Les techniques de chromatographie

I- Les techniques chromatographiques

Historique :
1ère chromatographie :1906  pr séparer les pigments (= « chromato » en grec) d’une feuille
d’épinard.
Tswett : obs séparation des colorants végétaux, lorsqu’il filtrait leur solution dans l’éther de pétrole,
sur une colonne de carbonate de calcium.
Dans ces conditions, zones colorées vertes et jaunes qui se forment. Il a constaté : « tout comme les
rayons lumineux d’un spectre, les différentes composantes d’un mélange de colorants se déploient
sur la colonne de carbonate de calcium selon une loi et peuvent être analysées qualitativement et
quantitativement.
Qques dates :
- 1940 : Lederer fait la chromatographie des hormones stéroïdes
- 1950 : invention de la CPG (chromato en phase gazeuse)
- 1960 : CLHP (chromato liquide haute performance)
- 1990 : superfluide chromatographie SFC ou supercritique
Ces dernières techniques chromatographiques peuvent être automatisées et permettent des dosages
précis et spécifiques.
Utilisation de CCM (chromato sur couche mince) pour identifier les antiseptiques, les sucres, les
insecticides chlorés, les acides…
1) Principes généraux

Chromatographie liquide sur colonne

a. Définition
La chromato : méthode d’analyse physico-chimique de séparation basée sur les différences d’affinité
des substances à analyser pour 2 phases, l’une stationnaire, l’autre mobile.
Chaque produit est soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force
de mobilité due à la phase mobile.
Une colonne va être constituée d’une phase qui attirera ceux qui sont de mem nature qu’elle. Les produits à
analyser vont migrer +/- rapidement suivant qu’ils ont ou qu’ils n’ont pas d’affinité pour la phase, plus ils se
ressemblent à la phase puis ils y resteront longtemps.

b. Termes utilisés :

- Molécules à séparer dans la solution : soluté S.

- Phase stationnaire : exerce une affinité par rapport au soluté
- Phase mobile ou éluant (E) : pour entrainer les solutés, gaz ou liquide (CPG, CLHP)
Il y a pourtant une gde différence :
- En CPG la phase mobile est un gaz inerte (l’azote), il joue un rôle physique seulement :
entrainement. Il n’y aura pour la séparation que l’affinité entre le soluté et la phase
stationnaire.
Soluté phase stationnaire

- En CLHP le soluté aura à choisir entre la phase mobile liquide et la phase stationnaire.
L’entrainement de S par E, s’appelle élution.
Soluté phase stationnaire

Phase mobile E
c. Grandeur de rétention
Injecteur colonne détecteur chromatogramme
L’échantillon est introduit en haut de la colonne à un temps t0, et un détecteur placé en bas de la
colonne mesure la concentration des espèces au cours du temps (et en fonction du volume d’éluant si
le débit est constant). L’avancée graduelle du solvant entraine les molécules de soluté vers le bas de la
colonne.
Plus l’interaction du soluté avec la phase fixe est grande, plus il sera retenu, ce qui entraine la
séparation des composés. Le détecteur enregistre le passage des différents produits, en fonction du
temps et on obtient une série de pics symétriques. Le chromatogramme est utilisé à la fois en analyse
qualitative et quantitative.
La position des pics sur l’axe du temps (temps de rétention) permet d’identifier le constituant.
L’aire des pics permet de mesurer la quantité de produit.

t0 : plutôt le moment
d’injection.
 d. Etalement des bandes
En chromato liquide : dans chaque bande la répartition des solutés est gaussienne.
La phase stationnaire doit avoir une surface élevée pour une meilleure séparation. On utilise donc
des matériaux poreux. La vitesse à l’intérieur et à l’extérieur des pores ne sera donc pas la
même, la progression sera plus lente à l’intérieur qu’à l’extérieur.
Plus la vitesse d’élution augmente, plus cette différence sera accentuée et l’étalement plus
grand. Plus la vitesse d’élution augmente, plus cette différence sera accentuée et l’étalement
plus grand sur le chromatogramme.
Si on utilise des microparticules, cet effet diminue.
Analyse ou séparation de biomolécules par chromatographie liquide sur colonne :
- La solution de molécules dissoutes dans la phase mobile migre à travers une colonne
constituée d’un support solide poreux : la phase stationnaire.
- Les interactions des différentes molécules avec la phase stationnaire ralentissent +/- leur
migration à le support.

a. Chromatographie d’échanges d’ions :

Dans la chromatographie d’échange d’ions, les ions liés électrostatiquement à un support insoluble et
chimiquement inerte sont échangés de manière réversible par des ions en solution.

