REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES

Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de

MASTER ACADEMIQUE

Domaine : Sciences de la nature et de la vie.

Filière : Biologie.

Spécialité : Microbiologie.Appliquée.

Présente par : BACHOUCHE Hamida

YAGOUBI Ibtissam

Thème
Production et extraction d’antibiotiques à partir d’une
souche d’actinobactéries AHO23 (Saccharothrix sp.)

Soutenu le : 30/09/2020
Devant le jury :
BEN AISSA Atika MCA Présidente UKM Ouargla

BOURICHA Mhamed MAA Examinateur UKM Ouargla

SAADI Sid Ahmed MAA Encadreur UKM Ouargla

BELDI Nadia MCB Co-promotrice UKM Ouargla

Année universitaire : 2019/2020

 Remerciements
Au terme de ce modeste mémoire, nous tenons tout d’abord à remercier Allah, qui
nous a donné la force et la volonté pour arriver au bout de nos études.
Hommage à notre cher Professeur SABAOU Nasserdine «le père des
actinobactéries», connu par ses très grandes qualités humaines et scientifiques. Sa rencontre a
été une aubaine, qui nous a permis de bénéficier de ses conseils avisés et ses encouragements.
Que son âme repose en paix dans le paradis d’ALLAH.
Nous tenons à exprimer notre profonde gratitude à notre encadreur Monsieur SAADI
Sid Ahmed maître assistant A de université KASDI Merbah Ouargla pour ses aides, sa
disponibilité, ses orientations fructueuses, et pour avoir mis à notre disposition les ressources
nécessaires à la réalisation de ce thème.
Nous adressons à notre Co-promotrice, Mlle BELDI Nadia maître de conférences B à
UKM Ouargla nos remerciements pour ses conseils et sa gentillesse.
Nos gratitudes s’adressent aux membres du jury :
Madame BENAISSA Atika maître de conférences A à UKM Ouargla qui nous fait l’honneur
de présider notre jury.
Monsieur BOURICHA Mhamed maître assistant A á UKM Ouargla pour avoir ménagé son
temps afin d’examiner ce travail.
Nous tenons à exprimer nos remerciements à tout le personnel du laboratoire de
LBSM de Kouba Alger, en particulier Mme YAICHE ACHOUR Hafsa, Mme YOUSFI
Kheira, M TOUMATIA Omrane, ainsi que notre chère collègue TITOUAH Nour el
houda et à tous les membres du Laboratoire LBSM, pour leur disponibilité, leurs conseils
scientifiques et leur sympathie.
Nous remercions chaleureusement notre chère amie, collègue et sœur KHERRAZ
Assia pour sa collaboration et son soutien moral.
Nous ne manquons pas de remercier profondément tous les enseignants qui ont
contribué à nous transmettre l’inestimable trésor qui est le savoir.
Enfin, Nous remercions toute personne ayant contribué de près ou de loin à la
réalisation de ce modeste travail.
 Dédicace
C’est avec un immense plaisir que je dédie ce modeste travail :
Á L’ÉSPRIT DE L’HOMME QUI MARQUERA Á JAMAIS MA VIE, MON GRAND
PÉRE PATERNEL : LE PIONNIER DE LA PHILOSOPHIE EN ALGERIE PROFESSEUR
MAHMOUD YAGOUBI
Qui a été mon modèle et mon inspiration depuis toujours et qui a toujours aimé de voir ses
enfants gravir les échelons de la connaissance. Que son âme repose en paix dans le paradis
d’ALLAH.
Á MA TRÈS CHÈRE MÈRE : SOUFFI Nadjat
Autant de phrases aussi expressives soient-elles ne sauraient montrer le degré d’amour et
d’affection que j’éprouve pour toi. Tu m’as comblé avec ta tendresse et encouragements tout
au long des années de mes études.

Á MON TRÈS CHER PÈRE : Mohammed Arabi

L’épaule solide, l’œil attentif compréhensif et la personne la plus digne de mon estime et de
mon respect. Aucune dédicace ne saurait exprimer mes sentiments.

Á MES TRES CHERS GRAND-PERE, GRAND-MERE MATERNELLE ET GRAND-

MERE PATERNELLE
Que ce modeste travail, soit l’expression des vœux que vous n’avez cessé de formuler dans
vos prières. Puisse le tout puissant vous donner santé, bonheur et longue vie.

Á MON FRERE Aymen, qui m’a sorti du stress avec sa joie.

Á MON CHER ONCLE Youcef, qui a tout fait pour me voir la plus performante possible,
autant de phrases aussi éloquentes soient-elles ne sauraient exprimer ma reconnaissance.
Á MES TRES CHERES TANTES Khadidja, Wassima et Karima qui ont toujours été en
soutien quand j’en avais besoin.
Á MES CHERS ONCLES, on particulier mon oncle Yasser et sa femme Zahra qui a été une
grande sœur pour moi.
Á MA CHERE BINOME ET SŒUR, Hamida.
Á MES CHERES COUSINES, en particulier ma petite Razouna.
Et finalement à ma sœur de cœur Amina, et à mes amies Bessma, Iman, Hadjer, Roufida et
Lina.

Ibtissam
 Dédicace
Je tiens a dédié avec un grand plaisir ce modeste travail :
Á MA CHÉRE MÉRE : MECHACHE Louiza
Tu m’as donné la vie, la tendresse et le courage pour réussir. Tout ce que je peux t’offrir ne
pourra exprimer l’amour et la reconnaissance que je te porte. Je t’offre ce modeste travail
pour te remercier pour tes sacrifices et l’affection dont tu m’as toujours entourée.
Á MON CHER PRÉRE : BACHOUCHE Aissa
Tu as su m’inculquer le sens de la responsabilité, de l’optimisme et de la confiance en soi face
aux difficultés de la vie. Tes conseils ont toujours guidé mes pas vers la réussite. Ta patience
sans fin, ta compréhension et ton encouragement sont pour moi le soutien indispensable que
tu as toujours su m’apporter. Je te dois ce que je suis aujourd’hui et ce que je serai demain et
je ferai toujours de mon mieux pour rester ta fierté et ne jamais te décevoir.
Que Dieu vous préserve, vous accorde santé, bonheur, quiétude de l’esprit et vous protège de
tout mal.
Á MA GRAND MERE, Qui m’a accompagné par ses prières, sa douceur. Á MA CHERE
TANTE Aicha, puisse Dieu les prêter longue vie, de santé et de bonheur.

Á MA CHERE SŒUR Amina et son mari Ahmed Abdlefateh et sa famille ABDERAHIM.

Aucune dédicace ne saurait exprimer tout l’amour que j’ai pour vous, votre encouragement et
votre gaieté me comblent de bonheur. Puisse Dieu vous garder, éclairer votre route et vous
aider à réaliser à votre tour vos vœux les plus chers.

Á MA CHERE PETITE SŒUR de cœur Hanane que j’aime plus que tout.

Á MON TRES CHER frère Abd Allah et son époux Kahina en gage de ma profonde estime
pour l’aide que vous avez m’as apportés, réconfortés et encouragés.

Á MES CHOUCHOUS Saber, Younes et Lina.

Á MA CHERE BINOME ET SŒUR, Ibtissam.

Á MES CHERES COUSINES, en particulier ma chère Asma.

Á MES CHERES AMIES Bessma, Iman, Roufida, Maroua, Leila, kalthoum et Fatima. En
témoignage de l’amitié qui nous unit et des souvenirs de tous les moments que nous avons
passés ensemble, je vous souhaite une vie pleine de santé et de bonheur.

Hamida
 TABLE DES MATIERES

Remerciements

Dédicace

Liste des tableaux

Liste des figures

Liste des abreviations

Introduction .............................................................................................................................. 1

Première partie : Synthèse bibliographique

Chapitre I. Taxonomie des actinobactéries et du genre Saccharothrix

I.1.Définition des actinobactéries ............................................................................................... 3

I.2. Historique sur les actinobactéries ........................................................................................ 3

I.3. Ecologie des actinobactéries du genre Saccharothrix.......................................................... 4

I.4. Taxonomie des actinobactéries ............................................................................................ 4

I.4.1. Critères morphologiques............................................................................................................ 5

I.4.1.1. Critères macromorphologiques ............................................................................................. 5

I.4.1.2. Critères micromorphologiques .............................................................................................. 5

I.4.2. Critères chimiotaxonomiques ................................................................................................... 6

I.5. Taxonomie de Saccharothrix ............................................................................................... 6

I.6. Position taxonomique du genre Saccharothrix .................................................................... 6

I.7. Caractéristiques du genre Saccharothrix ............................................................................. 7

I.7.1. Caractéristiques macromorphologiques et micromorphologiques ....................................... 7

I.7.2. Caractéristiques chimiotaxonomiques et physiologiques ..................................................... 8

I.8. Espèces appartenant au genre Saccharothrix ....................................................................... 9

I.9. Métabolites secondaires sécrétés par Saccharothrix.......................................................... 10

 Chapitre II. Les antibiotiques

II.1.Définition des antibiotiques ............................................................................................... 11

II.2.Classification des antibiotiques ......................................................................................... 11

II.3.Microorganismes producteurs d’antibiotique .................................................................... 12

II.4.Biosynthèse des antibiotiques ............................................................................................ 13

II.5.Régulation de la biosynthèse des antibiotiques ................................................................. 13

II.5.1. Facteurs physico-chimiques ........................................................................................ 133

II.5.2. Inoculum ........................................................................................................................ 14

II.5.3. Facteurs nutritionnels .................................................................................................... 15

II.6. Mécanisme d’action des antibiotiques .............................................................................. 16

II.6.Résistance aux antibiotiques .............................................................................................. 17

Deuxième partie : Partie expérimentale

Chapitre III. Matériels et Méthodes

III.1. Lieu de stage.................................................................................................................... 19

III.2. Matériel ........................................................................................................................... 19

III.2.1. Matériel non biologique ............................................................................................... 19

III.2.2. Matériel biologique ...................................................................................................... 19

III.2.2.1. La souche AHO23 de Saccharothrix ........................................................................ 19

III.2.2.2. Germes cibles utilisés ................................................................................................ 19

III.3.METHODES .................................................................................................................... 20

III.3.1. Identification de la souche AHO23 .............................................................................. 20

III.3.1.1. Étude morphologique ................................................................................................ 20

III.3.1.2. Étude physiologique .................................................................................................. 20

III.3.1.2.1. Utilisation des composés glucidiques .................................................................... 20

III.3.1.2.2. Utilisation de divers autres composés organiques.................................................. 21

III.3.1.2.3. Production de nitrate réductase .............................................................................. 21

III.3.1.2.4. Production de pigments mélanoïdes ....................................................................... 21

III.3.1.3. Identification moléculaire.......................................................................................... 22

III.3.1.3.1. Séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S et phylogénie (pour la souche
AHO23) .................................................................................................................................... 22

III.3.1.3.2 Analyses phylogénétiques ....................................................................................... 22

III.3.2 Production des antibiotiques par la souche AHO23 ...................................................... 22

III.3.2.1.Mise en évidence de l’activité antagoniste de la souche AHO23 sur milieu solide ... 22

III.3.2.1.1. Préparation de culture de la souche AHO23 .......................................................... 22

III.3.2.1.2. Préparation des suspensions des germes cibles ...................................................... 23

III.3.2.1.3. Test d’antagonisme « Méthode des cylindres d’agar » .......................................... 23

III.3.2.2. Cinétique de pH, de croissance et de la production des antibiotiques par la souche

AHO23 en milieu liquide ......................................................................................................... 24

III.3.2.2.1. Préparation de l’inoculum de la souche AHO23 .................................................... 24

III.3.2.2.2. Préparation des pré-cultures ................................................................................... 25

III.3.2.2.3. Milieux de cultures utilisés .................................................................................... 25

III.3.2.2.3.1. Préparation des sources de carbone ..................................................................... 25

III.3.2.2.3.2. Ajustement de pH des milieux de culture et la stérilisation ................................ 26

III.3.2.2.4. Préparation des cultures ......................................................................................... 26

III.3.2.2.5. Prélèvement ............................................................................................................ 26

III.3.2.2.6. Test d’activité antibactérienne................................................................................ 27

III.3.2.2.7. Suivi du pH des cultures de la souche AHO23 ...................................................... 27

III.3.2.2.8. Suivi de la croissance de la souche AHO23 ........................................................... 28

III.3.3.Recherche du meilleur solvant d’extraction antimicrobien de la souche AHO23 ........ 28

III.3.3.1. Préparation des cultures ............................................................................................ 28

III.3.3.2. Extraction des substances antimicrobiennes ............................................................. 28

III.3.3.3.Antibiogramme........................................................................................................... 30

III.3.3.4. Analyse de l’extrait de la souche AHO23 par HPLC ................................................ 31

 Chapitre IV. Résultats et discussion

IV.1 ETUDE TAXONOMIQUE DE LA SOUCHE AHO23 .................................................. 33

IV.1.1. Caractéristiques phénotypiques et phylogénétiques d’isolat ....................................... 33

IV.1.1.1. Résultats .................................................................................................................... 33

IV.1.1.1.1 Caractéristiques macro et micromorphologiques .................................................... 33

IV.1.1.1.2. Caractéristiques physiologiques ............................................................................. 34

IV.1.1.1.3. Caractéristiques phylogénétiques ........................................................................... 35

IV.1.1.2. Discussion ................................................................................................................. 36

IV.2.PRODUCTION DES ANTIBIOTIQUES PAR LA SOUCHE AHO23 .......................... 37

IV.2.1. Mise en évidence de l’activité antagoniste de la souche AHO23 sur milieu solide .... 37

IV.2.1.1 Résultats ..................................................................................................................... 37

IV.2.1.2. Discussion ................................................................................................................. 39

IV.2.2. Cinétique de croissance, de pH et de production des antibiotiques par la souche

AHO23 en milieu liquide ......................................................................................................... 40

IV.2.2.1. Résultats .................................................................................................................... 40

IV.2.2.1.1 Milieu ISP2 ............................................................................................................. 40

IV.2.2.1.2 Milieu MS additionnée de dextrine ......................................................................... 42

IV.2.2.2. Discussion ................................................................................................................. 43

IV.3. Etude des molécules bioactives produites par Saccharothrix sp. AHO23 ...................... 44

IV.3.1. Résultats ....................................................................................................................... 44

IV.3.1.1. Extraction et mise en évidence des antibiotiques par antibiographie ..................... 444

IV.3.1.2. Purification des molécules bioactives par HPLC ...................................................... 46

IV.3.2. Discussion .................................................................................................................... 47

Conclusion et perspectives ................................................................................................... 499

Références bibliographiques
Annexes
Résumé
 LISTE DES TABLEAUX
Tableau n° Titre des tableaux Page

1 Position taxonomique de Saccharothrix.sp. 7

Espèces du genre Saccharothrix, d'après le National Center for

2 Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov 9
/Taxonomy).

Les principales substances bioactives ayant une activité biologique et

3 synthétisées par les souches appartenant au genre Saccharothrix 10
(Bouras, 2005).

Les principaux antibiotiques et leur classification (Joffin et Leyral,

12
4 2014).

5 Conditions d’élution des antibiotiques par HPLC. 31

6 Caractéristiques culturales de la souche AHO23. 34

Comparaison des caractéristiques physiologiques de la souche

7 34
AHO23 avec l’espèce de Saccharothrix xinjiangensis.

Activité antagoniste de l’isolat AHO23 de Saccharothrix sp. contre

8 38
les germes -cibles par la méthode des cylindres d’agar.

Zones d’inhibition (mm) de la phase organique de la souche AHO23

9 45
issue de l’extraction par l’utilisation des 04 solvants organiques.
 LISTE DES FIGURES
Figure n° Titre des Figures Page

Une comparaison de la micromorphologie du genre Saccharothrix

1 avec celle du genre d'actinomycète le plus abondant dans la nature, 8
Streptomyces (ln : Bergy, 1989).

Différents mécanismes de résistance aux antibiotiques retrouvés chez

2 les bactéries (Guardabassi et Courvalin, 2006 ; Muylaert et Mainil, 18
2012).

Activité antagoniste de la souche AHO23 vis-à-vis des germes cibles

3 24
sur milieu ISP2 par la méthode des cylindres d’agar.

Mise en évidence de l’activité de la souche AHO23 sur ISP2 par la

4 27
méthode des puits.

5 Extraction des antibiotiques à partir des filtrats de cultures. 29

6 La méthode de l’antibiogramme. 30

Schéma de l’installation de la chromatographie liquide à haute

7 32
performance (HPLC Agilent®1260).

Macromorphologiques(A) et Micromorphologie(B) de la souche

AHO23. Les chaine de spores de la souche AHO23 poussant sur
8 33
milieu ISP2 et observés au microscope optique (grossissement 10 x
40).

Arbre phylogénétique (neighbor-joigning) basé sur l’analyse des

9 35
séquences du gène codant pour l’ARNr 16S de la souche AHO23.

Cinétique de croissance, de pH et de production des antibiotiques par

10 41
la souche AHO23 sur le milieu ISP2.

Cinétique de croissance, de pH et de production des antibiotiques par

11 42
la souche AHO23 en milieu MSD.

Activité antibactérienne de l’extrait organique de la souche AHO23.

12 45
a : L.monocytogenes sur milieu ISP2, b : E. coli sur milieu ISP2.

L’extrait organique obtenu par le dichlorométhane provenant à partir

13 46
d’une culture de la souche AHO23 sur le milieu ISP2 pendant 6jours.

Profil d’élution en HPLC analytique obtenu à 575 nm de l’extrait au

44 47
dichlorométhane de la souche AHO23

PH mètre (HANA pH211) Annexe

15
n°1
 Autoclave (pbi 96 de 65 litre) Annexe
16
n°1

Centrifugeuse (Jouan E96) Annexe

17
n°1

Rotavapeur (Stuart) Annexe

18
n°1

HPLC (Agilent®1260) Annexe

19
n°1

Etuve (Memmert) Annexe

20
n°1

Microcentrifuge des eppendorfs (Sigma) Annexe

21
n°1

Shaker New (Brunswick Scientific) Annexe

22
n°1

Four Pasteur (Memmert) Annexe

23
n°1

Activité antagoniste de la souche AHO23 contre Sa.S. Annexe

24
n°5

Activité antagoniste de la souche AHO23 contre M3. Annexe

25
n°5

Activité antagoniste de la souche AHO23 contre BS. Annexe

26
n°5

Activité antagoniste de la souche AHO23 contre Agro. Annexe

27
n°5

Activité antibactérienne de la souche AHO23 contre LM. Annexe

28
n°5

Activité antibactérienne de la souche AHO23 contre E.coli. Annexe

29
n°5

Activité antibactérienne de la souche AHO23 contre Sa 639. Annexe

30
n°5
 LISTE DES ABREVIATIONS
La liste des abréviations des antibiotiques et des antifongiques

AM : ampicilline AMB : Amphotéricine B AMC: amoxicilline + clavulanate

AMX: Amoxicilline AN: Amikacine C : Chloramphénicol
CAR : carbénicilline CAZ : ceftazidime CF : céfalotine
CHX : cycloheximide CHL :Chlorotétracycline CIP : ciprofloxacine
CLD : clindamycine COT : Cotrimoxazole CRO : ceftriaxone
CS : colistine CTX : céfotaxime CXC : céfotaxime + acide
clavulanique
CXM : céfuroxime ERY: érythromycine A FEP : céfépime
FLU : Fluoroquinolones FOS : fosfomycine FOX : céfoxitine
clavulanique
GEN : gentamicine GLY : Glycopeptides HM : Hygromycine
IPM : imipénème ITR : itraconazole K : kanamycine B
KM : Kanamycine LIN : lincomycine MET : méthicilline
NEO : néomycine NOR: norfloxacine NYS: nystatine
OFL : ofloxacine OXA : oxacilline PEN : pénicilline G
POS : posaconazole PRL : pirlimycine RIF : rifampicine
SPI : spiramycine SSS : sulfamide SXT : triméthoprime –
sulfamétoxazole
TCC : ticarcilline + acide TE : tétracycline TER : terbinafine
clavulanique
TIC : ticarcilline TIZ : thioconazole TMP : triméthoprime
TOB : tobramycine VAN: vancomycine VOR: voriconazole
q.s.p : quantité suffisante pour.
μL: Microlitre.
GLY : Glycopeptides.
Rpm : rotation par minute.
HPLC: High Performance Liquid Chromatography.
ISP2 : International Streptomyces Project 2.
MA : Mycélium aérien.
MS : Mycélium du substrat.
PS : pigments solubles.
MH : Mueller Hinton.
MS : Milieu synthétique.
MSS : Milieu semi synthétique.
NCBI : National Center for Biotechnology Information.
Introduction
 Introduction

Introduction
En 1928, Alexandre Fleming a découvert le premier antibiotique nommé pénicilline, et
c’est lui qui a informé la communauté scientifique que l’usage abusif et inapproprié des
antibiotiques conduira dans un proche avenir, à l’apparition des souches résistantes à ces
substances. A l’heure actuelle, nous sommes confrontés malheureusement à sa prédiction ;
l’émergence des bactéries multi résistantes qui menacent la santé mondiale conjuguée au choix
limité des classes d’antibiotiques et à l’absence de la découverte de nouvelles molécules. Cela
incite les scientifiques à rechercher des molécules naturelles inconnues présentant de nouveaux
mécanismes d'action plus efficaces, afin de poursuivre la lutte contre les microorganismes
pathogènes multi résistants (Durand et al., 2018; Djinni et al., 2019).
En 1944, c’était la découverte du 1er antibiotique "la streptomycine" produit par les
actinobactéries, aujourd’hui on peut dire que ces microorganismes retiennent particulièrement
l’attention des chercheurs et semblent êtres d’excellents candidats producteurs des molécules
actives originales aux propriétés intéressantes et structure chimique très diversifiée. Elles sont
employées dans plusieurs domaines, non seulement dans le domaine pharmaceutique mais aussi
dans la science vétérinaire, l’agriculture et l’industrie (Moulin et Coquerel, 1998 ; George et
al., 2012; Solecka et al., 2012; Bouznada, 2018;Tata, 2020).
La majorité des antibiotiques utilisés en clinique sont produits par les actinobactéries,
qui sont des bactéries Gram positives à pourcentage G + C élevé, les différenciant des autres
bactéries. Elles partagent les caractéristiques des bactéries et des champignons dont plusieurs
formant généralement des hyphes ramifiés et des spores asexuées non mobiles ou parfois
mobiles à un certain stade de leur développement. Elles présentent aussi un cycle de
développement cellulaire asexué similaire à celui des champignons imparfaits (Locci et
Sharples, 1984 ; Bouras, 2005 ; Van Der Heul et al., 2018; Williams et al., 2019).
Plusieurs travaux des chercheurs du Laboratoire de Biologie des Systèmes Microbiens
(LBSM) ont révélé l’écosystème particulier et extrême des régions arides d’Algérie, ainsi que
leur richesse et biodiversité surprenante en actinobactéries, ce qui a abouti à l’isolement de
plusieurs souches intéressantes (Lahoum, 2017 ; Bouznada, 2018).
Les chercheurs ont commencé à s’orienter vers les environnements extrêmes et chercher
des taxons rares, comme le genre Saccharothrix ; c’est un genre peu fréquent d’actinobactéries
possédant un matériel génétique unique traduit par son système enzymatique et métabolique
particulier, qui lui permet de s’adapter aux conditions de vie très difficiles. En plus, les souches

1
appartenant au genre Saccharothrix s’avèrent des producteurs de molécules à spectres d’action
intéressants contre plusieurs germes pathogènes (Solanki et al., 2008; Genilloud et al., 2011).

