Introduction :
L’auxine (AIA) et une substances organiques Oligo-dynamiques, elle est principalement
synthétisée au niveau de l’apex des plantes, aussi dans les bourgeons, les embryons, les
méristèmes et les jeunes feuilles. L’auxine est la seule phytohormone qui subit un transport
active polarisée, suivant un flux basipète (stocker au niveau racinaire).
Elle joue plusieurs rôles essentiels dans la croissance (élongation cellulaire *auxèse*) des
plantes, notamment dans la dominance apicale et la rhizogenèse. Cependant, sa concentration
doit être précisément régulée, car un excès peut avoir des effets toxiques. La synthèse d’auxine
se fait à partir du tryptophane, par désamination oxydative ou par décarboxylation, et
dégradation par des enzymes telles que les oxydases (d’oxyindole-3-acétique ou d’oxyindole-3-
méthylène).
L’auxine est également sensible à des températures très élevées ou une exposition excessive à la
lumière qui peut accélérer sa dégradation. En revanche, elles favorisent des conditions
d’obscurité et des températures entre (25 et 27 °C).
Le but du TP :
1. Extraire les protéines solubles à partir de matériel végétal frais.
2. Mesurer l’activité des enzymes oxydases responsables de la dégradation de l’auxine.
3. Réaliser le dosage de l’auxine par spectrophotocolorimétrie en utilisant le réactif de
Salkowski.
NB : réactif de Salkowski est un liquide vert-jaunâtre utiliser comme un colorant pour
déterminer la présence de l’AIA dans l’échantillon par une coloration rose. (Absence de
coloration en présence de l’enzyme).
Manipulations :
A. Préparation de l'extrait enzymatique :
1. Prélever 5 g de parties aériennes de petits pois étiolés.
2. Broyer avec du sable dans un mortier sur glace en ajoutant 15 ml de tampon phosphate.
3. Filtration suivie d’une centrifugation à 8000 g pendant 10 minutes.
4. Collecter le surnageant dans une éprouvette, noter le volume, et conserver au froid.
B. Action d’AIA avec le réactif de Salkowski :(mesure de DO)
Détermination du temps optimal de formation du complexe AIA-réactif de Salkowski :
1. Préparer 50 ml d'AIA à 50 μg/ml à partir d'une solution-mère de 125 μg/ml.
Calcule
(H20 (30ml) + AIA (20ml))
2. Préparer deux cuves :(D.O. à 540 nm)
o T0 : 0.5 ml d'eau distillée + 1,5 ml de réactif de Salkowski. Mélanger doucement
(4 inversions).
o T1 : 0.5 ml d'AIA (50 μg/ml) + 1,5 ml de réactif de Salkowski. Mélanger
doucement (4 inversions).
3. Mesurer la D.O. de la cuve test à 540 nm immédiatement de (T1) et (T0), puis après 2, 4,
6, 9, 10, 11, et 12 min.
Tableau (DO)
Graph
Conclusion :
On a pu à déterminer le temps optimal (10min) de formation du complexe AIA-Salkowski
(coloration rose) permet de fixer un point précis où l'absorbance à (540 nm) atteint sa valeur
maximale (525 nm).
C. Préparation et dosage de la gamme-étalon :
1. À partir de la solution-mère d'AIA à 125 μg/ml, préparer 25 ml de solutions à 5, 10, 20,
40 et 50 μg/ml d'AIA. Homogénéiser chaque solution.
2. Préparer 4 cuves de spectrophotocolorimétrie :
o 0.5 ml de solution contenant 5,10, 20, 40 et 50 μg d'AIA.
o 1,5 ml de réactif de Salkowski + 0.5 ml de la solution pour chacune des 4 cuve.
3. Mélanger comme précédemment et mesurer la D.O. de chaque mélange en mesurant le
temps optimal.
Calcule
Tableau (DO)
Graph
Conclusion :
On peut conclure que l'augmentation de l'absorbance résulte à l'intensification de la couleur
rose au bout des quatre tubes, ce qui peut être expliquer par l’augmentation de la
concentration en AIA sans changer le volume de final (10ml).
D. Incubation et détermination de l'activité enzymatique :
1. Préparation du milieu d'incubation :
Utilisation du l’extrait enzymatique préparer dans la première manipulation (A).
Tableau (pdf)
2. Détermination de l'activité enzymatique :
Après chaque 15 minutes d'incubation dans le bain-marie tout le long de (15,30,45 min)
prélever 0.5 ml de chaque tube, ajouter 1,5 ml de réactif de Salkowski et mesurer la D.O.
à 540 nm.
Tableau (DO)
Graph
Synthèse :(observation)
Le tube 1 ne présente aucune coloration, avec une (DO=0), en raison de l'absence d'AIA.
Le tube 2 montre une coloration rose, avec une (DO) mesurable qui va rester stable durant le
temp puisque la concentration en AIA reste la même.
Le tube 3 présente une coloration rose moins intense que celle du tube 2, dû à la présence
d'AIA et d'enzyme (bouiller) avec un (DO).
Les tubes 4 et 5, contenant les mêmes concentrations d'AIA et d'enzyme, présentent un (DO)
similaire et une coloration moins claire par rapport au tube 2.
Conclusion :
On peut confirmer qu'avec le temps, la (DO) stabilisera puis démunira, cette diminution est
accompagnée d'une disparition progressive de la couleur rose résulter par la dégradation de AIA
en présence d'enzyme (oxydase), jusqu'à atteindre une densité optique stable (nulle) pour les
tubes 4 et 5.
NB : la (DO) va atteindre une valeur nulle au cours de temp, cela va être expliquer par l’absence
totale de la coloration rose résulter d’une dégradation totale de l’AIA par l’enzyme.
