Habilitation à Diriger des Recherches

présentée par

Raphaël Morillon

DETERMINISMES PHYSIOLOGIQUES ET MOLECULAIRES

DE LA TOLERANCE AU DEFICIT HYDRIQUE ET AU
STRESS SALIN CHEZ LES PLANTES

Soutenue le 19 mai 2005 devant le Jury composé de :

Liliane Berti, Professeur, Université de Corse, Corte, Présidente

Jean-Paul Lassalles, Directeur de Recherche au CNRS, Rouen, Rapporteur
Jean-Philippe Galaud, Maître de Conférences, UPS, Toulouse, Rapporteur
Felix Tomi, Professeur, Université de Corse, Corte, Rapporteur
Luis Navarro, Directeur de Recherche, IVIA, Valencia, Examinateur
Patrick Ollitrault, Responsable de l’équipe Agrume, CIRAD Montpellier, Examinateur

UPR 75 « Amélioration génétique d’espèces à multiplication végétative, CIRAD »

Site de San Giuliano, 20230 San Giuliano, FRANCE
A mon père, A ma mère,

A mes frères et sœurs,

A Marie.
 Remerciements

Il paraît qu’une HDR est une étape importante pour un chercheur. C’est, paraît-il, la
reconnaissance qui lui est faite de pouvoir encadrer des étudiants en thèse, sur la
thématique scientifique qu’il souhaite développer. Depuis mon stage de DEA à l’Université
de Clermont-Ferrand, j’ai eu la chance d’être encadré par des chercheurs qui m’ont toujours
incité à être curieux et à mener les expérimentations que j’avais envie de réaliser. Lorsque
j’ai été recruté en tant que chercheur au département Flhor du CIRAD, il m’a été donné carte
blanche. Quelles que soient les orientations et thématiques scientifiques que j’ai souhaité
développer, j’ai eu la chance d’être aidé et encouragé. Depuis plus de deux ans maintenant,
je développe librement des collaborations avec mes collègues de l’INRA de San Giuliano. Je
tiens donc à remercier l’ensemble de mes collègues (qu’ils soient dans les bureaux, dans les
labos ou sur le terrain) pour la disponibilité et la confiance qu’ils m’ont accordées.

Une HDR, c’est aussi l’occasion de prendre son indépendance scientifique vis-à-vis de
tutelles pouvant être parfois trop présentes. Je tiens donc à remercier les départements
«Environnement & Agronomie» et «Génétique & Amélioration des Plantes» de l’INRA pour
m’avoir incité à franchir le pas et à soutenir mon HDR. Ces deux départements ont rejeté
depuis le début mon thème de recherche. Pourtant, contre vents et marées la thématique
stress salin s’est développée, des projets internationaux ont été déposés et financés et deux
thèses vont bientôt démarrer. Je les remercie donc vivement de m’avoir ouvert les yeux.

Le démarrage d’une nouvelle thématique scientifique peut être soumis à de nombreux aléas.
Néanmoins, si l’on a la chance d’avoir quelques « idées », de travailler en bonne intelligence
avec ses collègues et d’avoir des étudiants enthousiastes, l’on se rend vite compte qu’il est
très facile de se faire plaisir. Je souhaite donc remercier tous les étudiants que j’ai encadrés
ou que j’ai eu la chance de côtoyer. Leur dynamisme et la fraîcheur qu’ils ont chaque fois su
insuffler au laboratoire, ont rendu pour moi l’expérience de chercheur passionnante.

Enfin, je tiens à adresser toute ma reconnaissance aux membres du Jury pour avoir accepté
de juger cette Habilitation à Diriger des Recherches.
 Habilitation à Diriger des Recherches
présentée par
Raphaël Morillon

I – ETAT CIVIL 1

II – FORMATION 1

STAGE POST- DOCTORAL 1

DIPLOMES 2
EXPERIENCES PROFESSIONNELLES, STAGES 2

III – LISTE DES TRAVAUX ET PUBLICATIONS 4

ARTICLES PUBLIES DANS DES REVUES A COMMITE DE LECTURE 4

PARTICIPATION A DES COLLOQUES, CONGRES 5
SEMINAIRES SUR INVITATION 6
PARTICIPATION A DES PROJETS, CONTRATS 7
COLLABORATIONS 8

IV – ACTIVITES D’ENCADREMENT ETD’ENSEIGNEMENT 10

ENCADREMENT DE THESARDS & STAGIAIRES 10

ENSEIGNEMENT 11

V – ACTIVITES DE RECHERCHES 12

INTRODUCTION 12

CHAPITRE - 1 : « ETUDE FONCTIONNELLE DES AQUAPORINES CHEZ LES

PLANTES » 12
1. LES ECHANGES D'EAU PLANTE / ENVIRONNEMENT 12
1.1. POTENTIEL HYDRIQUE ET FLUX D'EAU 13
1.2. LES FLUX D'EAU DANS LA PLANT 14
1.3. FORCES A L'ORIGINE DU DEPLACEMENT DE L'EAU DANS LA PLANTE 14
1.3.1. LA THEORIE TENSION-COHESION DU TRANSPORT DE L’EAU 14
1.3.2. LA REGULATION DES FLUX D'EAU AU NIVEAU DES FEUILLES 15
1.3.3. LA POUSSEE RACINAIRE 16
2. LES ECHANGES D’EAU A TRAVERS LES MEMBRANES CELLULAIRES 16
2.1 PERMEABILITE A L'EAU DE LA BICOUCHE LIPIDIQUE 16
2.2. PERMEABILITE A L'EAU DES AQUAPORINES 17
2.3 REGULATION DES AQUAPORINES 18
3. UNE NOUVELLE TECHNIQUE POUR MESURER LES FLUX D’EAU A
TRAVERS UNE MEMBRANE CELLULAIRE 18
4. MOUVEMENTS RAPIDES DE L'EAU CHEZ LES PLANTES: UN MECANISME
DE CO-TRANSPORT EST-IL POSSIBLE ? 20
5. ETUDE DE QUELQUES SITUATIONS PHYSIOLOGIQUES
SUGGERANT L’IMPLICATION D’AQUAPORINES 21
5.1 MESURE DE PERMEABILITE OSMOTIQUE SUR PROTOPLASTES ET
VACUOLES ISOLES - ROLE DU DEVELOPPEMENT 21
5.2. L'EFFET DU DEFICIT HYDRIQUE ET DU STRESS SALIN 22
5.3. ETUDE DES EFFETS HORMONAUX: CAS DU BRASSINOLIDE ET DE L’ABA 24
5.4. CARACTERISATION D'UNE AQUAGLYCEROPORINE CHEZ LE PIN 28
5.5 CARACTERISATION FONCTIONNELLE D'UNE AQUAPORINE CHEZ LE NOYER 28
6. CONCLUSIONS 28

CHAPITRE – II : « TOLERANCE DES AGRUMES A LA SALINITE » 30

1. PHYLOGENIE DES AGRUMES 30

2. LA SALINITE DES EAUX D’IRRIGATION : UNE PROBLEMATIQUE
MEDITERRANEENNE 31
3. LE STRESS SALIN CHEZ LES AGRUMES 31
3.1. LES EFFETS DU STRESS SALIN CHEZ LES AGRUMES 31
3.2 LE ROLE PIVOT DE L’ACIDE ABSCISSIQUE 32
3.3. COMPORTEMENTS DE DIFFERENTS GENOTYPES FACE A UN STRESS
SALIN 32
-
3.4. TRANSPORT DU CL 32
3.5. TRANSPORT DU NA+ 33
3.6. LES INTERACTIONS PORTE-GREFFE/GREFFON 34
4. POLYEMBRYONNIE ET PLOÏDIE 34
4.1. LA POLYEMBRYONNIE 34
4.2. LA PLOÏDIE 34
5.THEMATIQUES DE RECHERCHE ABORDEES 35
5.1. CARACTERISATION PHYSIOLOGIQUE ET ECOPHYSIOLOGIQUE DE
DIFFERENTES COMBINAISONS DE PORTE-GREFFES / GREFFONS D’AGRUMES
EN SITUATION DE STRESS SALIN 35
5.1.1. INTRODUCTION 35
5.1.2. RESULTATS ET PERSPECTIVES 36
5.2. IDENTIFICATION PAR EXPRESSION DIFFERENTIELLE DES GENES
IMPLIQUES DANS LA TOLERANCE AU SEL CHEZ LES AGRUMES ET
EVALUATION DE L’EFFET DE LA POLYPLOÏDISATION SUR L’EXPRESSION
DE CES GENES 37
5.3. ETUDE DES DETERMINANTS GENETIQUES DES CAROTENOÏDES DES
AGRUMES, FACTEURS DE LA QUALITE ORGANOLEPTIQUE NUTRITIONNELLE
ET HEDONISTE 38
5.4. SEQUENÇAGE DE COLLECTIONS D’EST D’AGRUME OBTENUES A PARTIR
DE DIFFERENTS ORGANES VEGETATIFS ET REPRODUCTEURS 39
5.5. REALISATION D’UNE POPULATION F2 ISSUE DE L’AUTOFECONDATION
D’UN HYBRIDE PONCIRUS TRIFOLIATA / MANDARINER CLEOPATRE 39
5.6. SEQUENÇAGE DES EXTREMITES TERMINALES DE CLONES BACS
D’AGRUME EN VUE DE LA REALISATION D’UNE CARTE PHYSIQUE 40
5.7 CONCLUSIONS 40

VI – PRINCIPALES PUBLICATIONS 41
VII – BIBLIOGRAPHIE
- ETAT CIVIL

MORILLON Raphaël, Pascal, Michel, Marie

Date et lieu de naissance: le 21 janvier 1970 à Vichy (03)

Nationalité: Française

Adresse professionnelle

Station de Recherche Agronomique – Site de San Giuliano, 20230, FRANCE.

Téléphone professionnel: (33) 04 95 59 59 45

Fax: (33) 04 95 59 59 37

E-mail: [email protected] ; [email protected]

Situation professionnelle

Depuis 2002, Chargé Recherches au CIRAD (Centre de coopération Internationale en

Recherche Agronomique pour le Développement). Physiologiste moléculaire : « Tolérance
des agrumes à la salinité ».

II - FORMATION

II - A - STAGE POST- DOCTORAL

1999-2002: Stage post-doctoral dans le groupe du Pr. Maarten J. Chrispeels (Division of

Biology, University of California San Diego): « Etude de l'expression et de la fonctionnalité
des aquaporines du plasmalemme chez Arabidopsis thaliana ».

II -B- DIPLOMES

- 1999: Doctorat de l’Université de Rouen, Spécialité Biologie Cellulaire (UPRESA

CNRS 6037, 76821 Mont-Saint-Aignan). Obtention du diplôme de Docteur de l’Université
de Rouen avec la mention Très Honorable le 29 juin 1999 devant la commission d’examen:
Pierre-Alain Balangé (Président), Christophe Maurel (Rapporteur), Jean-Paul Lassalles
 (Directeur), Jean-Baptiste Thibaud (Rapporteur), Rajbir Sangwan (Examinateur).

- 1994: DEA de phytomorphogénèse et productions végétales. Université Blaise

Pascal de Clermont-Ferrand (UMR PIAF; Resp: Drs M-O Desbiez, J-C Mauget & J-L
Julien). Mention Assez-Bien.

- 1993: Maîtrise de Physiologie Cellulaire et Moléculaire – Option biologie végétale –

Université Blaise Pascal de Clermont-Ferrand.

- 1992: Licence de biologie cellulaire à l’Université Blaise Pascal de Clermont-Ferrand.

- 1990: DEUG B – Université Blaise Pascal de Clermont-Ferrand.

- 1988: Baccalauréat série D, Lycée Pasteur, Issoire (63).

II -C- EXPERIENCES PROFESSIONNELLES, STAGES

2002-2004: Chargé de Recherches au CIRAD (Centre de coopération Internationale en

Recherche Agronomique pour le Développement). Physiologiste moléculaire : « Tolérance
des agrumes à la salinité et à la sécheresse ».

1999-2002: Université de Californie, San Diego, USA (Groupe du Pr. Maarten J.

Chrispeels). «Etude de l'expression et de la fonctionnalité des aquaporines du
plasmalemme chez Arabidopsis thaliana».

1995-1999: Thèse de Doctorat. Laboratoire des Processus Ioniques Membranaires, UMR

CNRS 6037 (Directeur de thèse: Dr J-P Lassalles) : « Modifications de perméabilité
cellulaire à l’eau liées au développement, au stress hydrique et aux mutations ».

1994: Service militaire en tant que scientifique du contingent au CEA, Institut National des
Sciences et Techniques Nucléaires (INSTN) de Saclay. Elaboration et enseignement de
travaux pratiques de DEA et formation permanente.

1993: Stage de DEA. Laboratoire de Physiologie Intégrée de l’Arbre Fruitier, UMR PIAF -
Université Blaise Pascal (Resp: Drs. M-O Desbiez, J-C Mauget & J-L Julien) : « Etude du
potentiel membranaire de repos chez Lycopersicum esculentum ».

1992: Stage de Maîtrise. Laboratoire d'amélioration des plantes, CEA de Cadarache (Resp:
Dr. M-H Montane) : « Etude de l'expression de gènes ELIPs ».
III - LISTE DES TRAVAUX ET PUBLICATIONS

III -A- ARTICLES PUBLIES DANS DES REVUES A COMITE DE LECTURE

[1]- Ramahaleo T., Morillon R., Alexandre J., Lassalles J-P. (1999). Osmotic water
permeability of isolated protoplasts: modification during development. Plant Physiology 119:
885-896.

[2]- Morillon R., Lassalles J-P. (1999). Osmotic water permeability of isolated vacuoles.
Planta 210: 80-84.

[3]- Comparot S., Morillon R., Badot P-M. (2000). Possible occurrence of water channels
in Phaseolus vulgaris L. twining shoots. Plant and Cell Physiology 41: 114-118.

