14

TP6

DOSAGE DES PROTÉINES TOTALES

I. Principe :

En milieu alcalin, les ions cuivriques donnent avec les liaisons peptidiques un complexe de
coloration violet-pourpre. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration des
protéines. Cette coloration est mesurée par spectrophotométrie en lumière visible. C’est une
méthode simple, rapide et fiable mais peu sensible.

II. COMPOSITION

A. Réactif acétate de cuivre (II) 6 mmol/L, iodure de potassium 12 mmol/L, hydroxide de sodium
1,15 mol/L, détergent.
S. Étalon de Protéine. Albumine bovine. La concentration est indiquée sur l’étiquette du flacon.
III. CONSERVATION

Réactif (A) : Conserver à 2-30ºC.

Étalon de protéine (S): Conserver à 2-30ºC,
Après ouverture. Réactif et étalon resteront stables jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette. Bien
refermer les flacons et éviter toute contamination lors de l'utilisation. Indications de dégradation: 
Réactifs: Présence de particules, turbidité, absorbance du blanc supérieure à 0,150 at 545 nm. 
Étalon : Présence de particules, turbidité.
IV. PRÉPARATION DES RÉACTIFS

Réactif (A) et Étalon (S) sont prêts à l'emploi.

V. MATÉRIEL

 Tubes à essai
 Portoir
 Micropipette et pipettes
 Bain thermostaté à 37ºC
 Spectrophotomètre pour lectures à 545  20 nm

VI. ÉCHANTILLONS

Sérum, plasma hépariné collecté par procédures normalisées. Stable 4 semaines à 4-8ºC2. Les
anticoagulants autres que l’héparine ne doivent pas être utilisés.
VII. PROCÉDURE

1. Pipeter dans des tubes à essais :

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Blanc réactif Étalon Echantillon

Eau distillée 20 µL

Étalon (S) 20 µL
Échantillon 20 µL
Réactif (A) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml

2. Bien agiter et incuber les tubes pendant 10 minutes à température ambiante.

3. Lire l’absorbance (A) de l’Étalon et de l’Échantillon face au Blanc à 545 nm. La couleur
est stable au moins 2 heures.

VIII. CALCULS

La concentration en protéine de l'échantillon est calculée selon la formule suivante :

IX. VALEURS DE REFERENCE

Sérum, adulte :
Ambulatoire 64-83 g/L
Alité 60-78 g/L
La concentration est plus basse chez l’enfant. La concentration plasmatique de protéine totale est
de 2 à 4 g/l plus élevée, due à la présence de fibrinogène et de trace d’autres protéines3. Ces
valeurs ne sont données qu’à titre indicatif. Chaque laboratoire doit établir ses propres valeurs de
référence.

X. CARACTÉRISTIQUES MÉTROLOGIQUES

 Limite de détection : 4,6 g/L

 Limite de linéarité : 150 g/L Pour des valeurs supérieures diluer l'échantillon au 1/2 en
eau distillée et répéter l’essai.
 16

TP

Dosage de l’albumine
I. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

L'albumine présente dans l'échantillon réagit avec le vert de bromocrésol en milieu acide, en
donnant lieu à un complexe coloré quantifiable par spectrophotométrie.

II. COMPOSITION

A. Réactif : Tampon acétate 100 mmol/L, vert de bromocresol 0,27 mmol/L, detergent, pH 4,1.
ATTENTION : H317: Peut provoquer une allergie cutanée. P261: Éviter de respirer les
poussières/fumées/gaz/brouillards/vapeurs/ aérosols. P280: Porter des gants de protection/des
vêtements de protection/un équipement de protection des yeux/du visage. P302+P352: EN CAS
DE CONTACT AVEC LA PEAU: Laver abondamment à l’eau et au savon. P333+P313: En cas
d’irritation ou d'éruption cutanée: Consulter un médecin. P362: Enlever les vêtements contaminés
et les laver avant réutilisation
S. Étalon Albumine : Albumine bovine. La concentration est indiquée sur l'étiquette du flacon. La
valeur de concentration est traçable au Standard Reference Material 927 (National Institute of
Standards and Technology, USA

III. STOCKAGE ET STABILITÉ

Stocker à 2-8 ºC. Une fois ouverts, les composants sont stables jusqu'à la date de péremption
marquée sur l'étiquette s'ils se stockent parfaitement fermés et que l'on prend soin d'éviter la
contamination pendant leur usage. Sur la stabilité dans table : Les réactifs ouverts et conservés
dans le compartiment réfrigéré de l'analyseur sont stables 2 mois. Indications de dégradation :
 Réactifs : Présence de particules, turbidité, absorbance du blanc supérieure à 0,200 à 630 nm
(cuvette de 1 cm).
 Étalon : Présence de particules, turbidité.