Dans ce travail, nous sommes intéressés par ce genre, qui a montré un réel pouvoir
antagoniste contre les germes pathogènes et s’est révélé être l’un des nouveaux genres secrétant
de nouveaux antibiotiques. Aussi, il y’a lieu de préciser que la souche de Saccharothrix étudiée
a été isolée par Mr SAADI chercheur au niveau du LBSM, ENS de Kouba, Alger.
Le manuscrit est subdivisé en deux parties :
La première est consacrée à une synthèse bibliographique, elle comporte deux chapitres,
le premier chapitre sur les actinobactéries et le genre Saccharothrix, et le deuxième chapitre sur
les antibiotiques, leur production et leur classification.
La deuxième partie qui est divisée en deux chapitres, le premier chapitre présente
l’ensemble des méthodes et techniques utilisées pour la réalisation de ce travail. En premier
lieu, notre souche étudiée a été mise dans des conditions nutritionnelles et physiologiques
appropriées, afin d’améliorer la production conduisant à une production maximale des
molécules d’intérêts. En second lieu, il a été procédé à l’évaluation de l’activité antagoniste de
la souche Saccharothrix sp. (AHO23), la production et l’extraction des molécules bioactives
élaborées par cette souche, et enfin l’analyse par HPLC des extraits actifs. Le deuxième chapitre
est réservé à la présentation des résultats et leur interprétation.
La conclusion du travail réalisé ainsi que les perspectives qui en découlent clôturent ce
manuscrit.

2
 Première partie
Synthèse bibliographique
 Chapitre I
Taxonomie des actinobactéries et du
genre Saccharothrix
Chapitre I Taxonomie des actinobactéries et du genre Saccharothrix

I.1.Définition des actinobactéries

Les actinobactéries précédemment appelées actinomycètes, du fait de leur morphologie
fongoïde (filaments ramifiés, organes de sporulation etc.), elles ont été considérées comme un
groupe intermédiaire entre les bactéries et les champignons, mais leurs propriétés chimiques,
physiologiques et immunologiques approuvent de les classer parmi les procaryotes (Williams
et al., 1973 ; Habbibeche, 2012).
Elles sont caractérisées par une teneur élevée en guanine et cytosine (GC >55%) dans
leur ADN (Pandey, 2018). Ces microorganismes sont des bacilles à gram positive, saprophytes,
immobiles et hétérotrophes mais certains sont chimio-autotrophes, aérobies, mésophiles et
croissent de façon optimale dans la gamme de pH 5,0 à 9,0 avec une proximité idéale à la
neutralité (Williams et Wellington, 1982 a ; Goodfellow et Williams, 1983).
Plusieurs espèces des actinobactéries sont connues pour leur capacité à produire de
nombreux métabolites secondaires synthétisés naturellement, ayant des activités biologiques
diverses et jouent un rôle important au niveau de la minéralisation des sols et dans la
décomposition des matériaux biologiques (Belferkh et Megoura, 2016).

I.2. Historique sur les actinobactéries

L’histoire des actinobactéries a été divisée selon Waksman en cinq grandes périodes :
 Première période (1874-1900) : En 1875 Ferdinand Cohn fut le premier à décrire un
actinomycète nomma Actinomyces bovis, un organisme parasite trouvé dans une infection de la
mâchoire d'un bovin qui désigne l’agent responsable de la maladie du bétail. Cette période a été
nommée «période médicale » du fait du rôle des actinomycètes dans la pathologie (Merizig,
2015).
 Seconde période (1900-1940) : Cette période concerne à la mise en évidence de l’étude des
actinomycètes du sol selon les travaux de Rossi-Doria (1890-1891), Waksman (1919),
Lieske (1921) et Jensen (1931-1933), et à la découverte des conditions saprophytiques
d’habitat des actinomycètes pour distinguer deux groupes : les pathogènes et les saprophytes
(Djebbah, 2016).
 Troisième période : Cette période commence en 1940, est reconnue par la découverte des
antibiotiques produits par les actinomycètes. Waksman a découvert l’actinomycine à partir
d’une culture de Streptomyces antibioticus. Et puis en 1944 la streptomycine produite par
Streptomyces griseus (Djebbah, 2016).
 Quatrième période (1940-1970) : Est caractérisée par le développement des critères
morphologiques, biochimiques et physiologiques pour la classification des actinomycètes, et de

3
Chapitre I Taxonomie des actinobactéries et du genre Saccharothrix

leur intérêt pour la production de métabolites secondaires et la biodégradation de composés

organiques (Belyagoubi, 2014).
 Cinquième période : Depuis les années 1960, des méthodes génétiques initiées par
Hopwood pour la classification des espèces et d’exploration du potentiel biotechnologique de
ces microorganismes (Abriche et Benamira, 2018).

I.3. Ecologie des actinobactéries du genre Saccharothrix

Les actinobactéries sont des microorganismes ubiquitaires, que l’on rencontre sur tous
les substrats naturels et artificiels (Larpent et Sanglier, 1989 ; Saker 2015), et elles ne sont
pas limitées à des habitats spécifiques (Hussein et al., 2018).
Le genre Saccharothrix reste minoritaire parmi les actinobactéries. Il colonise des
écosystèmes très variés tels que les eaux usées, les sols désertiques salés et alcalins, voire les
sédiments océaniques et les gisements de minéraux (Schippers et al., 2002 ; Hozzein et al.,
2004 ; Zitouni et al., 2005; Hamdar,2018). La majorité des espèces de Saccharothrix sont
d’origine tellurique du sol. La première espèce assignée à ce genre, S. australiensis ATCC
31947T, a été isolée du sol de l’Australie (Labeda et al., 1984). Beaucoup d’espèces sont isolées
de sols arides au sud Algérien, deux d’entre elles, S. algeriensis SA233T (Zitouni et al., 2004b)
et S. hoggarensis SA181T (Boubetra, 2013) ont été décrites et publiées comme nouvelles
espèces.

I.4. Taxonomie des actinobactéries

La taxonomie est l’étude qui décrit, regroupe les microorganismes, afin de les identifier,
les nommer et les classer. Elle a progressé en fonction du développement des connaissances.
Actuellement, les actinobactéries sont classées dans le règne des Procaryotes, le
domaine des Bacteria ou Eubacteria et le phylum Actinobacteria, (tel qu’il figure dans le
Bergey’s manual 2012), lequel renferme cinq classes : Acidimicrobiia, Coriobacteriia,
Nitriliruptoria, Actinobacteria et Thermoleophilia. Ce phylum est, en outre, subdivisé en 15
ordres, 43 familles et 203 genres (Goodfellow et al., 2012 in Bergey’s Manual).
L’identification des espèces est facilitée par les études physiologiques et moléculaires
tandis que les critères morphologiques et chimiques séparent les genres (Badji, 2006 ; Bendris
et al., 2017).
D’après Bouras, (2006) et Boudjella, (2007), les caractères morphologiques
contribuent parfois dans la différenciation des genres d’actinobactéries entre eux, parmi les
critères :

4
Chapitre I Taxonomie des actinobactéries et du genre Saccharothrix

I.4.1. Critères morphologiques

Les caractères morphologiques sont classés en caractères macromorphologiques et
micromorphologiques.

I.4.1.1. Critères macromorphologiques

Ces critères reposent sur une observation à l’œil nu des cultures actinobactériennes
poussant sur des milieux de culture (Agoulmine, 2019).
 La production ou non d’un mycélium aérien (MA), qui est habituellement plus épais
que le mycélium du substrat. Il montre une différenciation suffisante selon laquelle
plusieurs isolats peuvent être séparés en un certain nombre de groupes ayant des
caractéristiques morphologiques similaires dans des conditions bien précises (Harir,
2018).
 La présence ou non de mycélium du substrat (MS), qui possède différentes tailles, forme
et épaisseurs. Sa couleur varie de blanc ou pratiquement incolore (Harir, 2018).
 La couleur du MA et du MS, est définie à l’aide d’une charte de couleur.
 La production ou non de pigments mélanoïdes.

I.4.1.2. Critères micromorphologiques

Ces critères reposent sur l’observation directe au microscope optique des colonies des
actinobactéries poussant sur les milieux de culture. Elle consiste à déterminer :
 La fragmentation ou non du MS et de MA.
 La présence de sporanges sur le MA ou sur le MS.
 La forme et la taille des sporanges et leur agencement : isolées, par deux, par quatre ou
en chaînes.
 Le nombre de spores par sporange ainsi que la longueur des sporangiophores.
 Le mode de sporulation : spores portées par des sporophores ou mycélium aérien se
fragmentant de manière anarchique en spores.
 La présence de spores mobiles ou non mobiles.
 L’ornementation de la surface des spores (lisses, rugueuses, épineuses ou chevelues).
 La formation de structures particulières : synnemata, sclérote (Boudekique et al.,
2016).

5
Chapitre I Taxonomie des actinobactéries et du genre Saccharothrix

I.4.2. Critères chimiotaxonomiques

La chimiotaxonomie est l'utilisation de la distribution des composants chimiques pour
regrouper les organismes en fonction des similitudes de leurs chimies cellulaires.
Les composants chimiques les plus couramment utilisés dans ces systématiques sont les
acides aminés de la paroi cellulaire, les lipides, les protéines, les ménaquinones, les types
d'acide muramique, la distribution du sucre dans la cellule entière, et la composition de base de
l'ADN (Ait Barka et al., 2016).
La composition de la paroi des actinobactéries varie fortement d'un groupe à l'autre. Ils
n’ont pas de membrane nucléaire et leur paroi cellulaire ne contient ni la chitine ni la cellulose
mais une glycoprotéine contenant de la lysine (formes fermentatives) ou de l’acide
diaminopimélique (formes oxydatives) (Mariat et Sebald, 1990 ; Saker, 2015 ; Ounadjela,
2016).

I.5. Taxonomie de Saccharothrix

Le genre Saccharothrix fut créé en 1984 par Labeda et al., avec comme espèce-type
Saccharothrix australiensis. Ce genre est caractérisé par sa morphologie, physiologie et son
chimiotype (Bouras, 2005). Plusieurs espèces de Saccharothrix furent décrites quelques années
après la création de ce genre, grâce à la taxonomie numérique et moléculaire basée sur le
séquençage de l’ADNr 16S et l’hybridation ADN-ADN. Donc le genre Saccharothrix
appartient au grand groupe des Actinobactéries qui regroupe tous les microorganismes
procaryotes de l’ordre des Actinomycetales (Labeda et Kroppenstedt, 2000).

I.6. Position taxonomique du genre Saccharothrix

Le genre Saccharothrix était classé dans l’ordre des Actinomycetal et à la famille des
Actinosynnemataceae (Labeda et Kroppenstedt, 2000). Mais après les profonds
remaniements opérés à l’échelle supragénérique, ce genre est reclassé dans l’ordre des
Pseudonocardiales et la famille des Pseudonocardiaceae (Manuel de Bergey, 2012). Il est
rattaché au phylum des Actinobacteria et à la classe des Actinobacteria (Labeda et al., 2001 ;
Labeda et Kroppenstedt, 2006 ; Whitman et al., 2012 ; Benaissa et Boufetta,2018).

6
Chapitre I Taxonomie des actinobactéries et du genre Saccharothrix

Tableau 1 : Position taxonomique de Saccharothrix.sp.

Taxon Position
Domaine Bacteria
Phylum (Embranchement) Actinobacteria
Classe Actinobacteria
Sous-classe Actinobacteridae

Ordre Pseudonocardiales
Sous-ordre Pseudonocardineae

Famille Pseudonocardiaceae
Genre Saccharothrix
Espèce Saccharothrix sp.

I.7. Caractéristiques du genre Saccharothrix

I.7.1. Caractéristiques macromorphologiques et micromorphologiques

La couleur des colonies de Saccharothrix diffère selon les espèces, mais la plus
abondante est la couleur blanche clairsemée, blanc Jaunâtre ou jaune orange.
Le mycélium de substrat de ce genre est ramifié, dressé et strié, et les colonies portent
souvent un mycélium aérien, qui est très peu produit ou abondant selon les espèces. La
fragmentation des filaments mycéliens est anarchique, souvent en « zig-zag », produisant de
longues chaînes de spores. Ces derniers sont non mobiles, en bâtonnets (1 à 2 µm x 0,7 à 1 µm)
ou ovoïdes. À la différence des Streptomyces, le genre Saccharothrix ne produit pas de
sporophores. Le mycélium du substrat se fragmente en éléments allongés ou coccoïdes, une
comparaison de la micromorphologie du genre Saccharothrix avec celle du genre Streptomyces,
est illustrée dans la figure 1 (Bouras, 2005 ; Hamdar, 2018).

7
Chapitre I Taxonomie des actinobactéries et du genre Saccharothrix

Figure 1 : Une comparaison de la micromorphologie du genre Saccharothrix avec celle du

genre d'actinomycète le plus abondant dans la nature, Streptomyces (Bergy, 1989). MA,
mycélium aérien ; MS, mycélium du substrat ; RF, Rectus Flexibilis (chaînes de spores droites
à flexueuse) ; RA, Retinaculum Apertum (chaînes en crochets ou en boucles fermées) ; S,
Spira (Chaînes spiralées) ; s, sporophore ; c.sp, chaînes de spores.

I.7.2. Caractéristiques chimiotaxonomiques et physiologiques

Le genre Saccharothrix est morphologiquement similaire au genre Nocardiopsis, il se
distingue par son chimiotype et ses constituants cellulaires (Labeda et Kroppenstedt, 2000) :
 La paroi cellulaire de type III E (présence d’acide méso-diaminopimélique sans
glycine).
 La présence de deux types de ménaquinones (lipides membranaires) : MK-9 (H4) ou
MK-10 (H4), constituées d’un noyau quinone méthylé et d’une chaîne carbonée
aliphatique formée de neuf à dix unités isoprènes dont quatre sont hydrogénées.
 La présence de deux types de phospholipides membranaires composés de
phosphatidyléthanolamine et d’hydroxy-phosphatidyléthanolamine avec ou sans
glucosamine (type P II ou P IV, respectivement).
 La présence de trois sucres caractéristiques (dans les cellules entières) : le galactose, le
rhamnose et le mannose.
 L’absence d’acides mycoliques pariétaux et de glycine.
 La L-alanine, la Dalanine, l’acide glutamique, l’acide muramique peuvent être, aussi,
présents (Zerizer, 2014).

8
Chapitre I Taxonomie des actinobactéries et du genre Saccharothrix

 Toutes les espèces du genre Saccharothrix sont aérobies strictes, catalase et uréase
positives, résistantes aux lysozymes (Labeda et al., 1984 ; Zerizer, 2014).
 L’intervalle de la température de croissance est de 10 jusqu’à 45 °C, l’optimum est
généralement à 30 °C.
 L’intervalle de pH est de 4 à 10, l’optimum est au tour de 7 (Kim et al., 2011).
L’optimum de la concentration en NaCl, pour la plupart des espèces, est dans l’intervalle
de 4-5 %(Labeda et Lechevalier, 1989 ; Otoguro et al., 2009 ;Zerizer, 2014).

I.8. Espèces appartenant au genre Saccharothrix

Quelques années après la création de ce genre, plusieurs espèces de Saccharothrix furent
découvertes (Labeda et Lechevalier, 1989 ; Labeda et Lyons, 1989). Quelques isolats
appartenant au genre Nocardiopsis et aux d'autres genres, furent reclassés parmi les
Saccharothrix (Grund et Kroppenstedt, 1990), mais ce genre a connu également plusieurs
remaniements, et plusieurs isolats de Saccharothrix ont été transférés vers d'autres genres.
Actuellement, le genre Saccharothrix compte 23 espèces parmi ces derniers sont montrés dans
le tableau 2.
Tableau 2 : Espèces du genre Saccharothrix, d'après le National Center for Biotechnology
Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov /Taxonomy) ; (Hamdar.A ,2018).
Numéros d’accès dans
Espèce Références
les collections
NRRL B-24137, NBRC
Saccharothrix algeriensis 101915, JCM 13242, (Zitouni et al., 2004 b).
DSM 44581
NRRL 11239, NBRC
Saccharothrix australiensis 14444, JCM 3370, DSM
43800, ATCC 31497, IFO (Labeda et al., 1984).
14444, VKM Ac-894
Saccharothrix ecbatanensis DSM 45486, UTMC (Hamedi et al., 2015).
00537, CCUG 63021
Saccharothrix ghardaiensis DSM 46886, CECT 9046 (Bouznada et al., 2017).
Saccharothrix hoggarensis DSM 45457, CCUG (Boubetra et al., 2013b).
60214
Saccharothrix isguenensis DSM 46885, CECT 9045 (Bouznada et al., 2016).

Saccharothrix mutabilis subsp. NRRL B-16077, ATCC (Labeda et Lechevalier,

31520, DSM 43853, IFO 1989).
Mutabilis 14310, IFM 240
Saccharothrix saharensis DSM45456, CCUG 60213 (Boubetra et al., 2013a).
Saccharothrix tamanrassetensis DSM 45947, CECT 8640 (Boubetra et al., 2015).

9
Chapitre I Taxonomie des actinobactéries et du genre Saccharothrix

I.9. Métabolites secondaires sécrétés par Saccharothrix

Le métabolisme des actinobactéries peut être divisé en deux parties : le métabolisme
primaire et secondaire. Le métabolisme primaire regroupe les réactions cataboliques et
anaboliques qui permettent la formation de biomasse, le pouvoir réducteur et l’énergie produits
par ces réactions sont utilisés pour former et assembler les monomères (ex : acides aminés) en
macromolécules (ex : protéine). Ces bactéries filamenteuses sont connues par la richesse de leur
métabolisme secondaire, ce métabolisme regroupe les voies de synthèse des composés qui n’ont
pas de fonction apparente dans le métabolisme cellulaire. Les gènes impliqués dans la
biosynthèse et dans la résistance des antibiotiques sont regroupés en clusters dont l’expression
est finement régulée (Strub, 2008).
Le genre Saccharothrix sécrète plusieurs antibiotiques dont leur nature chimique est
assez diversifiée (Tableau 03), certains sont doués d’une activité antibactérienne (Gram positif
et plus rarement Gram négatif), et d’autre d’une activité antifongique, ou encore antibactérienne
et antifongique à la fois. D’autres composés présentent des activités antitumorales, antivirales,
herbicides ou inhibitrices de métalloprotéases ou d'autres enzymes.
Tableau 3 : Les principales substances bioactives ayant une activité biologique et
synthétisées par les souches appartenant au genre Saccharothrix (Bouras, 2005).
Substances Propriétés Origines Références
Sugawara et
ThiazoIiIpyridine Antifongique Saccharothrix sp.
al., 1999.
Murakami et al.,
Ammocidine Antitumorale Saccharothrix sp.
2001 a, b.
Bush et al., 1993 ;
Coformycine Herbicide Saccharothrix sp.
Dancer et al., 1997.
Fluvirucines (Al,
A2, BI, B2, B3, B4 Sa.mutabilis subsp.
Antivirales Tomita et al., 1991.
et B5) Schiiijamaensis
Dithiolopyrrolones Antibactériennes, Lamari et al., 2002
Sa. Algeriensis
(AJ, Ct, C2, A et B) antifongiques a, b.
Pravastatine Anticholestérolémique Sa. mutabilis Matsuo et al., 2003.
Swalpamycin B Antibactérienne Saccharothrix sp. Zitouni 2004a.
Aldgamycin G Antibactérienne Saccharothrix sp. Zitouni 2004a.
Inhibiteur de Koguchi et al.,
TMC 96 Saccharothrix sp. 1999.
protéasome

10
 Chapitre II
Les antibiotiques
Chapitre II Les antibiotiques

II.1.Définition des antibiotiques

Les antibiotiques sont des molécules issues du métabolisme secondaire qui ont été
particulièrement étudiées du fait de leur importance en thérapie humaine et vétérinaire (Coates
et Hu, 2007 ; Merizig, 2015).
Le terme désigne toute substance naturelle ou synthétique qui détruisent ou bloquent la
croissance des bactéries (Veyssiere, 2019). Dans la majorité des cas, leur synthèse débute à la
fin de la phase exponentielle (trophophase) et le début de la phase stationnaire (idiophase)
(loucif, 2006). Un antibiotique est caractérisé par son spectre d’action, et son efficacité à une
très faible dose, et ce par l'inhibition de certains processus vitaux (Belyagoubi, 2014). De plus,
afin qu’il soit actif, il doit pénétrer dans la bactérie, sans être détruit ni être modifié, se fixer sur
une cible et perturber la physiologie bactérienne (Merniez, 2018).
Il a été signalé que plus de 70% des antibiotiques d'origine naturelle ont été isolés de
différents genres d'actinobactéries. Ainsi, il a été suggéré qu’un grand nombre d’actinobactéries
pourraient être encore inconnues et produire des antibiotiques (Pandey, 2018).

II.2.Classification des antibiotiques

La diversité et la complexité des molécules antibactériennes rendent nécessaire leur
classification (Smaoui, 2010), qui facilitera le choix thérapeutique. Ci-après les
critères retenus :
● Origine : élaboré par un organisme (naturel), synthétique ou semi synthétique (Koussa,
2019).
● Spectre d'action : peut-être large ou étroit.
● Type d'action : peut-être bactériostatique, fongistatique, bactéricide, ou fongicide.
● Nature chimique : les antibiotiques ayant la même structure chimique, sont classés dans
une même famille.

11
Chapitre II Les antibiotiques

Tableau 4 : Les principaux antibiotiques et leur classification (Joffin et Leyral, 2014).

Famille Antibiotiques Spectre d’action
Streptomycine, Kanamycine,
Large (bacilles à gram négatif,
Aminosides Gentamycine, Gobramycine,
certaines bacilles à gram positif).
Amikacine.
Etroit (cocci à gram positif et à
Pénicilline G
gram négatif).
B-lactamines
Pénicilline V Etroit (bacilles à gram positif).
Pipéracilline Large (bacilles à gram négatif).
Tétracycline, Minocycline,
Tétracyclines Large (gram négatif, gram positif).
Doxyciciline
Chloramphénicol
Phénicoles Large (gram négatif, gram positif).
Thiamphénicol
Sulfadiazine, Sulfamaxole,
Sulfamides Large (gram négatif, gram positif).
Sulfaméthaxazole.
Diminopyrimidines Triméthoprime Large (gram négatif, gram positif).
Acide nalidixique Etroit (bacille à gram négatif).
Quinolones
Enoxacine Large (gram négatif et positif).

II.3.Microorganismes producteurs d’antibiotique

La grande majorité des antibiotiques est produite par des microorganismes. Parmi ces
microorganismes, les bactéries (y compris les actinobactéries) sont responsables d'environ 74%
de la production. Parmi les molécules élaborées par les actinobactéries, seul 20% sont des
antifongiques, les 80% restantes ont des activités biologiques diverses : antibactériennes
(Surtout), antivirales, antitumorales, antiprotozoaires, ou insecticides. Les bactéries non
mycéliennes, en dehors des actinobactéries, produisent environ 17% des antibiotiques d'origine
microbienne (Lazzarini et al., 2001 ; Tiwari et Gupta, 2011 ; Boubetra, 2013) et qui sont
sécrétés surtout par les bactéries du genre Bacillus et Pseudomonas. D’autres bactéries
appartenant à des genres variés tels que Micrococcus, Chromobacterium, Proteus, etc,
produisent également quelques antibiotiques (Breton et al., 1989).
Les champignons producteurs sont à l’origine d’environ 22% de la production, dont les
genres aspergillus, fusarium, penicillium, trichoderma et coleophoma (champignons
imparfaits, ascomycètes) et aussi certains basidiomycètes et zygomycètes (Laskin et
Lechevalier, 1984 ; Barrett, 2002 ; Boubetra, 2013).

12
Chapitre II Les antibiotiques

II.4.Biosynthèse des antibiotiques

Les microorganismes produisent leur métabolite secondaire lors de la phase stationnaire
(Tortora et al., 2003). En effet, cette production n’est indispensable ni à la croissance, ni aux
besoins énergétiques des organismes producteurs. Il est, par ailleurs, possible d'obtenir un
couplage de la production de certains métabolites secondaires et la croissance contrôlée du
microorganisme en faisant varier la composition du milieu (Bouras, 2005).
Les antibiotiques naturels sont synthétisés chimiquement à partir des acides gras, acides
aminés, des bases pyrimidiques et puriques issus du métabolisme primaire. Ainsi, ses variétés
structurales résultent des chaines de réactions enzymatiques telles que la méthylation,
polymérisation, réduction et oxydation. Du point de vue génétique, les gènes codants sont
regroupés sous forme de cluster dans l’ADN génomique, et parfois dans des plasmides.
Généralement 10 à 15 gènes sont nécessaires pour synthétiser une molécule d’antibiotique,
alors qu’un seul gène peut encoder une protéine de 100 Kda (Merrouche, 2012).
Cette biosynthèse se déroule en présence des usines cellulaires (biomasse), des
précurseurs et des enzymes actives capables de transformer ces dernières. La dite biosynthèse
est soumise à tout un ensemble de mécanismes de régulation intervenant aux niveaux
anabolique, catabolique et énergétique de la cellule. Elle est affectée par les conditions
physicochimiques et nutritionnelles dans lesquelles le microorganisme se développe (Bouras,
2005).

