Premier Cycle d’Etudes Médicales

Premier Cycle d’Etudes Pharmaceutiques

Techniciens Supérieurs de Biologie Médicale
Sages – Femmes
Département de Chimie-Biochimie,
Biologie Cellulaire & Moléculaire

LES ACIDES NUCLÉIQUES

Dr NGUELE Jean – Calvin, Ph.D.

Copyright Dr NGUELE Jean-

Jean-Calvin 2013
 LES ACIDES NUCLÉIQUES

OBJECTIFS SPÉCIFIQUES

Définir les principaux acides nucléiques

Reproduire la structure des acides nucléiques

Reconnaître les molécules simples dont ils sont

Constitués BASES PURIQUES BASES PYRIMIDIQUES

Enumérer au moins deux méthodes d’ études des acides

nucléiques

Comprendre le mécanisme d’appariement des bases

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 PLAN SOMMAIRE

I- DÉFINITIONS & GÉNÉRALITÉS

II- MOLÉCULES SIMPLES CONSTITUANT LES ACIDES NUCLÉIQUES
III- BASES PURIQUES

IV- BASES PYRIMIDIQUES

V- NUCLÉOSIDES ET NUCLÉOTIDES

VI- MÉCANISME D’APPARIEMENT ET COMPLÉMENTARITÉ DES BASES

VII- L’ACIDE RIBONUCLÉIQUE

VIII- L’ACIDE DÉSOXYRIBONUCLÉIQUE

IX- PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES DES ACIDES NUCLÉIQUES

X- ORGANISATION DES GÉNOMES

XI- MÉTHODES D’ÉTUDE DES ACIDES NUCLÉIQUES
XII- QUELQUES CORRÉLATIONS CLINIQUES

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I- DÉFINITION & GÉNÉRALITÉS
I-1. Définition

Acides nucléiques
macromolécules constituées de plusieurs centaines ou de milliers de nucléotides
liés entre eux par des liaisons phosphodiesters.
phosphodiesters.

D’abord isolés dans le noyau cellulaire (Eucaryotes

Eucaryotes));

Puis dans le cytoplasme

cytoplasme;;

Les organites cellulaires (mitochondries et chloroplastes);

chloroplastes)

Mais aussi chez les Procaryotes (bactéries et virus

virus));

Le terme acide nucléique n’est plus approprié!!!

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 I-2. Généralités

Les acides nucléiques sont le support de l’information génétique.

génétique

Transmise de manière fidèle et héréditaire à tous les descendants d’une

même espèce;
espèce;

Contient un message pour la synthèse des protides (peptides et protéines)

qui sont des composés fondamentaux de la cellule et support de l’activité
activité
biologique..
biologique

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Il existe deux types d’acides nucléiques:

Acide Désoxyribo
ésoxyriboNNucléique ou Deoxyribo
eoxyriboNNucleic Acid
A D N D N A

Acide Ribo
iboNNucléique ou Ribo
iboNNucleic Acid
A R N R N A

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 ADN (ou DNA)

Localisé essentiellement (mais pas exclusivement) dans le noyau
Car le DNA peut
être aussi localisé dans les mitochondries
mitochondries,, chloroplastes
chloroplastes..

Le DNA (ou RNA chez certains virus) dicte l’ordre dans lequel les amino acides
vont se lier les uns aux autres pour donner naissance aux protéines
protéines..

Le DNA renferme aussi l’information nécessaire à la régulation de la synthèse

protéique..
protéique

Les informations contenues dans le DNA sont transmises de manière héréditaire

aux descendants
DNA est le support de l’information génétique.
génétique.

L’information est arrangée dans une unité identifiée par les généticiens (Gregor
MENDEL et Thomas Hunt MORGAN MORGAN))
GÈNE.

GÈNE = unité héréditaire (séquence d’ADN) contrôlant des traits indentifiables des
organismes..
organismes
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 ARN (ou RNA)

L’Acide Ribonucléique est essentiellement localisé dans le cytoplasme des

cellules..
cellules

Il provient de la transcription de l’ADN

l’ADN..

Les RNA permettent l’exécution de la synthèse des protéines.

protéines.

Il existe des faibles quantités de RNA de petite taille dans le noyau (small nuclear
RNA ou snRNA
snRNA)).

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II
II-- MOLÉCULES SIMPLES CONSTITUANT LES ACIDES NUCLÉIQUES
Les acides nucléiques sont des molécules constituées par l’enchaînement de plusieurs sous
sous--
unités appelées NUCLEOTIDES liés par des LIAISONS PHOSPHODIESTERS.
PHOSPHODIESTERS.

II
II--1. Le Sucre RIBOSE
Rockefeller Institute of Biochemistry + OSE
Le β-D-ribose et son dérivé le 2-désoxy
désoxy--β-D-ribose sont des oses simples qui
rentrent dans la constitution des acides nucléiques
nucléiques..
Anomère β exclusivement

A A

R D

N N
présence de –OH en C2 Absence de –OH en C2

β-D-Ribose désoxy-β-D-Ribose
2-désoxy-

Le ribose est un pentose de la série D. Dans les acides ribonucléiques, il est
cyclisé en ribofuranose : anomère β spécifiquement;
spécifiquement;

Le désoxyribose, composant des acides désoxyribonucléiques est dérivé du ribose

ribose..
Il confère à cet acide nucléique une plus grande stabilité propre à sa fonction de
conservation de l’information génétique.
génétique.
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 I-2. L’Acide Phosphorique
C’est un tri
tri--acide (contient 3 fonctions acides) dont deux seront estérifiées par une
liaison phosphodiester.
phosphodiester. On aura soit du phosphate inorganique (acide
phosphorique), soit du pyrophosphate (PPi PPi)).

