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Compte-rendu de TP : Application de la chromatographie liquide à haute

pression (HPLC)

Technical Report · January 2017

DOI: 10.13140/RG.2.2.15383.04002

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Benhidi Issame

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 Compte rendu TP2
Application de la chromatographie liquide à haute pression
(HPLC)

Encadré par : Ibrahim SBAI EL OTMANI

Réalisé par :
BENHIDI Issame
AHMADOU Aboubakar
ARBAI Salma
ANIS Malak
AHARRA Khadija
ASBAOUI Sara
BERNI Ihsane
CHERRAT Amina

2017/2018
 Table des matiéres
1. Introduction : ................................................................................................................................ 3
1.1. Principe : ..................................................................................................................... 3
1.2. Appareillage :............................................................................................................... 4
2. Matériels et méthode : .................................................................................................................. 5
2.1. Matériels : .................................................................................................................... 5
2.1.1. Préparation de la gamme d’étalonnage ................................................................. 5
2.1.2. Préparation de l’échantillon : ............................................................................... 6
2.1.3. Appareillage de HPLC .......................................................................................... 7
2.2. Méthode : ..................................................................................................................... 7
2.2.1. Méthode d’étalonnage........................................................................................... 7
2.2.2. Préparation d’une gamme d’étalonnage de caféine : ............................................. 8
2.2.3. Préparation d’une gamme d’étalonnage de paracétamol : .................................... 8
2.2.4. Préparation de l’échantillon à analyser : .............................................................. 9
2.2.5. Analyse de la gamme d’étalonnage et de l’échantillon par HPLC : ..................... 10
3. Résultats : .................................................................................................................................... 11
3.1. Résultats de la gamme d’étalonnage de la Caféine : ................................................... 11
3.2. Résultats de la gamme d’étalonnage du Paracétamol : ............................................... 12
3.3. Résultats du dosage de la Caféine et du Paracétamol dans notre comprimé analysé : 13
4. Discussion..................................................................................................................................... 15

2
1. Introduction :

L
a chromatographie en phase liquide à haute performance est une technique de
séparation analytique et/ou préparatrice de molécules présentes dans un mélange.
Cela permet d'adapter les méthodes chromatographiques usuelles, sur un montage
haute pression.
Cette forme de chromatographie est fréquemment utilisée en biochimie, ainsi qu'en chimie
analytique. La chromatographie permet la séparation ou la purification d'un ou de plusieurs
composés d'un mélange en vue de leur identification et de leur quantification.

1.1. Principe :
Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est
introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles
interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne
chromatographique.
La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système
chromatographique.
Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique.
Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et
la phase stationnaire.

3
 En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés
par un pic. L'ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme

1.2. Appareillage :
La phase mobile est pompée à partir d'une bouteille et parcourt en permanence le
chromatographe : l'injecteur, la colonne et le détecteur.
Le signal du détecteur est amplifié et enregistré.
• Réservoir de la phase mobile (solvant)
Le plus souvent ce réservoir est une bouteille en verre dans lequel plonge un tube avec une
extrémité filtrante en téflon. S'il est nécessaire le dégazage peut se faire par agitation puis
conservation du solvant sous atmosphère d'hélium.
• Pompe
Elle délivre en continu la phase mobile. Elle est définie par la pression qu'elle permet d'atteindre
dans la colonne, son débit, et la stabilité du flux. Actuellement les paramètres d'une pompe sont
pilotés par informatique (bien utile lors de l'utilisation de gradient d'élution).
• Injecteur
Le type d'injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à boucle d'échantillonnage
d'une capacité fixe (10, 20, 50 µL...). Cette boucle permet d'introduire l'échantillon sans
modifier la pression dans la colonne. Elle possède 2 positions. La première permet le
remplissage de la boucle d'injection de volume fixe (load), la seconde permet la mise en
circulation de l'échantillon dans le système chromatographique (inject).
Le remplissage de la boucle d'injection se fait à l'aide d'une seringue.

• Colonne

4
 En mode analytique, les colonnes en inox ont généralement un diamètre interne de 4,6mm. La
longueur est de 5,10, 15, ou 25cm. Le remplissage (en silice, silice greffée ou particules
polymériques) a une granulométrie de 3, 5, ou 10µm. Le diamètre interne d'une colonne est
usuellement de 4 ou 4,6 mm. Si des substances pures doivent être collectées en fin de
chromatogramme des colonnes de gros diamètre seront nécessaires.
• Détecteurs
Le détecteur suit en continu l'apparition des solutés. Pour détecter, on utilise différents
phénomènes physico-chimiques. Le signal obtenu est enregistré en fonction du temps.
Généralement, on compare le signal obtenu pour la phase mobile et le soluté à celui de la phase
mobile seule.
Le détecteur le plus utilisé en HPLC est un spectrophotomètre d'absorption UV-visible (190-
600 nm) relié à la sortie de colonne.
• Intégrateur
La détection d'un pic chromatographique par l'intégrateur, dépend de 2 paramètres :
* la largeur attendue des pics
* le seuil d'intégration (sensibilité)
La largeur de pic est à peu près prévisible en fonctions de la technique d'analyse et des
conditions opératoires. Elle détermine la fréquence d'échantillonnage du signal. Le pic est alors
découpé en tranches. Le seuil d'intégration est la valeur du signal à partir de laquelle le
calculateur repère un début de pic.