II.5.Régulation de la biosynthèse des antibiotiques

La régulation de la production microbienne des antibiotiques peut s’exercer directement
et spécifiquement sur les gènes des enzymes de synthèse des métabolites secondaires et/ou
indirectement sur les voies de biosynthèse des métabolites primaires « précurseurs » (Piret et
Demain, 1988 ; Demain, 1998 ; Benaissa et Boufetta, 2018). Elle est contrôlée par des
facteurs environnementaux et des mécanismes dus au métabolisme des sources de carbone,
d'azote et de phosphate, la quantité et la qualité des sels minéraux et les oligoéléments. Ces
facteurs ont une importance cruciale dans l’induction et répression de la biosynthèse des
antibiotiques par une rétro-inhibition et inactivation enzymatique (Bouras, 2005 ; Merrouche,
2012).
II.5.1. Facteurs physico-chimiques
L’influence des facteurs physico-chimiques tels que le PH, la température, agitation et
aération jouent un rôle primordial dans l’amélioration du rendement de la biosynthèse des
antibiotiques.

13
Chapitre II Les antibiotiques

Le PH a un impact significatif sur la cinétique de croissance des micro-organismes

comme activités enzymatiques (Elmahdi et al., 2003 ; Rafieenia,2013). D’une manière
générale, la production d’antibiotiques est optimale à pH légèrement basique (Wang et al.,
2010; Oskay, 2011). Ainsi Lamari (2006) a indiqué que CaCO3 ajouté au milieu de culture
joue un rôle d’un tampon, qui ajuste les changements du ph et favorise alors la production des
antibiotiques.
La température affecte fortement la croissance et la productivité d’une souche qu’elle
s’agit d’une souche mésophile, thermophile ou psychrophile (Larpent et Larpent-Gourgaud,
1997 ; Lu et al., 2019). Les températures optimales pour la production sont situées dans des
plages souvent étroites et plus basses que pour la croissance (Larpent et Sanglier, 1989 ; Arab
et Kabaz, 2018).
La vitesse d’agitation est un facteur pouvant influer sur la morphologie, la croissance
des actinobactéries ainsi sur la production des antibiotiques. L’agitation peut améliorer
l’aération et le mélange des éléments nutritifs dans le milieu de fermentation et par conséquent
la production des métabolites secondaires (Smaoui, 2010 ; Wadetwar et al., 2013 ; van Dissel
et van Wezel, 2017).
Le temps d’incubation est un facteur qui affecte la synthèse des métabolites secondaires
des actinobactéries. Chez le genre Saccharothrix, le temps d’incubation varie d’une espèce à
une autre, voire même d’une souche à une autre. Par exemple la souche Saccharothrix
algeriensis commence la production des biomolécules après 2 jours d’incubation et atteint un
maximum de production après le 4 ème jour (Lamari et al., 2002a). Par contre, la souche
Saccharothrix sp.SA 103 produit des métabolites antibactériens dès le premier jour et atteint un
maximum de production après le 4 ème jour (Zitouni et al., 2004a ; Bezari et Ouali, 2016).

II.5.2. Inoculum
L’Inoculum est l’ensemble de la biomasse (spores, cellules et hyphes) nécessaire pour
ensemencer le milieu de culture par la souche étudiée (Delaunay et al., 2003 ; Tata, 2020), en
contrôlant les paramètres relatifs à chaque production d’antibiotiques.
Ces paramètres sont :
 L’âge de la souche, laquelle doit être bien conservée pour conduire à une concentration
élevée en cellules au milieu de culture. Aussi, il vaut mieux utiliser les pelotes de
mycélium ouvertes, car elles conduisent à une forte diffusion de substrat.
 La quantité de l’inoculum, est importante afin de choisir le meilleur volume a prélevé à
partir de la culture mère. Car une faible densité d’inoculum peut réduire la charge de la

14
Chapitre II Les antibiotiques

nappe microbienne ainsi la formation du produit, tandis qu'une forte densité d’inoculum
peut entraîner une mauvaise production de l’antibiotique.
 La qualité de l’inoculum. Celle-ci est déterminée par ses propriétés physico-chimiques,
sans omettre de prendre en compte les caractères morphologiques des actinobactéries.
Aussi, il y’a lieu de s’assurer d’une activité respiratoire maximale de l’inoculum, devant
conduire à une production maximale d’antibiotique recherchée (Bouras, 2005 ;
Merrouche, 2012).

II.5.3. Facteurs nutritionnels

La nature et la concentration de certains composants du milieu de culture ont un effet
notable sur la production des métabolites secondaires biologiquement actifs chez les
actinobactéries (Gesheva et al., 2005 ; Ben Mahrez et Ikhlef, 2015).
Parmi les sources nutritionnelles, celles de carbone, d’azote, de phosphate, et les
oligoéléments qui jouent un rôle important dans cette production. La diminution de ces sources
nutritionnelles pourrait lancer l’initiation de la synthèse d’antibiotique en permettant de lever
la régulation négative exercée par ces nutriments (Martin et Demain ,1980 ; Strub, 2008 ;
Afroune et Barache, 2014).
Le carbone est un élément structural des cellules microbiennes et aussi une source
d’énergie. Le choix de cette source influence fortement le métabolisme secondaire et par
conséquent la production d’antibiotiques (Doull et Vining, 1990 ; Spizek et Tichy, 1995 ;
Awad, 2005). La source carbonée peut être simple ou complexe et son effet dépend de la souche
cultivée, de la concentration, du temps d’addition, de la composition du milieu de culture
(synthétique ou complexe), et du nombre de sources de carbone ajoutées (Singh et Rai, 2012 ;
Ababutain et al., 2013 ; Rafieenia, 2013 ; Souagui et al., 2015).
Quant aux sources d’azote, essentielles dans la structure des antibiotiques (Lebrihi et
al., 1992 ; Khaliq et al., 2013). Elles sont inorganiques (sels d’ammonium, nitrates) et
considérées comme des sources rapidement assimilables, bénéfiques pour la croissance des
microorganismes (Manikkam et al., 2015), mais entrainant une faible production des
métabolites secondaires. En revanche, les sources d'azote organiques simples ou complexes
(acides aminés, extrait de levure, peptone, tryptone, caséine) sont des sources d'azote durables,
bénéfiques pour la croissance ainsi que l'accumulation régulière des métabolites (Baoxin et al.,
2011). Dans le cas de nombreux métabolites, la production est meilleure lorsque la source
d’azote est organique.

15
Chapitre II Les antibiotiques

Plusieurs travaux ont montré l’implication d’autres sources nutritionnelles dans la

production des antibiotiques. Il s’agit des éléments minéraux comme le phosphore le
magnésium et le potassium, ainsi que les oligoéléments (Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Mo et Mn) qui
sont utilisés comme des cofacteurs pour la croissance des microorganismes à des concentrations
très faibles (Laprent et Sanglier, 1989 ; Laprent et Sanglier, 1992 ; Strub, 2008).

II.6. Mécanisme d’action des antibiotiques

La fixation de l’antibiotique sur son hôte d’action au niveau de la cellule entraine
l’inhibition spécifique d’une ou plusieurs étapes métaboliques précises. Certains antibiotiques
empêchent la synthèse de la paroi, d’autres la synthèse de la membrane plasmique, celle des
acides protéiques ou encore celle des acides nucléiques.
Les antibiotiques qui agissant au niveau de la paroi (exemple : β-lactamines) inhibent la
synthèse pariétale bactérienne en empêchant l’intégration des acides aminés constituant la
muréine (composant essentiel de la paroi bactérienne, qui confère à la bactérie sa forme et sa
rigidité ce qui lui permet de résister à la forte pression osmotique intra-cytoplasmique). La
bactérie alors n’est plus protégée contre la pression osmotique ce qui entraine la lyse de cette
cellule bactérienne (Lalaoui, 2012).
D’autres antibiotiques ayant une action sur la membrane plasmique comme les
polymyxines altèrent la membrane bactérienne en provoquant la formation de pores laissant
échapper le contenu cellulaire (Prescott, 2002 ; Yoneyema et Katsumata, 2006 ; Arab et
Kabaz, 2018), et en désorganisant la structure et le fonctionnement de la membrane, ce qui
produit des graves troubles d’échanges électrolytiques avec le milieu extérieur.
Les antibiotiques ayant aussi une action sur les unités ribosomales qui inhibent la
synthèse des protéines (exemple : chloramphénicol). Ces antibiotiques peuvent empêcher la
fixation de l’ARN porteur d’acides aminés, soit la translocation et la transpeptidation ou encore
ils peuvent provoquer des erreurs de lecture du code génétique (Asselineau et Zalta, 1973 ;
Agoulmine, 2019).
Les molécules antibiotiques ont une action sur la synthèse des acides nucléiques, et
inhibent l’ARN polymérase comme les ansamycines, l’ADN gyrase (indispensable à
l’ouverture de la double hélice et donc à la réplication de la cellule), la topoisomérase II et la
topoisomérase IV (exemple : les quinolones et fluoroquinolones). Ainsi ils ont un effet sur la
formation de l’acide folique qui est essentiel à la synthèse des acides nucléiques (exemple :
sulfamides et triméthoprime) (Asselineau et Zalta, 1973 ; Gewirtz, 1999 ; Tata, 2020).

16
Chapitre II Les antibiotiques

II.6.Résistance aux antibiotiques

Une souche est dite résistante lorsqu’elle se cultive en présence d’une concentration
d’antibiotique beaucoup plus élevée que celle qui inhibe le développement de la majorité des
autres souches de la même espèce (Sylvie Carle, 2009).
Un antibiotique n’est efficace que lorsqu’il rentre en contact avec la bactérie, puis
pénétré dans la cellule afin de perturber le fonctionnement vital du microorganisme en se fixant
à une cible sans être détruit et modifié (Collignon et al., 2016). La résistance aux antibiotiques
peut être naturelle ou acquise.
La résistance naturelle est un caractère d’espèce qui touche toutes les bactéries de
l’espèce considérée. Elle est stable, transmise à la descendance (elle a pour support génétique
le chromosome bactérien) mais elle n'est pas ou peu transmissible sur un mode horizontal (d’une
bactérie à l’autre au sein d’une même espèce ou entre espèces différentes) (Lozniewski et al.,
2010).
A côté de la résistance naturelle existe aussi des résistances acquises ; il s’agit d’un
caractère qui ne concerne alors que quelques (ou parfois de nombreuses) souches d’une espèce
donnée. La résistance acquise est moins stable, mais elle se propage souvent de façon
importante dans le monde bactérien, elle résulte d’une modification génétique de la bactérie
(Lozniewski et al., 2010 ; Collignon et al., 2016). Cette résistance peut être obtenue soit par
mutation chromosomique (des mutations spontanées ; 20% des cas), ou par la mutation
plasmidique (échange par conjugaison d’un plasmide ou d’un transposon ; 80% des cas)
(Ghannoum et Rice, 1999 ; Maltezou, 2008 ; Tata, 2020).
Les mécanismes de résistance aux antibiotiques peuvent être :
 Enzymatiques (les bactéries peuvent synthétiser des enzymes capables d’inactiver les
antibiotiques en les détruisant ou en les modifiant par hydrolyse, par transfert de
groupements chimiques ou par oxydoréduction).
 Non-enzymatiques (modification de la perméabilité membranaire, système d’efflux
bactérien ; ce mécanisme repose sur l’expulsion des antibiotiques hors de la cellule
bactérienne, la modification de la cible de l’antibiotique ou bien sur la formation de
biofilms) (Cavallo et al., 2004 ; Arab et Kabaz, 2018).

17
Chapitre II Les antibiotiques

Figure 2: Différents mécanismes de résistance aux antibiotiques retrouvés chez les

bactéries (Guardabassi et Courvalin, 2006 ; Muylaert et Mainil, 2012).

18
 Deuxième partie
Partie expérimentale
 Chapitre III
Matériels et méthodes
Chapitre III Matériels et méthodes

III.1. Lieu de stage

Notre travail a été réalisé au niveau du laboratoire de Biologie des Systèmes Microbiens
(LBSM) d’Ecole Normale Supérieure de Kouba, Alger, ce laboratoire est spécialisée pour :
 Les Actinobactéries et les Antibiotiques à Intérêt Médical et Vétérinaire.
 Champignons Toxinogènes et les mycotoxine.
 Les Microorganismes, les Antibiotiques et les Biomolécules d'Intérêt Agronomique.
 Taxonomie des Actinobactéries des Ecosystèmes Sahariens et Potentialités
Antagonistes.
Nous avons réalisé toutes les manipulations de notre thématique qui inclut dans un axe de
recherche du laboratoire LBSM (actinobacteries et antibiotiques). Le travail a duré une période
de deux mois (juillet et aout) de l’année 2019.

III.2. Matériel

III.2.1. Matériel non biologique

Le matériel non biologique utilisé dans cette étude est : shaker, PH mètre, centrifugeuse,
milieux des cultures et les autres matérielles utilisées sont résumé dans l’annexe 1.

III.2.2. Matériel biologique

III.2.2.1. La souche AHO23 de Saccharothrix

La souche d’actinobactérie notée AHO23 étudiée dans ce travail appartient à la
collection du Laboratoire de Microbiologie Appliquée (LBSM) de l’école normale supérieure
de Kouba. Elle a été isolée par le doctorant chercheur SAADI en 2016 à partir des sols sahariens
de la région de Tamanrasset (Ahaggar stastion d’olivier).

III.2.2.2. Germes cibles utilisés

La recherche a été effectuée pour l’obtention des molécules antimicrobiennes
intéressantes de la souche AHO23, contre divers germes cibles. Comme les bactéries, il est
aussi intéressant d’utiliser des champignons.
Les microorganismes cibles utilisés dans cette étude proviennent, respectivement, de la
collection du Laboratoire de Biologie des Systèmes Microbiens(LBSM) de Kouba-Alger, ils
sont conservés à 4 °C sur milieu semi solide Mueller Hinton pour les bactéries, et le milieu
PDA pour les champignons.
Les germes cibles utilisés pour évaluer les propriétés antagonistes, et pour tester
l’activité antimicrobienne de la souche AHO23 sont résumés dans l’annexe 4.

19
Chapitre III Matériels et méthodes

III.3.METHODES

III.3.1. Identification de la souche AHO23

III.3.1.1. Étude morphologique

L'observation macromorphologique et micromorphologique des colonies, de la souche
AHO23 poussant sur différents milieux de culture, nous a permis de déterminer les
caractéristiques culturales et micromorphologiques d’isolats d’actinobactérie.
Les caractéristiques macromorphologiques sont déterminées sur différents milieux de
culture solides : ISP2 et ISP4 recommandés par Shirling et Gottlieb (1966), ainsi que sur le
milieu CHV (Waksman, 1961). La composition des milieux de culture est donnée dans
l’annexe1.
Cette étude sert à noter, aux 12ème, 14 jours d'incubation à 30 °C, la croissance de la
souche, l'aspect et la couleur des mycéliums aériens et du substrat, ainsi que la production et la
couleur des pigments diffusibles (s'ils sont sécrétés) dans les différents milieux.
Les différentes couleurs sont définies à l'aide d'une charte de couleur (Color Name Chart
illustrated with Centroïd Color ISCC-NBS).
De même, les différentes souches (poussant sur les mêmes milieux de culture cités
précédemment) ont fait l'objet d'une observation microscopique à l'aide d'un microscope
optique Zeiss, à deux grossissements (x100 et x400). Ces observations ont été réalisées
directement sur les cultures poussant sur les milieux coulés en boîtes de Pétri, et ce, afin
d'étudier la structure des mycéliums et des fructifications sans avoir à les altérer.
Cette étude est indispensable pour la reconnaissance des genres. Elle consiste à observer
la sporulation du mycélium aérien, la forme et l’arrangement des spores ainsi que la
fragmentation ou non du mycélium du substrat.

III.3.1.2. Étude physiologique

Dans cette étude, une série de tests physiologiques a été réalisée. D'après Whitman et
al. (2012) (in : Bergey’s manual, 2012), ces tests sont ceux qui discriminent les espèces
appartenant aux mêmes genres. La composition chimique de tous les milieux de culture utilisés,
ainsi que les méthodes effectuées lors de l'étude physiologique sont détaillées en annexe 2.

III.3.1.2.1. Utilisation des composés glucidiques

Ce test a pour objectif d'apprécier la croissance de chaque souche en présence de vingt
composés glucidiques dont chacun est ajouté au milieu de base comme étant la seule source de

20
Chapitre III Matériels et méthodes

carbone. Le milieu de base utilisé dans ce test est celui préconisé par Gordon et al. (1974) (voir
annexe 2).

III.3.1.2.2. Utilisation de divers autres composés organiques

L'hydrolyse ou non de certains composés organiques a été également testée pour
chacune de nos souches. Ces tests sont effectués selon la méthode de Gordon et al. (1974) pour
l’utilisation de l'adénine, de la caséine du lait, de la guanine, de l'hypoxanthine, de la tyrosine
et de la xanthine ; la méthode de Marchal et Bourdon (1973) pour l’hydrolyse de l'amidon et
de la gélatine ; la méthode de Marchal et al. (1987) pour la dégradation de l’esculine et de
l’arbutine ; et la méthode de Sierra (1957) pour la dégradation du Tween 80. Chacune de ces
méthodes est donnée avec plus de détails en annexe 2.
Les acides organiques, utilisés sous forme de sels de sodium, sont ajoutés à raison de 2
g/L au milieu de base contenant le rouge de phénol à 0,12 % et à PH 6,8 (milieu coloré en
jaune).

III.3.1.2.3. Production de nitrate réductase

La production de la nitrate réductase est mise en évidence sur un bouillon nitraté
(Marchal et al., 1987) (composition dans l’annexe 2) contenu dans des tubes à vis, à raison de
5 mL par tube. Pour chaque souche, l'ensemencement est réalisé en double. La lecture se fait
après 5 à 10 jours d'incubation à 30 °C, et ce, en ajoutant de manière successive 5 gouttes de
chaque réactif : Griess I puis Griess II.
Un résultat positif se traduit par l'apparition d’une couleur rose rougeâtre dans le milieu
de culture. Si la couleur ne change pas, une petite quantité de poudre de zinc y est ajoutée.

III.3.1.2.4. Production de pigments mélanoïdes

La production de pigments mélanoïdes diffusibles (brun-noirâtre à noir-brunâtre) par
chacune de nos souches a été mise en évidence sur les milieux ISP 6 et ISP 7 recommandés par
Shirling et Gottlieb (1966) (composition dans l’annexe 2). Les résultats sont appréciés après
24 et 48 h d’incubation en comparaison avec le milieu témoin non ensemencé, mais incubés
dans les mêmes conditions.

21
Chapitre III Matériels et méthodes

III.3.1.3. Identification moléculaire

III.3.1.3.1. Séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S et phylogénie (pour la souche
AHO23)
Cette étude a pour but d'extraire et d’amplifier par PCR (Polymerase Chain Reaction)
le gène codant pour l'ARN ribosomique 16S en vue de déterminer sa séquence. Une fois
déterminée, cette dernière est comparée avec celles des espèces de références après alignement
automatique (méthode du blast), en utilisant un logiciel qui permettra d'obtenir les pourcentages
de similarités et de déterminer ainsi les espèces les plus proches de nos souches.
L’autre partie des souches a été séquencée au Laboratoire de Microbiologie de la
"German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)", Braunschweig
(Allemagne). Les étapes suivies lors de la PCR sont décrites dans l’annexe 2.

III.3.1.3.2 Analyses phylogénétiques

L'utilisation du logiciel MEGA 7.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, version
7.00) (Tamura et al., 2016) nous a permis d'aligner les séquences des souches obtenues avec
les séquences de références. L'ensemble des données alignées est analysé phylogénétiquement
afin de générer les matrices de distance évolutive comme décrit par Jukes et Cantor (1969).
Plusieurs arbres phylogénétiques ont été construits dans cette étude, sur la base des séquences
nucléotidiques des gènes codant pour l'ARNr 16S.
Pour toutes les souches, un arbre phylogénétique a été déduit par la méthode du
Neighbor-Joining (Saitou et Nei, 1987). Dans le cadre de la description de nouvelles espèces,
la méthode du Maximum-Likelihood (Felsenstein, 1981) et celle du Maximum-Parcimony
(Fitch, 1977) ont été utilisées en supplément à celle du Neighbor-Joining. Les nœuds communs
aux trois techniques sont indiqués par un astérisque. La robustesse des nœuds a été évaluée
statistiquement par la méthode du "bootstrap" dont les valeurs sont basées sur le résultat de
1000 rééchantillonnages (Felsenstein, 1985).

III.3.2 Production des antibiotiques par la souche AHO23

III.3.2.1.Mise en évidence de l’activité antagoniste de la souche AHO23 sur milieu solide

III.3.2.1.1. Préparation de culture de la souche AHO23

Des boîtes à pétries contenant différents milieux de culture solide (ISP2/MS/MSS) avec
différentes sources de carbone sont ensemencées par la souche AHO23 en stries serrées et

22
Chapitre III Matériels et méthodes

incubées à 30°C pendant 10 jours dans le but d’avoir une meilleure croissance, sporulation et
production des substances antimicrobiennes.

III.3.2.1.2. Préparation des suspensions des germes cibles

Afin d’évaluer les propriétés antagonistes, et tester l’activité antibactérienne et
antifongique de la souche AHO23, des suspensions des germes cibles ont été préparées.
Pour chaque germe cible, une solution mère a été préparée par l’inoculation d’une
fraction de ces germes dans 9ml d’eau distillée stérile, ensuite homogénéisée à l’aide d’un
vortex. Effectuer des ensemencements par des stries serrées, Puis les incubées à 37°C pendant
24h pour les bactéries et à 25°C pendant 48h pour les champignons, pour obtenir une nappe
microbienne.
Et pour le test d’activité, la suspension préparée est conservée à 4°C, après introduite
avec un volume donné dans le milieu de culture semi-solide ISP2 avec une bonne agitation et
puis couler les boites.

III.3.2.1.3. Test d’antagonisme « Méthode des cylindres d’agar »

Ce test est appliqué pour désigner la situation où un organisme exerce un effet inhibiteur
sur autre organisme qu’il tend à éliminer sans le consommer.
La souche ''Saccharothrix'' a été ensemencée en stries serrées à la surface des milieux
de différentes sources de carbone (ISP2/MS/MSS) afin de former un tapis homogène avec une
bonne sporulation. Après incubation à 37°C durant une période donnée, des cylindres d’agar
de 10mm de diamètre ont été réalisés à l’aide des emporte-pièce en verre stérile, puis prélevés
par une pince stérile pour être déposés à la surface des milieux semi-solides ISP2 pré-
ensemencés par les germes cibles préalablement cités . Les boîtes ensemencées sont maintenues
à 4°C pendant 2h avant d’être incubées pour permettre la diffusion des substances actives
antimicrobiennes et en inhibant momentanément la croissance des germes cibles, ces dernières
sont incubées à 37°C pendant 24h pour les bactéries et à 25°C pendant 48h pour les
champignons. Des zones d’inhibition ont été observées autour des disques de la souche AHO23
produisant des substances actives contre le germe test, et le diamètre d’inhibition est mesuré en
millimètre, moyennant une règle graduée. Plus la zone claire autour des disques d’agar est
grande, plus l'activité antimicrobienne est importante, signifie que ces bactéries produisent des
molécules antimicrobiennes capables de stopper la croissance des germes tests, alors que
l’absence de cette zone, indique un résultat négatif qui montre que les germes cibles utilisés
sont résistantes aux substances produites par cette souche.

23
Chapitre III Matériels et méthodes

Les souches présentant un pouvoir antagoniste et une bonne activité vis-à-vis des
germes cibles seront sélectionnées dans le but de déterminer le meilleur milieu d’activité
antagoniste pour la suite du travail.

