Les acides nucléiques : structure et fonction

Acide nucléique = ADN - ARN. Il s’agit d’une macromolécule formée par polymérisation de nucléotide. Il
comporte 2 messages.

Le message intrinsèque nécessite un codage à 3 bases pour passer à un codage en protéine. Dans les cellules il
existe des ARN qui ne sont pas traduit, ils sont essentiels à la cellule. Toutes les cellules contenant les 2 gènes
X en ont un qui fonctionne alors que l’autre non.

Pour le message extrinsèque, il existe un promoteur qui est le lieu de fixation d’une protéine qui inhibera ou
activera l’expression d’un gène. Le promoteur n’est jamais transcrit car il est le siège entre la protéine et l’ADN.

L’ADN est une molécule souple qui constitue le matériel génétique de la cellule. Les erreurs permettent
l’évolution des organismes. Le matériel génétique d’une cellule vivante doit détenir l’information génétique
propre à l’espèce, pouvoir se reproduire avec le moins d’erreurs possibles, pouvoir se modifier et être traduit en
caractéristiques physiques.

Nucléotide :
Il s’agit d’un nucléoside phosphaté. Il peut être mono, di ou tri phosphaté.
Poly p.3

Nucléoside :
Il s’agit de l’association entre une base azotée (adénine, cytosine, thymine, uracile, guanine) et l’anomère β du
ribose (ARN  ribonucléoside)) ou du désoxyribose (ADN  désoxyribonucléoside). Ils sont reliés par une
liaison N-glycosidique autour de laquelle les bases peuvent tourner, il existe donc 2 conformations : syn. (base
et sucre l’un au dessus de l’autre) et anti. Dans l’ADN, on trouve la conformation anti.
Nomenclature : on ajoute OSINE aux bases purines (adénine et guanine), IDINE aux bases pyrimidines
(thymine, uracile, cytosine)
Poly p.2

Phosphate : il pourra se lier à une fonction alcool OH pour donner une liaison phosphoester.

Par des études de diffraction aux rayons X, on constate que l’ADN est une molécule double brin antiparallèle
(la parallèle n’étant pas sable) avec une structure en hélice régulière d’un pas de 3,4 nm et de 2nm de diamètre.
Phosphate réalise des expériences de séparation des 2 brins d’ADN en nucléotides et constate qu’il y a autant de
base A que T et autant de base C que G. Selon les espèces, le nombre de nucléotide A ou C diffère. Les 2 brins
sont associés par des liaisons hydrogènes entre les bases complémentaires.
Poly p.5 et 6

Le brin d’ADN est orienté grâce à la liaison phosphodiester de 3’OH vers 5’P. Les bases n’interviennent pas
dans la liaison phosphodiester car elles ne sont là que pour maintenir la structure.

Il n’existe pas de colinéarité entre les sucres et les bases ainsi l’ADN comporte des grands et des petits sillons.
Pour le ribose, il existe 2 conformations : C2 endo et C3 endo. Dans la conformation C2 endo, la distance entre
le phosphate et le squelette phosphocarboné est plus grande. C’est la conformation la plus étendue, c’est celle
du B-ADN.
Il existe une forme A-ADN, où on trouve la conformation C3 endo, qui est plus large avec les bases azotées
inclinées. Les grands sillons sont très profonds et étroits ce qui ne permet pas d’accès aux bases. Il existe
également une forme Z.

A B Z

La structure en double hélice est maintenue grâce aux liaisons hydrogènes entre les bases d’une part mais aussi
grâce aux forces d’empilement hydrophobes entre les bases. L’ADN et l’ARN sont très souples donc on peut
trouver in vivo des triple hélice et in vitro on arrive à créer des hélices quadruplex.

Tautomérie :
Chacune des bases existent sous 2 formes appelées tautomères qui sont en équilibre : énol ou cétone. Dans
l’ADN se trouve la forme cétone. Cependant lors de la réplication, un nucléotide porteur de la forme énol peut
être incorporé modifiant ainsi les règles appariement : la forme énol de la thymine peut s’apparier avec la forme
cétone de la guanine et inversement)
Poly p. 24 et 2
On obtiendra finalement un mésappariement qui sera à l’origine d’une mutation s’il n’y a pas de réparation.

