Chapitre 02 : Méthodes de séparation

I. La filtration et la décantation

La décantation et la filtration sont des techniques de séparation des mélanges hétérogènes. Elles
permettent de séparer les particules solides du liquide auquel elles sont mélangées.

 La décantation s'obtient en laissant reposer le mélange. Elle est simple à réaliser, mais son temps
de réalisation est long et ne permet pas systématiquement d'obtenir un liquide homogène.
 La filtration repose sur l'utilisation d'un filtre. C'est une méthode rapide et efficace si le filtre
choisi est adapté au mélange filtré, elle permet d'obtenir un liquide homogène.

Un mélange est hétérogène si on peut distinguer à l'œil nu au moins deux constituants :

 Un mélange (solide + eau) est hétérogène si les particules solides restent visibles.
 Un mélange (liquide + eau) est hétérogène si le liquide reste au–dessus ou au–dessous de l'eau.

1. La décantation

Elle consiste à laisser reposer un mélange hétérogène afin de permettre aux différentes matières de se
séparer. Les matières les plus lourdes se déposent au fond et les plus légères restent au-dessus.

Décantation solide-liquide Décantation liquide-liquide

Pour séparer un solide et un liquide, on peut utiliser un bécher. Dans ce cas simple, on peut facilement
drainer le liquide.

Cependant, lorsque l'on a deux liquides, on utilise généralement une ampoule à décanter. Il est important
de savoir quelle phase est la phase souhaitée :
 Si la phase souhaitée a la plus grande densité, ouvrez soigneusement le robinet jusqu'à ce que la
couche liquide inférieure ne soit tout simplement pas traversée pour obtenir la fraction la plus
pure possible.
 Si la phase souhaitée a la plus petite densité, elle est au sommet. La phase inférieure est d'abord
drainée, avec une très petite quantité de la phase supérieure pour obtenir la fraction la plus
pure possible. En fin de compte, on peut capturer la phase souhaitée dans un autre conteneur.

Pour décanter à l'échelle industrielle, une machine appelée décanteur est utilisée : décanteur
gravitaire ou décanteur cyclonique par exemples.
 2. La filtration

La filtration permet de séparer un mélange hétérogène composé d’un liquide et d’un solide. Le mélange
passe à travers un filtre qui retient les éléments solides ou grossiers. Les liquides comme l’eau peuvent
passer.

Le liquide obtenu par filtration, appelé filtrat, est limpide : il s'agit d'un liquide homogène puisqu'il ne
contient plus de particules solides.

La filtration est utilisée dans la production de nombreux produits alimentaires et boissons, tels que la
bière, le vin et les jus de fruits, pour éliminer les impuretés et améliorer la qualité et le goût du produit.

L’objectif de la filtration peut être :

 Un liquide clarifié débarrassé des particules solides
 Un solide essoré de l’excès de liquide

Deux phénomènes accompagnent souvent la filtration :

Le colmatage : pénétration de particules dans les pores de filtre ce qui modifie la vitesse de passage du
liquide en le faisant ralentir et même le stoppant.

L’adsorption : Résultant de la charge électrique de la matière filtrante qui retient certains produits
malgré que leur taille permet le passage à travers le filtre.

I.1. Types de filtration

a) Ultrafiltration
Se définie comme une séparation de macromolécules (protéines par ex) en solution.
Elle élimine les contaminants de petite taille (sels, glucides, …).
Les pores se retrouvant sur les membranes ont des dimensions de 0,01 micron. Ces pores permettent
l’extraction de tous les contaminants pouvant être extraite par les membranes de microfiltration.

b) Microfiltration
Les filtres de microfiltration possèdent des pores d’une dimension de 0.1micron. Grâce à ces pores, les
membranes de microfiltration permettent l’extraction des bactéries, des cellules sanguines et de tout ce
qui est plus gros que 0.1micron.

c) Nanofiltration
La nanofiltration est le type de filtration possédant les plus petits pores de filtrations. Avec des pores de
0,001 micron, les membranes de nanofiltration permettent l’extraction des sels aqueux, de certains
pesticides et de certains herbicides.
I.2. Les filtres
On distingue de types de filtre : d’épaisseur et les filtres membranes.
 a) Les filtres d’épaisseur « filtration en profondeur »
Ils retiennent les particules dans un réseau de fibre ou de canalicules (petits canaux)
Réseau de fibres : papier, amiante, fibre de verre, coton cellulose…etc
Réseau de canalicules : verre fritté (issu de billes en verre ayant subi un chauffage), sable, charbon…etc
b) Les filtres membranes « filtration en surface »
Ils sont constitués d’une fine lame percée de pores calibrés.
Ils peuvent etre à base de cellulose, acétate de cellulose, nitrates de cellulose ou de téflon ( dérivé de
plastique inerte avec les solvants organiques)