Propriété des aa :
- Les aa portent 2 groupements ionisables = caractères amphotères, une fonction acide + f°
basique/ une charge + et une charge – sur la même molécule.
- Les aa peuvent former des ions en solution aqueuse : grande importance biologique et
fonctionnelle.
Charge des aa variable selon le pH :

Obs résultat sur chromatogramme

d’aa.
2 chromatogrammes : le standard et
celui obtenu par exp.
Tps de rétention au maximum du pic.
Va det l’aire sous pic pr chaque aa.
Plrs types de supports possibles (pas
par <3). Ex de résines échangeuses
d’ions :
Les résines polyosidiques utilisés pour
la séparation de macromolécules
ionisées : prot, ac nucléiques… la
matrice polyosidique (composée de
cellulose ou de dextranes) porte des
grpment chargés  support est
fonctionnalisé.

Principe :
- Protéine a :
o Charge positive : pH<pI
o Charge négative pH>pI

Elle peut donc être retenue sur un échangeur de cations ou échangeur d’anions, suivant les cas. Elle
peut alors être éluée par passage d’un tampon contenant du sel en qté croissante (gradient de
concentration en sels).
 b. Chromatographie d’exclusion stérique
Type de chromatographie aussi appelée : tamisage moléculaire, gel filtration ou perméation sur gel.
Les protéines sont séparées selon leur taille (MM) et leur forme.
La chromatographie d’exclusion est aussi souvent utilisée pour dessaler une solution protéique (ex :
séparation du sulfate d’ammonium et d’une protéine qui a été précipitée par ce sel).
La plupart des gels (gels poreux) sont constitués de polyosides bactériens ou dextran (Sephadex), ou
d’agarose (Sépharose).
Domaine d’application : macromolécules naturelles et synthétiques : polypeptides, protéines, sucres,
polymères.
Séparation basée sur la MM avec un tamisage basée sur la taille des pores.
Remarque : la dialyse : une forme de filtration moléculaire. Permet de séparer les molécules selon
leur taille, en utilisant des mbnes semi-perméables dont les pores ont une taille inférieure aux
macromolécules telles que les protéines.
c. Chromatographie d’affinité
La phase stationnaire est un support macroméculaire chimiquement inerte et poreux, sur lequel est
fixé covalence un effecteur qui présente une affinité biologique pour un soluté de l’échantillon à
analyser.
3 types d’affinités sont utilisées :
- Affinité enzyme-substrat
- Affinité ligand-récepteur
- Affinité antigène-anticorps
Très souvent, la molécule fixée sera le substrat, le ligand ou bien l’anticorps. Ceci permettra de
purifier l’enzyme, le récepteur ou l’antigène, respectivement.
La phase stationnaire (ou gel d’affinité) : constitué par un support : carboxyméthylcellulose,
Sephadex, gel de polyacrylamide + un bras de fixation (« spacer » en anglais), sur lequel est fixé
l’effecteur.
Elution : elle peut être réalisée de
différentes façons :
- Tampon de pH différent de
celui ayant permis la charge :
changement de l’état
d’ionisation de la protéine :
désorption
- Tampon de force ionique
différente de celle ayant permis la charge : changement de conformation de la protéine
 - Compétition avec un ligand libre.

Chromatographie liquide haute performance

CLHP : développée depuis 1958
Méthode d'analyse immédiate qui ne détruit pas le soluté
Les solutés se partagent entre une phase mobile et une phase stationnaire qui exerce un effet
retardateur : entraînement et rétention sont 2 effets antagonistes ; Solutés ne se déplacent pas à la
même vitesse.
Technique analytique, dérivée de la chromatographie sur colonne dont les performances se sont
grandement améliorées : utilisation de phases stationnaires très élaborées, constituées de grains
sphériques dont le diamètre est de l'ordre du µm. Cependant, plus les grains sont petits
(granulométrie de la phase stationnaire), plus la pression à exercer pour faire passer la phase mobile
à un débit correct doit être élevée, d'où un appareillage particulier.
On minimise le temps de cinétiques d'adsorption et désorption des molécules, en augmentant la
vitesse de la phase mobile.

Chromatographie en phase gazeuse

II- Dosages spectrophotométriques et colorimétriques

1) Dosage par absorption/émission de flamme
2) Dosage spectrophotométrique/colorimétrique