Figure 3: Activité antagoniste de la souche AHO23 vis-à-vis des germes cibles sur
milieu ISP2 par la méthode des cylindres d’agar.

III.3.2.2. Cinétique de PH, de croissance et de la production des antibiotiques par la

souche AHO23 en milieu liquide
La cinétique de croissance et de production des antibiotiques par la souche AHO23
consiste le suivie des bactéries survivantes à partir de bouillons contenant l’antibiotique à
étudier, par l’analyse d’évolution des variations du PH et la mesure du poids sec,
dynamiquement au cours du temps.

III.3.2.2.1. Préparation de l’inoculum de la souche AHO23

Inoculum est déterminé par la qualité et la quantité conservée de la biomasse (que ce
soit des cellules, spores ou mycélium) introduite par inoculation, Car ces 2 concepts sont
nécessaires pour achever le succès d’une bonne production des substances actifs.
La souche étudiée AHO23 est ensemencée en stries serrées sur le milieu solide ISP2
(Shirling et Gottlieb, 1966), ce milieu gélosé est utilisé pour la préparation des pré-cultures de
la souche. Les boîtes de pétri sont incubées pendant 10 jours, de façon à obtenir une culture
mûre d’une bonne croissance et sporulation de la souche.

24
Chapitre III Matériels et méthodes

III.3.2.2.2. Préparation des pré-cultures

Les pré-cultures sont effectuées dans des fioles d’erlenmeyer de 250 ml contenant 50
ml de milieu de culture liquide (ISP2/MS/MSS). A Chaque erlenmeyer de MS et de MSS sont
ajoutées d’une source de carbone soit (glucose, glycérol, amidon, saccharose ou dextrine).
Á l’aide d’un emporte-pièce métallique et stérile, ces fioles sont inoculées par des
spores et des fragments mycéliens de la souche AHO23, qu’elles sont recueillies à partir des
cultures âgées de 10 jours sur milieu ISP2 solide. L’âge de la pré-culture affecte également la
production et ça s'explique par des expériences menées sur l’effet de l’âge de la préculture, qui
ont montrés que les inocula âgés de 24h à 48h conduisaient, à l’obtention d’une bonne
reproductibilité, alors que des pré-cultures plus âgées ont donné des rendements plus faibles.
Les pré-cultures sont ensuite incubées à 30°C dans un shaker (New Brunswick Scientific) sous
une agitation à 250 rpm pendant 2 à 3 jours.

III.3.2.2.3. Milieux de cultures utilisés

D’après Bourass et al., 2006, trois milieux de culture sont recommandés :
 ISP2 (International Streptomyces Project 2)
C’est un milieu liquide de sporulation pour la croissance et notamment pour la
conservation bactérienne. Il est composé de : 4g du glucose, 4g d’extrait de levure et 10g
d’extrait de malt.
 MS (Milieu synthétique)
C’est un milieu relativement pauvre constitué de substances chimiques pures, sa
composition qualitative et quantitative est rigoureusement connue, ce milieu contient : 10g de
source de carbone (le glucose, le glycérol, le saccharose, l’amidon et la dextrine) ; 2g de NaCl ;
1g de K2HPO4 ; 0.5g de KH2PO4 ; 0,2g de MgSO4, 7H2O ; 2g de CaCO3 ; 2g de (NH4)2SO4.
 MSS (Milieu semi synthétique)
Sa composition exacte est mal connue que pour certains composants (d’un point de vue
quantitatif, pour les produits ayant un intérêt, comme les facteurs de croissance), les autres
composants étant présents de manière empirique. Ce milieu est composé de : 10g de source de
carbone (le glucose, le glycérol, le saccharose, l’amidon et la dextrine) ; 2g de NaCl ; 1g de
K2HPO4 ; 0.5g de KH2PO4 ; 0,2g de MgSO4, 7H2O ; 2g de CaCO3 ; 2g de (NH4)2SO4 ; 2g
d’extrait de levure.

III.3.2.2.3.1. Préparation des sources de carbone

Cinq sources de carbone ont été choisies (glucose, glycérol, le saccharose, l’amidon et
la dextrine), 1,5g pour chaque source de carbone est ajoutée à 10ml de l’eau distillée, afin
25
Chapitre III Matériels et méthodes

d’ajuster le volume du milieu à 150 ml pour garder la concentration des sources de carbone.
Qui vont être autoclaves séparément des milieux de culture pour éviter la caramélisation des
sources de carbone. Par la suite ces dernières sont additionnées après le refroidissement des
milieux de culture.

III.3.2.2.3.2. Ajustement de PH des milieux de culture et la stérilisation

D’une façon générale, la production des antibiotiques est optimale à PH légèrement
basique tandis que les PH très alcalin ou au contraire acides, ne favorisent pas la production.
Pour cela le PH des milieux est ajusté à 7,2 avec une solution de NaOH (pour régler le PH,
ajouter du NaOH si le milieu est acide et ajouter l’HCl si le milieu est alcalin).
La stérilisation est effectuée dans un autoclave à vapeur d’eau sous pression (1 bar), à
haute température de 121°C pendant 20min.Cette étape est destinée à détruire tous les germes
présents au départ dans le milieu.

III.3.2.2.4. Préparation des cultures

Les cultures sont réalisées dans des erlenmeyers de 500ml contenant chacun 100ml de
milieu de culture liquide ISP2/MS/MSS. Les fioles d’erlenmeyer sont ensemencées par un
inoculum des pré-cultures en phase exponentielle de croissance (âgé de 48 h) d’actinobactérie,
le volume de l'inoculation est de 3 ml (3% du volume utile). Les cultures sont incubées dans un
shaker aux mêmes conditions de température et d’agitation que les prés-cultures (30°C et 250
rpm) pendant 10 jours, cette durée correspond à la production maximale de substances actives
produite par la souche. Cette préparation sert d’avoir une population bactérienne en forme,
surement dans la phase exponentielle.

III.3.2.2.5. Prélèvement
La cinétique est une théorie expliquant un ensemble de phénomènes par le mouvement
de la matière pour déterminer le milieu et le jour optimal de la production dans des conditions
déterminées. Cette cinétique a été suivie pendant 10 jours à partir des prélèvements ponctuels,
qui ont été effectués quotidiennement en prélevant 2ml de chaque culture avec une micropipette
dans des tubes d’eppendorf (120 tubes eppendorf pour l’activité, 120 tubes eppendorf pour la
biomasse).
Des prélèvements de 2 ml ont été réalisés à des intervalles de temps fixe (24h) dans des
conditions aseptiques à partir des fioles en agitation, ces prélèvements ont été mis dans deux
eppendorf de 2 ml stériles. Le premier est destiné à l’estimation des variations de PH et de la

26
Chapitre III Matériels et méthodes

biomasse, et le second sert à l’évaluation de l’activité antimicrobienne vis-à-vis des germes

cibles.

III.3.2.2.6. Test d’activité antibactérienne

L’activité antimicrobienne est mesurée par la méthode de diffusion des puits. Cette
méthode préconisée par Aszalos (1986), pour but de mesurer toute substance utilisée pour
détruire les micro-organismes ou empêcher leur croissance, y compris, agents antibactériens et
antifongiques.
Après centrifugation à 12000 rpm pendant 10 mn, une aliquote de 0,1 ml du surnageant
du milieu de fermentation est introduite au fond d’un puit de 10 mm de diamètre (dont chaque
puit pour un jour précis) creusé à l’aide d’un emporte-pièce en acier inoxydable stérile dans le
milieu ISP2 semi solide (contenant 12 g d’agar par litre uniquement, pour permettre une
meilleure diffusion des substances actives) préalablement ensemencé avec un germe cible. Les
boîtes sont placées à 4°C pendant 2h, puis incubées à 30°C pendant 24h. La lecture des résultats
de l’activité antibactérienne est estimée par la mesure du diamètre des zones d’inhibition (zone
claire) autour des puits de la souche (figure 4).

Figure 4 : Mise en évidence de l’activité de la souche AHO23 sur ISP2 par la méthode des
puits.
III.3.2.2.7. Suivi du PH des cultures de la souche AHO23
Le PH et la croissance sont également mesurés durant toute la période de culture.
Chaque jour, une aliquote de 2 ml de la culture homogénéisée est prélevée stérilement dans un
tube eppendorf de 2 ml préalablement taré. Après centrifugation à 12000 rpm (Centrifuge 54
14 R) pendant 10 mn, le surnageant est récupéré séparément et utilisé immédiatement pour

27
Chapitre III Matériels et méthodes

enregistrer les variations du PH au cours du temps d’incubation par un PH mètre (HANNA

instruments). Le suivi de l’évolution de PH permet de mesurer l’activité de l’antibiotique et
aussi savoir si le milieu est contaminé ou pas.

III.3.2.2.8. Suivi de la croissance de la souche AHO23

Cette mesure est effectuée selon la méthode de Pfefferle et al., (2000). Après avoir
récupérer le surnageant, le culot mycélien obtenu de la centrifugation est lavé par l’HCl pour
éliminer le CaCO3, exception faite pour les tubes eppendorf de l’ISP2.
Une deuxième centrifugation se réalise pour passer au lavage avec l’eau distillée, ensuite
une troisième centrifugation est opérée, les eppendorf contenant le culot servira pour la mesure
de la croissance cellulaire en fonction du temps (par mesure du poids sec de la biomasse
contenue dans un volume de culture connu), puis déposés dans un four à 105°C pendant 24 h
afin d’éliminer les goulettes d’eau issues du rinçage. Le poids sec obtenu est rapporté en
gramme de matière sèche par litre de milieu de culture. Les pesées sont effectuées sur une
balance analytique (KERN).

III.3.3. Recherche du meilleur solvant d’extraction antimicrobien de la souche AHO23

Pour sélectionner le meilleur solvant d’extraction de l’antibiotique. Trois solvants non
miscibles à l’eau ont été choisis de polarité croissante.

III.3.3.1. Préparation des cultures

La production de métabolites actifs a été réalisée sur milieu ISP2 liquide, les souches
sont inoculées dans des erlenmeyers de 500 ml contenant chacun 100 ml du milieu de culture,
ont été inoculées par 3 ml de pré-culture, et les cultures sont incubées à 30°C sous l’agitation
de 250 rpm, jusqu’au jour optimal de la production déterminée lors de la cinétique.

III.3.3.2. Extraction des substances antimicrobiennes

Le principe de l’extraction par les solvants organiques se résume en une séparation du
milieu de fermentation en deux phases ; une phase organique et une phase aqueuse et de faire
passer les molécules bioactives dans la phase organique.
Selon la technique décrite par Badji et al., (2005) et celle de Zitouni et al., (2005),
l’extraction des antibiotiques à partir du surnageant de culture exige le choix d’un solvant non
miscible à l’eau. À cet effet trois solvants de polarité croissante ont été utilisés (Acétate
d’éthyle, Butanol et Dichlorométhane).Afin de déterminer le meilleur solvant d’extraction qui
permet d’obtenir le diamètre d’inhibition le plus élevé.

28
Chapitre III Matériels et méthodes

Les cultures sont refaites dans le milieu choisi et sont arrêtées au jour de production
optimale (précédemment déterminé lors des cinétiques). Le surnageant est récupéré après une
centrifugation afin d’éliminer la masse mycélienne et garder uniquement les substances actifs
produites par la souche, puis mélangé dans une ampoule à décanter avec un mélange à volume
égal de solvant(s)/surnageant de culture (V filtrat = V solvant) avec une douce agitation pendant
quelques secondes et dégazage de temps à autre. Après agitation et décantation, la phase
aqueuse a été éliminée et la phase organique (supérieure) est récupérée, puis filtrée par passage
à travers un papier filtre (Whatman n°1) contenant du sulfate de sodium anhydre (entonnoir +
papier filtre+ 2g de sulfate de sodium ou un peu plus) afin d’assurer l’élimination de toute trace
d’eau résiduelle et tous les impuretés et les contaminants hydrophiles restants. L’extrait de la
phase organique est concentré à sec à l’aide d’un rotavapor puis solubilisé dans un volume de
méthanol, pour être testés par la méthode d’antibiogramme.

Figure 5 : Extraction des antibiotiques à partir des filtrats de cultures.

29
Chapitre III Matériels et méthodes

III.3.3.3.Antibiogramme
Les différents antibiotiques testés appartiennent à la souche AHO23, extraits à partir de
différents solvants. L’efficacité de ces antibiotiques est testée vis-à-vis des germes cibles par la
méthode d’antibiogramme.
Elle consiste a utilisé des disques en papier buvard de 6mm imprégnés d’une
concentration fixe d’antibiotique (80μL), ou d’antifongique (100μL), dans des conditions
d’asepsie par une micro-seringue, afin de tester la sensibilité des germes bactériens aux
antibiotiques. Les disques sont séchés à froid par l’intermédiaire d’un séchoir, afin d’évaporer
le solvant, puis sont stérilisés sous UV à 254nm pendant 45min, avant d’être placés à l’aide
d’une pince stérile soigneusement à la surface du milieu gélosé ISP2 semi solide inoculé par
une suspension d’une culture pure et identifiée d’un germe cible. Les disques ne sont pas
déplacés après leur application.
Les boites sont maintenues à 4cº pendant 2h pour permettre une pré-diffusion de
l’antibiotique et l’antifongique, avant d’être incubées à 30cº pendant 24h. Pendant cette période,
ces substances actives se diffusent de façon uniforme. Un gradient de concentration s’établit
entre la culture du germe cible et la diffusion du disque, qui s’exprime par une zone d’inhibition
de la culture, qui a été mesurée avec précision par une règle. La détermination des diamètres
des zones d’inhibition permet une estimation de la concentration minimale inhibitrice des
germes cible aux substances testés.

Figure 6 : La méthode de l’antibiogramme.

30
Chapitre III Matériels et méthodes

III.3.3.4. Analyse de l’extrait de la souche AHO23 par HPLC

La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est une méthode physique
d’analyse basée sur la séparation et la purification d'un ou de plusieurs composés d'un mélange
en vue de leur identification et de leur quantification.
L’appareil d’HPLC utilisé est de marque Agilent®1260, équipé par des éléments qui sont
résumés dans l’annexe 1.
La phase mobile liquide (éluant) constituée par un mélange filtré et dégazé de méthanol et
d'eau bidistillée, elle croitre selon un gradient continu de 20 à 100% de méthanol dans l’eau
pendant 30 min, Le débit de l'éluant est de 1 ml/min et la détection se fait à 220 nm à cette
longueur d'onde tous les composés (colorés et non colorés) sont détectés.
Avant l’injection des échantillons, la colonne (phase stationnaire) est conditionnée et
équilibrée avec 20% de méthanol dans l’eau pendant 30min. Les extraits organiques obtenus
après l’extraction initiale, qui ont été effectuées à partir des cultures poussées sur le meilleur
milieu et la période préférable de la production d’antibiotique. Ces extraits sont séchés,
solubilisés dans 1 ml de méthanol, et ultrafiltrés à l'aide d’un filtre de 0,2 μm de porosité, puis
ils sont introduits dans l’appareil HPLC à raison de 100 μL par injection.
Les fractions obtenues (matérialisées dans les chromatogrammes par des pics) sont
récupérées séparément par l’évaporation du solvant sous vide à 40°C puis testées par
antibiographie contre les bactéries de type : Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus 639,
Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Salmonella typhi, Escherichia
coli(E.coli25922) (E.coli87), Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium, Aspergillus
carbonarius. Contre les champignons de type : Aspergillus ochraceus, Aspergillus fumigatus,
Fusarium culmurum, Fusarium poae, Umbelopsis ramanniana, Penicillium expansum,
Penicillium glabrum, Candida albicans.
Afin de localiser les fractions actives, le tableau 5 résume les conditions d’élution des
antibiotiques par HPLC.
Tableau 5 : Conditions d’élution des antibiotiques par HPLC.
Temps Débit Eau Méthanol
(min) (ml/min) (solvant A %) (solvant B %)
« Pré-run » (équilibrage de la colonne) 10 1 80 20
0 1 80 20
« Run » (gradient linéaire)
55 1 0 100
55 1 0 100
« Post-run » (lavage de la colonne)
65 1 0 100

31
Chapitre III Matériels et méthodes

Figure 7 : Schéma de l’installation de la chromatographie liquide à haute performance

(HPLC Agilent®1260).

32
 Chapitre IV
Résultats et discussion
Chapitre IV Résultats et discussion

IV.1 ETUDE TAXONOMIQUE DE LA SOUCHE AHO23

IV.1.1. Caractéristiques phénotypiques et phylogénétiques d’isolat

IV.1.1.1. Résultats

IV.1.1.1.1 Caractéristiques macro et micromorphologiques

Lors de cette étude, nous avons remarqué que, d’une manière générale, la croissance de
la souche AHO23 est bonne sur les milieux ISP2 et moyenne sur ISP4. Quant à la production
du mycélium aérien (MA), elle est favorisée par au moins un des milieux de culture utilisés (le
meilleur étant ISP2). L’observation au microscope optique, au grossissement, 10 x 40 a montré
que le MA est ramifié et se fragmente de manière anarchique, souvent en zig-zag, donnant
naissance à des chaînes de spores coccoïdes ou en bâtonnets, plus ou moins individualisées et
non mobiles. Les résultats consignés dans le tableau 6 et illustrés dans la figure 8.
D’après les caractéristiques culturales et micromorphologiques, de la souche AHO23
est été classée dans le genre Saccharothrix. Leur MA se fragmente anarchiquement en chaînes
de spores moins individualisées et qui ne laissent pas d’espaces entre elles.

Figure 8. Macromorphologiques(A) et Micromorphologie(B) de la souche AHO23. Les

chaine de spores de la souche AHO23 poussant sur milieu ISP2 et observés au microscope
optique (grossissement 10 x 40).

33
Chapitre IV Résultats et discussion

Les Caractéristiques culturales

Milieu de Pigment
Croissance mycelium de
culture mycelium Aérien soluble
Substrate
+ beige à beige Brun rougeâtre très ++++ rouge
ISP2 +++
moyen foncé foncé
++ rose à rose +++ orange
ISP4 ++ ++ orange moyen
orangé moyen
rose blanchâtre à rose
CHV ++ + rose blanchâtre ± rose clair
très clair

Tableau 6 : Caractéristiques culturales de la souche AHO23.

IV.1.1.1.2. Caractéristiques physiologiques
L’étude physiologique concerne l’isolat de la souche AHO23 dans le but de la différencier
de celle de l’espèce Saccharothrix xinjiangensis appartenant au même groupe morphologique,
les résultats sont résumés dans le tableau 7.
Tableau 7 : Comparaison des caractéristiques physiologiques de la souche AHO23
Avec l’espèce de Saccharothrix xinjiangensis.
Tests AHO23 Saccharothrix xinjiangensis NBRC
101911T (AB381939)
Utilisation de source de carbone :
L-arabinose + +
Lactose + +
Raffinose - +
L-rhamnose + +
D-sucrose + +
D-xylose + +
Methyl α-D-glucose - +
D- sorbitol - -
Melibiose - +
Hydrolyse de :
Gelatin ++ Nd
Citrate Nd Nd
Lactate Nd Nd
Starch + +
Tyrosine + -
Nitrate reduction + -
Croissance en presence de:
5% NaCl (w/v) - -

Note : + : test positif ; – : test négatif ; Nd : non déterminé.

34
Chapitre IV Résultats et discussion

Les résultats des tests physiologiques au niveau de ce tableau montrent :

 Les ressemblances entre la souche AHO23 et Saccharothrix xinjiangensis dans
l’utilisation de L’arabinose, Lactose, L-rhamnose, D-sucrose, D-xylose, et dans
l’hydrolysation de Starch. La souche AHO23 et Saccharothrix xinjiangensis poussent
en présence de 5% de NaCl (w/v).
 Les différences sont au niveau de la dégradation de Raffinose, Methyl α-D-glucose,
Melibiose et l’hydrolysation de Tyrosine et la réduction de nitrate.

IV.1.1.1.3. Caractéristiques phylogénétiques

Figure 9 :.Arbre phylogénétique (neighbor-joigning) basé sur l’analyse des séquences du

gène codant pour l’ARNr 16S de la souche AHO23.
Note : Les nombres figurant au niveau des nœuds indiquent les pourcentages du « bootstrap
», et la barre indique 0,005 substitutions par position de nucléotide. L’espèce Lechevalieria
flava est ajoutée comme “outgroup”.

35
Chapitre IV Résultats et discussion

La souche AHO23 est révélée appartenir au genre Saccharothrix. Ce genre, mis en

évidence pour la première fois par Labeda et al., (1984), a été également isolé à partir des sols
sahariens où plusieurs nouvelles espèces ont pu être décrites suite aux travaux de laboratoire
LBSM. C’est le cas de Saccharothrix algeriensis (Zitouni et al., 2004a), Saccharothrix.
Saharensis et Saccharothrix. hoggarensis (Boubetra et al., 2013), ainsi que Saccharothrix.
tamanrassetensis (Boubetra et al., 2015). De même, les résultats de l’étude physiologique,
renforcés par ceux de l’étude moléculaire, ont montré que cette souche se rapproche de
différentes espèces appartenant à ce genre.
L’analyse de la fraction du gène codant pour l’ARNr 16S de la souche AHO23, a permis
de confirmer les résultats des études phonétiques quant à leur appartenance au genre
Saccharothrix, avec des taux de similarités compris entre 97 et 98,60 % selon les espèces.
L’espèce la moins différente étant Saccharothrix xinjiangensis (Labeda et Lyons, 1989), avec
un pourcentage de similarité de 99,64 %. L’arbre phylogénétique obtenu (Figure 9) a montré
que cette souche est proche entre elle et forme un cluster avec cette espèce. Des pourcentages
de similarité inferieur s à 98,65 % ont été également enregistrés avec Saccharothrix
hoggarensis.

IV.1.1.2. Discussion
L’exploitation du genre Saccharothrix effectuée dans les sols sahariens de la région de
Tamanrasset. Cette région occupe une place de choix parmi les sols sahariens d’Algérie qui
représentent des écosystèmes extrêmes et particuliers, révélés être et riches en genre
Saccharothrix. Les travaux effectués par Sabaou et al. (1992 et 1998), Boudjella (1994),
Zitouni (1995), Zitouni et al. (2004), Badji et al. (2005, 2007), Meklat (2012), Aouiche
(2013) et Saker (2015) ont montré la richesse de ces sols en actinobactéries, y compris des
genres rares ou peu fréquents.
Dans ce travail, une étude taxonomique a été élaborée pour identifier notre souche, avant
d’entamer le protocole de production d’antibiotique. Cette étude repose sur les caractéristiques
morphologiques (macro et micromorphologiques), physiologiques (par utilisation de composés
organiques et tester la sensibilité à certains agents physiques et chimiques), et moléculaires
(séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S et hybridation ADN/ADN) (Goodfellow et al.,
2012).
En premier lieu, nous avons examiné la morphologie de la souche AHO23, les résultats
de cette étude sont illustrés dans la figure 8 et dans le tableau 6. Cela nous permet de classer
provisoirement la souche AHO23 au genre Saccharothrix.

36
Chapitre IV Résultats et discussion

La souche AHO23 possède un mycélium aérien qui se fragmente de manière anarchique

en longues chaînes de spores immobiles (souvent en zig-zag) et un mycélium du substrat
fragmenté.
D’après Labeda et al en 1984, la caractéristique macro et micromorphologiques de la
souche AHO23 ressemblent absolument à celles du genre Saccharothrix, en plus de certains
détails comme l’absence d’espaces entre les spores du MA et la fragmentation parfois exagérée
du mycélium du substrat montrent l’appartenance de ces souches au genre Saccharothrix.
En second lieu, nous avons étudié les caractéristiques physiologiques et moléculaires de
l’isolat d’actinobactérie afin de confirmer les genres et de déterminer les espèces le plus
proches.
La variabilité des résultats des tests physiologiques entre la souche AHO23 et
Saccharothrix xinjiangensis NBRC101911T (AB381939) au sein d’un même groupe
morphologique sont présentés dans le tableau 7, nous laissent supposer que cette souche
pourrait appartenir à une nouvelle espèce du genre Saccharothrix. Toutefois, leur originalité
reste à confirmer par des hybridations ADN-ADN pour assurer leur position taxonomique.
Cependant, l’arbre phylogénétique illustré par la figure 9 montre que cette souche constitue une
lignée qui s’est révélée être bien distincte de toutes les espèces existantes de Saccharothrix.
Tous ces résultats, confirment fortement que la souche AHO23 appartient à une nouvelle
espèce du genre Saccharothrix.

