M2 Biochimie appliquée module : techniques d’analyse en biologie moléculaire
Partie I : Méthodologie de biologie moléculaire :
Chapitre 2 : Le séquençage de l'ADN :
Introduction :
La séquence d’ADN contient l’information nécessaire aux êtres vivants pour survivre et se
reproduire. Déterminer cette séquence est donc utile aussi bien pour les recherches visant à
savoir comment vivent les organismes que pour des sujets appliqués. En médecine, elle peut
être utilisée pour identifier, diagnostiquer et potentiellement trouver des traitements à des
maladies génétiques et à la virologie. En biologie, l'étude des séquences d'ADN est devenue
un outil important pour la classification des espèces.
1. Historique :
Les premières techniques de séquençage ont été développées en parallèle au milieu des années
1970. Les méthodes de Sanger (Grande-Bretagne) et Gilbert (Etats-Unis) ont toutes deux été
récompensées d'un prix Nobel de chimie en 1980.
Le premier organisme a été séquencé en 1977. Il s'agissait du virus bactériophage φX174,
possédant un ADN simple brin ne nécessitant donc pas l'étape de dénaturation utilisé dans les
méthodes de Sanger et Maxam et Gilbert.
Depuis une trentaine d'année, l'amélioration de la technique de production des amorces, de
l'amplification des brins et la généralisation des traceurs fluorescents ont permis d'améliorer
considérablement les techniques de séquençage. L'apparition des séquenceurs automatiques
a notamment permis l'automatisation de ces technologies et ont contribué à la finalisation du
génotypage humain en 2003.
1.1 Définition de séquençage :
Le séquençage de l'ADN est une technique d'analyse de l'ADN, consiste à déterminer l'ordre
d'enchaînement des nucléotides pour un fragment d’ADN donné. Actuellement la technique
de séquençage repose majoritairement sur la méthode enzymatique de Sanger.
1.2 Les différents acteurs du séquençage :
l'ADN provient des organismes dont on souhaite séquencer le génome. L'ADN, le plus
souvent sous la forme double-brin, est dénaturé afin de séparer les deux brins. Celui
qui sera séquencé s'appelle le brin « matrice »
les nucléotides, ou plutôt désoxynucléotides, sont les bases de l'ADN (A, C, G ou T).
Ils sont attachés les uns aux autres grâce à des liaisons chimiques nécessitant la
présence d'un groupement OH particulier (sur le carbone 3' du ribose)
les didésoxynucléotides sont des nucléotides privés du groupement OH en position 3'.
Leur incorporation dans une chaîne d'ADN interrompt définitivement la synthèse de
l'ADN (voir figure 1).
une amorce est un brin d'ADN très court (une vingtaine de nucléotide), qui peut
s'hybrider à une séquence complémentaire spécifique
l'ADN polymérase est une enzyme qui a pour rôle de copier l'ADN, en synthétisant
un brin complémentaire au brin matrice. L'ADN polymérase ne fonctionne qu'en
ajoutant des nucléotides à une amorce déjà présente, en fonction de la succession de
nucléotides du brin matrice (un A est toujours positionné en face d'un T et un C
toujours en face d'un G).
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1.3 Méthode de Sanger :
Figure 1 : les différentes formes des nucléotides.
Dans le ddATP, le groupement 3'-OH est remplacé par un hydrogène. Cette modification
empêche la poursuite de la synthèse de l'ADN qui continue normalement sur le 3-OH
1.4 Principe du séquençage par la méthode de Sanger :
Le principe de cette méthode consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l'aide d'un petit
oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer.
L’élongation de l’amorce est réalisée par une ADN polymérase I dépourvue d’activité
exonucléase 5’→3’ et maintenue par des ADN polymérases thermostables, celles qui sont
utilisées pour la PCR. On utilise quatre tubes séparés contenant les quatre
désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), ainsi qu’une faible concentration de l'un
des quatre didésoxyribonucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP).
Ces didésoxyribonucléotides agissent comme des « poisons » terminateurs de chaîne : une
fois incorporés dans le nouveau brin synthétisé, ils empêchent la poursuite de l’élongation.
Cette terminaison se fait spécifiquement au niveau des nucléotides correspondant au
didésoxyribonucléotide incorporé dans la réaction. Pour le séquençage complet d'un même
fragment d'ADN, on répète cette réaction quatre fois en parallèle, avec les quatre
didésoxyribonucléotides différents.
Par exemple, dans la réaction où on a ajouté du ddGTP, la synthèse s'arrête au niveau des G.
Le mélange réactionnel contenant, à la fois du dGTP et un peu de ddGTP, la terminaison se
fait de manière statistique suivant que l'ADN polymérase utilise l'un ou l'autre de ces
nucléotides. Il en résulte un mélange de fragments d’ADN de tailles croissantes, qui se
terminent tous au niveau d'un des G dans la séquence. Ces fragments sont ensuite séparés par
électrophorèse sur un gel de polyacrylamide, ce qui permet ainsi de repérer la position des G
dans la séquence (voir figure 2).
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Figure 2: Séquençage de l'ADN par la méthode de Sanger
La détermination de l'enchaînement des nucléotides dans un fragment d'ADN simple brin par
la méthode de Sanger comporte deux étapes:
1- Synthèse du brin complémentaire d'un brin matrice à l'aide d'une polymérase à partir d'une
amorce, en présence des 4 dNTPs et d'un ddNTP qui joue le rôle de terminateur de chaîne
(absence de 3'-OH). Quatre réactions en parallèle sont nécessaires, chacune avec l'un des
terminateurs présents en faible quantité.
2- Séparation par électrophorèse des fragments synthétisés, le nombre de ces fragments
dépend du nombre de résidus nucléotidiques. Donc la position des terminateurs dans la
séquence (figure 2).
La détection des fragments ainsi synthétisés se fait en incorporant un traceur dans l'ADN
synthétisé. Initialement ce traceur était radioactif ; aujourd'hui, on utilise des traceurs
fluorescents, attachés soit à l'oligonucléotide, soit au didésoxyribonucléotide.
1.5 Automatisation du séquençage :
Des séquenceurs automatiques sont capables de réaliser les réactions de séquence puis de les
lire.
• Les didésoxynucléotides sont marqués avec des fluorescences différentes, cela permet
de faire une seule réaction et une seule lecture. Le séquenceur détecte la fluorescence
et repère la taille des fragments d'ADN.
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On obtient des courbes de fluorescences qui sont interprétées en terme de nucléotides
Bibliographie :
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