[4]- Morillon R., Catterou M., Sangwan R.S., Sangwan B.S., Lassalles J-P. (2001).
Brassinolide may control aquaporin activities in Arabidopsis thaliana. Planta 212: 199-204.

[5]- Chrispeels M.J., Morillon R., Maurel C., Gerbeau P, Kjellbom P, Johansson I. (2001).
Aquaporins of plants: Structure, function, regulation and role in plant water relations.
Current Topics in Membranes. 51: 277-334.

[6]- Morillon R., Liénard D., Chrispeels M.J., Lassalles J-P (2001). Rapid movements of
plants organs require solute-water co-transporters or contractile proteins. Plant Physiology.
127: 720-723.

[7]- Morillon R., Chrispeels M.J. (2001). The role of ABA and the transpiration stream in
the regulation of the osmotic water permeability of leaf cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:
14138-14143

[8]- Ciavatta V.T., Morillon R., Pullman G.S., Chrispeels M.J., Cairney J. (2001) An
aquaglyceroporin is abundantly expressed early in the development of the suspensor and
the embryo proper of loblolly pine. Plant Physiology.127: 1556-1567.

[9]- Morillon R., Lassalles J-P (2002). Water deficit during root development: effects on the
growth of roots and osmotic water permeability of isolated root protoplasts. Planta. 214:
392-399.

[10]- Martre P., Morillon R., Barrieu F., North G.B., Nobel P.S., Chrispeels M.J. (2002).
Plasma membrane aquaporins play a significant role during recovery from water deficit.
Plant Physiology. 130: 2101-10.
 [11]- Sakr S., Alves G, Morillon R., Decourteix K., Guilliot A., Julien J-L., Chrispeels
M.J. (2003) Plasma Membrane Aquaporins are involved in winter embolism recovery in
walnut tree Plant Physiology. 133: 630-641.

III -B- PARTICIPATION A DES COLLOQUES, CONGRES

Communications orales

- 2004: Effect of salt stress in diploid and tetraploid citrus rootstocks. 10th International
Citrus Congress. Agadir, Morocco.

- 2004: Variability of the cNhx1 gene (a putative Na+/H+ antiport) in citrus. 10th International
Citrus Congress. Agadir, Morocco.

- 2002: Flux d'eau chez les plantes: un rôle pour les aquaporines? Centre INRA de Nancy.

- 2001: Flux d'eau chez Arabidopsis thaliana: un rôle pour les aquaporines? IFR 59,
Université de Poitiers.

- 2001: Abscisic acid modulates the osmotic water permeability of the plasma membrane.
Minisymposium membrane transport. Annual meeting of the American Society of Plant
Physiologists. Providence, USA.

- 2001: ABA hormone controls aquaporin activities. San Diego Plant biology Meeting. Salk
Institut, La Jolla, California, USA

- 2001: Expression et fonctionnalité de l'aquaporine RD28 chez Arabidopsis thaliana.

Université Blaise Pascal, Clermont-Ferrand.

- 2000: Osmotic water permeability of isolated protoplasts from plants that express sense
and antisense aquaporins. San Diego Plant biology Meeting. Salk Institut, La Jolla,
California, USA.

- 1999: Stress et histoire d'eau. Séminaire de l’ESA 6037, Université de Rouen, France.

- 1998: Variation de perméabilité cellulaire à l'eau observée sur différents mutants

d'Arabidobsis thaliana. Réseau "Biomembrane Végétales". Besançon.

- 1997: Mise en place d’aquaporines au cours du développement. Biotechnologies’97,

Compiègne.

Communication par affiche

+ +
- 2003: Variability of the cNHX1 gene (a potential Na /H antiport) in citrus, Barcelona,
Espagne.- 2001: Abscisic acid modulates the osmotic water permeability of the plasma
membrane. Annual meeting of the American Society of Plant Physiologists. Providence,
 USA.

- 2000: Expression and functionnality of antisense and overexpression of the RD28

aquaporin in Arabidopsis thaliana. Colloque "Canaux Ioniques". La Londe les Maures.

- 2000: Water permeability of Arabidopsis protoplasts expressing sense and antisense

constructs of the aquaporin RD28. Annual meeting of the American Society of Plant
Physiologists. San Diego, USA

- 2000: Effects of water stress on drought-tolerant and non tolerant wheat species. Annual
meeting of the American Society of Plant Physiologists. San Diego, USA.

- 1998 : Mesures de perméabilité à l'eau sur protoplastes isolés: effet du stress hydrique et
du développement. Colloque "Canaux Ioniques". La Londe les Maures.

- 1998 : Perméabilité cellulaire à l'eau et développement. 5ème forum des jeunes chercheurs
de la Société Française de Physiologie Végétale, Montpellier.

III -C- SEMINAIRES SUR INVITATION

- 2002 : Water flux in plants: are aquaporins required ? Vrije Universiteit, Amsterdam. Sur
invitation du Prof. A. H. de Boer, Netherlands.

- 2002: Water flux in plants: are aquaporins required ? Séminaire dans le cadre du DEA de
physiologie et génétique moléculaire de l’Université Blaise Pascal de Clermont Ferrand,
UMR PIAF 547, INRA. Sur invitation du Dr. S. Sakre.

- 2001 : Flux d'eau chez Arabidopsis thaliana : un rôle pour les aquaporines? UMR 8618,
IBP - Université d'Orsay. Sur invitation du Prof. J-L Prioul.

- 2001 : Flux d'eau chez Arabidopsis thaliana: un rôle pour les aquaporines? UMR INRA-
ENSAM, Montpellier. Sur inviation des Dr C. Maurel et F. Tardieu.

III -D- PARTICIPATION A DES PROJETS, CONTRATS

- Coordinateur d’un Projet PRAD (Projet de Recherche Agronomique pour le

Développement, appel d’offre 2006): « Identification des déTerminismes génétIques et
moléculaIres de la Tolérance des Agrumes au défIcit hydrique et au stRess salin en fonction
du niveau de ploïdiE », IdenTITAIRE. Projet Franco-Marocain en cours d’évaluation.

- Coordinateur d’un Projet Genoscope, appel d’offre 2005 : «BAC ends sequencing for the
physical mapping of the Citrus clementina nuclear genome» dans le cadre d’un Consortium
International (Espagne, France, Brésil, USA, Maroc). Projet en cours d’évaluation.
 - Coordinateur d’un PAI avec le Maroc (Comité Mixte Inter universitaire Franco-
Marocain), appel d’offre 2004 : « Etude des déterminants moléculaires de la tolérance au
stress hydrique chez les agrumes ». 2005-2007

- Participation à un projet Européen, sixth framework programme – 2003 – INCO – MPC-

2 , appel d’offre 2004: « Citrus rootstock breeding for efficient water and nutrient use » en
collaboration avec le CIRAD (France), l’IVIA (Espagne), INRA (Maroc), l’INRAT et INAT
(Tunisie), l’Université de Cukurova (Turquie), coordinateur du projet : Dr. Patrick Ollitrault,
2005-2006.

- Participation à un projet Interreg IVA, appel d’offre 2004: « Le Citrus comme

modèle de système pour la zone méditerranéenne: étude variétale de résistance aux stress
biotiques et abiotiques. » en collaboration avec le CNR de Pisa et l’Université de Sassari,
coordinatrice du projet : Dr. Chiara Geri, 2005-2006.

- Participation au projet CPER 2004 sur la qualité des fruits, Université de Corse et INRA
de San Giuliano.

- Coordinateur d’un Projet Genoscope, appel d’offre 2003 : « Séquençage de 37 000 EST
d’agrume obtenues à partir de différents organes végétatifs et reproducteurs » en
collaboration avec l’IVIA de Valencia, le CIRAD de Montpellier et Genoscope, 2004.
http://www.genoscope.cns.fr/externe/Francais/Projets/Projet_IC/organisme_IC.html

III- E- COLLABORATIONS

Projet « Identification des déTerminismes génétIques et moléculaIres de la Tolérance

des Agrumes au défIcit hydrique et au stRess salin en fonction du niveau de
ploïdiE », en cours d’évaluation, IdenTITAIRE

- Abdelaziz Hmyene, Université Hassan II- Mohammedia, Maroc.

- Yann Froelicher, CIRAD FLHOR (UPR75), San Giuliano, France.
- Francois Luro, INRA GEQA, San Giuliano, France.

Projet «BAC ends sequencing for the physical mapping of the Citrus clementina
nuclear genome», en cours d’évaluation

- Patrick Ollitrault, CIRAD FLHOR (UPR 75), Montpellier, France

- Michel Delseny, UMR CNRS 5096, Perpignan, France.
 - Francois Luro, INRA GEQA, San Giuliano, France.
- Vicente Conejero, CSIC / Universitad Politécnica de Valencia, Espagne.
- Manuel Talon, IVIA, Valencia, Espagne.
- Gustavo Astua-Monge, Centro APTA Citros Sylvio Moreira, Brazil
- Fred Gmitter, University of Florida, USA.
- Samia Lotfy, INRA Maroc, Kénitra, Maroc.

Projet « Etude des déterminants moléculaires de la tolérance au stress hydrique

chez les agrumes »

- Abdelaziz Hmyene, Université Hassan II- Mohammedia, Maroc

Projet « Citrus rootstock breeding for efficient water and nutrient use »

- Patrick Ollitrault, CIRAD FLHOR (UPR 75), Montpellier.

- Manuel Talon, IVIA, Valencia , Espagne.
- Samia Lotfy, INRA Maroc, Kénitra, Maroc.
- Zina Belfalah, INRAT, Ariana, Tunisie.
- Mehdi Benmimoun, Mahrajène, Tunisie.
- Onder Tuzcu, Université de Çukurova, Turquie.

Projet « Le Citrus comme modèle de sYstème pour la zone médiTerrRanéenne:

étUde variétale de résistance aux Stress biotiques et abiotiques», CYTRUS
- Chiara Geri , CNR - IBBA, Pisa.
- François Luro, INRA GEQA, San Giuliano.
- Migheli, INBB, Sassari

Projet « CPER »
- Liliane Berti, Université de Corse, Corte.
- Felix Tomi, Université de Corse, Ajaccio.
- François Luro, Olivier Pailly, INRA GEQA, San Giuliano.
- Yann Froelicher, CIRAD FLHOR (UPR75), San Giuliano.

Projet « Séquençage de collections d’EST d’agrume obtenues à partir de différents

organes végétatifs et reproducteurs »

- Javier Terol, Javier Agustí, Enriqueta Alós, Fernando Andres, Javier Brumos, Jose A.
Carrillo, Manuel Cercos, Jose M. Colmenero, Ana Conesa, Vicente Conejero, Domingo
 Iglesias, Francisco Legaz, Luis Navarro, Guillermo Soler, Francisco Tadeo, Manuel
Talon. IVIA & IBMCP de Valencia, Espagne.
- Xavier Argout, Brigitte Courtois, Patrick Olltrault, CIRAD AMIS & CIRAD FLHOR (UPR75)
Montpellier.
- Carol Dossat, Patrick Wincker, Genoscope, Evry.
- François Luro, INRA GEQA San Giuliano.
IV - ACTIVITES D’ENCADREMENT ET D’ENSEIGNEMENT

ENCADREMENT DE THESARDS & STAGIAIRES

2005

-- Wafa Mouhaya , stage de Master Recherche Biomolécules deuxième année, Université

de Corse: « Identification par expression différentielle des gènes impliqués dans la
tolérance au sel chez les agrumes et évaluation de l’effet de la polyploïdie sur l’expression
de ces gènes ». Encadrement en co-tutelle avec le Prof. Hmyene de l’Université Hassan II
Mohammedia à partir de septembre 2005 de la thèse de Wafa (financement de thèse
obtenu dans le cadre du Comité Mixte Inter universitaire Franco-Marocain, PAI (appel à
proposition 2004).

- Encadrement à partir de septembre 2005 de la thèse de Thierry Allario : « Etude

physiologique et écophysiologique de porte-greffe vis-à-vis du stress salin, évaluation de
l’effet de la polyploïdie ». Thèse financée dans le cadre d’un projet INCOMED.

- Co-encadrement de la thèse d’Anne-Laure Fanciullino : « Etude des déterminants

génétiques des caroténoïdes des agrumes, facteurs de la qualité organoleptique
nutritionnelle et hédoniste ». Thèse co-financée par la Collectivité Territoriale de Corse et le
CIRAD.

2002- 2004

- Co-encadrement de la thèse de Basel Saleh: « Contribution à l’étude des déterminants

physiologiques, génétiques et moléculaires de la tolérance des agrumes à la salinité ».
Université de Montpellier II. Membre du Jury. Thèse soutenue le 7 janvier 2005.

-- Magali Joanin, encadrement d’un stage d’IUP3: « Etude du niveau de ploïdie et de

zygotie d’un parc semencier de porte-greffe appartenant au genre Poncirus trifoliata ».
Université de Corse.

-- Thierry Allario, encadrement d’un stage de DESS: « Caractérisation physiologique et

écophysiologique de différentes combinaisons de porte-greffe / greffons d’agrumes en
situation de stress salin ». Université de Corse.

1999 & 2001

-- Benoît Schwartz, encadrement d’un stage de maîtrise à l’Univerité de Californie à San

Diego (UCSD): « Etude de l'expression et de la fonctionnalité de l'aquaporine RD28 sur
 plusieurs lignées d'Arabidopsis thaliana poussant dans différentes conditions
d'humidité relative ». Université Blaise Pascal de Clermont-Ferrand.

-- Olivier Henin, encadrement d’un stage de maîtrise: « Etude de la perméabilité osmotique

de protoplastes de racines de cultivars de blé résistant au stress hydrique ». Université de
Rouen.