Liaison Ester Liaison Anhydride

d’acides

+ +

H2O Acide Acide Acide H2O

Ester Alcool Anhydride
phosphorique phosphorique phosphorique phosphorique
phosphorique

Le phosphate inorganique est un ion stable formé à partir de l’

l’acide
acide phosphorique
PO4H3.

Des esters de phosphate peuvent se former entre un phosphate et un groupement
hydroxyle libre (alcool
alcool,, énol,
énol, phénol...
phénol...)).

La condensation d’un phosphate et d’un autre acide donne un anhydride
anhydride.. Il y a
aussi des anhydrides mixtes avec les acides carboxyliques par exemple.
exemple.
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 II
II--3. Les Bases Azotées

Les bases azotées hétérocycliques sont des molécules aromatiques dont le noyau
est soit une purine (BASES PURIQUES
PURIQUES), ), soit une pyrimidine (BASES
PYRIMIDIQUES)).
PYRIMIDIQUES

BASES PURIQUES
PURIQUES:: ADÉNINE GUANINE

BASES PYRIMIDIQUES
PYRIMIDIQUES:: CYTOSINE THYMINE URACILE

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III
III-- LES BASES PURIQUES
Elles sont constituées d’un noyau purine et de divers substituants.
substituants. Elles sont au
nombre de 2 : l’
l’Adénine
Adénine (A) et la Guanine (G).
(G). Les purines ont un double noyau
aromatique comportant un cycle hexagonal de 4 carbones et 2 azotes et un cycle
pentagonal de 3 carbones (dont 2 communs avec le précédent) et 2 azotes
azotes..

Le noyau purine est constitué de deux noyaux hétérocycliques accolés,

accolés, un de
six atomes et l’autre de cinq atomes, ayant deux carbones en commun au milieu
milieu.. Les
différentes bases rencontrées dans les acides nucléiques en dérivent selon les
substituants que portent les atomes de ces noyaux
noyaux.. De nombreux médicaments
appartiennent aussi à ces deux classes de bases azotées

Noyau purine

ADÉNINE GUANINE

ARN ADN Copyright Dr NGUELE Jean-

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 III
III--1. L’Adénine
L’Adénine (A)
L’adénine est constituée d’un noyau purine dont le carbone 6 est substitué par
une fonction amine.
amine. Elle est la seule des bases nucléiques dont la formule ne
contient pas d’atome d’oxygène
d’oxygène..

1 6
7
5
8
2 4
9
3

ADÉNINE (6-Amino-
Amino-purine)
TAUTOMÉRISATION CETO-
CETO-ÉNOLIQUE DE L’ADÉNINE

Formes tautomères
de l’Adénine
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 III
III--2. La Guanine
Guanine (G)

La guanine est constituée d’un noyau purine dont le carbone 2 est substitué par
une fonction amine et le carbone 6 par une fonction cétone.
cétone.

GUANINE (2-Amino
Amino,, 6-oxy-
oxy-purine)
TAUTOMÉRISATION CETO-
CETO-ÉNOLIQUE DE LA GUANINE

Formes tautomères
de la Guanine
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IV-
IV- LES BASES PYRIMIDIQUES

Les bases pyrimidiques sont au nombre de 3 : la Cytosine (C),

(C), l’
l’Uracile
Uracile (U) et la
Thymine (T).
(T). Les pyrimidines ont un noyau aromatique hexagonal de 4 carbones et
2 azotes.
azotes.

Noyau pyrimidine

URACILE CYTOSINE THYMINE

ADN
ARN

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 IV
IV--1. La Cytosine
Cytosine (C)

La cytosine est constituée d’un noyau pyrimidine dont le carbone 4 est substitué
par une fonction amine et le carbone 2 par une fonction cétone
cétone..

CYTOSINE (2-oxy
oxy,, 4-amino
amino--pyrimidine)

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 IV
IV--2. La Thym
Thymine
ine (T)

La thymine est aussi constituée d’un noyau pyrimidine dont les carbones 2 et 4
portent des fonctions cétone, mais dont le carbone 5 est substitué par un méthyl.
méthyl.

THYMINE (2, 4-dioxy

dioxy,, 5-méthyl-
méthyl-pyrimidine)

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 IV
IV--3. L’Uracile (U)

L’uracile est constituée d’un noyau pyrimidine dont les carbones 2 et 4 portent
des fonctions cétones.

URACILE (2, 4-dioxy

dioxy--pyrimidine)

TAUTOMÉRISATION CETO-
CETO-ÉNOLIQUE DE L’URACILE

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V- LES NUCLÉOSIDES & NUCLÉOTIDES
V-1. Nucléosides
Les sucres (ribose ou désoxyribose) se lient aux bases azotées par des liaisons
impliquant un des azotes de la base (azote n°°1 des pyrimidines ou azote n°°9
des purines)
purines) et le carbone n°°1 de l’ose (carbone réducteur ou fonction hémi
hémi--
acétalique)). Ce sont des liaisons N-osidiques.
acétalique osidiques.