Méthylation :
Les gènes actifs chez les vertébrés sont situés dans des zones sous-méthylés de l’ADN. L’absence de
méthylation ou la déméthylation est nécessaire pour l’activité de certains gènes. Une méthyl-transférase
spécifique catalyse la méthylation de la cytosine en 5- méthylcytosine au niveau de la séquence CG répétée. La
méthylation inhibe la transcription. La méthylation est un phénomène essentielle à la régulation de l’expression
génétique : une modification anormale de la méthylation est associée à la plupart des pathologies humaines.
ADN : support de l’information génétique des bactéries (ADN double brin circulaire), des eucaryotes (on le
trouve dans les chloroplastes, mitochondries où il est en double brin circulaire et dans le noyau où il est en
double brin linéaire), des phages. Molécule stable. Dénaturation par l’urée ou la formamide.

ARN : support de l’information génétique de virus et de phages. Les ARN positifs sont traduits en protéines.
L’ARN ribosomal possède 2 sous unités : 18 S et 28 S. Les ARN sa sont minoritaires quantitativement mais pas
qualitativement. Molécule très instable et fragile. Intermédiaire entre le support génétique et la protéine.
L’ARN double brin est sous forme B. Il est très souple et cherche toujours à se mettre sous la forme la plus
stable. Le sucre est le ribose qui le fragilise et le rend instable  facilement dégradable car il doit être
rapidement renouvelé. La base azotée T de l’ADN est remplacée par la U dans l’ARN car au cours de la
désamination de C on obtient T et U, seulement il existe un système de réparation au niveau de l’ADN.

Propriété physico-chimique :
ARN en pH alcalin  hydrolyse.

ADN double brin n’a pas de fluorescence plus importante que l’ADN monobrin. A 260 nm, l’ADN monobrin
absorbe 12-40% plus de lumière que l’ADN double brin car l’empilage d’interaction entre les bases
complémentaires réduit l’absorbance de UV.

Hybridation moléculaire :
Dénaturation : séparation de 2 brins par rupture des liaisons hydrogènes.
Dégradation : rupture des liaisons phosphodiester et génération de base libre.

Tm est la température à laquelle 50% de l’ADN est dénaturé. Tm peut être influencé par la composition en base
(C et G sont plus difficile à dénaturer). Le nombre de mésappariement influe sur le Tm. De même plus la force
ionique est élevée, plus Tm augmente. Na Cl stabilise la double hélice. Moins il y a de formamide, plus Tm
augmente. Quand l’ADN possède moins de 18 bases : Tm = 2 (nB (A+T)) + 4 (nB (C+G))
La réaction d’hybridation est réversible. La réaction de renaturation est d’autant plus lente que l’ADN est long
et complexe. De même des séquences répétées se renaturent plus rapidement. On peut également utiliser une
dénaturation chimique.

Hybridation moléculaire : association par reconnaissance de base de 2 molécules d’acide nucléique. Les 2
séquences peuvent être totalement complémentaire, on parle d’hybridation homologue et il n’y a alors pas de
mésappariement et la séquence est alors stable.
On peut également avoir des séquences partiellement complémentaires, l’hybridation est alors hétérologue et il
peut y avoir des mésappariements dans la séquence qui est alors instable.
Les hybrides ARN : ARN sont plus stable que ADN : ARN et que ADN : ADN (on utilise le Tm -25°C).

Stringence :
Elle définit les conditions physico-chimiques d’une hybridation. Une forte stringence (forte température, faible
salinité, 10% formamide) permet une hybridation entre des molécules très homologues et une faible stringence
(faible température, forte salinité, 0% formamide) permet une hybridation entre des molécules peu homologues.

Les outils de la biologie moléculaires :

L’ADN est chargé négativement par les phosphates, il migre donc vers le pole positif. Il y a proportionnalité
entre la distance de migration et la taille de l’ADN. On utilise le BET pour le colorer. Pour analyser un ADN de
petite taille, on utilise aussi du gel d’acrylamide. Son avantage est d’avoir une grande échelle. Avec cette
méthode on ne fait pas de southern.

Les enzymes de restrictions :

Ce sont des endo nucléases qui sont produites par les bactéries pour se protéger des molécules d’ADN de
bactéries parasitées par des phages. Une nucléase catalyse l’hydrolyse des liaisons phosphodiesters. Une endo
nucléase coupe au milieu alors qu’une exo nucléase coupe à partir du coté. Les enzymes de restriction endo
nucléase coupe au palindrome (les 2 brins complémentaires ont une séquence 5’P 3’OH identiques).
L’enzyme de modification empêche l’enzyme de restriction de couper l’ADN. Chaque bactérie a son propre site
de restriction. Il existe 3 types d’enzyme de restriction.

