation des éléments structuraux. Pour les deux méthodes, il deviendrait
alors envisageable de travailler avec une fenêtre glissante et donc de traiter des ensembles de
séquences très longues.

138
 Toujours selon le principe de fenêtre glissante, il serait particulièrement intéressant de
proposer un mode de fonctionnement incrémental pour Protea et caRNAc. Partant d’un
ensemble de séquences homologues, codantes ou structurées, les comparaisons de tous les
couples de séquences sont réalisées une seule fois, et le graphe obtenu stocké. A l’aide du
fenêtre glissante, on balaye ensuite un génome à la recherche d’une séquence homologue à
l’ensemble de séquences pré-traitées, sans refaire de calculs inutiles. Dans l’idée, ce mode de
fonctionnement est équivalent aux modèles de covariances utilisés dans des méthodes comme
Infernal ou Erpin pour la détection de structures conservées.
Concernant le concept de méta-séquence que nous avons introduit et mis en œuvre dans
Protea et caRNAc, celui-ci pourrait être affiné. Actuellement, les séquences fortement si-
milaires sont regroupées et représentées par un alignement multiple, tandis que les séquences
“uniques” restent inchangées. Ce regroupement réalisé de manière binaire en fonction du pour-
centage d’identité pourrait être complété en intégrant des informations phylogénétiques. Ces
informations permettraient de pondérer les comparaisons entre méta-séquences dans Pro-
tea et caRNAc. Ce procédé déjà appliqué dans des méthodes comme ExoniPhy pour
la prédiction de séquences codantes ou d’EvoFold pour la prédiction d’ARN non-codants
semble contribuer à améliorer les résultats notamment entre les séquences qui présentent peu
de mutations.

139
Conclusion

140
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