ENSEIGNEMENTS

- 2004 -2005: Physiologie moléculaire, 12 h de cours et 6h de TD dans le cadre du Master

Recherche Biomolécules de l’Université de Corse.

- 1997 à 1999: Participation à l’encadrement de travaux pratiques de biologie végétale de

la maîtrise de biochimie, option biologie végétale de l’Université de Rouen.

- 1994-1995: Scientifique du contingent au Commissariat à l’Energie Atomique - Institut

National des Sciences et Techniques Nucléaires de Saclay – Unité d’Enseignement en
Radioprotection, Biologie et Médecine dirigée par le professeur D. Nolibé. Durant cette
année j’ai mis au point des travaux pratiques de biologie moléculaire et de biochimie. J’ai
également encadré des travaux pratiques concernant l’utilisation et la manipulation des
radioéléments ainsi que des travaux pratiques de biologie moléculaire et de biochimie. Ces
enseignements ont été réalisés dans le cadre de travaux pratiques pour étudiants de DEA
et également dans le cadre de sessions d’études organisées par le CEA (formation
permanente).
 IV - ACTIVITES DE RECHERCHES

INTRODUCTION

Mes activités de recherches ont débuté en 1994 lors de mon stage pratique de DEA au
laboratoire de Physiologie Intégrée de l’Arbre Fruitier à l’Université de Clermont-Ferrand
sous la direction des Dr. M-O Desbiez, J-C Mauget et J-L Julien (UMR PIAF 547, INRA).
J'ai ensuite réalisé mon service militaire en temps que scientifique du contingent au
Commissariat à l'Energie Atomique de Saclay (Institut National des Sciences et Techniques
du Nucléaire). Après cette année consacrée à l'enseignement, j'ai poursuivi un travail de
thèse au Laboratoire des Processus Ioniques Membranaires (UMR CNRS 6037, Université
de Rouen) dirigé par le Dr. J-P Lassalles. Pendant ces trois années, j'ai pu apprendre les
techniques de patch clamp et mettre au point une nouvelle technique pour mesurer les flux
d'eau membranaires sur des vacuoles et des protoplastes isolés. J’ai ensuite poursuivi
cette étude des mécanismes du transport de l'eau chez Arabidopsis thaliana, dans le cadre
d'un stage post-doctoral, dans le laboratoire du Professeur Maarten Chrispeels à
l'Université de Californie à San Diego. L'essentiel de mes travaux de thèse et post-
doctoraux ont donc porté sur l'étude des flux d'eau cellulaires et leurs implications à
l'échelle de la plante.

En 2002, j’ai été recruté en tant que Chargé de Recherches au CIRAD pour étudier la
tolérance des agrumes à la salinité.

Dans le premier chapitre de ce document, je vais présenter les principaux travaux que j’ai
effectués dans le cadre de l’étude des flux d’eau chez les plantes. Le second chapitre sera
consacré au programme de recherches que je développe aujourd’hui.

CHAPITRE - 1: « ETUDE FONCTIONNELLE DES

AQUAPORINES CHEZ LES PLANTES »

1. LES ECHANGES D'EAU PLANTE / ENVIRONNEMENT

Les végétaux sont soumis aux contraintes de l’environnement: le vent, la sécheresse, le

stress salin, la nature du sol sont autant de paramètres qui vont affecter la croissance et le
développement des plantes. Leur survie implique donc une adaptation qui se traduit par la
mise en place de dispositifs pour absorber efficacement l'eau du sol et pour réduire les
pertes par évaporation.
 1.1. POTENTIEL HYDRIQUE ET FLUX D'EAU

Le déplacement de l'eau d'un point à un autre est dû à la différence du potentiel

chimique de l'eau entre ces deux points. Ce potentiel, exprimé par sa mesure en énergie
par unité de volume, est appelé le potentiel hydrique, Ψ. Entre deux points, l'eau s'écoule
vers celui qui est au potentiel le plus bas, en empruntant des structures spécialisées dans
son transport à l'échelle de la plante, les vaisseaux, ou en se déplaçant à travers les
cellules. Les membranes cellulaires représentent la résistance essentielle à son
déplacement et c'est son étude qui va être développée dans la première partie de ce
manuscrit.
Si on considère les échanges d'eau entre la vacuole d'une cellule isolée et une solution
extérieure, on peut déterminer le potentiel hydrique en négligeant les «effets matriciels» et
les effets liés à la gravité dans ces deux milieux (Dainty, 1976). Dans le cas où les solutés
à l'origine des effets osmotiques ne traversent pas les membranes cellulaires, Ψ s'exprime
alors simplement par
Ψ = P −π
Dans cette équation, P représente la pression au point considéré. Elle est généralement
mesurée par rapport à la pression atmosphérique P0 (P est donc égal à zéro si le milieu est
à la pression P0). Le symbole π représente la pression osmotique, qui est reliée de façon
approchée à la concentration c, par la formule
π = RTc

Le flux d'eau qui traverse une membrane séparant deux compartiments (1) et (2), sera
proportionnel à la différence de potentiel appliquée à cette membrane, ψ2 - ψ1, ainsi qu'à sa
perméabilité hydraulique (Lp). En utilisant le symbole habituel ∆ pour représenter la
différence d'une grandeur X entre les deux compartiments
∆X = X 2 − X 1
le flux volumique d'eau Jv, (sens positif de (2) vers (1)) sera donné par la formule suivante:

J v = L p ( ∆ P − ∆π )
Jv ,exprimé en volume par unité de surface et de temps, a les dimensions d’une vitesse (ex:
cm s-1). Le potentiel hydrique a les dimensions d'une pression (énergie par unité de
volume), ce qui détermine les dimensions de Lp (ex: cm bar-1 s-1). Lorsque les différences
de potentiel hydrique sont déterminées par des différences de pression osmotique on
utilise également le coefficient Pos (pour perméabilité osmotique), dont l'expression est
définie par l'équation suivante:
 J v = − PosVw ∆c

ou Vw (18 cm3 mol-1) est le volume molaire de l'eau. La différence de concentration en

solutés imperméants, est exprimée en mol cm-3. Le produit Vw × ∆c est alors sans dimension
et le coefficient Pos a les dimensions d'une vitesse (cm s-1). A partir des formules précédentes
on déduit

P = L × RT
os p V
w

avec ( RT ) = 135 MPa

V 20°C
w

1.2. LES FLUX D'EAU DANS LA PLANTE

L’eau joue un rôle essentiel, notamment dans la rigidité des tissus en permettant aux
cellules de rester turgescentes, le contenu cellulaire faisant alors pression sur la paroi
pectocellulosique et permettant à la plante de garder un port dressé. En condition de
stress, par exemple, si la déshydratation est prononcée, on va alors assister à la fanaison
des feuilles et les tiges herbacées vont s'affaisser. L’eau joue aussi un rôle important dans
l’élongation des cellules, l’entrée d’eau dans la vacuole entraînant une augmentation de la
pression de turgescence et une déformation élastique de la paroi.
Pour répondre aux besoins de la plante, l'eau va emprunter plusieurs voies. De la racine à
la feuille, le déplacement de l'eau va se faire grâce aux forces de pression induites par le
courant de transpiration. Au niveau racinaire, le déplacement radial de l'eau implique un
transfert de cellule à cellule. Le passage de l'eau peut se faire par la voie apoplastique au
travers des espaces pariétaux, par la voie symplastique via les plasmodesmes, ou encore
par la voie transcellulaire au travers des membranes (Steudle et Peterson, 1998). La part
relative de chacune de ces voies dans le déplacement de l'eau est pour l'instant mal définie
mais il semble qu'elle dépende de l'espèce végétale étudiée, de l'organe ou encore des
conditions de culture (Steudle, 1994). La modulation de ce transport composite dans la
racine semble être un élément important dans la régulation des besoins en eau de la plante
(Steudle et Peterson, 1998)

1.3. FORCES A L'ORIGINE DU DEPLACEMENT DE L'EAU DANS LA PLANTE

1.3.1. LA THEORIE TENSION-COHESION DU TRANSPORT DE L’EAU

La théorie tension-cohésion du transport de l’eau (Dixon et Joly, 1894, Steudle, 1995)

rend compte des forces impliquées pour faire monter l’eau dans une plante. L’ascension de
l’eau ne nécessite pas d’énergie métabolique. Elle est essentiellement assurée par la
 transpiration au niveau des stomates des feuilles. On considère que l’air est
pratiquement saturé en vapeur d’eau dans la chambre sous-stomatique, alors qu’à
l’extérieur de la feuille, l’air est renouvelé et n’est pas dans les conditions de saturation.
C’est ce gradient de vapeur d’eau qui va provoquer l’évaporation au niveau des stomates.
Cette évaporation va attirer l’eau des cellules et, de proche en proche, la dépression va
être transmise à toute la colonne d’eau des vaisseaux du xylème jusqu’à l’extrémité des
racines (Bonner et Galston, 1952). La colonne de sève sous tension, c’est à dire à une
pression négative, va rester cohérente grâce aux liaisons hydrogène entre les molécules
d’eau dipolaires et aux forces d’adhésion de ces molécules aux parois des vaisseaux. Un
arbre de 100 m de hauteur est sur ce plan l’équivalent de colonnes d'eau s’étendant des
feuilles aux extrémités des racines (Steudle, 1995). L’eau peut donc être sous une pression
négative de 10 bars ou plus au niveau des racines. Ce mécanisme de montée de la sève
implique donc une forte déperdition en eau.

1.3.2. REGULATION DES FLUX D'EAU AU NIVEAU DES FEUILLES

L’ascension de l’eau dans la plante est assurée par la transpiration au niveau des
stomates des feuilles. Le gradient de vapeur d’eau entre l'intérieur de la chambre sous-
stomatique et l'extérieur de la feuille provoque l’évaporation de l'eau au niveau des
stomates. Cette évaporation va attirer l’eau des cellules du mésophylle et, de proche en
proche, la dépression va être transmise à toute la colonne d’eau des vaisseaux du xylème
jusqu’à l’extrémité des racines (Tyree, 1997). La régulation du flux de transpiration se fait
au niveau des stomates, la modulation de l'état d'ouverture de l'ostiole étant assurée par
des variations de la pression de turgescence des cellules de garde. L'absorption d’ions
potassium et la conversion d’amidon en malate notamment, produisent une entrée d’eau
dans les cellules de garde, ce qui va provoquer un gonflement cellulaire et un
élargissement de l’ostiole. Au contraire, la perte d’ions potassium conduit à une sortie d’eau
et à la fermeture des stomates. La lumière, l’humidité, les changements de concentrations
en CO2 ( Schroeder et al., 2001) ou encore l’acide abscissique sont autant de stimuli qui
entraînent des modifications dans le transport membranaire des ions et dans la production
d’osmoticum. Ces différents effecteurs vont donc participer à la régulation de l'état
d'ouverture stomatique.
Pour répondre aux besoins de la plante, l'eau va emprunter plusieurs voies. Au niveau
racinaire par exemple, le déplacement radial de l'eau implique un transfert de cellule à
cellule: le passage de l'eau pouvant se faire par la voie apoplastique au travers des
espaces pariétaux, par la voie symplastique via les plasmodesmes, ou encore par la voie
transcellulaire au travers des membranes (Steudle et Peterson, 1998). La part relative de
chacune de ces voies dans le déplacement de l'eau est pour l'instant mal définie mais il
semble qu'elle dépende de l'espèce végétale étudiée, de l'organe ou encore des conditions
 de culture (Steudle, 1994). La modulation de ce transport composite va être un
élément clef dans la régulation des besoins en eau de la plante.

1.3.3. LA POUSSEE RACINAIRE

L’absorption de l’eau par la plante se fait essentiellement au niveau des poils absorbants
ainsi qu’au niveau des espaces libres intercellulaires. Lorsque les stomates sont fermés, le
courant de transpiration est faible et c’est la poussée racinaire qui assure la montée de la
sève. Cette poussée est le résultat d’un flux d’eau dû à la différence de potentiel hydrique
entre le sol et les poils absorbants. C’est le transport actif d'ions des cellules de la stèle
dans les vaisseaux du xylème qui est à l’origine d'un gradient osmotique, entraînant l’eau
par osmose de cellule en cellule. En termes de pression, les poussées racinaires ont des
valeurs nettement plus faibles (< 6 bars) que celles engendrées par le courant de
transpiration (> 20 à 30 bars).

2. LES ECHANGES D’EAU A TRAVERS LES MEMBRANES CELLULAIRES

Une des fonctions principales des membranes est de maintenir les concentrations
ioniques au sein de la cellule en régulant les échanges d’eau et d’ions. L’étude des
échanges d’eau au travers des membranes a permis de définir deux mécanismes de
perméabilité différents. Le passage des molécules d'eau à travers la membrane, mesuré
par un isotope (ex: DHO) en l’absence de flux net d'eau, est caractérisé par la perméabilité
diffusionnelle Pd (Finkelstein, 1987). Le flux net d'eau en réponse à un gradient
hydrostatique ou osmotique est défini par la perméabilité osmotique Pos de cette
membrane.