Système de type 2 : ce sont les plus simples du point de vue action et génétique. Il existe 2 protéines différentes :
endo nucléase qui agit sous forme d’homo dimère et la méthylase qui agit sous forme monomérique.
Les enzymes de restrictions coupent uniquement l’ADN double brin. Pour couper il existe 2 possibilités. Toutes
les enzymes de restrictions génèrent la 2e possibilité où on a 3’OH et 5’P. On peut obtenir une extrémité
cohésive (possibilité de s’hybrider à nouveau et de reformer le site) ou une extrémité franche (il n’y a pas de
cohésion avec les 2 morceaux)
Ils existent des enzymes qui reconnaissent la même séquence mais qui ne coupent pas aux mêmes endroits :
isoschisomère. On peut hybrider 2 bouts d’ADN différents qui sont portés par des molécules différentes 
molécule d’ADN hybridée. On peut hybrider 2 bouts d’ADN qui ont été digérés par 2 enzymes différentes.
Après hybridation il y a plus de site de reconnaissance. Il faut savoir de quelle espèce provient l’ADN pour
savoir quelle enzyme utilisée.
Chez [Link], il existe 2 méthylase :
- Dam méthylase reconnaît GATC et méthyle le A
- Dcm méthylase reconnaît CCWCC et méthyle le dernier C (W = A ou T)
Bcl I est sensible à la méthylation, ainsi il ne coupe pas l’ADN quand il est méthylé.
L’ADN circulaire à une forme compacte et migre donc rapidement par rapport à un ADN de même taille
linéaire. Lors de la digestion, l’ADN circulaire devient linéaire.

Electrophorèse :
Il faut regarder l’intensité de bande. Les petites bandes moins colorées pour le cas où il y a moins d’ADN. Dans
une bande, il y a une accumulation d’ADN de même poids. Il faut toujours avoir un témoin. Attention car le
nombre de bande ne correspond pas toujours au nombre de sites. On peut avoir des bandes de petites tailles plus
intenses que les bandes de grandes tailles car toutes les molécules d’ADN dans le petit fragment ne sont pas
identiques.

Les enzymes de modifications :

La majorité des ADN polymérases utilisées proviennent de [Link]. On utilise les ADN polymérases I qui sont
incapables de polymériser un ADN car elles ont besoin d’une extrémité 3’OH et d’une amorce. Le sens est de
5’  3’.
Processivité : nombre de nucléotide incorporé avant que ADN pol. se détache
Distributivité : elles font généralement 200 à 300 nucléotide avant de changer de brin matrice. Pour la
réplication, on utilise des ADN polymérase processive et pour réparer l’ADN, on utilise des ADN polymérase
distributive. Pour éliminer les bases non appropriées il y a un système de relecture par l’activité exo nucléase 3’
 5’ de l’enzyme.

La terminal désoxynucléotidyl transférase ne copie pas de matrice.

La réverse transcriptase transcrit l’ARN en ADN. Elle nécessite une amorce et on obtiendra un hybride ARN :
ADN.
Fabrication d’un ADN complémentaire : conversion d’un ARNm en ADN double brin.

La ligase agit à l’inverse de la nucléase, elle forme des liaisons phosphodiesters.

L’exo nucléase III nécessite une extrémité 3’OH qui doit être appariée pour son fonctionnement et non un 3’
sortie sinon elle ne fonctionne pas.
La phosphatase élimine les phosphates en 5’.
La poly nucléotide kinase peut phosphoryler l’extrémité 5’ OH en 5’.

Fabrication – marquage d’une sonde :

Le marquage est nécessaire pour localiser spécifiquement une sonde. Le marquage de la sonde peut être assuré
à l’extrémité 5’P par le phosphate 32P radioactif ou par des bases azotées marquées par fluorescence.

Si on a un 5’ entrée, rien ne se passera car l’ADN pol. a besoin d’une entrée 3’. Donc on utilise d’abord une
phosphatase pour obtenir une extrémité 5’OH puis on fait agir une kinase. On a alors 2 techniques :
Ramdom priming : basé sur un mélange d’héxanucléotide de séquence NNNNNN
Nick translation : l’endonucléase va faire des trous et ensuite on utilise l’ADN polymérase.

Chemoluminescence :
Cette méthode ne rend pas l’ADN radioactif mais grâce au luminol, l’enzyme va émettre des photons.
Hybridation southern pour détecter une séquence d’ADN, northern pour détecter une séquence d’ARN et
western pour détecter une protéine.