I.3. Méthodes de filtration

a) Filtration gravimétrique
L’exemple type est l’entonnoir de laboratoire est équipé d’un filtre de papier.
La différence de pression est créée par la hauteur du liquide sur le filtre.
Cette méthode présente les inconvénients suivants :
 Lente
 Séparation incomplète (le solide contient une quantité non négligeable de liquide)
 Difficulté de récupération de la phase solide surtout lorsqu’elle est peu abondante

b) Filtration sous vide

L'appareil de filtration sous vide comprend un ballon Buchner, un entonnoir et une pompe à vide. La
fiole de Buchner est utilisée pour la filtration sous vide. Lorsque le ballon Buchner est relié à un vide, le
liquide est forcé de passer à travers le papier filtre et dans le ballon.

c) Filtration sous pression

La vitesse de filtration est augmentée en exerçant une pression sur le liquide à filtrer en amant du
matériel filtrant représenté par une membrane filtrante. La filtration sous pression évite le moussage et
l’évaporation du solvant ; elle est d’un emploi fréquent dans l’industrie. Ce système de filtration sous
pression avec membranes filtrantes existe également sous forme de cartouches filtrantes (millipore)
adaptable sur une seringue pratique pour la filtration des petits volumes de solution à
filtrer. Au laboratoire, la microfiltration stérilisante à l’aide du dispositif Swinnex
Millipore est une filtration sous pression. Ce dispositif est constitué de deux pièces
plastiques, que l’on visse l’une sur l’autre enserrant une membrane filtrante.
 II. La distillation
La distillation est une opération de transfert de matière ayant pour but de séparer les constituants d’un
mélange liquide, homogène ou hétérogène. Elle consiste en l’ébullition d’un mélange liquide suivie de
la condensation des vapeurs obtenues, en un liquide « pur » ou en fractions liquides plus ou moins riches
en constituants du mélange vaporisé. Elle se base sur la différence de volatilité entre ces constituants.
C'est l’une des opérations de séparation les plus employées dans le domaine de l’agroalimentaire, la
chimie et de la pétrochimie. La distillation permet de séparer les constituants d'un mélange solide-
liquide (S –L) ou liquide –liquide (L –L).
Il existe deux types de distillation : simple et fractionnée :
1. Distillation simple
Le principe de la distillation est très simple: on chauffe un mélange de liquides atteindre le point
d’ébullition d’un des constituants: le plus volatile s'évaporera le premier et les vapeurs sont recueillies et
condensées dans un autre récipient. Pendant que le premier liquide s'évapore (distillat), le deuxième
n'atteint pas sa température d'évaporation et reste sous forme liquide dans le contenant initial (résidu).
Elle se résume en deux actions:
 Chauffer un liquide impur ou un mélange de liquides pour les transformer en vapeurs par ébullition.
 Condenser ensuite les vapeurs par refroidissement et isoler les liquides purs.
Tout dépendra donc des températures d'ébullition des produits. Si les températures ne sont pas trop
élevées (T < 120°C), une distillation sous pression atmosphérique suffit. Par contre, si la température
des composés devient trop importante, il faut recourir à un artifice: diminuer la pression. En effet, si la
pression diminue, la température d'ébullition (Teb) d'un liquide diminue aussi.

