Diagnostic des
opportunistes :
I) Les cryptospridium:
Coloration de Ziehl Nielsen modifié par Henriksen et Pohlenz
:
Cette coloration est indispensable pour mettre en évidence les oocystes
de cryptospridium.
1- Réactifs :
- Carbolfuchine :
· Solution A
Fuchsine basique 1g.
Ethanol à 95% 1ml.
Dissoudre en broyant dans un mortier.
· Solution B
Phénol cristallisé 5g
Eau distillée 100ml
Mélanger les solutions A et B laisser reposer pendant 8jours filtrer et
conserver à température ambiante.
· Bleu de méthylène
Bleu de méthylène 0.3g
Eau distillée 100ml
Une fois mélanger filtrer et garder au frais à l’abri de la lumière.
- Acide sulfurique à 5%.
2- Technique :
- Fixer le frottis mince des fèces par le méthanol.
- Colorer pendant une heure par la solution de fuschine.
- Rincer rapidement à l’eau du robinet.
- Différencier pendant 30 secondes par l’acide sulfurique.
- Rincer et contre colorer au bleu de méthylène pendant une minute ou
au vert de malachite à 5% pendant cinq minutes.
- Rincer et examiner à l’immersion.
II) Les microsporidies :
a) Coloration au trichrome de Weber :
Cette technique de coloration est utilisée pour la recherche des
microsporidies dans des biopsies ou des selles.
Elle permet de confirmer la technique de Van Gool.
1- Réactifs :
- Colorant de Weber.
· Chromo trope 2R 6g.
· Fast green 0.6g.
· Acide phosphotungstique 1.4g.
Ajouter 3ml d’acide acétique glacial, laisser reposer 30mn à l’abri de la
lumière, ajouter progressivement 100 ml d’eau distillée et déposer la
préparation sur un agitateur magnétique pendant 15mn.
- Alcool acide 90°
Enlever 100ml à 1litre d’alcool éthylique absolu et remplacer par 100ml
d’eau distillées. Enlever de ce mélange 4,5 ml et remplacer par 4.5ml
d’acide acétique.
- Ethanol à 95°
2- Technique :
- A partir d’un culot de selles concentré par la technique de Ritchie,
filtrer le mélange selles formole à 10% sur un filtre à 50 microns, ajouter
l’éther au 1/3 et agiter.
- Centrifuger, jeter le surnageant.
- Reprendre le culot dans du PBS et agiter.
- Déposer 10 microlitres de suspension de selles sur une lame.
- Laisser sécher les lames à l’étuve.
La solution colorante est chauffée préalablement pendant deux heures à
50C° à l’étuve et doit être maintenue à cette température pendant toute
la coloration.
- Plonger les lames pendant 10mn dans le colorant (qui se trouve dans
l’étuve à 50C°).
- Différencier 10 secondes dans un bac d’alcool acide en agitant
légèrement.
- Rincer rapidement à l’éthanal à 95°, le jeter.
- Plonger 5mn dans un second bac d’éthanol à 95°.
- Laisser sécher les lames et observer à l’objectif 100 à immersion les
spores seront colorées en rouge fuchsia sur fond vert, de forme ovoïde
avec une vacuole excentrée.
· Pour les biopsies, réaliser des empreintes sur des lames.
III) Le pneumocytis carinii
Prélèvement : (LBA lavage broncho-pulmonaire)
Cet examen est pratiqué devant des troubles pulmonaires aigues ou
insidieux, accompagnés de fièvres non expliquée chez les
immunodéprimés.
Technique :
On utilise 4 à 6 instillations de 20 à 50 ml de soluté physiologique selon
l’état d’hypoxémie du patient. Les aliquotes sont respirés (rendement 30
à 70%) éventuellement mélangées et adressés immédiatement en flacons
de plastiques stériles. Aux différents laboratoires dont le laboratoire de
parasitologie et mycologie.
Le diagnostic doit être établi immédiatement.
La recherche de trophozoites et des kystes de P. carinii
Il existe plusieurs techniques possibles pour colorer les gouttes de culot
étalé ou les spots et qui permettent la mise en évidence de trophozoites
et des kystes de pneumocytis carinii. Les kystes ont une taille de 3 à 5µm
avec une paroi épaisse.
· Coloration par le Giemsa :
- Fixation au méthanol 2mn.
- Colorer au Giemsa à 10% 15 à 20 minutes.
- Rincer et sécher.
- Observer la totalité de la préparation au grossissement 100.
Lecture :
Les trophozoites de P carinii apparaissent groupés, colorés en bleu avec
un noyau et forment des amas de taille variable. On peut éventuellement
voir les kystes qui contiennent un ou plusieurs corps intra kystiques.
Coloration en bleu de toluidine O :
a) Réactifs
- Réaction de sulfatation (R1).
Verser doucement 20ml d’acide sulfurique dans 60ml d’acide acétique
pur.
bien mélanger.
- Solution de bleu de toluidine O (R2)
· Dissoudre 0.3g de BTO (sigma toluidine bleu O) dans 60ml d’eau
distillée.
· Ajouter 2ml d’acide chlorhydrique concentré, puis 140ml d’éthanol
absolu.
· Ethanol à 95° (éthanol absolu 200ml + eau distillée 13ml
Ethanol ou méthanol absolu).