Southern :
On fait une électrophorèse de l’ADN après une digestion.
On plonge le gel d’agarose dans la sonde pour le traiter ainsi l’ADN est dénaturé et passe à l’état simple brin.
On neutralise la sonde ADN en simple brin, on ajoute un colorant pour observer le front de migration.
Après 12-24h, l’ADN a migré sur le filtre de nylon.
On réalise ensuite une pré hybridation pour saturer le filtre en l’incubant avec un tampon.
On dénature la sonde puis on hybride dans les conditions de stringence, on lave puis on réalise une
autoradiographie.

C’est toujours les mêmes étapes pour les autres. Dans le cas du northern il s’agit d’ARN donc l’interprétation
sera différente : présence ou absence de ARNm. Le gène ne doit pas toujours être exprimé partout. Le gène Y
s’exprime uniquement dans le foie  spécificité. Le gène Z ne s’exprime pas dans le cœur. Le northern donne
plus d’information que le southern. Quand on interprète un southern il y a 2 possibilité : transcription ou
amplification. Pour le western, chaque protéine a des anticorps spécifiques.

Synthèse automatique de l’ADN :

Synthèse d’oligonucléotide : courtes séquences nucléotidiques de 5 à 10 pb. La synthèse chimique se fait à
l’inverse de la synthèse biologique donc de 3’ vers 5’. Les oligonucléotides dégénérés sont des mélanges
d’oligonucléotides de séquences partiellement homologues. Ils sont utilisés pour amorcer la PCR, pour les
sondes d’hybridation… Une fois terminé, on coupe la liaison avec la colonne.

Séquençage :
Méthode de Maxam et Gilbert :
ADN isolé et dénaturé par chauffage et ses brins sont séparés sur gel. Le séquençage porte sur l’un des brins qui
est fragmenté par clivage chimique. Le brin d’ADN est marqué radioactivement et il est réparti en 4 fractions,
chacune étant soumises à un réactif coupant la chaîne au niveau d’un nucléotide porteur d’une base spécifique.

Méthode enzymatique, le Sanger :

ADN isolé et dénaturé par chauffage. L’ADN monobrin est réparti en 4 fractions. Dans chaque fraction il est
répliqué mais sa réplication est bloquée par l’adjonction de didésoxynucléotides qui se fixent au brin répliqué
sur des nucléotides spécifiques et qui bloquent l’élongation de la chaîne

PCR : polymérase chain reaction

Cette méthode permet de copier en grand nombre une séquence d’ADN ou d’ARN. Ce procédé d’amplification
fait intervenir une succession de dénaturation, d’appariements d’oligonucléotide spécifiques et d’élongation à
l’aide d’une ADN polymérase thermostable qui réplique dans le sens 5’  3’ à partir d’amorce.
D’abord on dénature la matrice, puis on hybride avec les amorces qui sont de part et d’autres, puis on réalise
une polymérisation. On dénature une nouvelle fois, on hybride avec les amorces puis on polymérise. Et ainsi de
suite 40 fois.
Les 7 composants essentiels au PCR sont :
- l’ADN polymérase thermostable : TAQ polymérase
 - les oligonucléotides
- d NTPS
- caution pour activer la polymérase
- tampon pour maintenir le pH
- cations monovalents
- le brin matrice d’ADN
L’efficacité n’est pas de 100%.

RT-PCR : reverse transcription PCR

Elle permet d’amplifier directement la copie d’ADN complémentaire d’un ARNm.
Il faut connaître la séquence de l’ARNm que l’on souhaite amplifier. On obtient un hybride ARN-ADN
On a eu des surprises tel que l’épissage alternatif : plusieurs ARNm codent des protéines différentes.

Clonage de la molécule d’ADN :

Un clone désigne un ensemble d’individus ayant le même patrimoine génétique parce qu’étant issu du même
individu par reproduction sexuée.
En biologie, clonage signifie d’une part le fait de reproduire des organismes vivants pour obtenir des êtres
génétiquement identiques.
D’autre part, c’est une technique biologique qui consiste à isoler un fragment d’ADN et à le multiplier à
l’identique en l’insérant dans une molécule d’ADN porteuse appelée vecteur. Ce vecteur permet l’amplification.
Cette méthode peut s’appliquer pour un fragment partiel d’ADN mais également pour cloner un gène entier afin
de permettre de reproduire la protéine recombinante correspondante.

