Université de Jijel Matière : Enzymologie
Faculté des S.N.V. Option : Licence Biochimie LMD)
Département de B.M.C. Chargée de matière : Dr. BOUTENNOUN H.
TP 3 : "Effet de la Concentration du Substrat sur
l'Activité Enzymatique d'une Protéase"
But
Le but de ce TP est de mesurer l'activité enzymatique d'une enzyme protéolytique. En
utilisant des concentrations différentes de caséine ceci pour mesurer les paramètres cinétiques
de l'enzyme: Km et Vmax
Principe de la réaction
Les protéases hydrolysent les protéines. Les molécules non hydrolysées sont précipitées
par le TCA. Les acides aminés et les peptides simples se trouvent dans la phase soluble.
L'activité est donc mesurée par le dosage colorimétrique des groupements de la tyrosine à
l'aide du réactif de Folin-Ciocalteu.
Matériel utilisé
-Tubes à essai
-Pipettes graduées
-Micropipettes
-Agitateur Vortex
-Bain-Marie
-Erlen mayer
-Entonnoir
-Papier filtre
-Spectrophotomètre
Réactifs
-Extrait enzymatique
-Tampon phosphate/citrate 0,2M, pH 5
-Substrat: solution de caséine à 1%, 2%, 3% et 4% dans le citrate de sodium 0,2M
-Solution de TCA à 4 %
-Solution de Na2CO3 à 0,2 % dans le NaOH 0,1N
-Réactif du Folin-Ciocalteu dilué à 50%
Comment faire le dosage? (Mode opératoire)
La manipulation est réalisée en deux étapes:
Etape 1: Préparation du mélange réactionnel
En deux séries de 4 tubes:
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Département de B.M.C. Chargée de matière : Dr. BOUTENNOUN H.
La première série: les tubes à essai
Tube 1 2 3 4
Extrait enzymatique (ml) 1 1 1 1
Tampon phosphate (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5
Substrat (caséine) (ml) 2,5 (1%) 2,5 (2%) 2,5 (3%) 2,5 (4%)
Agiter et placer au bain-marie à 50ºC pendant 30min
TCA (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5
Laisser reposer 5min à température ambiante
Filtrer
La deuxième série: les blancs de la réaction (ajouter dans l'ordre)
Tube 1' 2' 3' 4'
Extrait enzymatique (ml) 1 1 1 1
Tampon phosphate (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5
TCA (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5
Substrat (caséine) (ml) 2,5 (1%) 2,5 (2%) 2,5 (3%) 2,5 (4%)
Agiter et laisser reposer 10minutes à température ambiante
Filtrer
Remarque:
-Le filtrat content la solution contenant le produit de la réaction.
Etape 2: Dosage de l'activité enzymatique
Essais Blancs
Réactif 1 2 3 4 1' 2' 3' 4'
Filtrat (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Solution de Na2CO3 (ml) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Réactif de Folin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Agiter et laisser reposer 30minutes à température ambiante, lire l'absorbance à 750nm
Remarque:
La lecture de l'absorbance à 750nm se fait entre blanc et essai pour chaque concentration de
caséine.
Tubes: (1', 1); (2', 2); (3', 3); (4', 4).
Question
1. Pourquoi a-t-on rajouté le TCA avant le substrat dans la série des blancs de la réaction?
2. Déduire la concentration correspondante par référence au courbe étalon de la tyrosine.
3. Calculer l'activité de la protéase, sachant que l'activité protéolytique est exprimée en UI et
qu’UI= µg de tyrosine libérée par 1ml de l'extrait enzymatique par heure.
4. Faire la représentation graphique selon Michaelis et Menten et Lineweaver-Burk.
5. Calculer les paramètres cinétiques Km et Vmax.
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