Le montage se fait en partant le chauffe ballon puis du ballon de réaction et en déposant successivement
la tête de distillation, le réfrigérant, l’allonge puis le récipient. Le démontage se fera dans l’ordre
inverse.
Exemple : La technique de distillation permet de séparer un mélange d’alcool et d’eau, l’alcool à une
température d’ébullition plus basse que l’eau alors elle s’évaporera en premier. Les vapeurs d’alcool
seront recueillies et refroidies, cette condensation permettra de récupérer l’alcool (distillat) dans un autre
contenant. L’eau (résidu) restera dans le contenant initial.
 2. Distillation fractionnée
Elle concerne un mélange de plusieurs liquides miscibles, elle utilise une colonne de séparation (ou
colonne de Vigreux) pour séparer les différents constituants du mélange en fonction de leurs
températures d’ébullition au niveau de chaque plateau de cette colonne.
La distillation fractionnée, appelée également rectification, est un procédé permettant de séparer des
liquides par fractionnement grâce à la différence de leur température d'ébullition. Le composant le plus
volatil a un point d'ébullition moins haut s'évapore donc en premier. Le mélange porté à une ébullition
lente reste à la même température jusqu'à ce que le composant le plus volatil soit complètement
vaporisé, chaque liquide peut ainsi être distillé en fonction de sa température d’ébullition.

Le mélange à séparer est placé dans un ballon (bouilleur) surmonté d'une colonne de distillation. En tête
de colonne, on place un réfrigérant droit en position inclinée de façon à permettre l'écoulement des
liquides qui se condensent vers une allonge de recette. Un thermomètre est placé en tête de colonne de
sorte que son réservoir soit placé au niveau de la jonction avec le réfrigérant (on mesure ainsi la
température de l'équilibre liquide-vapeur du composé qui est récupéré dans le distillat).

Exemple : Un jus d’orange sans pulpe:

Etape 1: le chauffe-ballon chauffe le mélange dans le ballon et celui-ci se met à bouillir.
Etape 2: la vapeur d’eau ainsi formée monte progressivement dans la colonne de Vigreux.
Etape3: le thermomètre permet de lire la température de la vapeur qui rentre dans le réfrigérant: elle est
proche de 100 °C.
Etape 4: la vapeur d’eau (très chaude) entre en contact avec les parois du réfrigérant. Comme le
réfrigérant est froid grâce à la circulation d’eau froide qui se fait autour, la vapeur d’eau se refroidit et se
transforme en eau liquide.
Etape 5: les gouttes d’eau liquide ainsi formée roulent vers la sortie du réfrigérant et tombent dans le
bécher. Le liquide ainsi obtenu, qui ne contient que de l’eau, est appelé le distillat.
 III. La centrifugation
C’est une technique de séparation mécanique (basée sur le déplacement de la particule) permettant la
séparation de constituants des mélanges hétérogènes par l’action de la force centrifuge.
Tous les constituants contenus dans un échantillon sont soumis à la gravité, force qui s’exerce du haut
vers le bas, et à la poussée d’Archimède, force qui s’exerce du bas vers le haut. En faisant tourner
l’échantillon, on fait apparaître une nouvelle force, la force centrifuge, qui est une accélération qui
s’exerce radialement vers l’extérieur ce qui entraine sa sédimentation ou sa remontée.

1. Matériel de centrifugation
1.1 Centrifugeurs selon la position des tubes à centrifuger
1.1.1. Centrifugeurs horizontaux
Ils sont ainsi nommés car les godets sont horizontaux en rotation, la masse qui subit la rotation
s’appelle rotor.
Ce type d’appareil présente quelques inconvénients :
Mauvais aérodynamisme du rotor (frottement avec l’air), produisant un grand bruit et des risques
d’échauffement de l’échantillon.
Les particules qui sédimentent doivent traverser une grande épaisseur du liquide.