Plasmide :
Molécule d’ADN extra chromosomique capable de se répliquer indépendamment. Il porte des caractères
génétiques non essentiels à la cellule hôte. Les gènes qu’ils portent codent pour des protéines qui confèrent
diverses propriétés biologiques telle que des résistances (antibiotiques, antiseptiques…). Ils permettent aux
bactéries de s’adapter à un environnement hostile.

pBR322 : vecteur de 1er génération conférant à [Link] la résistance à la tétracycline et à l’ampicilline.

On veut cloner un fragment du gène X dans le plasmide BR 322

I- Les extrémités du gène X sont les extrémités PST I, le fragment est pur

Le site se situe à l’intérieur du gène codant pour la résistance à l’ampicilline donc l’insertion d’un ADN
étranger va inactiver le gène de résistance

1er et 2e étapes : digestion du vecteur et du gène afin d’intégrer le gène au vecteur (plasmide)

3e étape : hybridation et ligation. Attention car tous les plasmides n’ont pas forcément intégré le gène.
4e étape : transformation chez l’hôte. On insère le vecteur recombinant dans des bactéries. Là encore toutes les
bactéries n’ont pas intégré le vecteur recombinant. On peut avoir des bactérie vides, des bactéries avec le
plasmide vide et des bactéries avec le vecteur recombinant On recherche les colonies ayant intégrées le
plasmide en testant leur résistance à l’ampicilline.

5e étape : repiquage sur un milieu solide d’agar en présence de tétracycline. Les bactéries vides meurent car
elles ne présentent aucune résistance.

II- Les extrémités du gène sont Eco RI, le fragment est pur

Le site se situe entre 2 gènes de résistances donc aucun des gènes ne sera inactivé lors de l’insertion de l’ADN.
On réalise les mêmes étapes que précédemment.

III- Les extrémités du gène sont Eco RI, le fragment n’est pas pur

On réalise la digestion du vecteur puis une déphosphorylation. Ensuite on réalise la digestion de l’ADN à cloner
puis la ligation mais la ligase ne peut pas circulariser le vecteur sur lui-même. Les fragments les plus petits
seront favorisés et il est rare que 2 fragments s’insèrent côte à côte. Enfin on réalise la transformation chez
l’hôte.

Il existe plusieurs options concernant le clonage mais elles sont fastidieuses :

- tester individuellement chaque plasmide
- amplifier l’ADN de chaque colonie
- extraire l’ADN à partir de chaque colonie amplifiée
- réaliser une carte de restriction

Problèmes lors de la ligation : interaction intramoléculaires (religation du vecteur sur lui-même) favorisées par
rapport aux interactions intermoléculaires (vecteur et ADN)
Pour réaliser une ligation il ne manque qu’un lien phosphodiester entre 3’OH et 5’P. Cependant si on élimine le
phosphate grâce à une phosphatase, la ligase ne peut plus fonctionner et donc la ligase ne peut circulariser le
vecteur sur lui-même. Il n’y a ligation que sur un brin. On obtient alors plus de 90% de clones recombinants.

Hybridation sur colonies :

On met la boite contenant les clones au contact d’un filtre ainsi une partie des bactérie est transférée sur le filtre
qui est ensuite traité à la soude pour dégrader les ARN et dénaturer l’ADN. L’ADN est fixé sur le filtre, on
réalise une neutralisation. On fabrique la sonde que l’on marque radioactivement puis on l’hybride sur le filtre,
on lave et enfin on réalise une autoradiographie pour repérer les clones positifs que l’on pourra ensuite
amplifier.

Tous les clones recombinant ne sont pas identiques car 2 orientations sont possibles (rapport de 50/50) lors de
la ligation. Pour les clonages, on utilise souvent [Link]

Bactériologie :
Une colonie bactérienne ne provient que d’une seule bactérie. T2 est un bactériophage : il injecte son ADN
dans la bactérie qu’il infecte.

Bactériophage M13 : ADN simple brin circulaire excrétée à l’extérieur dans le milieu de culture. Il infecte la
bactérie de manière chronique, elle n’est pas lysée. Dans la bactérie, M13 peut être sous forme double brin
comme un plasmide. Il est utilisé pour construire des banques d’anticorps ou d’oligonucléotides.

Le phage λ présente 2 cycles : un cycle lithique et un cycle lysogène (plus rare). Durant le cycle lysogène, le
phage introduit son ADN dans la bactérie qui continue à se diviser. Durant la phase lithique, le phage provoque
la lyse de la cellule. Son ADN est double brin et possèdent de nombreux gènes importants. Il est modifié pour
être utilisé en vecteur.