La liaison d’une base azotée avec un des sucres donne un nucléoside

nucléoside.. Un nucléoside
est donc formé d’une base et d’un sucre liés par une liaison N-osidique
osidique.. A
C
G
NUCLÉOSIDE = SUCRE (RIBOSE ou DÉSOXYRIBOSE) + BASE T
U

Dans un nucléoside, on numérote les atomes de la base par des chiffres : 1, 2, 3,

etc...
etc... et pour les distinguer, les carbones du sucre sont numérotés 1’, 2’, 3’, etc.
etc.
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 V-2. Nucléotides
La liaison d’un nucléoside avec un phosphate se fait par une estérification de la
fonction alcool primaire (carbone n°°5’) du sucre et une des trois fonctions acides
du phosphate
phosphate.. L’ester obtenu est un nucléotide
nucléotide.. Un nucléotide est donc formé d’une
base azotée, liée par une liaison osidique avec un sucre, lui-
lui-même lié par une liaison
ester avec un phosphate
phosphate..
NUCLEOSIDE
1P MONOPHOSPHATE
MONO PHOSPHATE

NUCLÉOTIDE = NUCLÉOSIDE + PHOSPHATE (S) 2P NUCLEOSIDE

DI
DIPHOSPHATE
PHOSPHATE

3P NUCLEOSIDE
TRIPHOSPHATE
TRI PHOSPHATE

Dans le métabolisme des acides nucléiques interviennent des substrats riches en

énergie, les nucléosides triphosphates.
triphosphates. Un nucléoside triphosphate est un
nucléotide dont le phosphate est lui-
lui-même lié à un ou deux autres phosphates par
des liaisons anhydride d’acides
d’acides..
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 V-3. Nomenclature des unités Nucléotidiques

L’union d’une BASE et d’un PENTOSE (RIBOSE ou DESOXYRIBOSE

DESOXYRIBOSE))
s’appelle un NUCLÉOSIDE
NUCLÉOSIDE.. Des qu’un groupe PHOSPHATE est présent,
l’ensemble est désigne par le terme NUCLÉOTIDE
NUCLÉOTIDE.. Il en résulte toute une
nomenclature comme suit
suit::

7 5 6 1
γ β α 8 4
9 3 2
5’

1’
4’

3’ 2’
BASE (A)

DÉSOXYRIBONUCLÉOSIDE (dA)
dA)

DÉSOXYRIBONUCLÉOSIDE 5’ MONOPHOSPHATE (dAMP

dAMP))

DÉSOXYRIBONUCLÉOSIDE 5’ DIPHOSPHATE (dADP

dADP))

DÉSOXYRIBONUCLÉOSIDE 5’ TRIPHOSPHATE (dATP

dATP))

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Chaque base peut entrer dans la structure de deux nucléosides, selon que le sucre
est un ribose ou un désoxyribose
désoxyribose..

Chaque nucléoside peut être lié à un, deux ou trois phosphates

phosphates.. On les désigne par
des sigles conventionnels : GMP pour guanosine monophosphate
monophosphate,, CDP pour
cytidine diphosphate
diphosphate,, ATP pour adénosine triphosphate
triphosphate,, etc...
etc...
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VI-
VI- MÉCANISMES D’APPARIEMENT COMPLÉMENTARITÉ DES BASES

VI
VI--1. La Règle de CHARGAFF

Dans un ADN double brin (bicaténaire),

bicaténaire), la QUANTITÉ de PURINE est
TOUJOURS ÉGALE à celle des PYRIMIDINES PYRIMIDINES.. Aussi, il en résulte que la
quantité de Cytosine équivaut toujours à celle GuanineGuanine,, de même, la quantité
de l’
l’Adénine
Adénine est toujours égale à celle de Thymine
Thymine..

PURINES = PYRIMIDINES %A + %G
= 1
%C + %T

T A U A G C
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VII-- L’ACIDE RIBONUCLÉIQUE
VII
VII--1. Définition & Caractéristiques
VII

L’Acide Ribonucléique (ARN

ARN)) se différencie de l’ADN par la structure des nucleotides
constitutives::
constitutives

Le RIBOSE y remplace le désoxyribose

La base pyrimidique URACILE se substitue à la thymine

L’ARN existe habituellement sous forme d’un seul brin polynucléotidique

polynucléotidique:: on dit alors qu’il est
MONOCATÉNAIRE..
MONOCATÉNAIRE

Toutefois, l’ARN peut se replier sur lui-
lui-même et former ainsi de courtes régions ou des
appariements complémentaires entre les bases simulent des structures en DOUBLE HÉLICE
HÉLICE..

Cela conduit a de nombreuses possibilités de structures tertiaires en forme d’ d’épingles
épingles à
cheveux (HAIRPIN
HAIRPIN), ), bourgeons ou boucles (LOOPSLOOPS)) qui sont autant de sites
d’interaction avec des complexes protéiques
protéiques..

L’une des caractéristiques les plus étonnantes de l’ARN

est également sa capacité à agir comme une enzyme, d’où
le nom de RIBOZYMES donne aux ARN concernés.
concernés.

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 VII--2. Origine et Différents types d’ARN
VII

L’ARN provient de la TRANSCRIPTION de l’ADN grâce aux enzymes appelées RNA

RNA--
Polymerases.. Ainsi, chez les Eucaryotes, il y a 4 classes d’ARN
Polymerases d’ARN::

Les ARN MESSAGERS ou mRNA (2% des ARN totaux); contiennent l’information
nécessaire a la synthèse des protéines.