1.1.2. Centrifugeurs obliques

Les tubes sont logés dans un rotor circulaire appelé couronne sans lequel ils sont inclinés.
A l’inverse des centrifugeurs horizontaux, les couronnes présentent un bon aérodynamisme
permettant d’atteindre des vitesses élevées.
Les particules n’effectuent qu’un court parcours au sein d’un liquide. Elles migrent horizontalement
atteignant la paroi puis glissent le long de celle-ci ce qui favorise la sédimentation.
 1.2. Selon la force du moteur et les volumes à centrifuger
La force du moteur qui fait tourner le centrifugeur constitue la principale limite qui détermine la
vitesse de rotation du rotor. Plus le rotor est lourd et volumineux, plus l’effort que doit fournir le
moteur est grand. Selon les besoins expérimentaux (accélération, volume à centrifuger, temps ..)
plusieurs types de centrifugeurs ont été développés :
1.2.1. Centrifugeurs de paillasse (table) (oblique)
Constituent les modèles les plus simples et sont caractérisés par de faibles accélération 1000 à 3000g
et peuvent être réfrigérés et utilisés pour de de petits ou moyens volumes. C’est un type de
centrifugeurs obliques.
1.2.2. Centrifugeurs de sol (horizontaux)
Sont caractérisés par des accélérations de l’ordre de 20.000g permettant de centrifuger des volumes
relativement grands (4à 6 récipients pour certains rotors, de 250ml la bouteille).
N.B : Tous les modèles sont réfrigérés
1.2.3. Ultracentrifugeurs (horizontaux)
Appareils qui permettent d’atteindre des accélérations très élevées (300.000g) et tous les modèles
sont réfrigérés.
Les volumes à centrifuger ne dépassent pas 40ml par tube.
N.B : Les ultracentrifugeurs diffèrent des classiques horizontaux par la puissance du moteur
d’entrainement et par l’établissement d’un vide très poussé dans la chambre de rotation afin d’éviter
l’échauffement du rotor par frottement de l’air.
1.2.4. Micro-centrifugeurs (obliques)
Centrifugeurs spécialement conçus pour les micro-volumes.
Peuvent être réfrigérés et atteindre des accélérations de l’ordre de 15000g

2. Types de centrifugation
 2.1. Centrifugation différentielle
Dans cette méthode, le tube à centrifugation est essentiellement rempli d’un mélange de particules qui
se trouvent dans un liquide. Après centrifugation on obtient :
 Un culot contenant les particules sédimentées
 Un surnageant où se trouvaient les particules.
C’est une sédimentation en culot qui se base sur les différences de vitesse de sédimentation entre
particules qui diffèrent par les masses et/ou les tailles.
La centrifugation sédimentera d’abord les particules les plus lourdes (massives) ensuite les moyennes
et enfin les moins lourdes : il va y avoir plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante
(séquentielle). Si 2 particules ont la même masse mais diffèrent par la densité alors les plus denses
sédimenteront plus rapidement que les autres.
2.2. Centrifugation en gradient de densité
Dans une centrifugation à l’équilibre, les différents constituants atteignent une position dont ils ne
vont plus bouger, car étant en équilibre. Or l’équilibre est atteint lorsque la densité d’une particule est
égale à la densité du solvant, ce qui entraîne que la force gravitationnelle est égale à la poussée
d’Archimède. On va donc utiliser un solvant dont la densité va varier en fonction de la position dans le
tube, permettant aux différents constituants de rejoindre la zone de densité équivalente à la sienne : on
parle de gradient. Pour obtenir des solutions de densités différentes, la méthode la plus classique est
d’utiliser des solutions de concentration croissante en saccharose
2.2.1. Gradient continu :
Gradient autoformé, constitué d’une solution (ex : de saccharose) de densité
donnée soumise à une force centrifugeuse intense ce qui forme spontanément
un gradient de densité continu.

2.2.2. Gradient discontinu :

Gradient préformé pour des dépôts successifs de solution de densité /
concentration décroissante : de la plus concentrée vers la moins concentrée.
Dans cette méthode les particules se séparent donc selon leur densité. Il s’agit
bien d’une sédimentation en bandes : les particules vont sédimenter au sein du
gradient et se stabilisent à l’équilibre dans la zone du gradient où la densité
égale la sienne.

2.3. Ultracentrifugation
2.3.1. Analytique
Ne diffère que par les résultats. Elle est utilisée essentiellement pour déterminer les caractères
physiques des molécules (protéine, AC. Nucléique)
3. Application
La centrifugation en agroalimentaire a pour objectif de :
 Clarifier un liquide trouble (suspension) comme la clarification des boissons.
 Séparer les phases légères et lourdes d’une émulsion.
Exemple : l’écrémage du lait ; pour épurer le lait, pour obtenir du lait écrémé par exemple. La
séparation entre la partie liquide du lait et la crème qui le compose permet aux industriels de
proposer différentes catégories de produits, en accord avec les préférences des consommateurs
 Concentrer ou épaissir la phase solide d’une suspension
Exemple : la fabrication de pâte fraiche en fromagerie (carré frais) ou de la levurière