IV.2.PRODUCTION DES ANTIBIOTIQUES PAR LA SOUCHE AHO23

IV.2.1. Mise en évidence de l’activité antagoniste de la souche AHO23 sur milieu solide

IV.2.1.1 Résultats
La souche AHO23 de Saccharothrix sp. a été testée pour son pouvoir antagoniste par la
méthode des cylindres d’agar sur milieu solide ISP2 contre divers germes cibles dont des
bactéries à Gram positif, à Gram négatif, des champignons filamenteux et une levure. Les
distances d’inhibition de la croissance des germes-cibles sont consignées dans le tableau 8.

37
Chapitre IV Résultats et discussion

Tableau 8 : Activité antagoniste de l’isolat AHO23 de Saccharothrix sp. contre les germes-
cibles par la méthode des cylindres d’agar.
Les microorganismes cibles zone d’inhibition (mm)

Staphylococcus aureus (MRSA 639c) 29

Staphylococcus aureus (S) 33

Listeria monocytogenes (ATCC 13932) 30

Bacillus subtilis (ATCC 663) 34

Escherichia coli (ATCC 8739) 34

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) 15

Acinetobacter baumannii (S54) 26

Salmonella typhi (ST) 0

Agrobacterium(Agro) 32

Aspergillus carbonarius (AC) 24

Aspergillus westerdijkiae (ATCC 3174) 26

Aspergillus fumigatus (AF) 21
Aspergillus ochraceus (A0) 23
Umbelopsis ramanniana (NRRL 1829) 22

Penicillium exapansum (Pe) 25

Penicillium glabrum (Pg) 30
Fusarium poae (Fp) 24
Fusarium culmorum (Fc) 36
Candida albicans (M3) 20

Les résultats obtenus montrent une activité variable de la souche AHO23 de

Saccharothrix sp. vis-à-vis des germes cibles testés. Cette souche a présenté un effet
antimicrobien remarquable contre tous les germes-cibles, avec une zone d’inhibition plus
importante contre le champignon filamenteux Fusarium culmorum (36 mm), ainsi que les
bactéries à Gram positif telles que Bacillus subtilis (34mm), Staphylococcus aureus (33mm) et
Listeria monocytogenes (30mm).
Cependant la souche a montré une activité moyenne entre (26mm et 20mm) contre les
autres champignons filamenteux et la levure. Ainsi contre les bactéries à Gram négatif telles

38
Chapitre IV Résultats et discussion

qu’E. coli avec une zone d’inhibition de 34 mm, Agrobacterium (32mm) et Acinetobacter
baumannii avec 26mm, Pseudomonas aeruginosa (15mm) sauf Salmonella typhi (0mm) qu’elle
présente plus de résistance par rapport aux autres.

IV.2.1.2. Discussion
La souche AHO23 de Saccharothrix sp. cultivée dans le milieu ISP2 est active contres
tous les microorganismes testés. Le choix de l’ISP2 comme milieu de culture est basé sur les
travaux de Badji (2006), Boudjella (2007), Aouiche (2013), Boubetra (2013), Toumatia
(2015) et Driche (2016) qui ont tous obtenu de très bons résultats avec ce milieu de culture par
rapport à d’autres milieux. Le milieu ISP2 est riche en éléments nutritifs (milieu complexe),
fournit des facteurs de croissance et d’autres précurseurs qui favorisent la production des
antibiotiques par les souches d’actinobactéries.
Le pouvoir antimicrobien de la souche d’actinobactérie mycélienne a été évalué par la
méthode des cylindres d’agar contre 20 microorganismes-cibles. Cette méthode convient mieux
à mesurer la sensibilité des microorganismes cibles à l’antibiotique testé. Une bonne activité
antimicrobienne a été obtenue par la souche AHO23. En effet d’autres travaux précédents ont
montré des propriétés antagonistes intéressantes des espèces appartenant au genre
Saccharothrix (Lamari et al., 2002 ; Zitouni et al. 2004a ; Merrouche et al., 2011; Aouiche
et al., 2012; Boubetra, 2013 et Bouznada, 2018). Le genre Saccharothrix est connu comme
regroupant des espèces et des souches productrices de plusieurs antibiotiques à spectre d’action
assez large.
Ces substances actives appartiennent à des familles et à des groupes différents, tels
que les aminoglycosides et les benzoquinones (Takahashi et al., 1986), les glycopeptides
(Takeuchi et al., 1992), les nucléosides carboxyliques (Bush et al., 1993), les
heptadécaglycosides (Singh et al., 2000), les dithiolopyrrolones (Lamari et al., 2002;
Merrouche et al., 2010; Merrouche et al., 2011),les anthracyclines (Zitouni et al., 2004), les
macrolides (Powell et Roush, 2001; Zitouni, 2005; Murakami et al., 2009), les angucyclines
(Kalinovskaya et al., 2010), les aromatiques benzéniques (Aouiche et al., 2012) , les
cyanogrisides (Lahoum, 2017) et les phénicolés (Aouiche et al., 2012).
Une bonne activité antimicrobienne a été observée contre toutes les bactéries Gram
positif et les champignons et à degré moindre chez la levure, tandis que l’activité était moyenne
vis-à-vis les bactéries à Gram négatif par rapport à leurs homologues les Gram positif.
Les résultats obtenus par plusieurs auteurs ont mentionné que la plupart des
antibiotiques sécrétés par les souches de Saccharothrix ciblent surtout les bactéries à Gram

39
Chapitre IV Résultats et discussion

positif et rarement dirigée contre les bactéries à Gram négatif. Cependant, le cas de
Saccharothrix spp.MB29 de Bouznada (2018) n’a enregistré aucune activité contre E. coli, par
contre notre souche AHO23 a noté des résultats contre trois bactéries à gram négatif qui sont
E. coli, Agrobacterium et Acinetobacter. En revanche les bactéries à Gram négatif se sont
révélées plus au moins résistantes comme Salmonella typhi dans notre cas (Takeuchi et al.,
1992; Kinoshita et al., 1999; Wang et al., 2000; Lamari et al., 2002a; Zitouni, 2005). Les
études ont déclaré que l’intensité de cette résistance est due en premier lieu, à l’enveloppe des
bactéries à Gram négatif qui peut moduler la diffusion de l’antibiotique de son entrée par les
porines situés sur la membrane externe, ainsi réguler son expulsion par le transport actif assuré
par les pompes d’efflux qui se traversent les deux membranes de l’enveloppe (Gupta et al.,
2011).
En second lieu, à l’occurrence facile de ces microorganismes aux plasmides portants des
gènes de résistance mobiles (Carattoli et al., 2006 ; Carattoli, 2009).

IV.2.2. Cinétique de croissance, de PH et de production des antibiotiques par la souche

AHO23 en milieu liquide

IV.2.2.1. Résultats
Une cinétique de croissance, de PH et de production des molécules bioactives par la
souche AHO23 a été suivie quotidiennement pendant 10 jours d’incubation sur deux milieux
de culture liquides de nature différente (le milieu ISP2, le milieu MS ajoutée de dextrine) dans
le but de déterminer le milieu le plus favorable à la production d’antibiotique et le temps
d’incubation nécessaire à cette production. Cette étude a été effectuée par la méthode de
diffusion des puits contre Escherichia coli (Ec), Listeria monocytogenes (Lm), Staphylococcus
aureus 639 (Sa.S639), Aspergillus carbonarius (AC), Aspergillus ochraceus (AO), Fusarium
culmurum (FC) et Umbelopsis ramanniana (UR).

IV.2.2.1.1 Milieu ISP2

Les résultats illustrés par la figure 12 montrent que la croissance débute par une phase
d’accélération au 1er jour, suivi d’une phase exponentielle entre le 1er et 3ème jour, cette phase
est accompagnée d’une augmentation du poids sec à cause de la ramification du mycélium. Et
elle la suit une phase stationnaire (J3 à J5), ensuite une courte phase de déclin entre le 5 ème et
le 7ème jour .Au-delà du 7ème jour, il est noté l’apparition d’une deuxième phase exponentielle
du 7ème jour au 10ème jour avec une courte phase stationnaire entre le 9ème et 10ème jour.

40
Chapitre IV Résultats et discussion

Sur le milieu ISP2, le PH s’acidifie légèrement de (PH=7.2) à (PH=6,7) entre le 1er et

le 2éme jours, puis il augmente de nouveau d’une manière progressive jusqu’au 10ème jour
(PH=8.4).
La production de molécules antibactériennes contre E. coli, et L. monocytogenes
commence à apparaitre dès le premier jour de la cinétique. Par la suite, cette activité augmente
progressivement et atteint son maximum le 6ème jour, ensuite une légère diminution a été
remarquée, puis elle a progressé de nouveau pour la deuxième fois au 9ème. L’activité contre
Sa.S639, n’est remarquée qu’à partir du 4ème jour, elle augmente graduellement pour atteindre
un premier pic au 6ème jour et un deuxième pic au 9ème jour.
L’activité antifongique débute le 4ème jour de la cinétique. Les meilleures activités ont
été notées par F.culmurum avec 2 maximas (le 6éme et le 7éme jour) ainsi que A. carbonarius
avec une maximum activité pendant le (5éme et le 9éme jour). Alors que des bonnes activités
ont été enregistrées par U.ramanniana et A. ochraceus pendant les deux maximas (6éme et
10éme jour). Chaque maximum est suivi par une diminution graduelle de l’activité.

Figure 10 : Cinétique de croissance, de PH et de production des antibiotiques par la souche AHO23

sur le milieu ISP2.

41
Chapitre IV Résultats et discussion

IV.2.2.1.2 Milieu MS additionnée de dextrine

La croissance de la souche AHO23 dans le milieu synthétique additionnée de dextrine,
débute par une phase d’accélération et une phase exponentielle entre le 1er et le 3ème jour, suivi
d’une phase stationnaire (J3 à J5), puis une phase de déclin qui commence à partir de 5ème jour
jusqu’à la fin de la cinétique.
Au cours de cette croissance, L’évolution du PH connait d’abord une acidification du
milieu (PH=5,7) entre le 1er et le 3ème jour, puis une basification progressive est remarquée
jusqu’au dernier jour de culture (PH=8,2).
Dans ce milieu de production, les activités antibactériennes vis-à-vis L.monocytogenes
et E. coli est détectée dès le 1er jour de la cinétique par contre Sa.S639 commence le 2ème jour,
cette activité augmente graduellement pour atteindre une valeur maximale lors du 5ème jour.
Simultanément les activités antifongiques apparaissent le 4ème jour de la cinétique, cette
activité est traduit par deux maxima le 5éme et 9éme jour (la phase stationnaire) pour A.
carbonarius et U.ramanniana, et par trois maxima le 5ème, 8ème et 10ème jour (la phase
stationnaire et la phase exponentielle) pour F.culmurum et A. ochraceus. Chaque maximum est
suivi par une diminution graduelle de l’activité.

Figure 14 : Cinétique de croissance, de PH et de production des antibiotiques par la souche AHO23

en milieu MSD.

42
Chapitre IV Résultats et discussion

IV.2.2.2. Discussion
Les résultats obtenus dans la figure 10 montrent que la courbe de croissance du milieu
ISP2 est caractérisée par la présence de deux phases exponentielles (phénomène de diauxie)
séparée par une phase stationnaire. Ce phénomène s’observe lorsque le milieu contient deux
sources de carbones, telles que le glucose et le lactose, le glucose et le galactose ou le glucose
et le xylose (Prescott et al., 2013), mais peut également se manifester en présence d’une seule
source de carbone et une d’azote, comme le glucose dans notre cas.
Pendant la première phase exponentielle, les acides aminés de l’extrait de levure sont
utilisés comme source de carbone et d’azote avec une faible consommation du glucose comme
source d’énergie et durant la deuxième phase le glucose est utilisé comme source de carbone et
d’énergie.
Cependant le PH du milieu ISP2 subit une acidification après le 1er jour, puis le PH
s’augmente progressivement, et pour le milieu MSD est subit une acidification dès le 1er jour
suivie par une alcalinisation jusqu’au dernier jour de la cinétique.
La diminution du PH dans les deux milieux est à cause de la dégradation des glucides (Strub,
2008 ; Boubetra, 2013), alors que l’alcalinisation des milieux est expliquée par l’utilisation des
acides aminés présents dans l’extrait de levure, qui sont désaminés pour libérer de
l’ammonium ; l’accumulation de ce dernier provoque l’augmentation du PH du milieu. La
deuxième augmentation du PH dans le milieu ISP2 indique l’existence de deux phases
exponentielles (phénomène de diauxie).
Nos résultats, montrent que la souche AHO23 a fourni une meilleure production des
antibiotiques et une forte activité antimicrobienne dans le milieu ISP2 (riche en extrait de malt
et contenant l'extrait de levure comme sources d'azote) mieux que le milieu MS-dextrine
(contenant le sulfate d'ammonium comme seule source d'azote), qui a donné par son rôle des
bonnes résultats en comparant par les autres milieux de cultures cités dans la partie matériels et
méthodes.
Presque les mêmes résultats ont été approuvés par (Badji, 2006 et Boudjella, 2007)
qui ont testé presque la plupart des milieux à cet effet, et ont trouvé que l’ISP2 a été le
meilleur choix pour la production d’antibiotiques.
La production moindre des antimicrobiens dans le milieu MS par rapport au celle du
milieu ISP2 pourrait être expliquée par le manque de l'extrait de levure et de malt qu’ils jouent
un rôle déterminant dans la synthèse des antimicrobiens. L'extrait de levure, de part de sa
composition, constitue une source d'azote riche et diversifiée très utilisée pour la production
des antibiotiques (Isshiki et al., 1989; Takeuchi et al., 1992; Kinoshita et al., 1999; Vertesy

43
Chapitre IV Résultats et discussion

et al., 2001; Lamari et al., 2002 ; Pandey et al., 2005 ; Gao et al.,2009). Il pourrait aussi que
la présence d’une grande quantité de dextrine dans le milieu synthétique (une concentration de
10g/l) exerce un effet négatif à la biosynthèse des molécules bioactives. Cet effet dépend de la
dose puisque plusieurs auteurs ont constaté que les fortes concentrations de glucose ou d'autres
sources carbonées rapidement catabolisables sont généralement défavorables à la production
(Martin et Demain, 1980 ; Demain et al., 1983).
Dans notre cas, il semblerait que la quantité de dextrine n'exerce pas forcément un effet
répressif sur la production de molécules antimicrobiennes par la souche AHO23, mais il faut
noter que la production des antibiotiques en milieu ISP2 contenant 4g de glucose est meilleure
que le milieu MS qui contient 10 g de source de carbone (dextrine).
Nous avons noté aussi que la production des molécules bioactives par la souche AHO23
a eu lieu au cours de la phase stationnaire et la phase de déclin (entre le 5ème et le 6ème jour).
C’est un temps moyen puisque le maximum de production des antibiotiques en milieu liquide
chez les actinobactéries, varie souvent de 3 à 14 jours. Généralement les microorganismes
produisent les métabolites secondaires durant les phases de ralentissement et stationnaire, mais
dans le cas des actinobactéries, cette production peut avoir lieu parfois au tout début de la phase
exponentielle ou encore durant la phase de déclin (Zitouni, 2005 ; Badji, 2006), ce qui
correspond à notre cas ou l’excrétion des antibiotiques se manifeste après la lyse des cellules.
De ce fait, on peut conclure que le premier choix à la production des métabolites
secondaire par la souche Saccharothrix sp.AHO23 c’est milieu ISP2, puis s’installe le milieu
synthétique ajoutée de dextrine en deuxième.

IV.3. Etude des molécules bioactives produites par Saccharothrix sp. AHO23

IV.3.1. Résultats

IV.3.1.1. Extraction et mise en évidence des antibiotiques par antibiographie

Les molécules bioactives secrétées par Saccharothrix sp. AHO23 sur milieu ISP2
liquide (le milieu le plus favorable pour la production des antibiotiques) sont extraits le 6ème
jour de culture (jour optimale de production). Le filtrat de culture est récupéré par centrifugation
et les antibiotiques sécrétés sont testés dans une ampoule à décanter par quatre solvants
organiques de polarités différentes (dichlorométhane, acétate d’éthyle, butanol et hexane). Les
extraits organiques sont concentrés à sec, puis récupérés dans 1 ml de méthanol pour tester leur
activité par la méthode des disques de papier (antibiographie) vis-à-vis Escherichia coli
(E.coli), Listeria monocytogenes (Lm), Staphylococcus aureus 639 (Sa.S639), Aspergillus

44
Chapitre IV Résultats et discussion

carbonarius(AC), Aspergillus ochraceus(AO), Fusarium culmurum(FC) et Umbelopsis

ramanniana(UR), afin de sélectionner le meilleur solvant d’extraction. Les résultats de
l'extraction des antibiotiques à activité antimicrobienne par les quatre solvants sont consignés
dans le tableau 9 et sont illustrés dans la figure 12.

Tableau 9 : Zones d’inhibition (mm) de la phase organique de la souche AHO23 issue de

l’extraction par l’utilisation des 04 solvants organiques.

BACTERIES CHAMPIGNONS
ISP2
LM E. coli Sa639 AO AC UR FC
50 54 15 32 20
Dichlorométhane 46 mm 35 mm 15 mm
mm mm mm mm mm
54 56 22 27 20
Acétate d’éthyle 46 mm 42 mm 18 mm
mm mm mm mm mm
60 62 25 45 25
Butanol 45 mm 47 mm 20 mm
mm mm mm mm mm
Hexane 0 0 0 0 0 0 0 0

Selon les résultats de tableau 9 l'activité antibactérienne et antifongique est détectée dans
les phases organiques des extraits au dichlorométhane, à l'acétate d'éthyle et au butanol, mais
pour l’hexane aucune activité n’est détectée dans ces extraits de la souche AHO23.
Le dichlorométhane a été retenu de nos expérimentations comme le meilleur solvant
d'extraction des composés bioactifs pour le milieu ISP2 même si son pouvoir d'extraction est
légèrement moindre que celui de butanol et d’acétate d'éthyle.

Figure 12 : Activité antibactérienne de l’extrait organique de la souche AHO23.

a: L. monocytogenes sur milieu ISP2, b: E. coli sur milieu ISP2

45
Chapitre IV Résultats et discussion

IV.3.1.2. Purification des molécules bioactives par HPLC

L’analyse par HPLC a été effectuée pour l’extrait au dichlorométhane provenant de la
culture de la souche AHO23 sur le milieu ISP2 et après une incubation de 6 jours à 30C°. Les
extraits analysés sont concentrés à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif à 35°C, récupérés par le
méthanol, afin de purifier les composés bioactifs par HPLC (figure 13). Le volume récupéré est
filtré par un filtre seringue, puis injecté dans l'HPLC La détection se fait à 220 nm et à 575 nm.
Á 220 nm l’extrait organique de la souche AHO23 a donné 14 pics dont 7 sans colorée.
Cinq pics sont majoritaires et neuf pics sont minoritaires. En revanche, une seule fraction (pic
8) est détectée à 450 nm car les fractions non colorées n’absorbent pas à cette longueur d’onde,
La détection se fait pendant 60min les résultats obtenus sont illustrés dans la figure 14.

Figure 13 : L’extrait organique obtenu par le dichlorométhane provenant à partir

d’une culture de la souche AHO23 sur le milieu ISP2 pendants 6jours.

46
Chapitre IV Résultats et discussion

Figure 14 : Profil d’élution en HPLC analytique obtenu à 575 nm de l’extrait au

dichlorométhane de la souche AHO23.
IV.3.2. Discussion
L’activité antibiotique des substances secrétées par la souche AHO23 a été mise en
évidence dans la phase organique avec l’utilisation de quatre solvants organiques, ces
substances actives ont été ensuite récupérées par le méthanol qui présente un pouvoir
d’extraction important grâce à sa polarité élevée et permet la faciliter d’extraction à partir du
milieu de culture
Le choix du meilleur solvant d'extraction de l'activité antibiotique repose sur le travail
du solvant, où il doit extraire une bonne activité antimicrobienne, avec moindre d'impuretés.
Tel est le cas pour le dichlorométhane qui s’est avéré d’être le meilleur solvant d’extraction,
car il rend le processus de purification par HPLC relativement plus facile (Lamari, 2002a ;
Zitouni, 2005 ; Merrouche, 2012). Par rapport au butanol qui rend les purifications et la
récupération des résidus par le méthanol plus difficiles, avec beaucoup d'impuretés (Zitouni,
2005 ; Boudjella, 2007).
L’analyse par HPLC de l’extrait organique au dichlorométhane de la souche AHO23 a
indiqué la présence de 14 pics. Chaque pic peut correspondre à un antibiotique de nature

47
Chapitre IV Résultats et discussion

chimique différente. En effet, plusieurs études ont montrés que les espèces d'actinobactéries
appartenant au genre Saccharothrix ont la capacité de produire un grand nombre
d’antibiotiques, telle que Saccharothrix algeriensis qui produit plus d’une vingtaine de
molécules d’antibiotiques appartenant à la famille des dithiolopyrrolones (Lamari et al., 2002 ;
Merrouche et al., 2010 et Merrouche et al. 2011).

48
Conclusion et perspectives
 Conclusion et perspectives

Conclusion et perspectives
Dans nos jours, l’intérêt à découvrir des solutions efficaces au phénomène de multi
résistance des microorganismes pathogènes pour l’homme et d’autres êtres vivants est plus
urgent que contrôler la propagation de ces microorganismes multi résistants. Ce qui nécessite
la découverte de nouveaux antibiotiques. Les actinobactéries mycéliennes constituent une
source très importante en antibiotiques notamment ceux apparentent à des genres rares ou peu
fréquents et provenant des environnements extrêmes et particuliers, tels que le genre
Saccharothrix.
Le présent travail qui rentre dans le cadre d’un axe de recherche du Laboratoire de
Biologie des Systèmes Microbiens (LBSM) de l'Ecole Normale Supérieure de Kouba-Alger,
vise à étudier le pouvoir antagonisme et la production des antibiotiques à partir de la souche
AHO23 provenant des sols non exploités de la région de Tamanrasset.
Les résultats des tests phénotypiques (macromorphologique et micromorphologique)
ainsi que l’ensemble des critères physiologiques et génomiques ont permis d’affilier la souche
AHO23 au genre Saccharothrix. Avec des taux de similarités compris entre 97 et 99,64 % selon
les espèces. La souche la plus proche étant Saccharothrix xinjiangensis avec un pourcentage de
similarité de 99,64 %.
Les résultats de l’antagonisme ont montré que notre souche (AHO23) présente une
bonne activité contre différentes bactéries pathogènes Listeria monocytogenes (30mm),
Bacillus subtilis (34mm), Escherichia coli (34mm) et une bonne activité contre quelques
champignons Fusarium culmorum (36mm), Penicillium glabrum (30mm), Aspergillus
westerdijkiae (26mm).
Les résultats obtenus lors des cinétiques de production des antibiotiques de la souche
AHO23 sur les différents milieux de culture ont montré qu’une meilleure activité contre les
germes cibles a été enregistrée sur les milieux ISP2 et MS-dextrine liquides. La croissance est
diauxique sur le milieu ISP2 et la production maximale des antibiotiques est obtenue durant la
phase exponentielle et la phase de déclin (entre le 6éme et le 9 éme jour). Donc le milieu ISP2 est
retenu pour la production finale des antibiotiques, lesquels ont été extraits par le
dichlorométhane qui a été sélectionné comme le meilleur solvant d’extraction et de purification
des molécules actives.
L’analyse par HPLC a révélé quatorze piques antibiotiques, dont quelques-uns sont
antibactériens et d’autres sont antifongiques ou les deux à la fois.