Les ARN RIBOSOMIQUES ou rRNA (environ 80% du total); ce sont des composants
structuraux des ribosomes.

Les ARN de TRANSFERT ou tRNA (environ 16% du total); ils fixent les acides α-
aminés et les transportent jusqu’au lieu de synthèse des protéines (ribosomes).

Les ARN NUCLEAIRES HÉTÉROGÈNES ou nhRNA (moins de 2% du total); ils se

retrouvent au niveau du noyau ou ils sont associes a l’ADN. Leurs roles sont divers.

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 VII--3. Structure des ARN
VII

Les ARN sont monocaténaires mais dans certains cas, ils présenteront des structures
tertiaires bicaténaires:

Cas des mRNA

Leur structure est en MOSAÏQUE

MOSAÏQUE.

PRE-MESSAGER

EXON 1 INTRON 1 EXON 2 INTRON 2 EXON 3

5’ 3’

COIFFE
MESSAGER MATURE

G EXON 1 EXON 2 EXON 3 AAAAA

5’ 3’
QUEUE

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 CAS DES rRNA
Ce sont exclusivement des ARN de structuraux des ribosomes (sous (sous--unités 30
30ss
et 50s)
50s).. Ils ne sont jamais traduits en protéines.
protéines. Il existe une différence entre les
rRNA des procaryotes et ceux des eucaryotes
eucaryotes..

En médecine, du point de vue clinique, cette différence structurale entre procaryotes et

eucaryotes est mise à profit dans le cadre de l’l’antibiothérapie
antibiothérapie.. En effet, il existe des
antibiotiques (TÉTRACYCLINE, AMINOSIDES
inhibiteurs de la s.u. 30 30ss/
ÉRYTHROMYCINE et CHLORAMPHÉNICOL
inhibiteurs de la s.u 50s 50s) qui
inhiberont spécifiquement et sélectivement des ribosomes procaryotes (inhibiteurs de
traduction), empêchant ainsi la multiplication bactérienne
bactérienne..

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 Cas des tRNA

On compte chez l’Homme, 31 types différents de molécules d’ARN de transfert transfert.. Elles sont
formées d’un brin de tRNA d’environ 80 nucléotides.
nucléotides. Les tRNA servent de TRADUCTEURS
entre le LANGUAGE des nucléotides (dans le mRNA mRNA)) et celui des acides α-aminés (dans la
protéine).. Les tRNA ont une structure en « trèfle » très caractéristique
protéine) caractéristique..

ACIDE AMINE

BOUCLE BOUCLE
DIHYDROURIDINE (ψU)
PSEUDOURIDINE (ψ

BOUCLE
VARIABLE

FIXATION AMINOACYL-
AMINOACYL-tRNA
tRNA--SYNTHASE

BOUCLE
ANTICODON RIBOSOME (site A)
FIXATION CODON mRNA

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 VII--4. Exemple d’Inhibition sélective des RNA-
VII RNA-Polymérases

EMPOISONNEMENT A L’AMANITE PHALLOÏDE

Fréquemment, c’est une confusion avec des champignons comestibles d’apparence semblable
qui est à l’origine de l’intoxication
l’intoxication.. De plus, la toxine principale de l’amanite phalloïde (α-
AMANITINE)) n’est pas détruite par la cuisson.
AMANITINE cuisson.

L’ α-AMANITINE inhibe la RNA Pol II eucaryote donc, la synthèse des mRNA à des
concentrations faibles. A fortes concentrations, la RNA Pol III est à son tour inhibée et
partant, la synthèse des tRNA .
Les deux actions de l’α
l’α--amanitine aboutissent à empêcher les synthèses protéiques,
point d’impact de cette toxine
toxine.. Les conséquences sur les fonctions de l’organisme
sont celles classiques d’une observation clinique d’un empoisonnement qui
évoluera en 3 phases
phases::

1ère PHASE
PHASE:: GASTRO
GASTRO--ENTÉRITE (6 à 24
24hh après ingestion) sous forme d’une
forte diarrhée.
diarrhée.

2ème PHASE
PHASE:: EMBELLIE TROMPEUSE (1 à 2 j);j); seule une forte élévation
destransaminases est à ce moment-
moment-là annonciatrice de la menace.
menace.

3ème PHASE
PHASE:: HÉPATO
HÉPATO--RÉNALE (3 à 4 j);
j); l’action de la toxine sur le foie et les
reins devient visible aboutissant vite a une HÉPATITE FULMINANTE ou a
une INSUFFISANCE RÉNALE AIGUEAIGUE..

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VIII-- L’ACIDE DESOXYRIBONUCLÉIQUE (ADN)
VIII

VIII--1. Historique de la découverte de l’ADN

VIII

LES PRÉCURSEURS

En 1869
1869,, le Suisse Friedrich MIESCHER isole une substance riche en
phosphore dans le noyau des cellules, qu'il nomme nucléine (du latin nucleus
nucleus,, le
noyau)

En 1889
1889,, l'Allemand ALTMANN sépare à partir de la nucléine, des protéines et une
substance acide, l'acide nucléique
nucléique..

En 1896
1896,, l'Allemand KOSSEL découvre dans l'acide nucléique les 4 bases azotées A,
C, T, G.
G.