IV. La chromatographie
Chroma = couleur, Graphie = écriture ……… c’est l’écriture avec des couleurs
La chromatographie est une méthode séparative qui permet l’identification et le dosage des différents
composés d’un mélange.
Le principe est basé sur les différences d’affinité des composés du mélange avec 2 phases :
 Phase stationnaire = fixe
 Phase mobile
Il existe différents types de chromatographie suivant la méthode de séparation utilisée :
 La chromatographie en couche mince (CCM).
 La chromatographie en phase gazeuse (CPG).
 La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC).
Elles sont différentes quant au matériel utilisé. Une CCM nécessite une feuille de papier, un solvant et
une cuve en verre. La CPG, ou la HPLC nécessite des appareils de technologies poussées de coût élevé.
1. Chromatographie en phase gazeuse
C’est une méthode de séparation des composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage
sans décomposition. Elle constitue la méthode la plus puissante et la plus fine pour séparer, identifier et
quantifier les corps gazeux ou volatilisables.
La phase mobile, est un gaz et la phase stationnaire, est soit un liquide, soit un solide. Dans ce dernier
cas, la phase stationnaire liquide est retenue par support inerte.
Principe :
Le mélange à analyser est vaporisé puis transporté à travers une colonne renfermant une substance
liquide ou solide qui constitue la phase stationnaire. Le transport se
fait à l'aide d'un gaz inerte, appelé gaz vecteur (le plus souvent He ou
N2), qui constitue la phase mobile.
On obtient un chromatogramme où apparaissent des pics d'intégration
proportionnelle à la quantité de produit injecté.

Appareillage :
Un appareil de CPG comporte trois parties : un injecteur, une colonne et un détecteur.
 Injecteur : Il permet d'introduire un liquide qui doit être vaporisé instantanément avant d'être
transféré dans la colonne.
Cette opération est faite soit à l’aide d’une micro seringue pour les liquides et les solutions soit
d’une vanne à boucles pour les mélanges gazeux.
 Colonne : C'est l'organe principal. Elle est constituée d'un tube généralement métallique de
diamètre intérieur de l'ordre du millimètre.
 Détecteur : Il permet de mettre en évidence le passage des différents gaz séparés par la colonne.
La détection peut être basée sur des techniques de mesures différentes. Le détecteur le plus
utilisé en CPG est celui à conductibilité thermique appelé catharomètre.

La chromatographie en phase gazeuse permet l'identification des substances par leur temps de
migration ou temps de rétention et, également, la détermination des concentrations des substances
par mesure de la surface de leurs pics respectifs.
En agroalimentaire elle est surtout utilisée pour dosage des pesticides, recherche des nitrosamines
dans l’atmosphère et dans les produits de charcuteries.

2. Chromatographie en phase liquide à haute performance

C’est une technique extrêmement intéressante et complémentaire à la CG, puisqu’elle permet l’étude de
mélange dont les composants sont peu volatils ou qui se dégradent à haute température.
Principe :
Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la
phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la
phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique. La phase mobile poussée par une
pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique. C'est ce que l'on a appelé la
chromatographie liquide sous haute pression (HPLC).
Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique. Les
composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase
stationnaire. En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés
par un pic. L'ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme. Le signal du détecteur est
amplifié et enregistré, la température du four est maintenue constante.
Appareillage :

V. L’électrophorèse
 L’électrophorèse est utilisée pour vérifier la pureté d’une fraction chromatographique et pour
déterminer la masse moléculaire d’une protéine inconnue à l’aide des protéines standards.
Elle permet de déplacer des ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) sous l’effet d’un
champ électrique. Ceux-ci migrent vers leur électrode respective : Les anions (molécules chargées
négativement) migrent vers l’anode et les cations (molécules chargées positivement) migrent vers la
cathode. Pour les molécules non chargées, il n’existe pas de migration. Du fait de leurs caractéristiques
propres et des conditions de l’électrophorèse, la vitesse de migration et la distance parcourue dans la
matrice par ces diffèrent ions, ce qui permet leur séparation.
Appareillage :
L’appareillage usuel est constitué de:
- Un générateur du courant continu stabilisé relié aux électrodes de la cuve. Ce courant crée un champ
électrique qui va permettre de faire migrer les molécules.
- Une cuve d’électrophorèse fermée (horizontale ou verticale) et éventuellement thermostatée
comportant deux compartiments. Chaque compartiment est rempli du tampon de migration.
- Des accessoires comme le support d’électrophorèse, les plaques de verre pour couler le gel et les
peignes pour creuser des puits dans le gel, dans lesquels les composés à analyser seront déposés.