2. Matériels et méthode :
2.1. Matériels :
2.1.1. Préparation de la gamme d’étalonnage
➢ Verrerie
 Becher
 8 fioles jaugé de 50 ml dont 4 pour la gamme d’étalonnage de la caféine
 4 pipettes graduées dont 2 de 10 ml et les 2 autres sont de 20 ml
 Pipette pasteur
 Pompe à crémaillère
➢ Réactifs
 Solution étalon de caféine de 25 mg/L
 Solution étalon de paracétamol de 250 mg/L
 Solvant de dilution : 69% Eau +28% Méthanol + 3% Acide acétique

5
2.1.2. Préparation de l’échantillon :
➢ Verrerie
 Fiole jaugée de 1 L
 Fiole jaugée de 100 mL
 Filtre à 0.45 m
➢ Réactifs
 5 comprimés de la spécialité à analyser « PANALGIC® »
 Eau distillée
 Solvant de dilution : 69% Eau +28% Méthanol + 3% Acide acétique

6
 2.1.3. Appareillage de HPLC

2.2. Méthode :
2.2.1. Méthode d’étalonnage
Préparer une gamme d’étalonnage de concentrations croissantes en paracétamol de 0 à 150
mg/L et une gamme d’étalonnage de concentrations croissantes en caféine de 0 a 15 mg/L.
[Utiliser à cet effet les fioles jaugées de 50 ml et la solution étalon de paracétamol à 250
mg/L et la solution étalon de caféine à 25mg/L] ;
Exemple de Calcul du volume à prélever (Vi) :
* Pour la fiole 1 du paracétamol
A partir de la règle de dilution : Ci Vi = Cf Vf
Cf Vf
*Ci = 250 mg/L  Vi =
Ci
50 mg/L×50ml
*Cf = 50 mg/L = 250 mg/L

*Vf = 50 ml = 10 ml

Le volume à prélever est donc de 10 ml pour la fiole 1 (Le même calcul pour le reste de la
gamme)

7
 2.2.2. Préparation d’une gamme d’étalonnage de caféine :
Préparer une gamme d’étalonnage de concentrations croissantes en caféine de 0 à 15mg/L.
Utiliser à cet effet les fioles jaugées de 50ml et la solution étalon de caféine à 25mg/l.
Le solvant de dilution à utiliser est de même composition que la phase mobile.
Ci (mg/L) 25
Cf(mg/L) 0 5 10 15
Vf (mL) 50
Volumé à prélever de la solution 0 10 20 30
𝑪𝒇 𝒙 𝑽𝒇
d’étalon Vi(mL) = 𝑪𝒊

2.2.3. Préparation d’une gamme d’étalonnage de paracétamol :

Préparer une gamme d’étalonnage de concentrations croissantes en paracétamol de 0 à
150mg/L. Utiliser à cet effet les fioles jaugées de 50mletla solution étalon de paracétamol à
250mg/l. Le solvant de dilution à utiliser est de même composition que la phase mobile
Ci (mg/L) 250
Cf(mg/L) 0 50 100 150
Vf (mL) 50
Volumé à prélever de la solution 0 10 20 30
𝑪𝒇 𝒙 𝑽𝒇
d’étalon Vi(mL) = 𝑪𝒊

8
 2.2.4. Préparation de l’échantillon à analyser :
 Peser 5 comprimés de la spécialité à contrôler et déterminer la masse moyenne.
 Broyer les cinq comprimés jusqu’à obtenir une poudre homogène.
 Peser une prise d’essai de masse égale à la masse moyenne.
 Dissoudre la prise d’essai dans le volume nécessaire d’eau distillée jusqu’à
l’obtention d’une solution limpide puis ajuster le volume à 1Litre au moyen d’une
fiole jaugée.

 Réaliser une solution diluée 10 fois de la solution précédente en utilisant comme

solvant de dilution le solvant utilisé comme phase mobile pour l’analyse
chromatographique. Utiliser à cet effet une fiole jaugée de 100mL.

9
2.2.5. Analyse de la gamme d’étalonnage et de l’échantillon par
HPLC :
 Filtrer l’échantillon à injecter avant l’injection dans la colonne de
chromatographie sur un filtre à 0,45 μm

 Prélever par une seringue la solution et l’injecter dans l’injecteur manuelle

 Déterminer selon les résultats de la gamme d’étalonnage et de l’analyse de

l’échantillon la teneur des deux principes actifs par comprimé.
 Discuter la conformité du résultat obtenu en considérant une marge d’acceptation
de ± 5%

10
3. Résultats :
3.1. Résultats de la gamme d’étalonnage de la Caféine :
Après injection des solutions étalon dans l’injecteur, on obtient pour chaque
solution étalon un chromatogramme de la sorte (Caféine et Paracétamol).