49
 Conclusion et perspectives

Notre travail représente une première ébauche sur la production des antibiotiques par la
souche Saccharothrix sp. (AHO23), et qui mérite d’être exploitée, poursuivie et approfondie.
Les perspectives de cette étude sont multiples, dont les principales peuvent être résumées
ci-après :
 Elargir le nombre et la gamme des germes cibles (bactéries et champignons), ainsi que
la mise en évidence d’autres activités biologiques telles que (les activités
antiparasitaires, antivirales et antitumorales,…etc.).
 La réalisation de certains tests complémentaires pour déterminer par exemple la toxicité,
la perméabilité, la solubilité,…etc, des antibiotiques sécrétés.
 Purification des différents piques obtenus, faire l’activité anti-biographie et définie leur
structures chimiques (spectroscopie UV-VIS, Spectroscopie IR, la RMN et la
spectrométrie de masse).

 Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI).

50
Références bibliographiques
 Références bibliographiques

A-

 Ababutain, I. M., Zeinab, K., Abdul, A. and Nijla, A. A. (2013). Optimization of

environmental and nutritional conditions to improve growth and antibiotic productions
by Streptomyces Sp. Isolated from Saudi Arabia Soil. International Research Journal
of Microbiology (IRJM)., 4(8) : 179-187.
 Abriche, A. et Benamira M. (2018). Etude de l’activité antibactérienne d’une
collection d’actinomycètes Thermophiles et étude prospective de l’antibiose de certains
aliments commercialisés en Algérie. Mémoire de Master en Ecologie Microbienne.
Université des Frères Mentouri, Constantine.3-67p.
 Afroune, S. et Barache, Y. (2014). Criblage des paramètres de culture influents sur la
production d’antibiotiques par une souche d’actinomycète par un plan d’expérience de
Plackett et Burman. Mémoire de Master en Biotechnologie Microbienne. Université
Abderrahmane Mira, Bejaïa.64p.
 Agoulmine, I. (2019). Identification phylogénétique de quelques actinobactéries des
sols sahariens et potentiel antagoniste contre Listeria monocytogenes et Staphylococcus
aureus résistant à la méthicilline. Mémoire de Master en Microbiologie appliquée.
Université Djilali Bounaama, Khemis Miliana.4-39p.
 Ait Barka, E., Vatsa, P., Sanchez, L., Gaveau-Vaillant, N., Jacquard, C., Klenk, H.,
Clément, C., Ouhdouch, Y.et van Wezel, G. (2016). Taxonomy, Physiology, and
Natural Products of Actinobacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews., 80
(01) :1-43.
 Aouiche, A., Sabaou, N., Meklat, A., Zitouni, A., Bijani, C., Mathieu, F. &
Lebrihi, A. (2012). Saccharothrix sp. PAL54, a new chloramphenicol-producing
strain isolated from a Saharan soil. World J. Microbiol. Biotechnol., 28: 943–951.
 Aouiche, A. (2013). Taxonomie et antibiotiques de quelques souches de Streptomyces
et de Saccharothrix des sols de Ghardaïa actives contre des microorganismes
pathogènes et toxinogènes pour l’homme. Thèse de Doctorat. École Normale
Supérieure de Kouba, Alger. 159 p.
 Arab, S .et Kabaz, N. (2018). Effet de quelques sources de carbone et d'azote sur la
production des antibiotiques par la souche TAS18 d'Actinomadura sp. isolée d'un
sédiment marin de Tipaza. Mémoire de Master en Microbiologie appliquée. Université
Saad Dahleb, Blida.54p.
 Références bibliographiques

 Asselineau, J. et Zalta, J. P. (1973). Les antibiotiques : structure et exemples de mode

d’action. Hermine, Paris. 364 p.
 Aszalos, A. (1986). Modern analysis of antibiotics. Drugs and the pharmaceutical
sceineces. Vol.27. Ed, Marcel Dekker, Inc.
 Awad, G. (2005). Caractérisation et étude de l’effet des sources de carbone et d’azote
sur la production de nouveaux metabolites secondaires chez Aspergillus ochraceusnon
producteur de l’ochratoxine A. Thèse de Doctorat en Génie des Procédes. L’institut
National Polytechnique de Toulouse, France. 175p.
-B-
 Badji, B(2006). Etude de la taxonomie et des antibiotiques antifongiques de trois
souches d’actinomycètes d’origine saharienne appartenant aux genres Actinomadura et
Nonomurea. Thèse de doctorat. Université Mouloud Mammeri, Tizi-Ouzou.226 P.
 Badji, B., Riba, A., Mathieu, F., Lebrihi, A.et Sabaou, N. (2005). Antifungal activity
of a Saharan Actinomadura strain against various pathogenic and toxinogenic fungi. J.
Mycol.Méd, .15(4) :211- 219.
 Badji, B., Mostefaoui, A., Sabaou, N., Lebrihi, A., Mathieu, F., Seguin, E. &
Tillequin, F. (2007).Isolation and partial characterization of antimicrobial compounds
from a new strain Nonomuraea sp. NM94. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 34: 403–412.
 Baoxin, Z., Xiangjing, W. and Wensheng, X. (2011). Optimization of fermentation
medium for enhanced production of milbemycin by a mutant of Streptomyces
bingchenggensis BC-X-1 using response surface methodology.African Journal of
Biotechnology., 10: 7225-7235.
 Barrett, D. (2002). From natural products to clinically useful antifungals.
Biochemica.Biophysica Acta., 1587 :224-233.
 Belferkh, A Megoura, M. (2016). Isolement des actinomycètes à partir d’un sol
Saharien et d’une Sebkha de la région d’El-Oued et mise en évidence de leur capacité à
dégrader quelques pesticides. Mémoire de Master en Microbiologie Générale et
Biologie moléculaire des Microorganismes. Université des Frères Mentouri,
Constantine.p12-41.
 Belyagoubi, L. (2014). Antibiotiques produits par des bactéries (actinomycètes et
bactéries lactiques) issus de différents écosystèmes naturels Algériens .Thèse de
Doctorat en Biologie. Université Aboubakr Belkaïd, Tlemcen. 9-145p.
 Références bibliographiques

 Ben Mahrez, S et Ikhlef, N. (2015). Optimisation des paramètres de la production

d’antibiotiques par une souche d’actinomycète en utilisant un plan d’expérience.
Mémoire de Master en Biotechnologie Microbienne. Université Abderrahmane Mira,
Bejaia. 47p.
 Benaissa Yahia, K et Boufetta, K. (2018). Production d’antibiotiques antibactériens
par la souche TAM13 de Saccharothrix sp. isolée d’un sol de la région de Tamanrasset.
Mémoire de Master en Microbiologie. Université Saad Dahleb, Blida 1. 6-42p.
 Bendris, O. et Yous, K. (2017). Mise en évidence d’activités biologiques d’une souche
d’actinomycète isolée de sédiments marins. Mémoire de Master en Sciences
Biologiques. Université Abderrahmane Mira, Bejaia.3-37p.
 Bezari, H et Ouali, F.Z. (2016). Mise en évidence et amélioration de la production de
molécules bioactives d’une souche d’actinobactérie Saccharotrix tamanrassentensis
SA198 isolée d’un sol saharien. Mémoire de Master en Microbiologie et Bactériologie.
Université de Blida.7-65p.
 Boubetra, D. (2013). Nouvelles espèces de Saccharothrix isolées des sols sahariens et
nouveaux antibiotiques secrétés par Saccharothrix SP. SA198.Thèse de Doctorat en
Sciences Agronomiques. Ecole Nationale Supérieure Agronomique, Alger.26-140p.
 Boubetra, D., Zitouni, A., Bouras, N., Mathieu, F., Lebrihi, A., Schumann, P.,
Sproer, C., Klenk, H.P.et Sabaou, N. (2013b). Saccharothrix hoggarensis sp. nov., an
actinomycete isolated from Saharan soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 63 :549–553.
 Boubetra, D., Zitouni, A., Bouras, N., Mathieu, F., Lebrihi, A., Schumann, P.,
Sabaou, N. (2013a). Saccharothrix saharensis sp. nov., an actinomycete isolated from
Algerian Saharan soil. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology., 63(10) : 3744–3749.
 Boubetra, D., Zitouni, A., Bouras, N., Schumann, P., Spröer, C., Klenk, H., &
Sabaou, N. (2015). Saccharothrix tamanrassetensis sp. nov., an actinomycete isolated
from Saharan soil. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.,
65 :1316–1320.
 Boudekique, K et Cedah, M. (2016). Étude de quelques activités enzymatiques d’une
collection d’actinomycètes. Mémoire de Master en Microbiologie Générale et Biologie
Moléculaire des Microorganismes. Université des Frères Mentouri, Constantine. 52 p.
 Boudjella, H. (1994). Influence des milieux de culture, des antibiotiques et du
prétraitement des échantillons à la chaleur sur la sélection des genres et des espèces
 Références bibliographiques

d'actinomycètes rares de quelques sols sahariens. Mémoire de Magistère en

Microbiologie. École Normale Supérieure de Kouba, Alger. 177 p.
 Boudjella, H. (2007). Etude taxonomique et des propriétés antagonistes des
Streptosporangium des sols sahariens et caractérisation des principaux antibiotiques
sécrétés par trois souches. Thèse de Doctorat. Institut National Agronomique, El-
Harrach (Alger). 177p.
 Bouras, N. (2005). Régulation de la production d'antibiotiques Dithiolopyrrolones chez
Saccharothrix Algeriensis NRRL B-24137. Thèse de Doctorat en Sciences des procédés
et de l'environnement. Institut National Polytechnique de Toulouse, France. 238 p.
 Bouras N., Mathieu F., Sabaou N. and Lebrihi A. (2006). Effect of amino acids
containing sulfur on dithiolopyrrolone antibiotic productions by Saccharothrix
algeriensis NRRL B- 24137. J. Appl. Microbiol., 100, 390-397.
 Bouznada, A. K., Bouras, N., Mokrane, S., & Chaabane, F. (2016). Saccharothrix
isguenensis sp. nov., an actinobacterium isolated from desert soil. International Journal
of Systematic and Evolutionary Microbiology., 66(11) :4785–4790.
 Bouznada, K., Bouras, N., Mokrane, S., Chaabane Chaouch, F., Zitouni, A., Pöter,
G., Sabaou, N. (2017). Saccharothrix ghardaiensis sp. nov., an actinobacterium
isolated from soil. Antonie van Leeuwenhoek., 110(3) :399–405.
 Bouznada, K. (2018). Saccharothrix et genres apparentés des sols de la région du
M’zab : isolement, taxonomie, mise en évidence de nouvelles espèces et production
d'antibiotiques contre divers microorganismes pathogènes. Thèse de doctorat, École
Normale Supérieure (ENS) de Kouba, Alger.252 p.
 Breton, A., Theilleux, J., Sanglier, J. J. and Vobi G. (1989). Organismes producteurs :
biologie, taxonomie et écologie. In : Biotechnologie des antibiotiques. Larpent J. P., et
Sanglier J. J. (Eds.). Paris, Masson, pp. 33-70.
 Bush, B.D., Fitchett, G.V., Gates, D. A. and Langley D. (1993). Carbocyclic
nucleosides from species of Saccharothrix. Phytochemistry., 32 :737-739.
-C-
 Carattoli, A. (2009). Resistance plasmid families in Enterobacteriaceae. Antimicrob.
Agents Chemother., 53: 2227–2238.
 Carattoli A., Miriagou V., Bertini A., Loli A., Colinon C. C., Villa L., Whichard J.
M. and Rossolini G. M. (2006). Replicon typing of plasmids encoding resistance to
newer betalactams. Emerg. Infect. Dis., 12: 1145-1148.
 Références bibliographiques

 Cavallo, J.D., Fabre, R., Jehl, F., Rapp, C. et Garrabé E. (2004). Bétalactamines.
EMC- Maladies infectieuses., 1:129-202.
 Coates, A., Hu, Y. (2007). Novel approaches to developing new antibiotics for bacterial
infections. British Journal of Pharmacology., 152 :1147–1154.
 Collignon, P. C., Conly, J. M., Andremont, A., McEwen, S. A., Aidara-Kane, A.
and Agerso, Y. (2016). World Health Organization ranking of antimicrobials according
to their importance in human medicine : a critical step for developing risk management
strategies to control antimicrobial resistance from food animal production. Clinical
Infectious Diseases., 63: 1087-1093.
-D-

 Dancer, J. E., Hughes, R. G. and Lindell S. D. (1997). Adenosine-5' phosphate

deaminase, a novel herbicide target. Plant Physiol., 114 : 119-129.
 Delaunay, S., Rondags, E. et Germain, P. (2003). Production d’antibiotiques par
biotechnologies. Techniques de l’ingénieur. Opérations unitaires. génie de la réaction
chimique J6008 (1-12).
 Demain, A.L. (1998). Induction of microbial secondary metabolism. Internatl.
Microbiol., 1 :259-264.
 Demain A.L., Aharanowitz Y. and Martin J.F. (1983). Metabolite control of
secondry biosynthetic patheways. In : Vining (Ed.) Biochemistry and genectic
regulation of commercially important antibiotics. Addison-Wesley, London, p 49-67.
 Djebbah, F.Z. (2016). Isolement des microorganismes (actinomycètes et moisissures)
producteurs de substances antimicrobiennes à partir du sol d’une grotte dans la région
de Tlemcen (Tagema). Mémoire de Master en Microbiologie. Université de Tlemcen. P
9-83 p.
 Djinni, I., Defant, A., Kecha, M. and Mancini I. (2019). Actinobacteria Derived from
Algerian Ecosystems as a Prominent Source of Antimicrobial Molecules. Antibiotics.,
8:172.
 Doull, J.C. and Vining, L.C. (1990). Physiology of antibiotic production in
actinomyces and some control mechanisms. Biotech Adv., 8 :141-158.
 Driche, E. H. (2016). Isolement, taxonomie et caractérisation des molécules bioactives
d’actinobactéries des sols sahariens antagonistes de Staphylococcus aureus. Thèse de
doctorat. École Normale Supérieure (ENS) de Kouba, Alger. 162 p
 Références bibliographiques

 Durand, G.A., Raoult, D. and Dubourg, G. (2018). Antibiotic discovery: History,

methods and perspectives, International Journal of Antimicrobial Agents., P100.
-E-
 Elmahdi, I., Baganz, F., Dixon, K., Harrop, T., Sugden, T .et Lye, G. L. (2003). PH
Control in Microwell Fermentations of S.erythraea CA340: Influence on Biomass
Growth Kinetics and Erythromycin Biosynthesis. Biochem. Eng. J. Gen. Microbiol.,
16(3) : 299-310.
-F-
 Felsenstein, J. (1981). Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum
likelihood approach. J. Mol. Evol., 17: 368–376.
 Felsenstein, J. (1985). Confidence limits on phylogenies: an approach using the
bootstrap. Evolution, 39: 783.
-G-

 Gao H., Liu M., Liu J., Dai H., Zhou X., Liu X., Zhou Y., Zhang W. and Zhang L.
(2009). Medium optimization for the production of avermectin B1a by Streptomyces
avermitilis 14-12A using response surface methodology. Bioresource. Technol., 100 :
4012-4016.
 Genilloud O., González I., Salazar O., Martín J., Tormo J.R. & Vicente F. (2011).
Current approaches to exploit actinomycetes as a source of novel natural products.
Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology., 38 :375–389.
 George, M., Anjumol, A., George, G. & Mohamed Hatha, A. A. (2012). Distribution
and bioactive potential of soil actinomycetes from different ecological habitats. Afr. J.
Microbiol. Res., 6.
 Gesheva, V., Ivanova, V. et Gesheva, R. (2005). Effects of nutrients on the production
of AK-111-81 macrolide antibiotic by Streptomyces hygroscopicus. Microbiological
Research., 160 : 243-248.
 Gewirtz, D. A. (1999). A Critical Evaluation of the Mechanisms of Action Proposed
for the Antitumor Effects of the Anthracycline Antibiotics Adriamycin and
Daunorubicin. Biochemical Pharmacology., 57: 727-741.
 Ghannoum, M. A. and Rice, L. B. (1999). Antifungal agents: mode of action,
mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial
resistance. Clin Microbiol Rev., 12: 501-517.
 Références bibliographiques

 Goodfellow, M., Kâmpfer, P., Busse, H.J., Trujillo, M.E., Suzuki, K., Ludwig, W.et
Withman, W.B. (2012). Bergey Manuel of Systematic Bacteriology, The
Actinobacteria (2èmeEds) vol. V, parts A and B, New York, Dordrecht, Heidelberg,
London p. 2083.
 Goodfellow, M.et Williams, S.T. (1983). Ecology of actinomycetes. Annal Review of
Microbiology., 37 : 189-216.
 Gordon, R. E., Barnett, D. A., Handerhan, J. E. & Pang, C. H.-N. (1974). Nocardia
coeliaca, Nocardia autotrophica, and the nocardin Strain. Int. J. Syst. Bacteriol., 24:
54–63.
 Grund, E. and Kroppenstedt, R.M. (1990). Chemotaxonomy and numerical
taxonomy of the genus Nocardiopsis Meyer 1976. International Journal of Systematic
Bacteriology., 40(1) :5–11.
 Guardabassi, L.et Courvalin. (2006). Modes of antimicrobial action and mechanisms
of bacterial resistance. In: Aarestrup F.M. (Ed.), Antimicrobial resistance in bacteria of
animal origin. ASM Press : Washington, 1-18.
 Gupta, R. S. (2011). Origin of diderm (Gram-negative) bacteria: antibiotic selection
pressure rather than endosymbiosis likely led to the evolution of bacterial cells
with two membranes. Antonie van Leeuwenhoek, 100: 171–182.
-H-
 Habibeche, L. (2012). Isolement et sélection de souche d’actinomycètes productrices
d’antibiotique. Mémoire de Master en Biotechnologie Microbienne. Université
Abderrahmane Mira, Bejaia. 41 p.
 Hamdar, A. (2018). Procédés innovants pour la production de dithiolopyrrolones par
Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137. Thèse de Doctorat en Ingénieries
Microbienne et Enzymatique. Université Toulouse III, Paul Sabatier. 06-170 p.
 Hamedi, J., Carmen Montero-Calasanz, M. del, Spröer, C., Mohammadi panah,
F., Klenk, H.-P. & Schumann, P. (2015). Saccharothrix ecbatanensis sp. nov., an
actinobacterium isolated from soil. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology., 65(12):4544–4549.
 Harir, M. (2018).Caractérisation des molécules bioactives produites par des souches
d’actinobactéries isolées des sols arides et semi arides d’Algérie. Thèse de Doctorat en
Intérêt des microorganismes en Agriculture et en Agroalimentaire. Université Ahmed
Ben Bella, Oran. 181 p.
 Références bibliographiques

 Hozzein, W. N., Li, W. J., Ali, M. I. A., Hammouda, O., Mousa, A. S., Xu, L. H. &
Jiang, C. L. (2004). Nocardiopsis alkaliphila sp. nov., a novel alkaliphilic actinomycete
isolated from desert soil in Egypt. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology., 54(1) : 247–252.
 Hussein, E.I., Jacob, J.H., Shakhatreh, M.K., Abd Al-Razaq, M.A., Juhmani, A.F.
& Cornelison C.T. (2018). Detection of antibiotic-producing Actinobacteria in the
sediment and water of Ma'in thermal springs (Jordan). Germs., 8(4) :191-198.
-I-
Isshiki, K., Sawa, T., Naganawa, H., Matsuda, N., Hattori, S., Hamada, M.,
Takeuchi, T., Oosono, M., Ishizuka, M. & other authors. (1989). 3-O-
isobutyrylkinamycin C and 4-deacetyl-4-Oisobutyrylkinamycin C, new antibiotics
produced by a Saccharothrix species. J. Antibiot. (Tokyo), 42: 467–469.
-J-

 Jensen, H.L. (1931). Proc. Linnean Soc. N. S. Wales, 56, 334–370.

 Joffin, J.N. and Leyral, G. (2014). Microbiologie technique -Tome 1 : Dictionnaire
des techniques. CRDP d'Aquitaine. 368 p.
 Jukes, T. H. & Cantor, C. R. (1969). Evolution of Protein Molecules. In Mamm. Protein
Metab., pp. 21–132. Elsevier.
-K-

 Kalinovskaya, N. I., Kalinovsky, A. I., Romanenko, L. A., Dmitrenok, P. S. &

Kuznetsova, T. A. (2010). New angucyclines and antimicrobial diketopiperazines
from the marine mollusk-derived actinomycete Saccharothrix espanaensis An 113. Nat.
Prod. Commun., 5: 597–602.
 Khaliq, S., Ghauri, M. A. and Akhtar, K. (2013). Isolation, identification and
optimization of fermentation parameters for improved production of antimicrobial
compounds from indigenous Streptomyces isolates. African Journal of Microbiology
Research., 7(18) : 1874-1887.
 Kim, B.Y., Brown, R., Labeda, D.P. & Goodfellow, M. (2011).Reclassification of
‘Dactylosporangium variesporum’ as Saccharothrix variisporea corrig. (ex Tomita et
al. 1977) sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.,
61 :310–314.
 Kim, O.S., Cho, Y.J., Lee, K., Yoon, S.H., Kim, M., Na, H., Park, S.C., Jeon, Y. S.,
Lee, J.H. & other authors. (2012). Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA
 Références bibliographiques

gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int. J. Syst.
Evol. Microbiol., 62: 716–721.
 Kinoshita, N., Igarashi, M., Ikeno, S., Hori, M. & Hamada, M. (1999).
Saccharothrix tangerinus sp.nov., the producer of the new antibiotic formamicin:
taxonomic studies. Actinomycetologica, 13: 20–31.
 Koguchi, Y., Khono, J., Suzuki, S., Takahashi, K., Ohnuki, T. and Komatsubara,
S. (1999). TMC86A, B and TMC-96, new proteasome inhibitors from Streptomyces sp.
TC 1084 and Saccharothrix sp. TC 1094. I. Taxonomy, fermentation, isolation, and
biological activities. J. Antibiot. Tokyo., 52(1 2) :1069-76.
 Koussa, W., Kermia, L.et Izouine, F. (2019). Germes isolés en hémocultures et leurs
résistances aux antibiotiques durant l’année 2018. Thèse de Doctorat en pharmacie.
Université de Mouloud Mammeri, Tizi Ouzou. 121 p.
-L-
 Labeda, D. P. and Kroppenstedt, R. M. (2006). Goodfellowia gen. nov., a new genus
of the Pseudonocardineae related to Actinoalloteichus, containing Goodfellowia
coeruleoviolacea gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 56 : 1203-1207.
 Labeda, D. P., Hatano, K., Kroppenstedt, R. M. and Tamura T. (2001). Revival of
the genus Lentzea and proposal for Lechevalieria gen. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,
51: 1045-1050.
 Labeda, D.P. and Kroppenstedt, R.M. (2000). Phylogenetic analysis of Saccharothrix
and related taxa: proposal for Actinosynnemataceae fam. nov. Int. J. Sy st. Evol.
Microbiol., 50 : 33 1-336.
 Labeda, D.P. and Lyons, A.J. (1989). Saccharothrix texasensis sp. nov. and
Saccharothrix waywayandensis sp. nov. International Journal of Systematic
Bacteriology., 39(3) :355–358.
 Labeda, D.P., and Lechevalier, M.P. (1989). Amendment of the genus Saccharothrix
Labeda et al. 19 84 and descriptions of Saccharothrix espanaensis sp. nov.,
Saccharothrix cryophilis sp. nov., and Saccharothrix mutabilis comb. nov. International
Journal of Systematic Bacteriology., 39 (4) : 420–423.
 Labeda, D.P., Testa, R.T., Lechevalier, M.P. & Lechevalier, H.A. (1984).
Saccharothrix, a new genus of the Actinomycetales related to Nocardiopsis. Int. J. Syst.
Bacteriol., 34(4) :426-431.
 Références bibliographiques