En 1928
1928,, LEVENE et JACOBS (USA USA)) identifient le désoxyribose
désoxyribose.. En 1935
1935,, on
parle alors d'acide désoxyribonucléique.

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Jean-Calvin 2013
Le premier phénomène qui allait permettre de progresser dans l'identification du
support de l'hérédité est celui de la transformation bactérienne, rapporté en 1928 par
l'anglais Fred GRIFFITH (1877 – 1941 1941..

Celui-ci travaillait alors au laboratoire de pathologie du ministère de la santé du

Celui-
Royaume UniUni..

En 1944
1944,, l'américain AVERY découvre que l'ADN est l'agent l'agent transformant des
bactéries, et donc ce serait bien le support de l'hérédité
l'hérédité..

Mais, certains scientifiques restent sceptiques, et n'abandonnent pas l'idée que les
protéines puissent porter l'information génétique
génétique.. En 1952
1952,, l'expérience de Hershey
et Chase invalide définitivement cette hypothèse
hypothèse..

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 LES PÈRES DE LA STRUCTURE DE L’ADN
C'est au laboratoire Cavendish de Cambridge
Cambridge,, qu'a été établi la structure en
double hélice de l'ADN, grâce à la Technique de diffraction des rayons X, le
25 avril 1953.
1953.
On doit cette découverte à James WATSON,
WATSON, alors âgé de 25 ans, Francis CRICK,
CRICK,
physicien de formation, et Maurice WILKINS qui reçurent le prix Nobel de
physiologie et de médecine,
médecine, le 31 octobre 1962.
1962. Mais leur découverte a été
aussi rendue possible par le travail de Rosalind FRANKLIN,
FRANKLIN, qui mourut avant
l'attribution du prix Nobel.
Nobel.

PN, Physiology & Medicine,

Medicine, Octobre 31, 1962

†
James D. WATSON Francis C. CRICK Maurice WILKINS Rosalind FRANKLIN

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 VIII--2. Généralités
VIII

L’
L’acide
acide désoxyribonucléique ou ADN est une macromolécule, retrouvée dans
toutes les cellules vivantes, qui renferme l'ensemble des informations nécessaires au
développement et au fonctionnement d'un organisme
organisme..

L'ADN est aussi le SUPPORT DE L'HÉRÉDITÉ car il est transmis lors de la

reproduction.. Il porte donc l'INFORMATION
reproduction l'INFORMATION GÉNÉTIQUE et constitue le
GÉNOME des êtres vivants
vivants..

L'ADN détermine la synthèse des protéines.

Dans les cellules eucaryotes

eucaryotes,, l'ADN est contenu dans le NOYAU et une petite partie
dans la matrice des MITOCHONDRIES ainsi que dans les CHLOROPLASTES
CHLOROPLASTES..
Dans les cellules procaryotes
procaryotes,, l'ADN baigne directement dans le CYTOPLASME
CYTOPLASME..
Certains virus possèdent également de l'ADN dans leur CAPSIDE
CAPSIDE..

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L’enchainement des nucléotides de l'ADN qui est assuré par des LIAISONS
PHOSPHODIESTERS est non non--aléatoire.
aléatoire.

L'information portée par l'ADN peut se modifier au cours du tempstemps.. Cela engendre
une diversité des individus (POLYMORPHISME
POLYMORPHISME)et )et à une évolution possible des
espèces.. Cela est dû à des mutations suite à des erreurs lors de la réplication
espèces
(ajout, délétion ou substitution de nucléotides), ou bien à des RECOMBINAISONS
GÉNÉTIQUES..
GÉNÉTIQUES

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Jean-Calvin 2013
 VIII--3. Structure
VIII

L’ADN est une molécule bicaténaire qui se retrouve sous forme d’une DOUBLE
DOUBLE--
HÉLICE DROITE
DROITE..

DNA--A
DNA DNA--B
DNA DNA--Z
DNA

Dans la nature et en solution, c’est la forme DNA

DNA--B (très
hydratée) qui est prédominante.
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Au niveau de la double hélice d’ADN il y a des valeurs constantes remarquables
remarquables:: aussi, ses deux
brins constitutifs sont ANTIPARALLÈLES (l’un orienté 5’
3’ et l’autre 3’
5’) et
COMPLÉMENTAIRES (appariement A/T et G/C) G/C).. Un tour d’hélice mesure 3,4 nm (0,34 nm
entre nucléotides successifs) et contient 10 paires de bases.
bases.

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IX
IX-- PROPRIÉTÉS PHYSICO-
PHYSICO-CHIMIQUES DES ACIDES NUCLÉIQUES
IX
IX--1. Dénaturation
Lorsqu’on place une solution de DNA dans un spectrophotomètre avec un dispositif
permettant son chauffage, on constate qu’à une certaine température, il y a une
brutale augmentation de l’absorbance (DENSITÉ
DENSITÉ OPTIQUE
OPTIQUE).

Cette augmentation de la DO = EFFET

EFFET HYPERCHROME
HYPERCHROME, due à la rupture
des liaisons hydrogènes entre les chaînes de DNA. On dit alors que la molécule
d’ADN est dénaturée quand les chaînes complémentaire sont séparées.

De même, une baisse de la DO = EFFETEFFET HYPOCHROME

HYPOCHROME, sera due au
HYPOCHROME
rétablissement des liaisons hydrogènes entre les deux chaînes de DNA. On dit
alors que la molécule d’ADN est renaturée quand les chaînes
complémentaire se sont rappariées.