IV. PRÉPARATION DE RÉACTIFS

Réactif (A) et Étalon (S) sont prêts à l'emploi.

V. MATÉRIEL

 Tubes à essai
 Portoir
 Micropipette et pipettes
 Bain thermostaté à 37ºC
 Spectrophotomètre pour lectures à 630  20 nm

VI. ÉCHANTILLONS
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Sérum ou plasma (EDTA, héparine ou citrate) recueilli par des processus standard. L’albumine
dans le sérum est stable 3 jours à 2-8ºC

VII. PROCÉDURE

1. Pipeter dans des tubes à essais :

Blanc réactif Étalon Échantillon

Eau distillée 20 µL

Etalon (S) 20 µL
Échantillon 20 µL
Réactif (A) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml

 Bien agiter et incuber les tubes pendant 1 minute à température ambiante.

 Lire l’absorbance (A) de l’Etalon et de l’Echantillon contre le Blanc à 630 nm. La couleur
est stable au moins 30 minutes.

VIII. CALCULS

La concentration en albumine de l'échantillon est calculée selon la formule suivante :

IX. VALEURS DE RÉFÉRENCE

Sérum et plasma :
Nouveau-né, 2 à 4 jours 28-44 g/L
4 jours à 14 ans 38-54 g/L
Adulte 35-52 g/L > 60 ans 32-46 g/L

X. CARACTÉRISTIQUES MÉTROLOGIQUES

 Limite de détection : 1,43 g/L. Limite de quantification : 3,72 g/L.

 Limite de linéarité : 70 g/L. Intervalle de mesure : 3,72 - 70 g/L.
Pour des échantillons avec des valeurs supérieures, diluer manuellement

TP
 18

RECHERCHE DES PROTÉINES DANS LES URINES

I. INTRODUCTION

La recherche doit être réalisée avant chaque dosage de protéines urinaires. Elle peut se faire,
soit par la réaction de Heller, soit par thermo-coagulation acétique. Ces deux techniques sont
aujourd'hui dépassées et sont remplacées par une technique rapide et fiable utilisant les
bandelettes réactives.

II. ÉCHANTILLON

On travaille sur les urines de 24 heures ou à défaut sur une émission fraîche.

III. TECHNIQUES DE RECHERCHE

1. RÉACTION DE HELLER

a) PRINCIPE

Dans le cas d'une protéinurie vrai, l'acide nitrique concentré réagit, à froid, sur les protéines
en donnant un anneau blanc à la zone de contact avec l'urine. Les glycoprotéines, appelées
pseudo-albumine, donnent un léger trouble nuage au-dessus de la-zone de contact de l’acide

nitrique avec l’urine.

b) RÉACTIFS

 Solution de permanganate de potassium à 20 g/l :

o Permanganate de potassium KMn04 2g
o Eau distillée 100 ml

 Eau oxygénée à 12 volumes :

o Eau oxygénée à 12 volumes 12 ml

o Eau distillée 100 ml
 Acide nitrique concentré.
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c) MATÉRIEL
 Tubes à essai
 Verre à pied
 Pipettes graduées de I ml
 Pipette jaugée de 5 ml
 Pipette graduée de 20 ml ou éprouvette de 20 ml
 Entonnoir avec support et papier filtre plissé
 Becher ou erlenmeyer de 50 ml.

d) MODE OPÉRATOIRE

L'urine doit être limpide. Si elle est trouble on la clarifie soit par :
 Filtration
 Centrifugation,
 Méthode chimique (procédé de Zottier).