2.1 PERMEABILITE A L'EAU DE LA BICOUCHE LIPIDIQUE

Les membranes d'une cellule sont constituées essentiellement de phospholipides. Ceux-

ci forment une bicouche lipidique dans laquelle sont insérées des protéines. Les lipides et
les protéines sont libres et ont une certaine mobilité dans le plan de la membrane. La
fluidité de la bicouche dépend de son contenu lipidique, de sa teneur en cholestérol et de la
température. Un modèle proposé par Haines (1994) suggère que lors du déplacement
latéral des lipides dans la bicouche, il pourrait y avoir formation de lacunes dans lesquelles
les molécules d’eau viendraient se positionner. C’est donc la diffusion latérale des chaînes
lipidiques qui permettrait le transfert des molécules d’eau d’un coté à l’autre de la
membrane.
 2.2. PERMEABILITE A L'EAU DES AQUAPORINES

La découverte de protéines membranaires spécifiques du transport de l’eau, les

aquaporines, a amené la communauté scientifique à reconsidérer la vision des flux d’eau
dans la plante. En effet, la présence de ces protéines qui peuvent représenter jusqu'à 25 %
des protéines membranaires permet d'augmenter de façon considérable la vitesse des
échanges d'eau transmembranaires.
Au début des années 1990 on a pu montrer l’existence de protéines spécifiques du
transport de l’eau tant chez les animaux que chez les plantes. Ces protéines ont été
appelées aquaporines. L’isolement d’ARNm de globule rouge et leur expression dans des
ovocytes de xénope ont permis de démontrer l’existence d'une protéine, CHIP28 (ou
AQP1), facilitant le déplacement de l'eau dans les membranes (Preston et al., 1992). Ces
auteurs ont isolé des ARNm de protéines membranaires de globules rouges. L'injection de
ces ARNm traduits in vitro dans des ovocytes de xénope a permis de montrer que ces
ARNm entraînaient une augmentation de Pos. En effet, 48 à 72 heures après injection, la
perméabilité osmotique de l'ovocyte passe de 28 à 210 µm s –1. Ces ARNm seraient donc à
l'origine de la mise en place au sein de la membrane de protéines spécifiques du transport
de l'eau, les aquaporines.
Des travaux analogues ont été réalisés à partir de tubules de rein (Fushimi et al., 1993) ou
de plantes (Maurel et al., 1993, Daniels et al., 1994). Chez les plantes, des expériences de
voltage clamp sur ovocyte ont permis de vérifier la sélectivité pour l’eau des aquaporines
vacuolaires α TIP et γ TIP (Maurel et al., 1993; Maurel et al., 1995), aucun courant d’ion
n'ayant pu être mis en évidence. Ces différents résultats ont ainsi permis de porter un
regard nouveau sur l'ensemble des travaux déjà réalisés dans le cadre de l'étude de la
perméabilité à l’eau des membranes.

Au niveau moléculaire, la comparaison des séquences en acides aminés des aquaporines

montre qu'elles appartiennent à la famille des MIP (pour Membrane Intrinsic Protein), une
famille de protéines membranaires qui se rencontre tôt au cours de l'évolution (Reizer et
al., 1993). Chez l'homme 8 protéines MIP ont été identifiées; du point de vue fonctionnel
elles ont toutes des caractéristiques d'aquaporine (Ma et al., 1997). Ce sont des protéines
membranaires de 25 à 30 kDa, avec des séquences très conservées. La structure
moléculaire des aquaporines montre que la chaîne polypeptidique forme 6 segments
transmembranaires et deux domaines N- et C- terminaux du coté cytoplasmique. Certaines
de ces protéines possèdent des résidus cystéine qui peuvent être oxydés par l'ion mercure
et ses dérivés, ce qui entraînerait la "fermeture" de l'aquaporine (Preston et al., 1993)

Chez Arabidopsis thaliana 35 protéines MIP permettant le transport passif de petites

molécules polaires ont été identifiées par homologie de séquence (pour revue voir
Johanson et al., 2001). Les MIPs qui permettent un transport spécifique de molécules d'eau
 sont appelées aquaporines. Les 35 MIPs peuvent être classées en quatre sous
familles: treize PIPs (pour Plasma Intrinsic Proteins) ou aquaporines du plasmalemme,
elles mêmes divisées en deux sous familles, les PIP1 et les PIP2 ; dix TIPs (pour Tonoplast
Intrinsic Proteins) ou aquaporines du tonoplaste ; neuf NIPs (pour nodulin like Intrinsic
Proteins) qui sont principalement des aquaglyceroporines ; et enfin trois SIPs (pour Small
Intrinsic Proteins) dont la fonction n'a pas encore été définie (Figure. 1).

2.3 REGULATION DES AQUAPORINES

Divers travaux ont permis de montrer que les flux d’eau au travers des aquaporines étaient
fonction de la quantité de protéines aquaporines au sein des tissus (c’est par exemple le
cas au niveau racinaire pour l’absorption de l’eau (Javot & Maurel, 2002 )). Les études au
moyen de microfiltres à haute densité ont également permis de vérifier que l’expression du
génome au niveau du transcriptome pouvait être variable chez Arabidopsis en fonction du
stress étudié. En effet, des résultats très différents ont été observés en situation de froid,
de sécheresse, de stress salin ou d’anoxie (Maathuis et al., 2003 ; Bray, 2004).

Il a été montré que l’activité aquaporine était dépendante de l’état de phosphorylation de

ces mêmes protéines. Les premières démonstrations ont été faites sur des α-TIP
d’Arabidopsis injectées dans des ovocytes de xenopes soumis à de l’AMPc (Maurel et al.,
1995). Plus récemment, il a été montré que les aquaporines de pétales de tulipes
pouvaient être phosphorylées par des protéines kinases Ca2+ dépendantes et
déphosphorylées par une protéine phosphatase de type A (Azad et al., 2004a ; 2004b).
Enfin, il a été montré que l’activité aquaporine était fonction du pH. Gerbeau et al., (2002)
ont en effet montré sur des vésicules de plasmaleme d’Arabidopsis qu’un pH compris entre
7.2 et 7.5 permettrait d’inhiber 50% des flux d’eau. De même, Tournaire-Roux et al. (2003),
on montré qu’en situation d’hypoxie la diminution des flux d’eau au travers des aquaporines
du plasmaleme était liée à une diminution du pH cytosolique.

3. UNE NOUVELLE TECHNIQUE POUR MESURER LES FLUX D’EAU A TRAVERS UNE
MEMBRANE CELLULAIRE

De nombreuses techniques ont été mises au point pour mesurer les flux d’eau au niveau
d’un organe ou d’une cellule. Ces techniques (sonde de pression, stopped flow, RMN,
mesure sur protoplaste isolé etc...) ont permis l’étude de systèmes biologiques très variés
(Steudle, 1994 ; Hüsken et al., 1978 ; Url,1971 ; Stadelmann et Lee-Stadelmann, 1989 ; par
Kamiya et Tazawa, 1956). Les valeurs de perméabilité membranaire qui ont pu être
mesurées sont donc étroitement dépendantes de la technique de mesure employée et du
 matériel biologique étudié. Je me bornerai ici à mettre en perspective les résultats
obtenus lors de mesures par variations de volume.
Lorsqu‘une cellule est placée dans un milieu ayant une pression osmotique différente de la
pression osmotique intracellulaire, un flux d'eau se forme de manière à équilibrer les
différentes concentrations de part et d'autre de la membrane. La mesure de la vitesse de
variation de volume qui en résulte permet de mesurer Pos.
Des mesures de Pos peuvent être réalisées en enregistrant la vitesse initiale de
changement de volume que subissent des cellules à la suite d’un choc osmotique.
Généralement pour les ovocytes cela ne pose pas de problème, en raison de la grande
taille de ces cellules (≈ 1 mm). Il est possible de fixer l’ovocyte de manière à réaliser un
changement de solution en quelques secondes.
Pour des cellules de taille plus faible, il est difficile d’estimer le volume des cellules au
cours du choc osmotique. Lors d'une plasmolyse par exemple les cellules ne sont plus tout
à fait sphériques et la mesure de la variation de volume est délicate. L'autre problème
rencontré est celui des couches limites. La non prise en compte de ce phénomène entraîne
dans le cas de fortes valeurs de perméabilité une sous estimation de la valeur mesurée.
Des mesures ont été réalisées sur des ovocytes de souris (75 µm) (Gao et al., 1994). La
faible taille des cellules nécessitait de pouvoir augmenter la vitesse du changement de
solution. Pour cela les auteurs ont utilisé une pipette de verre permettant le maintien de
l’ovocyte lors de la réalisation du choc osmotique. Les valeurs de Pos alors mesurées
étaient proches de 10 µm s-1. D’autres mesures sur des cellules comparables sont
possibles en utilisant une chambre de perfusion permettant de changer la solution en
moins d'une seconde. Lors du changement de solution les cellules sont immobilisées sur
une membrane poreuse transparente. L’enregistrement des variations de volumes permet
ensuite d'estimer Pos (µm.s-1).
Des mesures de Pos ont été réalisées sur des protoplastes d'Arabidopsis thaliana en
ajoutant le plus rapidement possible une seconde solution ayant une pression osmotique
plus faible de manière à imposer un choc osmotique (Kaldenhoff et al, 1998). Cependant,
les faibles valeurs mesurées par les auteurs sont sujettes à caution en raison de la taille
environ dix fois plus petite des protoplastes. Dans ces conditions, il est probable que les
variations de volume très rapides ne sont pas observées. Les mesures ne donnent donc
pas accès à la vitesse initiale du changement de volume et peuvent conduire à sous-
estimer Pos.
Mon travail de thèse m’a permis d'aborder les propriétés de perméabilité à l'eau des
cellules végétales, liées à la présence des aquaporines dans les membranes. Comme on
l’a vu, c’est une étude difficile qui repose essentiellement sur des mesures de variations du
volume cellulaire (Stadelmann et Lee-Stadelmann, 1989, Preston et al, 1992 ; Farinas et
Verkman, 1996). Les résultats déjà obtenus avec la sonde de pression fournissent une idée
 assez précise des flux d’eau au niveau d’un tissu (Steudle, 1994). Cependant, lorsqu'il
s'agit d'estimer la contribution des aquaporines à ces flux, l'interprétation des résultats est
délicate, car les mesures ne permettent pas de distinguer le flux à travers les aquaporines
de celui dépendant des plasmodesmes qui mettent en contact les cellules d’un tissu. Les
difficultés rencontrées avec la sonde de pression s’apparentent à celles liées aux
techniques d’électrophysiologie au niveau tissulaire. Dans les deux cas, il s'agit
d'interpréter les données d'une électrode implantée dans un tissu en termes de propriétés
membranaires. On est donc confronté aux problèmes de la localisation précise de
l'électrode, aux lésions pas toujours négligeables qu'elle provoque sur des cellules de
petite taille, ainsi qu'à la "fuite" de la membrane liée aux connexions entre les cellules. Pour
résoudre ces problèmes, l’électrophysiologie s’est dotée de la technique du patch clamp
qui permet de travailler sur des protoplastes isolés. Il semblait également intéressant pour
l’étude fonctionnelle des aquaporines, de pouvoir mesurer la perméabilité à l'eau de
protoplastes ou vacuoles isolés. La taille moyenne des protoplastes et vacuoles étant
inférieure à 100 microns, et leur perméabilité à l'eau pouvant être importante, il était
impératif de pouvoir mesurer les variations de leur volume en réponse à un choc
osmotique, sur des intervalles de temps parfois très brefs, de l'ordre de la seconde. Cette
technique, à laquelle je me suis consacré au début de ma thèse, est décrite dans la
publication # 1.

4. MOUVEMENTS RAPIDES DE L'EAU CHEZ LES PLANTES: UN MECANISME DE CO-

TRANSPORT EST-IL POSSIBLE ?

Chez Mimosa pudica, le fait de toucher un rameau ou une feuille entraîne un

abaissement du rameau ainsi qu'une fermeture des folioles. Ces mouvements rapides
(quelques secondes) ont été activement étudiés (Fleurat-Lessardt et al., 1997; Moshelion
et Moran, 2000) mais l'interprétation du phénomène reste encore problématique. Lors du
mouvement on constate une plasmolyse des cellules du pulvinus (organe moteur) (Fleurat-
Lessardt et al., 1997). Pour expliquer ce phénomène le modèle le plus souvent avancé
propose que les molécules d'eau "suivent" un déplacement d'ions induit par le signal, en
provoquant la plasmolyse des cellules. Les études réalisées sur des protoplastes de
pulvinus montrent que les conductances ioniques membranaires au potassium (ion le plus
mobile) (Stoeckel et Takeda, 1995) sont bien trop faibles pour confirmer ce modèle. Nous
avons proposé un autre modèle faisant intervenir des aquaporines et des "pompes à eau"
pour expliquer la rapidité des mouvements. Dans ce modèle, les aquaporines ne seraient
actives que de façon transitoire, lors du mouvement. En l'absence d'excitation, un transport
actif de molécules d'eau vers l'intérieur des cellules, couplé à un ion ou à un sucre,
permettrait de créer la pression de turgescence. La réception d'un signal entraînerait
l'ouverture transitoire des aquaporines, provoquant la perte de turgescence de certaines
 cellules et l'affaissement du rameau. La fermeture des aquaporines permettrait de
restaurer lentement la pression de turgescence des cellules et par la même le relèvement
du rameau et l'ouverture des folioles. La possibilité d'existence d'une pompe à eau au sein
des membranes est examinée du point de vue énergétique, en utilisant les valeurs de flux
ionique de la littérature et mes propres mesures de perméabilité à l'eau sur Mimosa pudica
(Publication # 6).

5. ETUDE DE QUELQUES SITUATIONS PHYSIOLOGIQUES SUGGERANT L’IMPLICATION

D’AQUAPORINES
5.1 MESURE DE PERMEABILITE OSMOTIQUE SUR PROTOPLASTES ET VACUOLES ISOLES
- ROLE DU DEVELOPPEMENT

Au moyen de la technique que nous avons développée, nous avons calculé la

perméabilité osmotique à l’eau (Pos) de la membrane plasmique à partir de la mesure de la
vitesse initiale du changement de volume d'un protoplaste ou d'une vacuole. Les fortes
valeurs de Pos (≈ 300 µm s-1) mesurées sur certains protoplastes se caractérisent par une
dépendance faible vis à vis de la température (énergies d’activation < 5 kJ mol–1) ce qui
suggère la présence de canaux à eau fonctionnels au sein du plasmalemme. Au contraire,
les faibles valeurs de Pos (≈ 10 µm s-1) mesurées sur des protoplastes de pelure d'oignon
présentent une forte dépendance vis à vis de la température et se caractérisent donc par
une forte énergie d'activation (≈ 60 kJ mol–1) caractéristique des flux d'eaux au travers des
membranes lipidiques.