 Le temps de rétention obtenue pour la caféine est de 6.4min environ.

Tr(caféine)=6.4min
 L’aire sous la courbe de chaque substance est également observable. Ce
qui nous permet t’établir une corrélation avec la concentration.
 Les résultats des concentrations de la gamme d’étalonnage ainsi que
l’aire sous la courbe correspondant à chaque concentration sont
consignés dans le tableau suivant :

11
Numéro de tube 1 2 3 4 échantillon

Concentration 0 mg/L 5 mg/L 10 mg/L 15 mg/L X mg/L

de la solution étalon
AUC 0 258.31 531.72 793.33 235.41
(aire sous le pic)

La linéarité de la courbe est presque parfaite car R2=0.9999 proche de 1.

3.2. Résultats de la gamme d’étalonnage du Paracétamol :

Le temps de rétention obtenue pour la caféine est de 2.4 min environ.
Tr(paracétamol)=2.4min
Les résultats des concentrations de la gamme d’étalonnage ainsi que l’aire
sous la courbe correspondant à chaque concentration sont consignés dans le
tableau suivant :

12
Numéro de tube 1 2 3 4 Échantillon

Concentration 0 mg /L 50 mg/L 100 mg/L 150 mg/L X mg/L

de la solution étalon

AUC 0 785,14425 1622,01465 2392,34717 752,18

(aire sous la pic)

Voir les chromatogrammes de chaque solution dans l’annexe.

Courbe d'étalonnage de paracétamol

3000

2500 y = 16.009x 2392.34717

R² = 0.9998
2000
1622.01465

1500
AUC

1000 785.14425

500
0
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
-500
C (mg/L)

3.3. Résultats du dosage de la Caféine et du Paracétamol dans notre

comprimé analysé :
Après injection de la solution diluée de l’analyte le chromatogramme obtenue présente cette
allure (voir la page suivante)

➢ Caféine
Sachant que la caféine a un Tr proche de 6min, la substance 2 est celle qui correspondrait a la
caféine dans notre échantillon (Tr=5.73min).
L’aire sous la courbe de la substance 2 (caféine) est de AUC=235.41
En se basant sur l’équation de la courbe y = 52,882 X,
La concentration X= 235.41/52.882=4.451mg/L
En tenant compte le facteur de dilution de 10 :
Concentration de la caféine : 44.51mg/L
La masse de la caféine : 44.51mg

13
Conformité : masse théorique= 50mg
masse théorique+ 5% = [47.5mg-52.5mg]
M=44.51mg n’appartient pas a cet intervalle  non conforme

➢ Paracétamol
Sachant que le paracétamol a un Tr proche de 2,4 min, la substance 1 correspondrait au
paracétamol
L’aire sous la courbe de la substance 1 (Paracétamol) est de 752,18
AUC=752,18
En se basant sur l’équation de la courbe Y = 16.009 X,
La concentration X= 752.18/16.009=46.984mg/L
En tenant compte le facteur de dilution de 10 :

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 Concentration de paracétamol : 469.84mg/L
La masse de la caféine dans 1 L : 469.84mg

Conformité :
 masse théorique= 500mg
 Marge= masse théorique+ 5% = [475mg-525mg]
M=469.84 mg n’appartient pas a cet intervalle  non conforme.

4. Discussion
On a commencé par la préparation de l’échantillon en broyant 5 comprimés de la spécialité à
analyser « PANALGIC ® » afin d’obtenir une prise d’essai de masse égale à la masse
moyenne.
Ensuite on a préparé des solutions de concentration massique croissante (dans le cadre du TP,
la concentration massique est exprime en mg/l) à partir de deux solutions mères de
concentration connue, l’une en paracétamol et l’autre en caféine.*
Par la suite on a obtenu le chromatogramme de chaque gamme d’étalonnage et celui de
l’échantillon par HPLC
Les pics qui constituent les chromatogrammes sont caractérisés par deux paramètres :
• le temps d’élution : qui est propre à chaque substance quelque soit sa
concentration.
• L’aire sous la courbe : caractérise la concentration de la substance en question.
Les valeurs obtenues de temps de rétention ont été la base pour identifier chaque substance en
comparant le temps de rétention de la gamme d’étalonnage et celui de l’échantillon .
Les valeurs obtenues pour l’aire sous la courbe ont été la base pour établir des courbes
d’étalonnage AUC = f(C ) sous forme de droite d’équation y=a.x
L’équation de chacune des droites nous a permis de calculer les quantités de paracétamol et
de caféine contenues dans la spécialité PANALGIC*. Et on obtenu les résultats suivants
Caféine Paracétamol
44.51mg 469.84mg
Que l’on compare avec la masse indiquée dans le conditionnement de la spécialité analysée
« PANALGIC ® »
Caféine Paracétamol
50mg 500mg

Et en tenant compte l’intervalle d’erreur de ±5 % ,on peut dire que la dose de la caféine
et du paracétamol ne sont pas conformes .

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