La température à laquelle le phénomène se produit = TEMPÉRATURE DE

FUSION (ou Tm Tm))
correspond à la moitié de l’effet hyperchrome c.à.d. à la
température à laquelle il y a rupture des liaisons H de la moitié des molécules
du DNA.
DNA

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Jean-Calvin 2013
 La température de fusion Tm dépend de la proportion des bases GC dans la
molécule du DNA.

Il faut chauffer davantage pour rompre les liaisons hydrogène d’un DNA
riche en (G + C) que celles d’un DNA riche en (A + T)
T)..

Remarque:
La Tm augmente linéairement en fonction de la proportion de G + C selon
la relation suivante: Tm = 69
69,,3°° + 0,41 (G + C ) %

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Jean-Calvin 2013
 IX
IX--1. Dénaturation (suite) DNA
Dénaturé
DO monocaténaire

DO (260 nm)

DNA
bicaténaire
1.40 λ
230 260 280

1.20

Tm = 82°C

1.00
65 70 75 80 T ((°
° C)

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Jean-Calvin 2013
 IX
IX--2. Renaturation - Hybridation

Lorsque le DNA est chauffé au-delà de son Tm (on sépare alors les liaisons hydrogenes
de toutes les molécules) et qu’on refroidit très progressivement (Température
ambiante), les chaînes séparés du DNA se réapparient pour reformer la
double hélice identique à celle du DNA natif natif: ce phénomène est appelé
RENATURATION.
RENATURATION

Le DNA renaturé présente la même absorbance (DO) que le DNA natif: c’est l’EFFET
EFFET
HYPOCHROME!
HYPOCHROME

RENATURATION

DENATURATION
IRREVERSIBLE!!!

DNA
natif
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Jean-Calvin 2013
 IX
IX--3. Application biochimique: la Polymerase Chain Reaction (PCR)
Robert K. MULLIS, 1985
PRINCIPE PN Chimie, 1993

La PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d’amplifier spécifiquement une

région de DNA double brin de quelques centaines de paires de bases. Ce DNA doit
d’abord être séparé en simples brins (dénaturation
dénaturation à 95°
95° C).

On ajoute au DNA de départ une large quantité d’amorces amorces (oligonucléotides
synthétiques complémentaires des deux extrémités de la région à amplifier) qui
vont s’hybrider à 50-
50-60°
60° C environ avec la séquence complémentaire sur chacun des
brins de DNA, et les quatre dNTPs qui serviront de substrats.

On soumet le tout à l’activité d’une DNA polymérase (Taq Taq polymerase
polymerase) qui
synthétise à 72°
72° C un brin complémentaire à partir du 3’OH de l’amorce hybridée. On
obtient quatre brins de DNA.

On recommence à dénaturer ces 4 brins brins, puis on les laisse s’hybrider avec les
amorces (toujours en excès) et la polymérase entre en action pour aboutir à 8 brins
de DNA.
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Jean-Calvin 2013
 IX
IX--3. Application biochimique: la Polymerase Chain Reaction (PCR)
Robert K. MULLIS, 1985
PRINCIPE (suite) PN Chimie, 1993

On recommence à dénaturer ces 8 brins brins,, puis on les laisse s’hybrider avec les
amorces (toujours en excès) et la polymérase entre en action pour aboutir à 16 brins
de DNA
DNA..

Et ainsi de suite en 35 cycles,

cycles, ce qui aboutit à 34
34..359
359..738.
738.368 brins de DNA (34
milliards), ce qui représente une quantité suffisante pour étudier le fragment de DNA
amplifié..
amplifié

TEMPERATURE (°C)

90°C

(1) 72°C

55°C (3)

(2)

90 30 60 TEMPS (sec)
(1) DENATURATION (95°
(95° C)
(2) HYBRIDATION (65°
(65° C)
(3) AMPLIFICATION (72°
(72° C)

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Jean-Calvin 2012
 Robert K. MULLIS, 1985
PRINCIPE (suite) PN Chimie, 1993

5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’

5’ 3’
Fragment de DNA d’intérêt Amorces (primers) Brins complémentaires néo-
3’ 5’ synthétisés

Brins complémentaires

3’ 5’ 3’ 5’
3’ 5’ 3’ 5’
(1) DÉNATURATION (à 95°C) (2) HYBRIDATION (à 65°C) (3) AMPLIFICATION (à 72°C)
90 sec 30 sec 60 sec
Actuellement, cette amplification in vitro automatisée et rendue possible grâce à
des appareils programmés en temps et température appelés THERMOCYCLERS
THERMOCYCLERS.

Les résultats obtenus ou amplifiats

peuvent être visualisés après
électrophorèse sur gel d’agarose et
coloration au BET (bromure
d’ethydium).

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Jean-Calvin 2013
 IX
IX--4. Spectre d’absorption

Le DNA présente un maximum d’absorption dans l’ultraviolet à 260 nm.

nm

DO

230 260 280 λ (nm)

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 IX
IX--5. Dosage des DNA

La lecture au spectrphotomètre en U.V permet de vérifier la quantité et la pureté

de DNA extrait.
Le rapport DO 260 nm/DO 280 nm ≈ 1.8

Si ce rapport est élevé (>

>1.8)
contamination par le RNA (qui absorbe aussi à
260 nm
nm).