 CLARIFICATION DE L'URINE PAR LE PROCÉDÉ DE ZOTTIER

Ne pratiquer cette méthode que si la filtration ou la centrifugation de l'urine trouble s'est
révélée inefficace
Pour clarifier l'urine par ce procédé, on opère comme suit :
Dans un verre à pied, introduire
o Urine à clarifier 20 ml
o Solution de KMnO4 à 20 g /l 10 goutes
Agiter à l'aide d'un agitateur. Laisser agir I minute et ajouter :
o Eau oxygénée à 12 volumes 5 gouttes.
Agiter et laisser agir 5 minutes
Filtrer sur papier filtre plissé en recueillant le filtrat limpide dans un bêcher identifier par le
numéro de l'urine

e) RECHERCHE

 Mettre dans un tube à essai 5 ml d'urine limpide,

 Prélever 0,6 ml d'acide nitrique concentré à l'aide d'une pipette graduée de I ml
 N'ajouter que 0,4 ml tout en plongeant la pointe de la pipette au fond du tube et en
évitant le mélange de l'acide nitrique avec l'urine dans la partie superficielle.
 Attendre une minute et observer le tube sur fond noir, en ayant une bonne source de
lumière derrière soi.

f) RÉSULTATS

DESCRIPTIONS RÉSULTATS
Présence de protéines
Présence d'un disque blanc mince et net sans
diffusion la zone de contact acide-urine
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Pas de disque blanc mais présence de nuage Absence de protéines et présence de

au-dessus de la zone de contact acide-urine. pseudo-protéines

Présence de disque blanc dans la zone de Présence de protéines et de pseudo

contact acide-urine et nuage au-dessus. protéines

Pas de disque blanc. et ni nuage dans la zone Absence de protéines et de pseudo

de contact acide-urine. protéine

2. THERMO-COAGULATION ACÉTIQUE

a) PRINCIPE

Les protéines contenues dans l'urine sont précipitées par la chaleur en milieu faiblement acide
et en présence d'un excès d'électrolytes (Na Cl ou Na2S04).

b) RÉACTIFS

Chlorure de sodium cristallisé.

Solution d'acide acétique à 10 % (V/V)
 Acide acétique concentré I ml
 Eau distillée 1 0 ml

c) MATÉRIEL

Bec de gaz Tube à essai thermorésistant / Pince en bois pour tube à essai / Pipette de 10 ml

d) MODE OPÉRATOIRE

Introduire dans un tube essai.

 Urine limpide 10 ml
 Chlorure de sodium 0 ,5 g (pointe de spatule)
 Acide acétique à 10% 5 gouttes

Bien agiter et filtrer-si nécessaire,

Chauffer la partie supérieure du tube à essai en le tenant à l'aide d'une pince en bois et
sans agiter jusqu’à ébullition.
En observant le tube sur fond noir. Comparer la phase chauffée de l’urine à celle se trouvant à
la partie inférieure.
• durant l'opération de chauffage et de lecture de la réaction, te tube doit être maintenu incliné.
(45°)

e) RÉSULTAT

 Présence de protéines lorsqu'il y a apparition d'un trouble blanc en forme de nuage ou

en forme de flocon dans la partie chauffée de l'urine, tandis que la partie non chauffée
reste limpide.
 Absence de protéines lorsqu'il n'y a pas de trouble.
 21

NB • Si un nuage floconneux, d'apparence plus ou moins laiteuse, apparaît vers 60°C et disparaît
à l'ébullition puis réapparaît à froid, il peut s'agir de la protéine thérmo-soluble de Bence Jones.

3. BANDELETTES RÉACTIVES

a) PRINCIPE

Certains indicateurs colorés de pH tel que le bleu de tétrabromophénol à pH fixé par un

système tampon, réagissent avec les protéines, en donnant une coloration plus ou moins intense
suivant la concentration des protéines dans l'urine à analyser. Les bandelettes réactives utilisées
pour la recherche de protéines urinaires sont imprégnées d'un indicateur de pH dans un tampon
citrate.
La présence de protéines se traduit par un changement de coloration au niveau de la zone
réactive de la bandelette.

b) RÉACTIFS

Bandelettes réactives

c) MODE OPÉRATOIRE

Verser un volume d'urine dans un verre à pied,

Repérer sur la bandelette la zone réactive réservée aux protéines en se référant à l'échelle
des couleurs mentionnée sur le flacon,
Tremper la bandelette dans l'urine et la sortir en la secouant pour éliminer l'excès d'urine,
Faire la lecture, en respectant le temps de réaction, puis comparer la coloration obtenue
avec l'échelle des couleurs représentée sur le flacon.

d) RÉSULTAT

Observer la zone réactive de la bandelette

Pas de changement de coloration, la recherche est négative, on note : absence de
protéines.
> Changement de coloration, la recherche est positive, on note : présence de protéines.
Selon l'intensité de coloration, le résultat peut varier de l'état de traces, à un + , ++ ou
Dans le cas où la recherche est positive, pratiquer systématiquement le dosage, de
préférence sur les urines de 24 heure.