La perméabilité du tonoplaste est généralement considérée comme beaucoup plus forte

que celle du plasmalemme (Maurel et al., 1997 ; Niemietz et Tyerman, 1997). Cependant,
peu de mesures de Pos ont été réalisées sur vacuoles isolées car ces organites sont très
fragiles. Au moyen de cette même technique nous avons mesuré les propriétés de
perméabilité à l'eau mais aussi la capacité des vacuoles à augmenter leur surface lors d'un
choc hypo-osmotique. Chez les différentes espèces végétales que nous avons étudiées,
les valeurs de Pos des vacuoles étaient toujours très fortes (200 à 1000 µm s-1). Les
mesures réalisées sur protoplastes ont montré que lors d'un choc hypo-osmotique les
protoplastes ont la capacité d'augmenter leur surface membranaire de plus de 15 %
suggérant l'implication de vésicules ou bien la présence d'invaginations permettant une
augmentation de la surface membranaire lors du gonflement. Chez les vacuoles, lors d'un
choc hypo-osmotique analogue, les vacuoles éclatent sans augmentation de surface, ce
qui suggère que les membranes vacuolaires ne disposent pas des "réserves"
membranaires nécessaires. Enfin, des mesures de Pos sur des vacuoles d’oignon et de
betterave rouge réalisées en présence de mercure (un inhibiteur non spécifique des
aquaporines), ont montré une réduction de 50 à 70 % de la perméabilité à l'eau qui peut
 être partiellement restaurée par un traitement avec un agent réducteur. Cette
perméabilité demeure peu sensible à la température (l'énergie d'activation reste faible), ce
qui suggère que la Pos résiduelle serait essentiellement due aux aquaporines insensibles
au mercure. Ce dernier résultat montre que la perméabilité des lipides vacuolaires comme
celle des protoplastes est très faible (Publication # 2).

Des mesures sur des protoplastes de racine de colza, de blé et de maïs à des stades de
développement différents de la racine ont également été réalisées. Cette étude indique que
la perméabilité à l'eau des protoplastes issus de racines de colza âgées de deux jours ont
des valeurs de Pos très faibles. Par contre, les protoplastes de racines âgées de 5 jours ont
des valeurs de Pos très fortes. En l'espace de 48 heures il y a eu élongation et
développement de la racine et apparition de fortes valeurs de Pos. Ces résultats m'ont
amené à conclure qu'au cours du développement, la mise en place d’aquaporines au sein
des membranes des cellules racinaires permet de faciliter les flux d'eau transcellulaires
(Publication # 1).

5.2. L'EFFET DU DEFICIT HYDRIQUE ET DU STRESS SALIN

L'effet du stress hydrique sur les plantes est un problème majeur qui a beaucoup été étudié
tant au niveau physiologique qu'au niveau moléculaire. De nombreuses revues (Bohnert et
Sheveleva, 1998; Bray, 1997 & 2004; Yamagushi-Shinozaki et al, 1995; Ingram et Bartels,
1996) traitent du sujet et des différents mécanismes d'adaptation aux stress hydriques.
C'est un sujet très vaste en raison de la diversité des types de stress, de la diversité des
plantes et de leur capacité plus ou moins grande à s'adapter aux contraintes de
l'environnement. Les réponses à un stress déterminé ne seront pas les mêmes pour les
plantes reviviscentes, les halophytes, les mousses ou encore les plantes d’intérêt
agronomique. La diminution de la quantité d'eau disponible dans le sol va entraîner un
déficit en eau au niveau de la plante qui peut entraîner la mort de celle-ci. Au niveau
cellulaire, le stress peut entraîner une augmentation de la concentration des solutés, un
changement de la forme des cellules, une perte de turgescence, la perturbation de
l'intégrité des membranes et enfin la dénaturation des protéines. Les mécanismes
d'adaptation aux déficits hydriques vont dépendre de la sévérité du stress, de la sensibilité
de la plante, ou encore de son stade de développement. La perception du stress osmotique
va se traduire par l'induction de nombreux gènes. Ces différentes étapes qui peuvent être
propres à chaque type de stress rendent compte de la complexité des phénomènes mis en
œuvre. Très brièvement, un stress hydrique peut se résumer de la manière suivante : La
première étape de la perception du stress hydrique se traduit au niveau cellulaire par une
perte de turgescence, un changement du volume cellulaire et une altération des
 connexions paroi-plasmalemme. Des protéines pouvant jouer le rôle d'osmosenseur,
déjà mises en évidence chez les levures semblent de même exister chez les plantes
(Shinozaki et Yamagushi-Shinozaki, 1997). La seconde étape conduit à l'induction de
gènes spécifiques qui vont entraîner la synthèse d'ABA (Acide Abscissique) au niveau
racinaire (Shinozaki et Yamagushi-Shinozaki, 1997; Bray, 1997). Elle va permettre la
fermeture des stomates mais aussi la synthèse de phospholipase C, Map Kinases
impliquées dans la transduction du signal (Mizoguchi et al, 1996). L’étape suivante va
consister à éviter la déperdition en eau. Pour cela, la plante va synthétiser des osmolites
tels la proline, le pinitol, des sucres et d'autres composés qui vont permettre d’abaisser le
potentiel osmotique cellulaire (Ingram et Bartels, 1996). De même, l’absorption d'ions
potassium ou sodium joue un rôle important dans l'adaptation au stress salin (Assmann et
Haubrick, 1996). D'autres protéines, telles que les LEA (pour "late embryogenesis
abundant") vont être synthétisées pour permettre la protection de la machinerie cellulaire,
le maintien de la structure des membranes ou des protéines et la compartimentation des
ions (Xu et al, 1996). Enfin des gènes de détoxification pourront aussi être induits pour
permettre la survie de la plante (Ingram et Bartels, 1996).
Au niveau des flux d'eau cellulaire, il y a peu de données sur l'effet du stress hydrique.
Quelques mesures ont cependant été réalisées par la technique de la sonde de pression.
En situation de stress salin les cellules de cortex racinaire de maïs semblent diminuer leur
conductivité hydraulique (Azaizeh et Steudle, 1991; Azaizeh et al., 1992) alors qu'en
situation de stress analogue, la conductivité hydraulique n'est pas modifiée chez l'orge, la
tomate, le tournesol et le tabac (Munns and Passioura, 1984; Shalhevet et al., 1976;
Tyerman et al., 1989). Des recherches en biologie moléculaire ont été effectuées afin de
mettre en évidence l’implication d'aquaporines dans le transport de l'eau en situation de
stress hydrique. Là aussi, les résultats obtenus dépendent du type de plante et de stress
étudié. Ainsi chez Arabidopsis thaliana il semble que la quantité d'aquaporines
membranaires soit augmentée par le stress hydrique (Yamagushi-Shinozaki et al., 1995)
alors que chez Mesembryantemum crystallinum elle est diminuée (Yamada et al., 1995).

Dans le cadre de ma thèse, j’ai étudié la tolérance au stress salin et au déficit hydrique de
différentes espèces plus ou moins sensibles tels que le blé, le colza et le lin. Il a été
possible d'induire de fortes valeurs de Pos chez le blé ‘Ritmo’, le colza et le lin. Dans les
mêmes conditions, la Pos du blé ‘Cham1’ demeurait inchangée.

L’imposition d’un stress hydrique plus important empêche le colza et le lin de pousser. Le
blé 'Ritmo' parvient à germer, mais seul le blé ‘Cham1’, connu pour ses propriétés de
résistance au stress hydrique, continue à se développer normalement. Une étude par
«western-blot» n'a pas révélé de différence dans l'expression des aquaporines appartenant
aux familles PIP1 et PIP2 pour les deux variétés de blé et le colza. On peut donc supposer
 que la régulation des flux d'eau au travers des aquaporines ne se fait pas via une
régulation de la quantité d'aquaporines au sein des membranes mais plutôt via une
régulation fonctionnelle. En ce qui concerne la perméabilité osmotique, les espèces
étudiées réagissent de façon différente au stress hydrique: Pos diminue ou reste faible pour
les espèces résistantes alors qu’elle augmente pour les espèces sensibles. Mes résultats
suggèrent que les faibles valeurs de Pos des cellules racinaires constituent une adaptation
au stress hydrique. (Publication # 9).

Au cours de mon stage post-doctoral à San Diego, j’ai poursuivi l’étude des mécanismes
du transport de l'eau chez des plantes antisens d’Arabidopsis thaliana.

L'inhibition des aquaporines de la famille PIP2 ne suffit pas à induire de phénotype

apparent chez les plantes antisens. On peut bloquer à la fois les aquaporines PIP1 et PIP2
si on croise ces plantes avec l'une des lignées antisens de la famille PIP1. Dans ce cas, on
inhibe à priori 8 gènes d'aquaporines sur les 13 que compte le plasmalemme
d'Arabidopsis. Les analyses par «western blot» ont permis de vérifier que ces plantes
étaient bien antisens pour les deux familles de gènes PIP1 et PIP2. Lorsque ces plantes
sont normalement hydratées elles ont une croissance analogue à celle des plantes contrôle
en ce qui concerne la partie végétative. Cependant ces plantes fleurissent très lentement: 2
mois après plantation, moins de la moitié des plantes ont fleuri. En condition de stress, un
autre phénotype apparaît très rapidement: on observe un rougissement des feuilles lié à la
présence d'anthocyanes. Cependant, ce phénotype est également observé chez les
plantes issues du croisement parental Col - C24. La plus grande résistance au manque
d'eau de ces plantes s'explique probablement par leur délai dans la floraison. Les mesures
de Pos sur protoplastes isolés ont montré que les cellules des feuilles des doubles
sauvages gardaient une forte perméabilité à l'eau, ce qui n'est pas le cas du double
antisens qui, lui, présentait toujours de faibles Pos. L'absence, ou la non-fonctionnalité des
aquaporines PIP1 et PIP2, ne semblent donc pas nuire au développement de la plante
lorsque l'hydratation est suffisante. De même, nous avons pu montrer qu’à la suite d’un
déficit hydrique le double antisens récupérait moins vite que les plantes sauvages
lorsqu’elles étaient arrosées de nouveau (Publication # 10).