Si ce rapport est faible (<

< 1.8)
contamination par des protéines (qui absorbent
à 280 nm ou à 230 nm nm) ou PHÉNOL
PHÉNOL.

DNA pur
Double brin: 1 unité de DO (260 nm) = 50 ng/µl
Simple brin: 1 unité de DO (260 nm) = 40 ng/µl

NB: Les acides nucléiques sont purifiés à partir d’un mélange PHÉNOL-
CHLOROFORME.
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Jean-Calvin 2013
X- ORGANISATION DES GÉNOMES
X-1. Structure du chromosome
Le chromosome est le support physique de l’information génétique.
génétique Chez les
organismes diploïdes, ils sont organisés en paires d’homologues.
d’homologues Chaque espèce
animale et végétale en a un nombre bien déterminé de paires de chromosomes que
l’on obtient simplement en réalisant un caryotype
caryotype.

Chez l’humain, il y a 23 paires de chromosomes,

chromosomes c’est-à-dire
22 paires
de chromosomes normaux ou AUTOSOMES et 1 paire de chromosomes
sexuels ou GONOSOMES
GONOSOMES.
Télomère

Centromère

Chromatides

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 X-2. Structure des Histones

Si elle était étirée, la double hélice d’ADN de chaque chromosome humain aurait en
moyenne une longueur de 5 cm.

Les HISTONES sont responsables de l’empaquetage de cette très longue molécule

d’ADN dans un noyau qui a seulement quelques µm de diamètre.

L’unité fondamentale d’empaquetage est le NUCLÉOSOME

NUCLÉOSOME.

DNA d.s.

nucléosomes

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 X-2. Structure des Histones (suite)

Un nucléosome est constitué d’un noyau octamérique autour duquel s’enroule

une longueur de DNA de 146 paires de bases.
bases L’ octamère est constituée comme
suit:
DNA d.s.

2 x H2A
H4 H4
2 x H2B
Noyau octamérique H2A H1 H1 H2A
2 x H3
H2B H3 H3 H2B
2 x H4

En fait, l’histone H1 ne rentre pas dans la constitution de l’octamère mais joue tout
de même un rôle capital en permettant de relier les différents nucléosomes les uns
aux autres.

Ainsi les histones, en permettant une organisation structurale d’unités génomiques

(nucléosomes), assurent un degré de compaction très important de l’ADN dans
le noyau.

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XI
XI-- MÉTHODES D’ÉTUDE DES ACIDES NUCLÉIQUES
XI
XI--1. Extraction de l’ADN

1- PURIFICATION des solutions

précédemment obtenues PHENOL SATURE + TAMPON TRIS-EDTA

2- Séparation des phases CENTRIFUGATION

3- Recueil et lavage de la phases

acqueuse MELANGE CHLOROFORME/ALCOOL

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 XI
XI--2. Purification de l’ADN

1- Précipitations répétées CENTRIFUGATION ALCOOL

2- Addition d’une solution a haute PRECIPITAT du DNA = MEDUSE

force ionique [NaCl = 3M]

3- Conservation de l’ADN Eau pure ou Tris-EDTA

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 XI
XI--3. Extraction de l’ARN

1- Inhibition des RNases PHENOL SATURÉ + TAMPON TRIS-EDTA

2- Homogénéisation dans un Potter CENTRIFUGATION

3- Surnageant d’Acides Nucléiques ULTRACENTRIFUGATION

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 XI
XI--4. Purification de l’ARN

1- Chromatographie d’Affinité Colonne Poly-dT

2- Lavage de la colonne en milieu Chargement des ARN totaux à haute

alcalin [KOH] = 0.1M force ionique [KCl ]= 0.5M

3- Test de QUALITE Essai avec la REVERSE TRANSCRIPTASE

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 XI
XI--5. Spectrophotométrie

La spectrophotométrie est une méthode analytique

quantitative qui consiste à mesurer l‘Absorbance
Absorbance
(A) ou la Densité optique (DO) d'une substance
chimique donnée en solution. Plus cette espèce est
concentrée plus elle absorbe la lumière dans les
limites de proportionnalités énoncées par la Loi de
Beer--Lambert.
Beer Lambert

Aλ = ελ x l x c Spectrophotomètre

La densité optique des solutions est déterminée par un spectrophotomètre

préalablement étalonné sur la longueur d'onde d'absorption de l'espèce chimique à
étudier.
DNA pur
Double brin: 1 unité de DO (260 nm) = 50 ng/µl
Simple brin: 1 unité de DO (260 nm) = 40 ng/µl

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 XI
XI--6. Electrophorèse

C’est une méthode de séparation de molécules chargées en solution sous

l’impulsion d’un champ électrique à courant continu. Dans les tampons de migration
utilisés, le pH est alcalin (pH~8), aussi les acides nucléiques seront fortement chargés
négativement (polyanions). Leur dépôt se fera donc à la CATHODE (pole -) et ils
migreront soit vers l’ANODE (pole +).