 Lahoum, A. (2017). Souches d’actinobactéries mycéliennes des sols sahariens:

mise en évidence de nouvelles espèces et de nouveaux antibiotiques et réduction
de la concentration en aflatoxine B1.Thèse de doctorat. École Normale Supérieure
(ENS) de Kouba, Alger. 269 p.
 Lalaoui, W. (2012). Influence de quelques milieux de culture sur la production
d’antibiotiques par une souche de Streptomyces isolée d’un sol Saharien. Mémoire de
Master en Microbiologie Appliquée à l’agroalimentaire, biomédical et à
l’environnement. Université Abderrahmane Mira, Bejaia. 77 p.
 Lamari, L. (2006). Production de nouveaux antibiotiques du groupe des pyrrothines
par une nouvelle espèce d’actinomycète, Saccharothrix algeriensis. Thèse de Doctorat.
Université de Tizi Ouzou (Algérie). 186 p.
 Lamari, L., Zitouni, A., Boudjella, H., Badji, B., Sabaou, N., Lebrihi, A., Lefebvre,
G., Seguin, E. and Til, F. (2002a). New Dithiolopyrrolone Antibiotics from
Saccharothrix sp. SA 233.I.Taxonomy, Fermentation, Isolation and Biological
Activities. J. Antibiotics., 55 : 696-701.
 Lamari, L., Zitouni, A., Dob, T., Sabaou, N., Lebrihi, A., Germain, P., Seguin, E.
and Tillequin, F. (2002b). New Dithiolopyrrolone Antibiotics from Saccharothrix sp.
SA 233. II. Physicochemical Properties and Structure Elucidation.J. Antibiotics., 55:
702-706.
 Larpent, J. P. and Larpent-Gaurgaud, M. (1997). Memento technique de
microbiologie. Edition Lavoisier., 1039 p.
 Larpent, J.P.et Sanglier, J.J. (1989). Biotechnologies des antibiotiques. Masson.
Paris, p. 481.
 Larpent-Gourgaud, M. et Sanglier, J.J. (1992). Biotechnologie. Principes et
méthodes. Doin éditeurs. Paris. France.
 Laskin, A.I., and Lechevalier, H. (1984). Handbook of Microbiology. Vol. 3, CRC
Press.Laurent F.J., Provost F., and Boiron P. (1999). Rapid identification of clinically
relevant Nocardia species to genus level by 16S rRNA gene PCR. J. Clin. Microbiol.,
37 : 99-102.
 Lazzarini, A., Cavaletti, L., Toppo, G. and Marinelli, F. (2001). Rare genera of
actinomycetes as potential producers of new antibiotics. Antonie van Leeuwenhoek., 78 :
399-405.
 Références bibliographiques

 Lebrihi, A., Lamasaif, D., Lefebvre, G. and Germain, P. (1992). Effect of

ammonium ions on spiramycin biosynthesis in Streptomyces ambofaciens.Appl.
Microbiol. Biotechnol., 37: 382-387.
 Lieske, R., (1921). Morphologie und Biologie der Strahlenpilze, Lipsia.
 Locci, R. and Sharples, G.P. (1984). - Morphology. ln : «The biology of
Actinomycetes ». Goodfellow, M., Mordarski, M., Williams, S.T. Eds. Academic Press,
London. pp. 165-199.
 Loucif, L. (2006). Recherche des souches d’actinomycètes productrices de molécules
antibactériennes « Cas des eaux du lac Oubeira d’El Kala ».Magister en Microbiologie.
Université Badji Mokhtar, Annaba. 203 p.
 Lozniewski, A.et RABAUD, C. (2010). Résistance Bactérienne Aux Antibiotiques.
Fiches conseils pour la prévention du risque infectieux – Infections associées aux soins
CCLIN Sud-est. Nancy, 4p.
 Lu, S., Xie, B., Liu, B., Lu, B. and Xing, D. (2019). Neglected effects of inoculum
preservation on the Start-Up of psychrophilic bioelectrochemical systems and shaping
bacterial communities at low temperature. Frontiers in Microbiology., 10 : 935.
-M-
 Meklat A. (2012). Taxonomie et potentiel antagoniste des actinobactéries halophiles
des sols sahariens et mise en évidence de nouvelles espèces d’Actinopolyspora. Thèse
de Doctorat en Sciences biologiques. Ecole Normale Supérieure (ENS) de Kouba,
Alger. 162 p.
 Maltezou, H. C. (2008). β-lactamases in Gram-negative bacteria : introducing the era
of panresistance.Int J Antimicrob Agents., 33(5) : 405-407.
 Manikkam, R., Venugopal, G., Ramasamy, B. and Kumar, V. (2015). Effect of
critical medium components and culture conditions on antitubercular pigment
production from novel Streptomyces sp D25 isolated from Thar desert,
Rajasthan.Journal of Applied Pharmaceutical Science., 5: 15-19.
 Mariat, F. et Sebald, M. (1990). Actinomycetes In : Bactériologie Médicale. Le Minor
L. et véron M. 2éme édition, Flammarion. Paris. p.935-949.
 Martin, J.F. et Demain, A.C. (1980). Control of antibiotic biosynthesis.
Microbiological Reviews., 44 : 230-251.
 Matsuo, N., Negishi, A. and Negishi, Y. (2003). Jpn. Kokai Tokyo Koho, p 6.
 Références bibliographiques

 Marchal, N. & Bourdon, J. L. (1973). Milieux de culture et identification biochimique

des bactéries. Doin (Eds), Paris, 179 p.
 Marchal, N., Bourdon, J. L. & Richard, C. (1987). Les milieux de culture pour
l’isolement et l’identification biochimique des bactéries. Doin Press, Paris, France, pp.
67-122.
 Merizig, H.et Naami, F. (2015). Etude taxonomique de quelques souches
d’actinomycètes isolées de la région d’Ouargla. Mémoire de Master en Microbiologie
fondamentale et Appliquée. Université Kasdi Merbah, Ouargla. pp 3-85.
 Merniez, M. et Merniez, S. (2018). Etude De La Resistance Aux Antibiotiques Des
Souches D’Escherichia coli Isolées Du Lait De Vache Commercialise Dans La Région
D’Ain M’Lila Et Ain Fakroun. Mémoire de Master en Microbiologie Appliquée.
Université Larbi Ben M’hidi Oum El Bouaghi.65 p.
 Merrouche, R., Bouras, N., Coppel, Y., Mathieu, F., Monje, M.-C., Sabaou, N. &
Lebrihi, A. (2010). Dithiolopyrrolone antibiotic formation induced by adding
valeric acid to the culture broth of Saccharothrix algeriensis. J. Nat. Prod., 73:
1164–1166.
 Merrouche, R. (2012). Production de nouveaux antibiotiques du groupe des
dithiolopyrrolones par Saccharothrix algeriensis après addition de précurseurs dans le
milieu de culture. Thèse de Doctorat. Ecole nationale supérieure agronomique. El-
Harrach. 197 p.
 Merrouche, R., Bouras, N., Coppel, Y., Mathieu, F., Sabaou, N. & Lebrihi, A.
(2011). New dithiolopyrrolone antibiotics induced by adding sorbic acid to the
culture medium of Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137. FEMS Microbiol. Lett.,
318: 41–46.
 Moulin, M. et Coquerel, A. (1998). Pharmacologie, connaissances et pratique. 2ème
édition, Masson. Paris.
 Murakami, R., Tomikawa, T., Shin-Ya, K., Shinozaki, J., Kajiura, T., Kinoshita,
T., Miyajima, A., Seto, H. & Hayakawa, Y. (2001b). Ammocidin, a new apoptosis
inducer in ras-dependent cells from Saccharothrix sp. II. Physicochemical properties
and structure elucidation. J. Antibiot., 54 : 714-717.
 Murakami, R., Tomikawa, T., Shin-Ya, K., Shinozaki, J., Kajiura, T., Seto, B. &
Bayakawa, Y. (2001a).Ammocidin, a new apoptosis inducer in ras-dependant cells
 Références bibliographiques

from Saccharothrix sp. I. Production, isolation and biological activity. J. Antibiot., 54 :

710-7 13.
 Murakami, R., Shinozaki, J., Kajiura, T., Kozone, I., Takagi, M., Shin-Ya, K., Seto,
H. & Hayakawa, Y. (2009). Ammocidins B, C and D, new cytotoxic 20-membered
macrolides from Saccharothrix sp. AJ9571. J. Antibiot. (Tokyo), 62: 123–127.
 Muylaert, A. et Mainil, J.G. (2012). Résistances bactériennes aux antibiotiques : les
mécanismes et leur « contagiosité ». Ann. Méd. Vét., 156 : 109- 123.
-N-
 National Center for Biotechnology Information (NCBI) - Taxonomy. [En ligne] :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy (consulté le 18 septembre 2018).
-O-
 Oskay, M. (2011). Effects of some Environmental Conditions on Biomass and
Antimicrobial Metabolite Production by Streptomyces sp. KGG32. International
Journal of Agriculture et Biology., 13(3) : 317-324.
 Otoguro, M., Tamura, T., Suzuki, K.-I. and Hayakawa, M. (2009). Saccharothrix
violaceirubra sp. nov., isolated from soil and plant litter. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology., 59 :1504–1507.
 Ouali, F. et Bezari, H. (2016). Mise en évidence et amélioration de la production de
molécules bioactives d’une souche d’actinobactérie Saccharotrix tamanrassetensis SA
198 isolée d’un sol saharien. Mémoire de Master en Microbiologie et Bactériologie.
Université de Blida. 79 p.
 Ounadjela F.Z. (2016). Isolement des microorganismes (actinomycètes et moisissures)
producteurs de substances antimicrobiennes à partir du sol d’une grotte dans la région
de Tlemcen (Tagema).Mémoire de Master en Microbiologie fondamentale et
Appliquée. Université de Tlemcen.10-84 p.
-P-

 Pandey, A., Chandra, N., Srivastava, A., Kumar, D. & Kumar, S. (2018).
Antimicrobial Metabolites Producing Soil Microorganisms. Indian Journal of Applied
Microbiology., 21(01) : 46-57.
 Pandey A., Shukla A. and Majumdar S.K. (2005). Utilization of carbon and nitrogen
sources by Streptomyces kanamyceticus M 27 for the production of an Antibacterial
antibiotic. African J. Biotech., 4: 909-910.
 Références bibliographiques

 Pfefferle, C., Theobald, U., Gurtler, H. and Fiedler, H. P. (2000). Improved

secondary metabolite production in the genus Streptosporangium by optimization of the
fermentation conditions. J. Biotechnol., 80(2) : 135-142.
 Piret, J.M. and Demain, A.L. (1988). Actinomycetes in biotechnology: an overview
in : Goodfellow M., Mordarski M and Williams S.T. (Edn.) Actinomycetes in
biotechnology. Academie Press, London, pp 461-482.
 Powell, N. A. & Roush, W. R. (2001). Studies on the total synthesis of formamicin:
synthesis of the C(1)−C(11) Fragment. Org. Lett., 3: 453–456.
 Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A., Bacq-Calberg, C.M.et Dusart, J. (2002).
Microbiologie. De Boeck Université. 1147 p.
 Prescott, L. M., Willey, J. M., Sherwood, L. & Woolverton, C. J. (2013).
Microbiologie, 4ème édition. De Boeck Supérieur.
-R-
 Rafieenia, R. (2013). Effect of nutrients and culture conditions on antibiotic synthesis
in Streptomycetes. Asian Journal of Pharmaceutical and Heath Sciences., 3 :810-821.
 Rossi-Doria, T. (1891). Ann. Igiene Sper. Roma, 1 (n.s.), 339–428.
-S-

 Sabaou, N., Hacène, H., Bennadji, A., Bennadji, H. & Bounaga, N. (1992).
Distribution quantitative et qualitative des actinomycètes dans les horizons de sol
de surface et profonds d’une palmeraie algérienne. Can. J. Microbiol., 38: 1066–
1073.
 Sabaou, N., Boudjella, H., Bennadji, A., Mostefaoui, A., Zitouni, A., Lamari,
L., Bennadji, H., Lefèbvre, G. & Germain, P. (1998). Les sols des oasis du Sahara
algérien, source d’actinomycètes, rares producteurs d’antibiotiques. Sécheresse, 9: 147–
153.
 Saitou, N. & Nei, M. (1987). The neighbor-joining method : a new method for
reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol., 4: 406–425.
 Saker, R. (2015). Recherche de nouveaux taxons d’actinobactéries halophiles des sols
sahariens et potentialités antagonistes. Thèse de Doctorat en Microbiologie. Université
Ferhat Abbas, Sétif. 28-174p.
 Schippers, A., Bosecker, K., Willscher, S. & Spro, C. (2002). Nocardiopsis
metallicus sp. nov., a metal- leaching actinomycete isolated from an. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology., 2291–2295.
 Références bibliographiques

 Shirling, B. and Gottlieb, D. (1966). Methods for characterization of Streptomyces

species. Int. J. Syst. Bacteriol., 16(3) : 3313-3340.
 Sierra, G. (1957). A simple method for the detection of lipolytic activity of
micro-organisms and some observations on the influence of the contact between
cells and fatty substrates. Antonie van Leeuwenhoek, 23: 15–22.
 Singh, M. P., Petersen, P. J., Weiss, W. J., Kong, F. & Greenstein, M. (2000).
Saccharomicins, novel heptadecaglycoside antibiotics produced by Saccharothrix
espanaensis : antibacterial and mechanistic activities. Antimicrob. Agents Chemother.,
44: 2154–2159.
 Singh, N. and Rai, V. (2012). Optimization of cultural parameters for antifungal and
antibacterial metabolite from microbial isolate; Streptomyces rimosus MTCC 10792
from soil of Chhattisgarh. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences., 4: 94-101.
 Smaoui (2010). Purification et Caractérisation de Biomolécules à partir de
microorganismes nouvellement isolés et identifiés. Thèse de Doctorat, Université de
Toulouse, France. 181p.
 Solanki R., Khanna M., Lal R. (2008). Bioactive compounds from marine
actinomycetes. Indian J. Microbiol., 48:410–431.
 Solecka, J., Zajko, J., Postek, M. & Rajnisz, A. (2012). Biologically active secondary
metabolites from Actinomycetes. Open Life Sci., 7.
 Souagui, Y., Tritsch, D., Grosdemange-Billiard, C. and Kecha, M. (2015).
Optimization of antifungal production by an alkaliphilic and halotolerant actinomycete,
Streptomyces sp. SY-BS5, using response surface methodology. Journal of Medical
Mycology., 25 : 108-115.
 Spizek, J. and Tichy, P. (1995). Some aspects of over production of secondary
metabolites. Floia Microbiol., 40 : 43-50.
 Strub, C. (2008). Modélisation et Optimisation de la production de thiolutine chez
Saccharothrix algeriensis. Thèse de Doctorat en Génie des Procédés et de
l'Environnement. l’Institut National Polytechnique de Toulouse, France, P. 203.
 Sugawara, T., Tanba, T., Kaneda, Y., Yamamoto, H. and Adachi, T. (1999).
Antifungal thiazolylpyridine compound from Saccharothrix species and pharmaceutical
compositions containing it. Jpn. Kokai Tokyo Koho., p. 10.
 Références bibliographiques

 Sylvie, C. (2009). La résistance aux antibiotiques : un enjeu de santé publique important.

Pharmactuel., 42(2) :6-21.
-T-

 Takahashi, A., Hottan, K., Saito, O., Morioka, M., Okami, Y. & Umezawa, H.
(1986). Production of novel antibiotic, dopsisamine, by a new subspecies of
Nocardiopsis mutabilis with multiple antibiotic resistance. J. Antibiot. (Tokyo), 39:
175–183.
 Takeuchi, M., Takahashi, S., Enokita, R., Sakaida, Y., Haruyama, H., Nakamura,
T., Katayama, T. & Inukai, M. (1992). Galacardins A and B, new glycopeptide
antibiotics. J. Antibiot. (Tokyo), 45: 297–305.
 Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. & Kumar, S. (2016). MEGA6:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Mol. Biol. Evol., 30: 2725–
2729.
 Tata, S. (2020). Production d’antibiotiques par Streptomyces sp. PAL114 en fonction
des sources d'azote et de carbone, mise en évidence de nouvelles molécules et activités
biologiques. Thèse de Doctorat en Microbiologie appliquée. Ecole Normale Supérieure
De Kouba-Alger. 156 p.
 Tiwari, K. and Gupta, R.K. (2011). Rare actinomycetes: a potential store house for
novel Antibiotics.Crit. Rev. Biotechnol., 32 :108-132.
 Toumatia, O. (2015). Étude de quelques souches de Streptomyces des sols arides
d’Algérie antagonistes de Fusarium culmorum : taxonomie, caractérisation des
antibiotiques et essais de lutte contre la fusariose du blé. Thèse de doctorat. École
Normale Supérieure (ENS) de Kouba, Alger. 266 p.
 Tomita, K., Oda, N., Hoshino, Y., Ohkusa, N. and Chikazawa, H. (1991).
Fluvirucins AI, A2, BI, B2, B3, B4 and B5, new antibiotics active against influenza A
virus. IV. Taxonomy on the producing organisms. J. Antibiot. , 44 : 940-8.
 Tortora, J., Funk, B. F. et Case, Ch. l. (2003). Introduction à la microbiologie, (edn)
ISBN. Canada. 2eme édition : 332.
-V-

 Van der Heul H.U., Bilyk B.L., McDowall K.J., Seipke R.F. and Van Wezel G.P.
(2018). Regulation of antibiotic production in Actinobacteria: new perspectives from
the post-genomic era. Nat. Prod. Rep., 35 : 575-604.
 Références bibliographiques

 Van Dissel, D. and Wezel, G. P. V. (2017). Morphology-driven downscaling of

Streptomyces lividans to micro-cultivation. Antonie van Leeuwenhoek., 1-13.
 Veyssiere, A. (2019). La résistance aux antibiotiques des bactéries les plus
communément rencontrées dans les infections communautaires état des lieux en 2019.
Thèse de Doctorat en pharmacie. Université de Bordeaux. 15-87p.
 Vertesy L., Barbone F., Cashmen E., Decker H., Ehrlich K., Jordan B., Knauf M.,
Schummer D., Segeth M., Wink J. and Seibert G. (2001). Pluraflavins, potent
antitumor antibiotics from Saccharothrix sp. DSM 12931. J. Antibiot. 54 :718-29.
-W-
 Wadetwar, R. N., Chaturvedi, J. L., Building, Z. and Road, H. (2013). Production
of antibiotic from actinomycetes isolated from nagpur. International Journal of
Pharmaceutical Sciences and Research., 4: 3094-3098.
 Waksman, S.A. (1919). Soil Sci, 8: 71–215.
 Waksman, S. A. (1961). The Actionmycetes. Vol. 2, Classification, identification and
descriptions of genera and species. J. Pharm. Sci., 50: 979.
 Wang, Z.-X., Li, S.-M. & Heide, L. (2000). Identification of the coumermycin A1
biosynthetic gene cluster of Streptomyces rishiriensis DSM 40489. Antimicrob. Agents
Chemother., 44: 3040–3048.
 Wang, X., Huang, L., Kang, Z., Buchenauer, H. et Gao, X. (2010). Optimization of
the Fermentation Process of Actinomycete Strain Hhs.015T. Journal of biomedicine
and biotechnology., 10: 1-10.
 Whitman, W., Goodfellow, M., Kämpfer, P., Busse, H. J., Trujillo, M., Ludwig, W.
and Suzuki, K. (2012). Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology: Volume 5 : The
Actinobacteria. 2ème édition, Springer Science & Business Media, New York.1750 p.
 Williams L., Stapleton F., Carnt N. (2019). Microbiology, Lens Care and
Maintenance., P65-96.
 Williams, S.T. and Wellington, E.M.H. (1982a). Actinomycetes. In : Eds. Page A.L.,
Miller R.H., Keency O.R : Methods of Soil Analysis, part 2, Chemical and
Microbiological Properties, second ed. American. Society of Agronomy/Soil Science
Society of America, Madison., 969–987.
 Williams, S.T., Sharples, G.P. & Bradshow, RM. (1973). The fine structure of
actinomycetales. In : Sykes G. and skinner F. A. (ed). Actinomycetales : characteristics
and pratical importance. Academic Press. INC., New York, N. Y., p 113-130.
 Références bibliographiques

-Y-

 Yoneyema, H. and Katsumata, R. (2006). Antibiotic Resistance in Bacteria and its

Future for Novel Antibiotic Developpement. Biosci. Biotechnol. Biochem., 70 (5)
:1060-1075.

-Z-

 Zerizer, H. (2014). Les genres d’actinomycètes (hors mycobactéries) impliqués dans

les infections dans la région de Constantine. Thèse de Doctorat en Biochimie et
Microbiologie Appliquées. Université de Constantine. 155 p.
 Zitouni, A. (1995). Les genres Nocardiopsis et Saccharothrix (Actinomycetales)
dans les sols sahariens: taxonomie numérique, extraction, purification et
caractérisation de quelques antibiotiques synthétisés. Mémoire de Magistère. École
Normale Supérieure de Kouba, Alger, 177 p.
 Zitouni, A. (2004). Etude taxonomique et des propriétés antagonistes des Nocardiopsis
et des Saccharothrix des sols sahariens et production de nouveaux antibiotiques par
Saccharothrix sp. 103. Thèse de Doctorat, INP-ENSAT, 230 p.
 Zitouni, A. (2005). Taxonomie et antibiotiques des Saccharothrix et des Nocardiopsis
des sols sahariens et nouvelles molécules bioactives sécrétées par Saccharothrix sp. SA
103. Thèse de Doctorat. Université Mouloud Mammeri de Tizi Ouzou, 230 p.
 Zitouni, A., Boudjella, H., Lamari, L., Badji, B., Mathieu, F., Lebrihi, A. and
Sabaou, N. (2005). Nocardiopsis and Saccharothrix genera in Saharan soils in Algeria:
Isolation, biological activities and partial characterization of antibiotics. Research in
Microbiology., 156(10) : 984-993.
 Zitouni, A., Boudjella, H., Mathieu, F., Sabaou, N. and Lebrihi, A. (2004a).
Mutactimycin PR, a new anthracycline antibiotic from Saccharothrix sp. SA103. I.
Taxonomy, Fermentation, Isolation and Biological Activities. J. Antibiot., 57 : 367-372.
 Zitouni, A., Lamari, L., Boudjella, H., Badji, B., Sabaou, N., Gaouar, A. and
Labeda, D. P. (2004b).Saccharothrix algeriensis sp. nov., isolated from Saharan soil.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology., 54(4) : 1377–
1381.
Annexes
 Annexes

ANNEXE N°1

Matériels et appareillages

1. Matériel léger a utilisation habituelle dans les laboratoires

 Balance analytique «KERN », Bec Bunsen, Micropipette. (100, 1000 µL.), Plaques
agitatrices chauffantes « VELP SCIENTIFICA », Vortex « Techno Kartell ».
 Verreries et matérielles consommable : Ampoule à décanter, erlenmeyer (250 et
500ml), bécher, Tubes à hémolyse, boite pétri, porte pièce, Tubes d’eppendorf, disque
papier wattman.

2. Matériel lourd à utilisation spécialisée

L’appareil d’HPLC utilisé dans notre travail est équipé par les éléments suivants :
 Un injecteur de type (auto-sampler G1329B) relié à une boucle d’injection de
100 μL.
 Un dégazeur.
 Un système de pompe G1311C à 4 voies accompagné d’un mélangeur G1316A.
 Un détecteur (UV-Vis G1315D) à barrette de diode à longueur d’onde UV-
visible variable.
 Une colonne en phase inverse C18 (Zorbax SB-C18, 250 mm × 9,4 mm, 5 μm
de granulométrie). Cette colonne est précédée d’une pré-colonne contenant la
même phase stationnaire.
 Une chambre thermostatée.
 Un contrôleur de gradient du solvant d’élution.
 La collection des données et l’intégration des pics sont assurées par un
ordinateur équipé du logiciel d’exploitation et d’analyse Agilent Chem Station
(Rev. B 04.03).
 Annexes

Matériel lourd à utilisation spécialisée.