IV. VALEUR PHYSIOLOGIQUE

L'urine normale renferme de très faibles quantités de protéines, environ 20 à 30 mg/l qu'on
considère comme une protéinurie physiologique et que les réactions habituelles ne décèlent pas.

V. CAUSES D'ERREURS

Ces causes d'erreurs sont souvent rencontrées dans la recherches des protéines urinaires par
méthodes chimiques
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La présence du sang d'origines diverses (urètre, vessie, rein, des règles) peut interférer
dans la recherche,
La présence de pus entraîne souvent, mais pas toujours, des réactions positives,
L. 'urine doit avoir à l'émission une réaction acide ou neutre. Si la réaction est alcaline, la
recherche des protéines est le plus souvent illusoire. En effet, il s'agit souvent d'urine ayant
subi, dans une vessie infectée, une fermentation ammoniacale,
Certains médicaments, en particulier les contrastants iodés employés en radiologie
polvvinyloyrrolidone , peuvent précipiter en milieu acide à froid ou à chaud
 23

TP
DOSAGE DE LA PROTÉINURIE ROUGE DE PYROGALLOL
I. PRINCIPE DE LA MÉTHODE

La protéine présente dans l’échantillon réagit avec le rouge de pyrogallol et le

molybdate en milieu acide pour former un complexe coloré quantifiable par
spectrophotométrie.

II. COMPOSITION

A. Réactif. Rouge de pyrogallol 60 mol/L, molybdate de sodium 40 mol/L,

succinate 50 mmol/L, pH 2,3, détergent.: Stocker dans un endroit bien ventilé. Tenir
au frais.
S. Etalon de Protéine (Urines). Albumine bovine . La concentration est indiquée sur
l’étiquette du flacon

III. CONSERVATION

A. Réactif: Conserver à 15-30ºC.

S. Etalon de protéine (urine): Conserver à 2-30ºC,après ouverture. Réactif et étalon
resteront stables jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette. Bien refermer les flacons et
éviter toute contamination lors de l'utilisation. Indications de deterioration: − Réactifs:
Présence de particules, turbidité, absorbance du blanc supérieure à 0,150 at 600 nm.
− Etalon: Présence de particules, turbidité.

IV. PRÉPARATION DES RÉACTIFS

Réactif (A) et Étalon sont prêts à l'emploi.

V. ÉQUIPEMENT SUPPLÉMENTAIRE

VI. MATÉRIEL
 Tubes à essai
 Portoir
 Micropipette et pipettes
 Bain thermostaté à 37ºC
 Spectrophotomètre pour lectures à 545  20 nm à 600  10 nm

VII. ÉCHANTILLONS

Urines recueillies par procédures normalisées. Mesurer le volume et conserver à 2-

8ºC. Stable 7 jours à 4-8ºC3. Liquide céphalorachidien (LCR) collecté par des
procédures standards. Ne pas utiliser d'échantillons contenant du sang. Stable 6
jours à 4-8ºC3.

VIII. PROCÉDURE

1. Pipeter dans des tubes à essais : (Notes 1, 2)

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Blanc Étalon Échantillon

réactif
Eau distillée 20 µL

Étalon (S) 20 µL
Échantillon 20 µL
Réactif (A) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
2. Bien agiter et incuber les tubes pendant 10 minutes à 37ºC.
3. Lire l’absorbance (A) de l’Étalon et de l’Échantillon contre le Blanc à 600 nm.
La couleur est stable 30 minutes.

IX. CALCULS
La concentration en protéine de l'échantillon est calculée selon la formule suivante

A échantillon X cc de l’étalon en mg/l X diurèse en l/24h = cc échantillon en mg/24h

A étalon

X. VALEURS DE REFERENCE

Urines : Inférieur à 150 mg/24-h

Liquide céphalorachidien : Enfants : 300-1000 mg/L
Adultes : 150-450 mg/L

XI. CARACTÉRISTIQUES MÉTROLOGIQUES

− Limite de détection : 26,0 mg/L.

− Limite de linéarité : 2000 mg/L
. Pour des valeurs supérieures diluer l'échantillon au 1/2 en eau distillée et répéter
l’essai.