Les types d’électrophorèses sont nombreux et les SUPPORTS utilisés, très divers.
Retenons:

L’ELECTROPHORESE sur GEL d’AGAROSE

L’ELECTROPHORESE sur GEL de POLYACRYLAMIDE

Générateur

Cathode

Gel

Anode

Electrophorèse sur gel Copyright Dr NGUELE Jean-

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GELS D’AGAROSE

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GELS DE POLYACRYLAMIDE

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XII-- QUELQUES CORRÉLATIONS CLINIQUES
XII
XII--1. Cas de la Goutte
XII

La GOUTTE est une pathologie liée au catabolisme des bases puriques

(ADENINE et GUANINE). Le catabolisme des bases puriques produit l’ACIDE
ACIDE
URIQUE.
URIQUE

L’acide urique est très peu soluble en milieu aqueux

H OH H O
N N NH
N
O O
N OH N NH O
N
H H
ACIDE URIQUE
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Jean-Calvin 2013
Une surproduction d’acide urique est liée soit à:

Un HYPERCATABOLISME des bases puriques.

Un déficit de HGPRT (Hypoxanthine Guanine Phosphorybosyl

Transferase).

P.S.: HGPRT = Enzyme qui recycle l’acide urique pour la synthèse d’acides nucléiques

SURPRODUCTION D’ACIDE URIQUE

Entraîne sa précipitation dans le sang et la formation de cristaux qui vont se

déposer dans le gros orteil (tophus
tophus) = GOUTTE
GOUTTE.

Ces cristaux peuvent également se déposer dans les reins et provoquer des
CALCULS RENAUX
RENAUX.

INSUFFISANCE RÉNALE

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Jean-Calvin 2013
 SURPRODUCTION D’ACIDE URIQUE

HOMME ♂ FEMME ♀ ENFANT ♀/♂

URICÉMIE (en μmol/L) 180 – 420 150 – 360 60 – 210

URICATURIE/URICURIE (mmol
(mmol/L)
/L) 2.4 – 4.8 1.8 – 3.6 1.2 – 2.6

ANTÉCÉDENTS FAMILIAUX

Dès la puberté, le taux d’Acide

Acide urique des hommes est naturellement plus élevé que
celui des femme.

Les personnes âgées, accumulation de l’A.U dans l’organisme due à une mauvaise
filtration de sang, etc.

PRÉCAUTION: limiter la consommation d’alcool, de gibier, de

PRÉCAUTION:
! fruits de mer et abats de viandes
riches en purines.
purines.

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 APPROCHE THÉRAPEUTIQUE: EXEMPLE DE TRAITEMENT DE LA GOUTTE
Allopurinol = Analogue structural de l’hypoxanthine
hypoxanthine, inhibe la synthèse de l’A.U
par inhibition de la xanthine oxydase.
oxydase

La maladie est améliorée par la prise d’

d’ALLOPURINOL
ALLOPURINOL,, un analogue structural de
l’
l’HYPOXANTHINE
HYPOXANTHINE qui, par conséquent, est un INHIBITEUR SPÉCIFIQUE de la
XANTHINE OXYDASE.
OXYDASE.

Allopurinol

XANTHINE OXYDASE
XANTHINE ACIDE URIQUE
FAD FADH2

H2O2 O2

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 XII--2. Cas de la Drépanocytose
XII

La cause moléculaire de la drépanocytose est une mutation au niveau du gène de

la β-globine
globine. La substitution d’une adénine par une thymine dans la séquence de
nucléotides du gène de la β-globine entraîne une modification de la séquence
protéique dans laquelle un acide glutamique est remplacé par une valine
valine.

La mutation présente dans le gène β-globine est responsable de la formation d’une

protéine d'hémoglobine anormale appelée hémoglobine S ou HbS HbS. L'hémoglobine
normale est dénommée hémoglobine A ou HbA HbA.

Cellule normale (HbA

(HbA)) Cellule anormale (HbS
(HbS))

ACT CCT GAG GAG RNAm ACT CCT GUG GAG

THR PRO GLU GLU Protéine THR PRO VAL GLU

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Jean-Calvin 2013
La mutation responsable de la maladie est située au niveau d'une séquence reconnue
par l’enzyme
enzyme de restriction BsuI.
BsuI L'ADN muté ne peut plus être coupé par
l'enzyme à cet endroit.

Séquence reconnue par l’enzyme: CCTNAGG N= A, C, G ou T

ADN normal: CCTGAGG Reconnue et clivé par l’enzyme BsuI

ADN muté: CCTGTGG

CCTGT Non Reconnue et forcement non-
non-clivé
par l’enzyme BsuI

Après extraction d’ADN génomique à partir des

lymphocytes contenus dans le sang, un fragment
d’ADN contenant la région susceptible d’être
mutée est amplifié par PCR à l’aide d’amorces
spécifiques.

Le fragment amplifié de 442 paires de bases

contient 2 sites de restriction pour l’enzyme BsuI
si il correspond à un gène normal; il n’en contient
qu’un seul si il correspond à un gène muté.

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Jean-Calvin 2013
La digestion du fragment amplifié donne donc naissance à trois fragments de 201201,
143 et 98 paires de bases pour un gène normal. En présence de la mutation, un
des sites disparaît , la digestion produit alors deux fragments de 344 et 98 paires
de bases.
bases

La taille des fragments d’ADN formés est mesurée par électrophorèse en gel
d’agarose.

Chaque individu possède 2 copies du gène de la

β-globine, l’une héritée de son père, l’autre
héritée de sa mère. Il y a donc 3 cas possibles:
possibles

soit les 2 copies sont normales (2 x HbA ou «AA

AA»)

soit une seule des 2 copies est mutée (AS

AS)

soit les 2 copies sont anormales (2 x HbA ou «SS

SS»)

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