Transformation bactérienne :
Elle peut être réaliser par la méthode chimique : calcium ou par la méthode physique : électroporation. En effet
l’ADN recombinant ne peut pas traverser les membranes cellulaires, il faut donc réaliser l’introduction
artificiellement.

PUC 18 : vecteur de 2e génération conférant à [Link] la résistance à l’ampicilline.

On s’intéresse au gène Lac Z qui code pour la β galactosidase (tétramère) qui hydrolyse le lactose en glucose et
galactose. Sous l’action de la galactosidase, X-Gal colore en bleu.
1er propriété unique chez les protéines : l’alpha complémentation, quand on coupe la galactosidase, on obtient 2
parties, α et Ω, qui peuvent se recombiner pour donner une activité enzymatique.
On construit une bactérie qui n’exprime que la protéine Ω. Elle sera donc sensible à l’ampicilline et en présence
de X-Gal elle restera blanche. Si on introduit un plasmide exprimant le fragment α, la bactérie sera bleue et
résistance à l’ampicilline.
Dans le fragment Lac Z du plasmide il y a un site Eco RI. On introduit dans la bactérie un plasmide
recombinant)  la bactérie est blanche et résistante.
Crible direct car alpha complémentation :
- mort des bactéries sans plasmide
- bleues : bactéries avec plasmide non recombinant
- blanches : bactéries avec plasmide recombinant
Il y a un site multiple de clonage qui aide au clonage.

Bluescript : vecteur de 3e génération

- alpha complémentation pour crible direct
- multisite de clonage pour l’aide au clonage
- mutation augmente le nombre de copie par bactérie
- il peut passer sous forme monobrin
- il peut réaliser la transcription in vitro

Clonage d’un produit de PCR :

Après la PCR on obtient un fragment à bout franc (enzyme Sma I)
1er étape : phosphorylation du produit de PCR
2e étape : ligation avec le vecteur linéarisé par Sma I. Après la ligation, aucun site de restriction n’est reformé.
Grâce aux enzymes du polykinker, on fait ressortir le produit PCR
Il y a un problème car la TAQ polymérase ajoute un A à la fin du produit de PCR donc on va cloner TA

Dans une PCR classique, les amorces sont homologues à la cible, et on veut savoir ce qu’il se passe quand on
utilise une amorce contenant une information (site) en 5’ ? Le site sera incorporé au produit de PCR ainsi cette
méthode permet d’introduire une nouvelle information génétique.
Désormais il y a possibilité de cloner dans un site Eco RI d’un plasmide.
Les vecteurs :
Plasmides :
- introduction par transformation
- 106 à 108 clones par µG d’ADN
- 102 à 103 bactérie par boite
Lambda :
- introduction par infection
- 108 à 1010 clones
- 103 à 104 plage par boite.

Banque :
Collection de fragments d’ADN clonés issue d’un seul génome. Une banque idéale doit contenir les clones
représentatifs de toutes les séquences d’ADN génomique du génome de départ. C’est un assortiment aléatoire
de clones dans lequel les séquences génomiques sont représentées sous une distribution suivant la loi du
poisson.

N = ln (1 – P) / ln (1 – f)

N : nombre de clone à analyser pour avoir la probabilité P de le trouver une fois

F : fraction du génome représenté par la taille moyenne des fragments d’ADN dans la banque

Exemple : soit le génome d’un phage de 40 kB. Digestion en 8 fragments de 5 kB et clonage des 8 fragments
dans un plasmide  8 plasmides recombinant contenant chacun des fragments constituent une collection.

Etude d’une pathologie : progéria

On ne connaît pas le gène. On commence par une analyse protéique : les protéine avec un poids moléculaires
élevé migrent moins vite qu’une protéine qui à un poids moléculaire plus faible. On réalise une électrophorèse
du patient sain et une du patient malade. On réalise un micro séquençage qui permet de connaître une partie de
la séquence puis on laisse une recherche dans les banques bioinformatiques. On a des problèmes pour définir la
meilleure sonde car on a une dégénérescence de l’ADN (un aa peut avoir plusieurs codons). La transcriptase
inverse ne transcrit pas tout. Les anticorps sont le 1er outil pour analyser les protéines.
Les malades atteints de la progéria ne sont plus capables de réparer leur ADN, il y a donc de nombreuses
erreurs.