5.3. ETUDE DES EFFETS HORMONAUX: CAS DU BRASSINOLIDE ET DE L’ABA

Bien que leurs définitions ne soient pas aussi claires que celles établies dans le monde
animal, différents types d'hormones ont pu être mis en évidence chez les végétaux. Au
niveau membranaire, de nombreux travaux ont été réalisés pour mettre en évidence des
récepteurs hormonaux impliqués dans la transduction d'un signal. Au niveau des cellules
stomatiques, l'effet de l'acide abcissique a beaucoup été étudié, notamment par les
 techniques de patch clamp. Cependant on ne connaît pas de canal ionique dont
l’activité serait contrôlée de façon directe par un récepteur hormonal membranaire. En ce
qui concerne les propriétés de transport de l'eau, il a été observé que l'acide gibberéllique
permettant l’allongement cellulaire pourrait induire chez Arabidopsis thaliana la synthèse de
γ TIP et de PIP1b (Phillips et Huttly, 1994; Kaldenhoff et al., 1998) tandis que l’ABA
provoquerait l'induction de PIP1b (Kaldenhoff et al., 1998).
Au cours de ma thèse, dans le cadre d'une collaboration avec le laboratoire Androgenèse
et Biotechnologies d'Amiens, nous nous sommes intéressés à l'effet du brassinolide
(22(S),23(S)-homo-brassinolide). Ce produit n'est pas considéré aujourd'hui comme une
hormone car son rôle est pour l'instant mal défini bien qu'il soit impliqué dans l'élongation
cellulaire de mutants d'Arabidopsis thaliana. Ces mutants sont affectés dans la croissance
de leur hypocotyle qui reste de petite taille. Si au bout de 7 jours on transfère ces mutants
sur un milieu auquel on a ajouté du brassinolide, on observe en quelques jours une
augmentation de la taille des hypocotyles. Différents mutants, dont l'un est insensible au
brassinolide, ayant été mis à notre disposition, il paraissait intéressant de voir dans quelle
mesure ceux-ci pouvaient être affectés au niveau de leur perméabilité à l’eau.
Les Brassinostéroïdes sont des composés naturels impliqués dans la croissance des
plantes. Le brassinolide est le premier composé de cette famille a avoir été identifié, ce qui
a permis de mettre en évidence une similitude structurale avec les hormones stéroïdes
animales (Grove, 1979). Ces travaux ont montré que l'application exogène des
brassinolides pouvait entraîner un large spectre d'effets physiologiques: ils sont impliqués
par exemple dans la modulation de l'élongation de la tige ou encore dans la division
cellulaire des plantes (Mitchell et al., 1970). Ils interviendraient aussi dans la régulation de
l'expression de gènes impliqués dans la biosynthèse des parois (Wang et al., 1993; Zurek
et al., 1994; Zurek et Clouse, 1994) et dans la différentiation des vaisseaux du xylème
(Fukuda, 1997). De même ils entraîneraient une hyperpolarisation des membranes
cellulaires en agissant sur les ATPases (Cao et Chen, 1995). Enfin, il a pu être montré que
les brassinostéroïdes interagissaient avec les signaux de l'environnement comme la
lumière et la température (Russell, 1996; Wilen et al., 1995). Différentes voies de
biosynthèse du brassinolide ont pu être mises en évidence (Fujioka et al., 1995; Fujioka et
Sakurai, 1997). L'isolement et la caractérisation de mutants sensibles au brassinolide ont
ainsi permis de mieux cerner les effets de cette molécule. Les mutants isolés résultent
généralement de la lésion d'un gène codant une enzyme impliquée dans la chaîne de
biosynthèse du brassinolide. Le phénotype nain qui en découle pourra être restauré en
phénotype sauvage en ajoutant du brassinolide dans le milieu de culture. Chez Arabidopsis
thaliana, les mutants nains que l'on observe ne sont pas dus à une diminution du nombre
de cellules de l'hypocotyle, mais à une diminution de leur taille (Kauschmann et al., 1996).
Il a ainsi été mis en évidence que les mutants det (pour de etiolated) et cpd (pour
 constitutive photomorphogenesis and dwarfism) présentent un nanisme très prononcé,
avec des feuilles vert foncé, une fertilité mâle réduite, ainsi qu’une diminution de la
dominance apicale. Le mutant det2 ne présentant pas d’étiolement à l’obscurité, le gène
DET2 a une très forte homologie avec un gène codant une 5 α-réductase de mammifère
qui est une enzyme impliquée dans le métabolisme des stéroïdes (Li et al., 1996). L’apport
de brassinolide permet de restaurer le phénotype sauvage. La mutation correspondrait
donc a une déficience dans la synthèse du brassinolide.
En plus des caractéristiques citées pour det2, le mutant cpd présente une stérilité mâle
ainsi qu’une incapacité du grain de pollen à faire de l’élongation lors de la germination. Le
clonage du gène CPD a permis de montrer que celui-ci avait une homologie avec la
cytochrome P450 monooxygénase (Szekeres et al., 1996) et présentait aussi un domaine
homologue avec les stéroïdes hydroxylases. Le gène CPD coderait lui aussi pour une
enzyme impliquée dans la chaîne de biosynthèse du brassinolide.
Un autre mutant, bri1 (pour brassinolide insensitive) encore appelé cbb2 isolé par Clouse et
al., (1996) a pu être mis en évidence. Ce mutant présente un phénotype nain, des feuilles
vert foncé, une stérilité mâle, une dominance apicale réduite, et il garde le même
phénotype à l'obscurité. Il a pour caractéristique principale d’être insensible aux
brassinostéroïdes: l’apport de brassinolide dans le milieu de culture n'entraîne pas d’effet
sur l’élongation de l’hypocotyle et les pétioles du mutant bri1. Une analyse de la
ségrégation mendélienne de la descendance a permis de montrer que le gène muté
correspondait à un seul allèle récessif. L’analyse génétique laisse penser qu’un seul gène
serait affecté avec des effets pléiotropes qui conféreraient une insensibilité au brassinolide.
Mais il se pourrait aussi que cela soit dû à des mutations indépendantes dans des gènes
qui seraient très proches. L’effet de la mutation sur le développement suggère que le gène
BRI1 jouerait un rôle important dans la perception des brassinostéroïdes ou dans la
transduction des signaux. Ce mutant pourrait résulter de la lésion d’un gène codant un
récepteur hormonal ou des éléments participant à la transduction du signal (Clouse et
Sasse, 1998).
J’ai utilisé les mesures de Pos pour détecter des modifications de perméabilité membranaire
à l’eau chez des mutants nains d’Arabidopsis thaliana (cpd et bri1). Ces deux mutants ont
un hypocotyle très court et présentent une sensibilité variable au brassinolide. Chez le
mutant cpd, la taille de l'hypocotyle redevient comparable à celle de l’écotype sauvage C24
après quelques jours de culture en présence de brassinolide. Au contraire, après un
traitement analogue, la taille de l'hypocotyle du mutant bri1 ("brassinolide insensitive",
Kauschmann et al., 1996) demeure totalement inchangée. J’ai réalisé des mesures de Pos
sur les protoplastes d’hypocotyles de ces différents mutants. Les mesures de Pos sur
l’écotype sauvage C24 ont mis en évidence de fortes valeurs de Pos, indépendamment de
la présence du brassinolide. Par contre, les mutants cpd et bri1 présentaient toujours de
 faibles Pos en l’absence de brassinolide. Chez le mutant cpd, le passage sur un milieu
contenant du brassinolide a permis l’élongation de l'hypocotyle, des pétioles et des racines.
Il a également induit l’apparition de fortes valeurs de Pos parmi les protoplastes
d’hypocotyle. Pour le mutant bri1, qui est insensible au brassinolide, aucune élongation n’a
été observée et les valeurs de Pos mesurées sont restées faibles quelles que soient les
conditions de culture. Ces résultats montrent que le passage de l’eau à travers les
membranes des cellules de l’hypocotyle pourrait constituer une étape limitante dans le
transport de l’eau nécessaire à l'élongation cellulaire et à la croissance de la plante
(Publication # 4).

De même dans le cadre d’une collaboration avec l’Université de Besançon, nous avons
étudié l’implication possible des aquaporines dans le mouvement révolutif de la tige de
haricot. Les résultats obtenus suggèrent que le transport de l’eau au niveau des cellules de
l’épiderme se fasse principalement au travers de plasmodesmes. Au contraire, dans les
tissus sous-jacents en élongation, les aquaporines pourraient faciliter les mouvements
d’eau de cellule à cellule et donc la croissance de la tige (Publication # 3).

Dans le cadre de mon stage post-doctoral à San Diego je me suis également attaché à
étudier les mécanismes du transport de l'eau chez des mutants d’Arabidopsis thaliana
affectés dans la chaîne de biosynthèse de l’ABA.

L'acide abcissique (ABA) est une hormone clef dans la réponse des plantes au stress
hydrique. Depuis quelques années, la mise en évidence de mutants affectés dans la
chaîne de biosynthèse de l'ABA a permis de mieux comprendre la signalisation qui conduit
à l'ouverture ou à la fermeture des stomates (Leung et Giraudat, 1998; Schroeder et al.,
2001). En condition de stress hydrique la synthèse d'ABA, principalement au niveau
racinaire, induit la fermeture des stomates chez la plante sauvage, ce qui limite
l'évaporation et lui permet de s'adapter aux contraintes hydriques. La caractérisation des
mutants aba (Marin et al., 1996; )(auxotrophe) et abi (Koornneef et al., 1984) (insensible)
se révèle donc être un outil particulièrement intéressant pour étudier les flux d'eau dans la
plante.

Des mesures de Pos ont été réalisées sur des protoplastes de feuilles des mutants aba1,
abi1 et abi2. Les valeurs obtenues sont faibles si on les compare à celles du sauvage Ler.
Un traitement à l'ABA pendant 3h ou 24 h (mise en contact des racines avec une solution 1
µM ABA) provoque la fermeture des stomates et entraîne une augmentation de Pos pour le
sauvage et le mutant aba1. Au contraire les mutants abi1 et abi2 conservent leurs stomates
ouverts et présentent de faibles valeurs de Pos même après le traitement hormonal.
L'immunodétection par western blot a permis de montrer que le traitement à l'ABA
n'induisait pas d'augmentation de l'expression des aquaporines PIP1 et PIP2 chez les
mutants et le sauvage. L’incubation de feuilles excisées dans une solution ABA entraîne la
 fermeture des stomates chez l'écotype sauvage et le mutant aba1. Par contre, dans
ces mêmes conditions, aucune augmentation de Pos n'est observée. Des mesures de Pos
sur des protoplastes de plantes ayant poussé en forte humidité relative ont montré que la
perméabilité des cellules était augmentée chez le WT et les trois mutants. Ces résultats
nous ont amenés à proposer un modèle dans lequel la perméabilité cellulaire à l'eau des
cellules n'est pas régulée par l'ABA mais par le flux de transpiration dans la plante. Dans
notre modèle, les augmentations de flux d'eau trans-membranaire observées quand le flux
d'évaporation est diminué, devraient permettre l'osmorégulation des cellules du mesophylle
et le recyclage de l'eau dans le phloème (Publication # 7).

5.4 CARACTERISATION D'UNE AQUAGLYCEROPORINE CHEZ LE PIN

J’ai été amené à collaborer avec Vincent Ciavatta (Institut of Paper Science and
Technology, Atlanta) afin de caractériser une aquaglyceroporine chez des embryons de
pins. Nous avons pu montrer que cette porine transporte du glycérol et a de même une
activité aquaporine. (Publication # 8).

5.5 CARACTERISATION FONCTIONNELLE D'UNE AQUAPORINE CHEZ LE NOYER

Dans le cadre d'une collaboration avec Soulaiman Sakr et Jean Louis Julien (UMR 547
PIAF, Université Blaise Pascal, Clermont Ferrand) nous avons caractérisé du point de vue
fonctionnel une aquaporine de noyer qui est impliquée dans les phénomènes de réparation
de l'embolie hivernale (Publication # 11).

6 CONCLUSIONS

L’ensemble des travaux réalisés depuis le début des années 90 a fait évoluer de façon
considérable la vision in situ des flux d’eau. En effet, jusqu’alors, la présence de canaux à
eau au sein des membranes n’était pas nécessaire pour expliquer les flux d’eau chez les
êtres vivants. On a donc bien assisté à une forme de révolution conceptuelle où il fallait
accepter que des protéines présentes en très grande quantité au sein des membranes
puissent permettre des échanges d’eau extrêmement rapides sans que ceux ci ne
semblent être nécessaires aux équilibres d’osmorégulation cellulaires.

Aujourd’hui, l’étude du flux d'eau au travers des canaux à eau est considérée comme
particulièrement importante pour la compréhension des mécanismes régulant le statut
hydrique des êtres vivants et le prix Nobel décerné à Peter Agree en 2003 pour la
découverte des aquaporines en est la preuve.
 Bien que l’importance des aquaporines dans le transport de l’eau ait été beaucoup
discutée (Farinas et Verkman, 1996 ; Steudle et Peterson, 1998; Tyerman et al. 1999;
Maurel et Chrispeels, 2001; Johanson et al., 2001 ; Luu et Maurel, 2005), on ne sait
toujours pas quelles sont les implications exactes de ces protéines dans les différentes
voies du transport de l’eau. Cependant, on peut espérer qu’à plus long terme la
compréhension du fonctionnement des aquaporines et de leur régulation permettra d’ouvrir
des perspectives nouvelles dans les domaines de la biotechnologie (réabsorption de l’eau
au niveau des reins dans le cas du diabète insipide pour les êtres humains, tolérance au
stress hydrique pour les plantes par exemple).
Chapitre – II : « Tolérance des agrumes à la salinité »

Originaires du Sud-Est asiatique, les agrumes sont cultivés en Chine depuis plusieurs
millénaires (Praloran, 1971). Ils se seraient ensuite répandus au fil du temps, grâce aux
échanges commerciaux et aux invasions, sur les cinq continents, entre les 40° parallèles
Nord et Sud. Le cédratier (Citrus medica) serait le plus ancien agrume à avoir été importé
en Méditerranée. Aujourd’hui, le bassin méditerranéen est considéré comme le second
berceau d’implantation et de diffusion des agrumes. Les agrumes constituent la première
production fruitière mondiale avec 104 millions de tonnes (FAO, 2004) dont près de 60%
sont des oranges. L’agrumiculture, en constante expansion, reste localisée surtout aux
Amériques, avec le Brésil (20%) comme principal pays producteur, puis les Etats Unis
(16%) et la chine (10%), mais aussi à la plupart des pays du pourtour méditerranéen
comme l’Espagne et le Maroc (Food and Agriculture Organization of the United Nations
(F.A.O.), 2003). La France métropolitaine n’a qu’une production « lilliputienne »,
essentiellement localisée en Corse et tournée quasi exclusivement sur la clémentine.
De cette dispersion, la culture des agrumes est confrontée à de nombreuses contraintes
biotiques et abiotiques. La pérennité de l’agrumiculture est donc tributaire de l’emploi de
porte-greffe. Au XIXe siècle, les vergers d’agrumes furent décimés par l’apparition de
nouvelles maladies, issues de l’accroissement des échanges entre l’Europe et les
Amériques (par exemple le Citrus Tristeza Virus (CTV), la gommose (due à un
champignon), le Phytophthora sp., le Mal Secco lié à Deuterophoma tracheiphila…). En
1840, des porte-greffe d’agrumes résistants au Phytophthora sp ont été utilisés. Dès lors,
de nombreuses études ont été réalisées, montrant l’influence de l’association porte-greffe /
greffon en ce qui concerne leur comportement physiologique vis-à-vis des conditions
environnementales. Selon les espèces de porte-greffe utilisées en combinaison avec des
variétés d’intérêt, les effets peuvent être multiples et variés, et peuvent affecter
positivement ou négativement le rendement, la chute et le calibre des fruits, la résistance
au froid ou à la chaleur, la tolérance à la salinité, etc… Chaque variété interagit
différemment selon le porte-greffe, qui lui même réagit différemment en fonction des
conditions pédoclimatiques. Il est donc nécessaire de bien connaître les caractéristiques
des variétés de porte-greffe comme celles des greffons.

1. PHYLOGENIE DES AGRUMES

Les agrumes appartiennent à la famille des Rutacées qui comprend trois genres
botaniques sous la dénomination de Citrus, Poncirus et Fortunella. Il existe deux grandes
 classifications pour le genre Citrus : la classification de Swingle et Reece (1967)
constituée de 16 espèces, et la classification de Tanaka (1961) constituée de 156 espèces
comprenant de nombreux hybrides inter et intra spécifiques assimilés à des espèces à
parts entières. Le genre Poncirus est dit mono-spécifique car il inclut uniquement l’espèce
P. trifoliata, caractérisée par des feuilles caduques et trifoliées. Quant au genre Fortunella,
il réunit 4 espèces usuellement rassemblées sous le terme générique de « kumquats ».