Figure 15 : PH mètre Figure 16 : Autoclave (pbi 96 Figure 17: Centrifugeuse

(HANA pH211) de 65 litre) (Jouan E96)

Figure 18 : Rotavapeur Figure 19 : HPLC Figure 20 : Etuve

(Stuart) (Agilent®1260) (Memmert)

Figure 21 : Microcentrifuge Figure 22 : Shaker New Figure 23: Four Pasteur

des eppendorfs (Sigma) (Brunswick Scientific) (Memmert)
 Annexes

ANNEXE N°2

MILIEUX DE CULTURE

1. Milieux d’isolements
Milieu chitine-vitamines B (Hayakawa et Nonomura, 1987)
Chitine: 2 g; K2HPO4: 0,35 g; KH2PO4: 0,15 g; MgSO4, 7H2O: 0,2 g; NaCl: 0,3 g ;
CaCO3:0,02 g; FeSO4, 7H2O: 10 mg; ZnSO4, 7H2O: 1 mg; MnC12, 4H2O: 1 mg; agar: 18 g;
eau distillée, q.s.p. 1000 ml ; pH= 7,2.
Pour ce milieu, sont ajoutés :
 Les vitamines : thiamine-HCl, riboflavine, niacine, pyridoxine-HCl, inositol,
panthoténate de calcium : à raison de 0,5 mg/L et biotine : 0,25 mg/L. Les vitamines
sont stérilisées à l’éther puis dissoutes en solution aqueuse stérile avant d’être ajoutées
aseptiquement au milieu autoclavé.
 Une solution stérile d’un antifongique, le cycloheximide (ou actidione) à 80 mg/L.
 Une solution stérile d’un acide nalidixique (anti Gram négative) à raison de 50 mg/l
2. Milieux pour l’identification de l’isolat AHO23

1.1. Étude morphologique

Milieux ISP2 et ISP4 préconisés lors de l’"International Streptomyces
Project"(Shirling et Gottlieb, 1966) et le milieu CHV sans agents sélective (Hayakawa et
Nonomura, 1987).
1.1.1. Milieu ISP2 (extrait de levure-extrait de malt agar)
Glucose : 4 g ; extrait de levure : 4 g ; extrait de malt : 10 g ; eau distillée q.s.p. 1000
ml ; agar : 20 g ; pH 7,2.
1.1.2. Milieu ISP4 (amidon-sels minéraux agar)
Amidon: 10 g; K2HPO4: 1 g; MgSO4,7H2O: 1 g; NaCl: 1 g; (NH4)2SO4: 2 g; CaCO3:
2 g; solution saline standard (voir ISP3): 1 ml ; agar: 20 g; eau distillée q.s.p. 1000 ml ; pH=7,2.
1.1.3. Milieu chitine-vitamines B (Hayakawa et Nonomura, 1987) sans agents sélective

1.2. Étude physiologique

1.2.1. Utilisation des glucides comme seules sources de carbone (Gordon et al., 1974)
 Milieu minéral de base : (NH4)2HPO4 : 1 g ; KCl : 0,02 g ; MgSO4, 7H2O : 0,2 g ;
agar : 15 g ; eau distillée q.s.p. 1000 ml ; pH = 7,2.
 Annexes

 Le sucre : est ajouté à raison de 10 g/l et sont stérilisés à l'éther pendant une nuit et sans
dégradé avant d'être ajoutés séparément et aseptiquement.( adonitol, L-arabinose, D-
cellobiose, Dfructose, D-galactose, D-glucose, myo-inositol, D-lactose, D-maltose, D-
mannitol, D-mannose, Dmélibiose, a méthyle D-glucoside, D-raffinose, L-rhamnose,
D-ribose, saccharose, D-sorbitol, Dtréhalose et D-xylose)
 Le rouge de phénol : est utilisé comme un indicateur de ph, du rouge-orangé (pH
neutre) au jaune (pH acide).
 Milieu de base : contenant le rouge de phénol à 0,12 % et à pH 7,5 (milieu coloré en
rouge-rose). Un témoin sans source de carbone a été aussi réalisé. Les souches ont été
ensemencées en stries serrées et incubées à 30 °C (pendant 1 à 2 semaines).
 Le test est considéré comme positif lorsque la croissance est meilleure que celle
observée sur le milieu témoin (sans source de carbone) dans lequel la croissance de la
souche est soit à l'état de traces, soit absente. La dégradation est également notée
positivement après virage de l'indicateur coloré du rouge-rose au jaune

1.2.2. Dégradation de divers composés organiques

1.2.2.1. Dégradation de l'adénine, de la guanine, de la tyrosine, de l'hypoxanthine et de la

xanthine (Gordon et al., 1974)
Le milieu de base utilisé est la gélose nutritive
La composition du Gélose nutritive (GN) : Peptone: 5 g; extrait de viande: 1 g; extrait de
levure: 2 g; NaCl: 5 g; agar: 15 g; eau distillée: q.s.p. 1000 ml; pH 7,5.
0,4 g de chaque composé (sauf pour la guanine 0,2 g) est suspendu dans 10 ml d’eau
distillée stérile. La suspension est ajoutée à 100 ml de gélose nutritive stérile et maintenue en
surfusion à 45 °C. Après refroidissement du milieu, l’isolat de la souche AHO23 a été
ensemencé par point et en double (deux points par isolat). La dégradation se manifeste par une
auréole claire autour des colonies.
1.2.2.2. Dégradation de l’amidon (Marchal et Bourdon, 1973)
2,5 g d’amidon sont dissout dans 250 ml de gélose nutritive puis stérilisés à l’autoclave.
Le milieu est coulé dans des boîtes de Pétri stériles. L’ensemencent (par point) et les
conditions d’incubation sont identiques à ceux cités dans le paragraphe précédent. Une solution
de lugol permet de mettre en évidence la dégradation de l’amidon.
 Annexes

1.2.2.3. Dégradation de la gélatine (Marchal et Bourdon, 1973)

4 g de gélatine sont ajoutés dans 100 mL de gélose nutritive. L’ensemencent (par point)
et les conditions d’incubation sont identiques à ceux cités dans les deux paragraphes précédents.
Après croissance, le réactif de Frazier est ajouté sur les colonies et le milieu. Ce réactif permet
de mettre en évidence la dégradation de la gélatine (auréole claire autour des colonies).

1.2.2.4. Dégradation de la caséine du lait (Gordon et al., 1974)

10 g de lait en poudre écrémé sont dissout dans 100 ml d’eau distillée, puis stérilisés à
l’autoclave. Une quantité de 100 ml d’eau distillée contenant 3,6 g d’agar est parallèlement
autoclavé. Ces deux solutions sont mélangées aseptiquement puis coulées dans des boîtes de
Pétri stériles. L’apparition d’une auréole claire autour des colonies indique la dégradation de la
caséine.

1.2.2.5. Dégradation de l’esculine et de l’arbutine (Marchal et al., 1987)

Esculine (et /ou arbutine) : 1 g ; citrate de fer ammoniacal : 1 g ; peptone : 10 g ; agar :
18 g ; eau distillée : q.s.p. 1000 mL. PH 7,5. L’ensemencement d’isolat de la souche se fait par
points (en double). La dégradation de ces deux hétérosides se manifeste par l’apparition d’un
pigment brun foncé à noir autour des colonies.

1.2.2.6. Dégradation du Tween 80 (Sierra, 1957)

Tween 80: 10 ml; NaNO3 : 1 g; extrait de levure: 5 g; solution saline (*): 50 ml; CaC12,
2H2O: 0,1 g; eau distillée q.s.p. 1000 ml; agar: 18 g ; pH=7,5.
(*) Solution saline standard : K2HPO4 : 0,25 g ; MgSO4, 7H2O : 0,125 g ; FeSO4, 7H2O :
0,001 g ; MnSO4 : 0,001 g ; eau distillée q.s.p. 50 ml.
L’ensemencement d’isolat se fait par point (en double). La dégradation du Tween 80
se manifeste par une auréole opaque autour des colonies.

1.2.3. Réduction des nitrates (Marchal et Bourdon, 1973)

Milieu nitrate : peptone : 5 g ; extrait de viande : 3 g ; KNO3 : 1 g ; eau distillée q.s.p. 1000
mL. pH = 7,2.
Ce test consiste à mettre en évidence la présence ou non dans le milieu de culture des
nitrites (NO2) issus de la réduction des nitrates (NO3) par les nitrates réductases.
Après ensemencement et croissance d’isolat, la recherche du nitrate réductase est effectuée en
utilisant le réactif de Griess.
 Annexes

1.2.4. Production de pigments mélanoïdes

1.2.4.1. Milieu ISP 6 (Shirling et Gottlieb, 1966)

Peptone: 20 g; citrate ferrique ammoniacal: 0,5 g; K2HPO4: 1 g; thiosulfate de sodium:
0,08 g; extrait de levure: 1 g; agar: 15 g; eau distillée: q.s.p. 1000 ml; pH 7,2.

1.2.4.2. Milieu ISP 7 (Shirling et Gottlieb, 1966)

Glycérol: 15 g; L-tyrosine: 0,5 g; L-asparagine: 1 g; K2HPO4: 0,5 g; MgSO4,7H2O:
0,5 g; NaCl: 0,5 g; FeSO4, 7H2O: 0,01 g; solution saline standard (voir ISP 3): 1 ml; agar: 18
g; eau distillée: q.s.p. 1000 ml; pH =7,2.

1.3. Identification moléculaire

1. Extraction et quantification de l'ADN génomique

Les souches sélectionnées sont ensemencées en stries espacées sur boîtes de Pétri
contenant de l'ISP 2 solide. L'ADN est extrait selon la méthode de Liu et al. (2000) comme
suit : des colonies jeunes, bien isolées, sont prélevées aseptiquement à l'aide d’une lame bistouri
stérile et transférée dans des tubes Eppendorf stériles de 1,5 mL. La biomasse ainsi prélevée est
mise en suspension dans 500 µL d'une solution de lyse, préalablement stérilisée par filtration,
et composée de 400 mM de tris HCl (pH=8), 60 mM d'EDTA (pH=8), 150 mM de NaCl et 1 %
de sulfate de sodium dodecyl (SDS).
Après incubation pendant 15 min à température ambiante, le contenu des eppendorfs est
mélangé avec 150 µL d'une solution à pH= 4,8 composée d'acétate de potassium à 5 M et de
11,5 % d'acide acétique glacial.
Le mélange obtenu est vortexé brièvement puis centrifugé une minute à 12000 rpm. Un
volume de 400 µL de surnageant est récupéré et transféré dans un autre tube Eppendorf stérile,
puis additionné d'un même volume d'isopropanol et mélangé brièvement par inversion, avant
que le mélange ne soit centrifugé pendant 2 min à 12 000 rpm. Le surnageant est éliminé et le
culot est lavé avec 300 µL d'éthanol à 70 % par centrifugation pendant une minute à 12 000
rpm. Le culot, représentant l'ADN obtenu, est séché à température ambiante pendant une nuit
puis re-suspendu dans 40 µL d'eau bidistillée stérile afin d'être conservé à -20 °C pour une
utilisation ultérieure.
La quantification de l’ADN extrait sert à déterminer la quantité d'ADN présente dans
les échantillons, mais aussi de vérifier sa qualité (pureté). Chaque échantillon est dilué (1/200e)
 Annexes

dans de l'eau bidistillée stérile. La mesure de la densité optique (DO) se fait à l’aide d’un
spectrophotomètre UV-visible à deux longueurs d'onde différentes :
 260 nm : longueur d'onde d'absorption des acides nucléiques : ADN et ARN
 280 nm : longueur d'onde d'absorption des protéines.
Le rapport des DO : DO 260 nm /DO 280 nm nous permet de connaître la pureté de l'ADN. Il
doit être compris entre 1,8 et 2,0. S'il est inférieur à 1,8, il y a contamination par des protéines
et s'il est supérieur à 2,0, il s’agit d’une contamination par des ARN. La quantité d'ADN est
calculée selon la formule suivante :
 [ADN] = DO 260 nm x 50 x facteur de dilution (µg/ml). Remarque : 1 unité DO 260 nm =
50 µg/ml d'ADN.

2. Amplification par PCR et électrophorèse en gel d'agarose

Le gène codant pour l'ARNr 16S est amplifié par PCR avec un Kit MP Biomédical.
Les amorces utilisées sont : 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') et 1492r (5'
GGTTACCTTGTTACGACTT 3'). Le mélange réactionnel contient, pour un volume final de
50 L :
 25 à 50 ng d'ADN génomique.
 0,5 µM de chaque amorce 27f et 1492r.
 tampon PCR 1X composé de : 10 mM tris-HCl ; 50 mM KCl ; 1,5 mM MgCl2 0,1%
Triton X-100 ; 0,2 mg/mL de Bovine Serum Albumin (BSA) ; pH 9,0 ; à 25 °C.
 200 µM du mélange désoxynucléoside triphosphate (dNTPs) et 1,5 U de Taq ADN
polymérase.
L'amplification a été effectuée dans un thermocycleur BIORAD My CyclerTM selon le
profil suivant : une étape initiale de dénaturation à 98 °C pendant 4 min, suivie d'une pause
permettant l'addition de la Taq polymérase. Par la suite, 30 cycles d'amplification ont été
effectués (dénaturation à 94 °C pendant 1 min, hybridation à 52 °C pendant 1 min et extension
à 72 °C pendant 2 min).
A la fin des cycles, le mélange réactionnel est maintenu à 72 °C pendant 10 min pour
l'élongation finale, puis refroidi à 4 °C. Les produits de la PCR ont été analysés par
électrophorèse sur gel d'agarose (à 0,8 %), où les fragments d'ADN sont séparés, leur taille,
déterminée et leur qualité, vérifiée. Le gel d'agarose a été préparé après solubilisation de 480
mg d'agarose en poudre (DNA grade, Euromedex) dans 60 mL de tampon TAE 1X (Tris acétate
EDTA ; Euromedex). Le mélange a été porté à ébullition pendant 2 min dans une micro-onde
pour faire fondre l'agarose. Le gel est coulé sur la plaque d'électrophorèse horizontale (10 × 4
 Annexes

× 1 cm). Des puits, dans lesquels les échantillons seront déposés, ont été formés par
positionnement d'un peigne. La solidification du gel a lieu après 30 min à température ambiante.
Le peigne est ensuite retiré. Six microlitres de chaque amplifiat obtenu par PCR sont
alourdis par 1 µL de tampon de charge contenant du bleu de bromophénol, puis déposés dans
un des puits du gel déjà immergé dans le tampon TAE 1X. La migration a lieu à 100 volts
pendant 35 min. Un marqueur de taille de 1 Kb DNA Ladder est déposé dans un des puits pour
vérifier la taille des amplifiats.
Après migration des échantillons, le gel est placé dans un bain de bromure d'éthydium
(BET) et de TAE 1X pour révéler les bandes d'ADN. Étant un agent mutagène, le BET
s'intercale entre les acides nucléiques et fluoresce sous lumière UV à 254 nm. Après révélation,
le gel est déposé sur un transilluminateur (table UV) d'un appareil gel Doc XR pour visualiser
les bandes d'ADN et vérifier leur taille.

3. Séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S

La détermination des séquences a été effectuée par un séquenceur automatique, et avec
les mêmes amorces utilisées lors de la PCR. Une fois obtenues, et à l'aide du serveur EzTaxon-
e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net), la position phylogénétique des souches a été déterminée
après comparaison, par le test du BLAST, des séquences du gène codant pour l'ARNr 16S
obtenues avec celles des espèces de référence répertoriées dans cette banque de données
génomiques (Kim et al., 2012).

ANNEXE N°3
Milieux de production des antibiotiques

1. Le milieu ISP2 : la composition de milieu ISP2 est similaire à celle utilisée lors de
l’identification des actinobactéries.

2. Milieu synthétique (MS) : avec une source de carbone a raison de 10g de (dextrine, amidon,
glycose, glycérol, saccharose) ; 2g de NaCl ; 1g de K2HPO4 ; 0.5g de KH2PO4 ; 0,2g de
MgSO4, 7H2O ; 2g de CaCO3 ; 2g de (NH4)2SO4 (Bouras et al., 2006).

3. Milieu semi synthétique (MSS) : avec une source de carbone a raison de 10g de (dextrine,
amidon, glycose, glycérol, saccharose) ; 3g d’extrait de levure ; 2g de NaCl ; 1g de K2HPO4 ;
0.5g de KH2PO4 ; 0,2g de MgSO4, 7H2O ; 2g de CaCO3 ; 2g de (NH4)2SO4 (Bouras et al.,
2006).
 Annexes

ANNEXE N° 4

MICROORGANISMES-CIBLES

 Les germes cibles utilisés pour évaluer les propriétés antagonistes, et pour tester
l’activité antimicrobienne de la souche AHO23.
Espèces Résistance Sensibilité
Staphylococcus aureus (MRSA
K, OXA, PEN,
639c) RIF, VAN
TE, MET
Staphylococcus aureus S(Sa.s)
OXA, FOS, CIP,
RIF,PEN,
Listeria monocytogenes (ATCC CAZ, CTX,
Gram COT,GLY,
13932) CXC, FEP, FOX,
positive FLU
LIN, CLD, PRL
C, CAR, CHL,
ERY, GEN, K,
Bacillus subtilis(ATCC 663) NEO
RIF, SPI, SSS,
VAN
Bactéries CIP,NOR,
AM, SSS, SXT,
Salmonella typhi(ST) CAZ,AN,
TE, TMP, AMX
CRO, CXM
Escherichia coli (ATCC 8739) AMC, AMX,CF,
CAZ,CTX,CXM, C, CXC
Gram FOX, TCC, TIC
négative CAR, ERY,
Pseudomonas aeruginosa C, CHL, K,
GEN, NEO, SPI,
(ATCC 9027) RIF
SSS
Agrobacterium(Agro) KM, HM -
Acinetobacter baumannii (S54) CAZ, CIP, IPM CS, AN
AMB, ITR,
Aspergillus carbonarius(AC) CHX, NYS
TER, TIZ
Aspergillus ochraceus(AO) - -
Aspergillus fumigatus(AF) VOR, POS, AM -

Aspergillus westerdijkiae - -
(ATCC 3174)
Champignons
CHX, ITR, NYS,
Fusarium culmurum(FC) AMB, TER
TIZ
Fusarium poae(Fp) - -
Umbelopsis ramanniana CHX, ITR, TER,
AMB, NYS
(NRRL 1829) TIZ
Penicillium exapansum(Pe) - -
Penicillium glabrum(Pg) - -
CHX, ITR, NYS,
Levure Candidas albicans(M3) AMB
TER, TIZ
 Annexes

ANNEXE N°5
Activité antibactérienne de la souche AHO23

1. photo de l’activité antagoniste de la souche AHO23

L’activité antagoniste de la souche AHO23 contre les germes ciblent sur le milieu ISP2
semi-solide, par la méthode des cylindres d'agar.

figure 24 : Activité antagoniste de la figure 25 : Activité antagoniste de la

souche AHO23 contre Sa.S. souche AHO23 contre M3.

figure 26 : Activité antagoniste de la figure 27 : Activité antagoniste de la

souche AHO23 contre BS. souche AHO23 contre Agro.
 Annexes

2. photo résultat dès l’activité antibactérienne au cours de la cinétique de la souche AHO23

dans un milieu liquide par la méthode de puis

figure 28 : Activité figure 29 : Activité figure 30 : Activité

antibactérienne de la souche antibactérienne de la souche antibactérienne de la souche
AHO23 contre LM. AHO23 contre E.coli. AHO23 contre Sa 639.
 Production et extraction d’antibiotiques à partir d’une souche d’actinobacteries (Saccharothrix sp. AHO23).

Résumé : Ce présent travail porte sur l'étude de la production, l’extraction et la purification des antibiotiques par
la souche AHO23, isolée des sols sahariens de la région de Tamanrasset (Ahaggar station d’olivier). L’étude taxonomique
a été réalisée sur la base des caractéristiques morphologiques, physiologiques et phylogénétiques. Les résultats de cette
étude ont permis d’affilier la souche AHO23 au genre Saccharothrix comme étant une nouvelle espèce de ce genre. Les
potentialités antagonistes de la souche étudiée ont été évaluées par la méthode des cylindres d’agar vis-à-vis des
microorganismes-cibles. Des activités importantes antibactériennes et antifongiques ont été produites contre tous les germes
cibles testés (champignons filamenteux, bactéries à Gram positif, bactéries à Gram négatif, et une levure), ces activités étant
nettement plus fortes sur les milieux ISP2 et MSD. Les cinétiques de croissance et de production des composés bioactifs
ont montré que l’activité antimicrobienne atteint son maximum le 5 ème jour sur le milieu MSD et le 6 ème jour sur le milieu
ISP2. Les antibiotiques produits ont été extraits par le dichlorométhane qui a été déterminé comme étant le meilleur solvant
d'extraction suite à l’antibiographie. La purification par HPLC de l’extrait de la souche AHO23 a montré la présence de
quatorze composés bioactives en milieu ISP2, ce qui rend cette souche très intéressante dans la recherche médicale.
Mots clés
Sols sahariens, Saccharothrix sp., étude taxonomique, activité antagoniste, antibiotiques, extraction.

Production and extraction of antibiotics from a strain of actinobacteria (Saccharothrix sp. AHO23).
Abstract: This work focuses on the study of the production, extraction and purification of antibiotics by the
strain AHO23, isolated from the Saharan soils of the Tamanrasset region (Ahaggar station d’olivier). The taxonomic study
was carried out on the basis of morphological, physiological and phylogenetic characteristics. The results of this study
allowed the AHO23 strain to be affiliated with the genus Saccharothrix as a new species of this genus.
The antagonistic potential of the strain studied was evaluated by the agar cylinder method in relation to the target
microorganisms. Significant antibacterial and antifungal activities were produced against all target germs tested
(filamentous fungi, gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, and yeast), these activities being significantly stronger
on ISP2 and MS-dextrin medium. The growth and production kinetics of the bioactive compounds showed that
antimicrobial activity reaches its maximum on the 5 th day on the MSD medium and the 6th day on the ISP2 medium. The
antibiotics produced were extracted by dichloromethane, which was determined to be the best extraction solvent following
antibiography. HPLC purification of AHO23 strain extract showed the presence of 14 bioactive compounds in ISP2
medium, which makes this strain very interesting in medical research.
Keywords
Saharan soils, Saccharothrix sp., taxonomic study, antagonistic activity, antibiotic production, extraction.

.(Saccharothrix sp. AHO23) ‫إنتاج واستخراج المضادات الحيوية من ساللة أكتينوبكتيريا‬

‫ المعزولة من التربة الصحراوية‬،AHO23 ‫ يتناول هذا البحث إنتاج المضادات الحيوية واستخراجها وتنقيتها من خالل ساللة أكتينوبكتيريا‬:‫ملخص‬
‫أجريت الدراسة التصنيفية على أساس الخصائص المورفولوجية والفزيولوجية والوراثية وقد سمحت‬. ) Ahaggar station d’olivier) ‫في منطقة تمنراست‬
‫ تم تقييم القدرة التضادية للساللة التي تمت دراستها من خالل طريقة‬.‫ كنوع جديد‬Saccharothrix ‫ باالنتساب إلى جنس‬AHO23 ‫نتائج هذه الدراسة للساللة‬
،‫ وقد تم إنتاج أنشطة مهمة مضادة للبكتيريا والفطريات ضد جميع الجراثيم المستهدفة المختبرة (الفطريات‬.‫أسطوانة األغار بالنسبة للكائنات الدقيقة المستهدفة‬
‫أظهرت حركيات النمو واإلنتاج‬.MS-dextrine ‫ و‬ISP2 ‫ وهذه األنشطة أقوى بكثير في الوسطين‬،)‫ والخميرة‬،‫ والبكتيريا سالبة الغرام‬،‫والبكتيريا موجبة الغرام‬
‫ المضادات‬.ISP2 ‫ واليوم السادس في وسط‬MSD ‫للمركبات الحيوية النشطة أن نشاط مضادات الميكروبات يصل إلى أقصى حد له في اليوم الخامس في وسط‬
‫ من‬HPLC ‫ كما أظهرت عملية تنقية‬.‫الحيوية المنتجة استخرجت بواسطة ثنائي كلوروميثان والذي تم تحديده كأفضل مذيب االستخراج بعد الكشف التضادي‬
.‫ مما يجعل هذه الساللة مثيرة لالهتمام للغاية في البحث الطبي‬,ISP2 ‫ مركبا ً حيويا ً في وسط‬14 ‫ وجود‬AHO23 ‫مستخلص‬
‫الكلمات المفتاحية‬
.‫ استخالص‬،‫ انتاج مضادات حيوية النشاطات التضادية‬،‫ دراسة تصنيفية‬،Saccharothrix sp ،‫تربة صحراوية‬