2. LA SALINITE DES EAUX D’IRRIGATION : UNE PROBLEMATIQUE

MEDITERRANEENNE

Les agrumes se développent communément dans des régions où la salinité des eaux
d’irrigation est significativement élevée, comme c’est le cas dans de nombreux pays du
bassin méditerranéen (Espagne, pays du Maghreb, Turquie, Syrie, Israël etc…). Dans ces
pays, les effets néfastes du sel sur les vergers d’agrumes peuvent être observés suite à
l’analyse des pratiques d’irrigation. En effet, une mauvaise gestion des ressources en eau,
comme par exemple, une surirrigation combinée à l’utilisation d’eau saumâtre, entraîne des
baisses de rendement et de qualité sur la production. Il est donc nécessaire, à défaut de
pouvoir améliorer les pratiques d’irrigation et d’empêcher l’augmentation des teneurs en sel
des sols, de comprendre les mécanismes de résistance des agrumes à un stress salin et
de déterminer les meilleures associations possibles entre variétés et porte-greffe.

3. LE STRESS SALIN CHEZ LES AGRUMES

3.1. LES EFFETS DU STRESS SALIN CHEZ LES AGRUMES

Les agrumes sont généralement très sensibles au sel, mais il existe des différences de
comportements suivant les génotypes. Un stress salin génère deux phénomènes
singulièrement nocifs. Tout d’abord, une perte du potentiel hydrique du sol du fait de
l’augmentation de son pouvoir de rétention de l’eau. En effet, les nombreuses molécules de
sel interagissent électroniquement avec les molécules d’eau, ce qui les maintient
fermement dans le sol et entraîne de fait un stress hydrique chez la plante. En second lieu,
une accumulation d’ions toxiques, consécutive au stress hydrique, se propage dans les
parties aériennes (Munns, 1993). Les effets du stress salin se traduisent principalement par
des nécroses, dues à l'élévation de concentrations ioniques à des niveaux toxiques dans
les cellules des feuilles matures (Walker et al., 1983), allant jusqu’à l’abscission des feuilles
(Banuls et Primo-Millo, 1995), mais aussi par un ralentissement de la croissance, une
augmentation de la turgescence, une diminution de la respiration, de la photosynthèse, de
la conductance hydraulique des racines et de la conductance stomatique (Lloyd et al.,
 1990). Ces phénomènes sont consécutifs à la réaction de la plante et déterminent sa
capacité de résistance au stress.

3.2 LE ROLE PIVOT DE L’ACIDE ABSCISSIQUE

Le sel augmente le taux d’ABA et d’AminoCyclopropane-1-Carboxylic acid (ACC),

précurseur de l’éthylène, dans la tige et les racines des plants (Wolf et al., 1990), ainsi que
leur transport des racines vers les parties aériennes par le xylème (Gomez-Canedas et al.,
1996). L’ABA joue donc un rôle important dans la modulation de la réponse, intervenant
dans l’accumulation d’osmoprotectants, dans la fermeture des stomates et l’inhibition de la
croissance. Les plants d’agrumes s’adaptent par un réajustement osmotique, renforçant
leurs productions de proline (solutés compatibles), d’éthylène (phytohormone inhibitrice et
gaz produit dans toutes les parties de la plante, à rôle primordial pour la maturation des
fruits, la chute des organes caduques, la stimulation de la tubérisation et de la sénescence)
et d’ABA dans les racines, la sève et les feuilles, tout en soutenant l’accumulation d’ions Cl-
et Na+.

3.3. COMPORTEMENTS DE DIFFERENTS GENOTYPES FACE A UN STRESS SALIN

La résistance au sel de porte-greffe, comme le limetier Rangpur ou le mandarinier

Cléopâtre, est due à leur capacité à limiter l’accumulation des ions Cl- dans les feuilles.
D’autres porte-greffe, comme l’oranger trifolié, présentent une aptitude à restreindre le
transport de Na+ dans la tige lors de faibles salinités. La limitation du transport de la racine
à la tige des ions Cl- et Na+ est clairement identifiée comme caractère héréditaire chez les
agrumes. Les combinaisons variétés/porte-greffe permettent une modulation des
concentrations ioniques dans les feuilles, à la fois par la variété et par le porte-greffe,
même si l’influence de ce dernier est prépondérante. Chez les agrumes, la régulation des
ions Cl- dans les tissus foliaires semble être liée au processus de transport dans la racine,
à la capacité d’absorption dans le sol et au chargement dans le xylème. De même, la
faculté des porte-greffe, comme l’oranger trifolié, à limiter l’accumulation des Na+ dans les
feuilles semble être associée à une réabsorption des Na+ de la sève xylémique dans la
racine et la tige basale. L’importance des flux transpiratoires est également critique dans la
différenciation de génotypes plus résistants que d’autres au sel, notamment sur leur
tendance à accumuler les ions Cl- à de faibles taux ou non. (Storey et Walker, 1999).

3.4. TRANSPORT DU Cl-

Oppenheimer (1937) est le premier à avoir démontré l’influence des porte-greffe sur le
 comportement des agrumes exposés à un stress salin. Il a été proposé que la
tolérance des porte-greffe d’agrumes pouvait être classée en 3 groupes principaux (Zekri,
1987) : un groupe tolérant tels le Bigaradier et le Mandarinier Cléopâtre, un groupe
sensible tels le Rough lemon et le citrange Carrizo, puis un groupe très sensible tel le P.
trifoliata. Ces mêmes auteurs considèrent que le bigaradier et le mandarinier Cléopâtre
sont des excluants pour les ions chlorures (Cerdá et al., 1979).
Les porte-greffe, lorsqu’ils sont franc-de-pied, jouent un rôle majeur sur le niveau
d’accumulation foliaire de Cl-. Au contraire, peu de différences sur le niveau d’accumulation
ont été observées pour différents greffons sur un même porte-greffe (Behboudian et al,
1986). Toutefois, il est à noter qu’un effet du greffon sur l’accumulation du Cl- a pu être
observé dans le cas d’associations avec des porte-greffe sensibles aux Cl- (Lloyd et al.,
1989). D’une manière générale, les différents porte-greffe peuvent être classés comme
indiqué ci-après pour leur aptitude à induire l’accumulation des ions Cl- au niveau du
greffon : Mandarinier Cléopâtre < Bigaradier< citrange Carrizo < P. trifoliata.
Cette accumulation est linéaire et continue pour la plupart des porte-greffe (Grieve et
Walker, 1983). Les mécanismes intervenant dans la régulation du transport de Cl- sont peu
connus. Il a été déterminé que le limetier Rangpur possédait, au niveau de la racine, un
mécanisme d’exclusion efficace du Cl- (Storey, 1995) proche des halophytes « Plantago
media » (Erdei et al, 1980). De même, des changements de composants lipidiques aux
membranes des cellules de la racine contribuent à la régulation de la perméabilité
membranaire aux ions en conditions de stress salin.

3.5. TRANSPORT DU Na+

Lorsqu’un taux en sel, faible à modéré, est présent dans le sol, le Poncirus trifoliata a la
faculté de limiter l’accumulation de Na+ dans ses feuilles (Jacoby, 1964 ). Ainsi, Poncirus
Pomeroy est considéré comme peu sensible au Na+ (Elagazzar et al., 1965). Les
différences de concentrations en Na+ entre feuilles et racines, selon les combinaisons
greffon/porte-greffe, sont généralement moins fortes que celles observées pour le Cl-
(Bañuls et al., 1990). L’exclusion de Na+ semble dépendre de l’aptitude des cellules
parenchymateuses du xylème à se débarrasser du Na+ xylèmique pour le stocker dans les
tissus de la racine et de la tige (Walker, 1986) .

3.6. LES INTERACTIONS PORTE-GREFFE/GREFFON

De nombreux travaux ont été réalisés dans le but de caractériser les comportements
d’associations porte-greffe/greffon. En ce qui concerne le clémentinier greffé sur
mandarinier Cléopâtre, l’accumulation foliaire en Cl- était inférieure à celle des individus
 greffés sur citrange Troyer (Banuls et Primo Millo, 1995). Par ailleurs, l’accumulation
foliaire en Na+ chez le clémentinier greffé sur citrange Troyer est moindre que celle
observée dans le cas de l’oranger Navel.

4. POLYEMBRYONNIE ET PLOÏDIE
4.1. LA POLYEMBRYONNIE
La polyembryonnie résulte de l’apomixie partielle des agrumes (développement
d’embryons surnuméraires issus des tissus nucellaires du plant mère nécessitant une
fécondation) (Oliveira et al., 2003). L’embryon issu de la fécondation entre alors en
compétition avec les embryons nucellaires, réduisant d’autant plus ses chances de viabilité
que le nombre d’individus nucellaires est important. Ce caractère est essentiellement
intéressant pour l’obtention de populations génétiquement homogènes. En effet, des
individus d’intérêt, aux caractères avantageux, pourront être « clonés naturellement » et ce
phénomène pourra aussi être exploité dans le cadre expérimental. De plus, il est à noter
qu’en situation de stress salin, la ploïdie a un impact non négligeable sur la tolérance au
sel. De plus, il a pu être démontré dans le cadre des travaux menés au laboratoire que la
croissance des plants tétraploïdes pouvait être stimulée par un stress salin, ce qui n’était
pas le cas pour les plants diploïdes (travail réalisé dans le cadre de la thèse Basel Saleh).

4.2. LA PLOÏDIE

La polyploïdie est fréquemment rencontrée dans le règne végétal. Elle se caractérise par
une multiplication d’un facteur X du matériel génétique (soit Xn) de la plante, associant de
ce fait de nouvelles caractéristiques morphologiques et physiologiques. Alors que la famille
Rutaceae réunit des espèces diploïdes (2X), il est courant de rencontrer naturellement au
sein de mêmes espèces des individus tétraploïdes (4X), voire d’une polyploïdie supérieure,
et ce, avec des fréquences différentes. Ainsi, on a pu déterminer que le taux de
tétraploïdes chez les citranges Carrizo et Troyer et Poncirus pomeroy sont, respectivement
en 2003, de 9%, 8,1% et 5,4% (Medecin, 2003). Le phénomène de polyploïdisation peut
être dû à différents événements pouvant survenir au moment de la reproduction. Dans le
cas des triploïdes, ils peuvent être issus soit d’une fécondation spontanée d’un gamète
femelle non réduit et demeuré à l’état diploïde avec un gamète mâle haploïde, soit d’un
croisement entre un diploïde et un tétraploïde. En ce qui concerne les tétraploïdes, il s’agit
principalement d’individus ayant subi un doublement des tissus nourriciers de l’ovule, le
nucelle, ce qui implique qu’ils sont d’origine somatiques. Du fait d’une répartition
chromosomique mal équilibrée lors de la méiose, les individus triploïdes sont stériles et
développent des fruits de plus gros calibres, ce qui est un avantage de sélection certain.
Quant aux tétraploïdes, ils présentent généralement de faibles rendements et des fruits à
 peau épaisse, les rendant peu attractifs économiquement. Cependant, ces tétraploïdes
développent des qualités fort appréciables en tant que porte-greffe, et présentent
notamment une résistance accrue pour les stress abiotiques (Syvertsen et al., 2000).

5.THEMATIQUES DE RECHERCHE ABORDEES

5.1. CARACTERISATION PHYSIOLOGIQUE ET ECOPHYSIOLOGIQUE DE DIFFERENTES
COMBINAISONS DE PORTE-GREFFES / GREFFONS D’AGRUMES EN SITUATION DE
STRESS SALIN
5.1.1. INTRODUCTION

Chez les agrumes, la sensibilité au stress salin est principalement due aux ions chlorure
dont l’accumulation conduit à la défoliation, à la chute des fleurs, et au final, à une
diminution de la production de fruits. Différentes stratégies adaptatives ont pu être mises en
évidence chez les plantes comme par exemple l’exclusion des ions chlorure et sodium au
niveau racinaire (Banuls et al., 1990 ; Garcia-Agustin et Primo-Millo, 1995). D’autre part,
l’accumulation des ions sodium et chlorure au niveau vacuolaire dans les feuilles est une
autre stratégie adaptative permettant la détoxication mais également le maintien de
l’homéostasie cellulaire (Zhu, 2001 ; 2002). Chez les plantes modèles que sont Arabidopsis
thaliana et le riz, différents transporteurs et antiports pour les ions sodium impliqués dans
l’homéostasie cellulaire ont été clonés. La sur-expression de ces protéines canales a
permis d’accroître de façon considérable la tolérance au sel des plantes transformées par
rapport aux plantes témoins (Apse et al., 1999 ; Zhang et Blumwald, 2001 ; Shi et al.,
2003). La forte sensibilité des agrumes aux ions chlorure, contrairement à la plupart des
plantes où la sensibilité est due principalement au sodium, en fait un modèle de choix pour
l’étude du stress salin. De même, des études réalisées chez Arabidopsis thaliana et le maïs
ont montré que l’ajout d’un millimolaire de CaCl2 lors d’un stress salin en condition
hydroponique permettait de restaurer la croissance racinaire, et donc, de protéger la plante
contre les effets néfastes du sel au niveau cellulaire. En effet, l’ion calcium est un
messager secondaire très important qui est impliqué dans de nombreuses cascades de
régulation conduisant au contrôle de l’activité de différents transporteurs membranaire mais
également à la stabilisation des membranes (Ingram et Bartels, 1996). L’étude des
différents gènes décrits dans la littérature en ce qui concerne leurs rôles dans la protection
de la machinerie cellulaire et le maintien de l’homéostasie sera donc nécessaire.

Du point de vue écophysiologique, des études récentes, réalisées en Espagne, ont montré
l’existence d’une corrélation étroite entre le niveau d’ions chlorure absorbés et leur
translocation au niveau des feuilles avec le flux de transpiration au travers de la plante
(Moya et al., 2003). Les résultats obtenus tendent à démontrer que les génotypes qui
maintiennent une forte transpiration, et par là même, une forte absorption au niveau
 racinaire, présentent de fortes concentrations en sel au niveau des feuilles. Enfin,
l’activité photosynthétique au travers du photosystème II (PSII) est particulièrement
sensible aux stress oxydatifs (Maxwell et Johnson, 2000). La réalisation de mesures de
l’activité photosynthétique de plantes soumises à un stress salin devrait donc permettre de
renseigner leur sensibilité vis à vis du sel.

5.1.2. RESULTATS ET PERSPECTIVES

Au cours des trois dernières années, nous avons réalisé des études sur des porte-greffe
diploïdes et tétraploïdes (génotypes âgés de 4 à 6 mois) plus ou moins tolérants au stress
salin qui ont permis de montrer que les individus tétraploïdes sont plus tolérants au sel que
les individus diploïdes. De même, nous avons observé que pour les génotypes diploïdes
les plus tolérants au sel, les génotypes tétraploïdes correspondants voyaient leur
croissance accrue en situation de stress salin (travail de thèse de Basel Saleh, publication
en cours de rédaction). Il semble donc que pour ces individus, un stress salin modéré ait un
effet stimulant et donc, bénéfique (Figure. 2).

L’intégration à l’échelle de l’arbre des résultats obtenus au niveau cellulaire semble donc
absolument nécessaire pour appréhender les mécanismes de tolérance à la salinité.

De manière à analyser au niveau physiologique et écophysiologique le stress salin chez les

agrumes, nous envisageons d’étudier dans un premier temps l’effet du sel sur différentes
combinaisons de porte-greffe diploïdes greffés avec des greffons d’intérêt agronomique. Ce
travail sera complété dans les années à venir par une étude analogue des porte-greffe
tétraploïdes de manière à mieux comprendre le rôle de la ploïdie dans la tolérance au sel.
De même, nous souhaitons réaliser des mesures par fluorométrie de l’activité du PSII ce
qui devrait nous permettre de caractériser l’état de stress des plantes et peut-être de
discriminer les individus les plus prometteurs au sein de notre collection, mais également
nous aider au choix des géniteurs potentiellement intéressants pour la création variétale.
Parallèlement, nous poursuivrons cette année la caractérisation des génotypes tétraploïdes
à un stade précoce (4 à 6 mois) au niveau moléculaire et biochimique. A plus long terme
(nous disposons actuellement de différentes combinaisons d’arbres âgés de 4 ans élevés
en serre), nous envisageons d’étudier l’effet du sel (entre autres, sur la chute de feuilles et
des fleurs, le nombre de pousses feuillées initiées, et l’architecture) en fonction du moment
où est appliqué le stress salin, pendant la fructification des arbres.

5.2. IDENTIFICATION PAR EXPRESSION DIFFERENTIELLE DES GENES IMPLIQUES

DANS LA TOLERANCE AU SEL CHEZ LES AGRUMES ET EVALUATION DE L’EFFET
DE LA POLYPLOÏDISATION SUR L’EXPRESSION DE CES GENES

Différentes espèces et variétés de porte-greffe présentant un éventail de

comportements vis à du vis du sel, allant de la forte sensibilité à la tolérance, sont utilisés
 en agrumiculture. Cependant, les génotypes qui paraissent intéressants pour la
tolérance au sel et au déficit hydrique sont souvent très sensibles aux maladies comme par
exemple le mandarinier Cléopâtre. Une des nouvelles voies explorées pour créer de
nouveaux porte-greffe tolérants aux contraintes abiotiques et biotiques est de sommer les
caractères d’intérêts par fusion de cellules diploïdes de génotypes complémentaires
aboutissant à la genèse d’hybrides somatiques. Le Poncirus trifoliata est connu pour ses
résistances à la Tristeza (maladie virale), au Phytophthora et aux nématodes. En revanche,
ce porte-greffe très largement utilisé, est très sensible au sel et aux sols calcaires. D’autre
part, le mandarinier commun Willow Leaf (Citrus deliciosa) est lui, beaucoup plus tolérant
au sel et au calcaire, mais il s’avère être très sensible au Phytophtora, aux nématodes et à
la Tristeza. Un allotétraploïde combinant ces deux génotypes, créé par le CIRAD, le Flhor
AG1, présente des propriétés de tolérance vis à vis du sel et du calcaire, et une résistance
vis-à-vis du CTV (virus responsable de la Tristeza). Cet allotétraploïde est actuellement
évalué dans le cadre d’essais multi-locaux.

De manière à étudier la contribution de chacun des génomes parentaux dans la tolérance

au sel, il nous apparaît nécessaire d’entreprendre une étude de l’expression des gènes
chez le Flhor AG1, ses parents, et les autotétraploïdes respectifs suite à un stress salin. La
technique de cDNA AFLP développée depuis quelques années est tout à fait adaptée à ce
type d’étude. La technique consiste à partir des ARNm produits dans les différentes
conditions de culture par les différentes variétés sélectionnées, à étudier la présence ou
l’absence des ADNc. Ainsi, l’expression différentielle rendra compte des comportements
contrastés des génotypes vis à vis d’une condition de culture particulière (le stress salin en
première approche) et le séquençage des ADNc présents uniquement chez les génotypes
tolérants permettra d’isoler un petit nombre de gènes directement induits ou réprimés par le
stress. L’étude des profils d’expression de ces gènes chez le Flhor AG1 et chez ses
parents devrait également nous permettre de mieux comprendre la contribution de chacun
des gènes isolés dans la tolérance au sel.

Chez les agrumes, il existe très peu d’ESTs (Expressed Sequence Tags) disponibles qui
permettraient d’étudier les gènes déjà décrits dans la littérature sur le stress salin (et le
pourcentage d’homologie avec les espèces modèles est faible). Cette année, dans le cadre
du travail de Master recherche deuxième année de Wafa Mouhaya (et au cours de sa
thèse qui va démarrer en septembre 2005), nous proposons:

- d’étudier le comportement physiologique et écophysiologique du Flhor AG1, de ses

parents diploïdes et des autotétraploïdes respectifs (structure foliaire, taille des cellules,
nombre et densité des stomates, taille des espaces dans les parenchymes lacuneux, flux
de transpiration etc…)

- d’identifier des gènes impliqués dans les phénomènes de tolérance au sel.

 - de comparer les gènes isolés avec ceux déjà décrits chez les espèces modèles.

- de savoir quelles sont les contributions respectives de chacun de ces gènes dans la
tolérance au sel.

- de mieux connaître l’effet du doublement chromosomique sur l’expression de ces gènes

- de vérifier l’implication des gènes isolés au moyen de microfiltre (collaboration avec l’IVIA
de Valencia).

- de déterminer la régulation d’expression de ces gènes de tolérance chez les

allotétraploïdes.

5.3. ETUDE DES DETERMINANTS GENETIQUES DES CAROTENOÏDES DES

AGRUMES, FACTEURS DE LA QUALITE ORGANOLEPTIQUE NUTRITIONNELLE ET
HEDONISTE

Je suis également co-encadrant de la thèse de Anne-Laure Fanciullino. Le sujet de la

thèse a pour but de déterminer quelle est l’origine de la diversité de la coloration des
agrumes (coloration due à des pigments : les caroténoïdes). Trois objectifs principaux ont
été fixés :

-- Connaître les déterminants de la coloration des fruits, c'est-à-dire les déterminants de la

composition en caroténoïdes, par l’étude des facteurs génétiques et de l’impact de
l’environnement, ceci pour développer des stratégies optimales dans le cadre de
l’amélioration de la qualité des agrumes ;
-- Identifier des variétés à fort potentiel nutritionnel. Les caroténoïdes ont en effet diverses
fonctions biologiques importantes (provitamines A, antioxydants jouant un rôle dans la
prévention de certains cancers et des maladies cardiovasculaires) et constituent ainsi des
micro nutriments ;
-- Valoriser certaines variétés et un terroir par la détermination des teneurs en caroténoïdes
des agrumes produits en Corse.

5.4. SEQUENÇAGE DE COLLECTIONS D’EST D’AGRUME OBTENUES A PARTIR DE

DIFFERENTS ORGANES VEGETATIFS ET REPRODUCTEURS

Dans le cadre des appels d’offre Genoscope 2003, je suis coordinateur d’un projet que
nous avons monté avec nos collègues Espagnols (laboratoire du Dr. Talon) et du CIRAD
de Montpellier pour le séquençage de 37 000 EST d’agrume obtenues à partir de différents
organes végétatifs et reproducteurs. L’ensemble des clones a été séquencé. L’analyse
 bioinformatique a été faite (laboratoire de bio informatique de Montpellier, Xavier
Argout et laboratoire de bio informatique de l’IVIA, Javier Terol). Une publication est en
cours de rédaction.

Dans ce même projet, près de 1700 marqueurs microsatellites ESTs ont été identifiés.
Parmi eux, 52 marqueurs dans des gènes d’intérêt ont été étudiés dans le cadre d’un
travail réalisé avec François Luro de l’INRA de San Giuliano. Il a ainsi pu être montré que
45 de ces marqueurs microsatellites étient polymorphes, que dans 90% des cas ces
marqueurs étaient de type di et tri nucléotides et que dans près de 60% des cas, les
répétitions étaient de type TC/GA (Figure 3). Ces marqueurs microsatellites seront utiles
pour la réalisation d’une carte génétique dense du Clémentinier mais également pour le
positionnement des gènes sur la carte. Une autre publication est en cours de rédaction.

5.5. REALISATION D’UNE POPULATION F2 ISSUE DE L’AUTOFECONDATION D’UN

HYBRIDE PONCIRUS TRIFOLIATA / MANDARINER CLEOPATRE.

De manière à étudier la ségrégation des caractères de tolérance aux stress biotiques

(conférés par Poncirus trifoliata) d’une part, et aux stress abiotiques (conférés par le
mandarinier Cléopâtre) d’autre part, un dispositif a été mis en place au printemps 2004. Les
fruits (et donc les graines) d’un hybride F1 Poncirus trifoliata / mandarinier cléopâtre en
situation d’autofécondation ont été récupérés. La sélection des individus zygotiques après
culture in vitro des graines qui semblent monoembryonnées est en cours. La mise en place
au champ de ces plants (au minimum 150 individus) devrait nous permettre la réalisation
d’une carte génétique, d’étudier les caractères impliqués dans la tolérance aux facteurs
biotiques et abiotiques, et au final, de déterminer les gènes impliqués dans ces caractères
(Approche QTL).

5.6. SEQUENÇAGE DES EXTREMITES TERMINALES DE CLONES BACS D’AGRUME

EN VUE DE LA REALISATION D’UNE CARTE PHYSIQUE

Dans le cadre des appels d’offre Genoscope 2005, je suis coordinateur d’un projet en
partenariat avec nos collègues Français, Espagnols, Brésiliens, Nord-Américains et
Marocains. Le but du projet est de séquencer les extrémités terminales de clones issues de
trois banques BAC (40 000 clones, 80 000 lectures) de clémentinier. Par la suite, il sera
possible d’ancrer les clones sur une carte physique à l’aide de marqueurs microsatellites
de type SSR et microsatellites ESTs déjà positionnés sur une carte génétique (Projet
financé dans le cadre d’un financement Européen INCOMED). Pour cela un
« fingerprinting » va également être réalisé (Projet financé dans le cadre d’un projet
Européen INCOMED et de financements espagnols) ce qui permettra de choisir parmi les
 clones BAC les fragments chevauchants les moins redondants. Si ce projet
Genoscope est accepté il devrait ouvrir la voie au séquençage BAC à BAC du génome du
clémentinier (380 Mb).

5.7. CONCLUSIONS

Les projets de recherche que je développe aujourd’hui ont donc pour but de mieux
connaître quels sont les déterminants génétiques de la tolérance au sel chez les agrumes.
La connaissance du comportement physiologique et ecophysiologique des porte-greffe
franc de pied mais également greffés est donc fondamentale (INCOMED 2004). De même,
la mise en évidence de nouveaux gènes induits ou régulés permettant une tolérance
accrue sera nécessaire (Interreg IV A 2004). Pour cela, l’utilisation de filtre à haute densité
dans le cadre de collaborations avec nos collègues espagnols nous permettra d’étudier sur
différents génotypes l’impact de la ploïdie sur la tolérance au sel (Figure. 4). De même,
l’utilisation des microsatellites obtenues dans le cadre du projet Genoscpe 2003 nous
permettra de réaliser une carte génétique dense du Clémentinier (INCOMED 2004) . Enfin,
l’acceptation du projet Genoscope 2005, aujourd’hui en cours d’évaluation, qui vise à la
réalisation d’une carte physique du Clémentinier nous permettra de jeter les bases pour le
séquençage du génome, et au final, de pouvoir disposer de l’ensemble des gènes
permettant d’associer les résultats moléculaires et physiologiques de la tolérance au sel.

VI - PRINCIPALES PUBLICATIONS

Article 1

Ramahaleo T., Morillon R., Alexandre J., Lassalles J-P. Osmotic water permeability of
isolated protoplasts: modification during development.

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Article 2

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Planta (1999), 210: 80-84.

Article 4

Morillon R., Catterou M., Sangwan R.S., Sangwan B.S., Lassalles J-P. Brassinolide may
control aquaporin activities in Arabidopsis thaliana.

Planta (2001), 212: 199-204.

Article 7

Morillon R., Chrispeels M.J. The role of ABA and the transpiration stream in the regulation
of the osmotic water permeability of leaf cells.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001), 98: 14138-14143

Article 9

Morillon R., Lassalles J-P. Water deficit during root development: effects on the growth of
roots and osmotic water permeability of isolated root protoplasts.

Planta (2002), 214: 392-399.

Article 10

Martre P., Morillon R., Barrieu F., North G.B., Nobel P.S., Chrispeels M.J. Plasma
membrane aquaporins play a significant role during recovery from water deficit.

Plant Physiology (2002), 130: 2101-10.

Article 11

Sakr S., Alves G, Morillon R., Decourteix K., Guilliot A., Julien J-L., Chrispeels M.J. Plasma
Membrane Aquaporins are involved in winter embolism recovery in walnut tree.

Plant Physiology (2003), 133: 630-641.

VII - BIBLIOGRAPHIE

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