5.1.3. Efficacité de la conservation antimicrobienne PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.

stérilisation par les gaz sont actuellement utilisés, notamment de Brevundimonas diminuta (ATCC 19146, NCIMB 11091
la stérilisation par l’oxyde d’éthylène, le peroxyde d’hydrogène, ou CIP 103020). La suspension de Brevundimonas diminuta
l’acide peracétique ou des combinaisons de ces méthodes. doit être préparée de façon à obtenir principalement des
La désinfection de surface par les gaz est communément cellules non agrégées, de la plus petite taille possible. D’autres
utilisée pour les dispositifs médicaux, les isolateurs, les locaux, microorganismes, par exemple issus de la flore naturelle
etc. L’utilisation des gaz dans ce contexte ne relève pas de isolée à partir du produit ou processus considéré, peuvent
la Pharmacopée Européenne, mais les indications données être utilisés s’ils constituent pour le système de filtration
dans le présent chapitre général sur l’utilisation d’indicateurs stérilisante une épreuve plus exigeante que Brevundimonas
biologiques peuvent constituer une aide pour la validation de diminuta. Pour les systèmes de filtration ayant un diamètre
ces procédés de désinfection. nominal de pores inférieur ou égal à 0,1 μm, une suspension
d’Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) peut être utilisée.
4-1. MICROORGANISMES D’ESSAI
4-1-1. Stérilisation par l’oxyde d’éthylène
Pour la stérilisation par l’oxyde d’éthylène, l’utilisation de 01/2011:50103
spores de Bacillus atrophaeus (par exemple ATCC 9372,
NCIMB 8058, NRRL B-4418 ou CIP 77.18) ou d’autres souches
dont il a été démontré qu’elles présentent des performances
équivalentes est recommandée. Le nombre de spores viables
par support est supérieur ou égal à 106 et les microorganismes 5.1.3. EFFICACITÉ DE LA
d’essai possèdent une valeur D appropriée pour le procédé à CONSERVATION ANTIMICROBIENNE
valider. Ces indicateurs biologiques sont utilisés en routine
à chaque cycle de stérilisation, permettant ainsi de vérifier Dans le cas où les préparations pharmaceutiques elles-mêmes
l’efficacité du procédé. ne possèdent pas de propriétés antimicrobiennes adéquates,
4-1-2. Autres procédés des agents de conservation antimicrobienne peuvent être
ajoutés, spécialement aux préparations aqueuses, pour éviter
Il incombe à l’utilisateur de définir le cycle de stérilisation à la prolifération ou limiter la contamination microbienne qui,
appliquer et éventuellement de qualifier l’indicateur biologique dans les conditions normales de conservation et d’emploi,
utilisé. Geobacillus stearothermophilus s’est avéré approprié notamment pour des récipients multidoses, pourrait se
pour la stérilisation par le peroxyde d’hydrogène vaporisé. produire et entraîner un risque d’infection pour le malade
5. INDICATEURS BIOLOGIQUES POUR STÉRILISATION et une détérioration de la préparation. Les agents de
PAR IRRADIATION conservation antimicrobienne ne doivent pas remplacer des
bonnes pratiques de fabrication.
Sauf indication contraire, l’emploi d’indicateurs biologiques
n’est en général pas considéré comme nécessaire pour la L’efficacité d’un agent de conservation antimicrobienne
validation de la dose d’irradiation ayant un effet stérilisant. peut être accrue ou diminuée par le composant actif de la
L’emploi d’indicateurs biologiques peut toutefois être requis préparation ou par la composition de la préparation dans
pour le développement et la validation de la stérilisation laquelle il est incorporé ou par le récipient et le mode de
par irradiation de tissus ou préparations cellulaires, ou dans fermeture adopté. L’activité antimicrobienne de la préparation
d’autres cas spécifiques (par exemple dans le cas de produits dans son récipient définitif est évaluée pour sa durée de
susceptibles d’avoir un effet protecteur sur les spores). validité, afin de s’assurer que cette activité ne se modifie pas
au cours de la période de conservation. Ces examens peuvent
5-1. MICROORGANISMES D’ESSAI être effectués sur des échantillons prélevés à partir du récipient
L’utilisation de spores de Bacillus pumilus (par exemple définitif immédiatement avant l’essai.
ATCC 27142, NCTC 10327, NCIMB 10692 ou CIP 77.25) ou Au cours de la phase de développement d’une préparation
d’autres souches dont il a été démontré qu’elles présentent des pharmaceutique, il doit être démontré que l’activité
performances au moins équivalentes est recommandée. antimicrobienne de la préparation telle quelle ou, si nécessaire,
6. PRÉPARATIONS MICROBIENNES POUR FILTRATION additionnée d’un ou de plusieurs agents de conservation,
STÉRILISANTE assure une protection appropriée contre les effets nocifs qui
peuvent résulter d’une contamination microbienne ou d’une
Comme indiqué dans le chapitre général 5.1.1, certains prolifération au cours de la conservation et de l’usage de la
produits qui ne se prêtent pas à la stérilisation dans préparation.
leur récipient final peuvent être stérilisés par filtration.
L’épreuve biologique consiste alors à évaluer la rétention L’efficacité de l’activité antimicrobienne peut être démontrée
des microorganismes par les filtres, alors que dans les à l’aide de l’essai décrit ci-après. L’essai n’est pas destiné au
sections précédentes les indicateurs biologiques servaient à contrôle de routine.
évaluer la capacité du procédé de stérilisation à détruire les ESSAI DE L’EFFICACITÉ DE LA CONSERVATION
microorganismes. ANTIMICROBIENNE
Pour valider le procédé de stérilisation, il faut apporter la L’essai consiste en la contamination artificielle de la
démonstration (généralement via un modèle à échelle réduite) préparation, si possible dans son récipient définitif, au moyen
que la filtration stérilisante est capable d’assurer la rétention d’un inoculum de microorganismes appropriés prescrit,
de l’intégralité d’une biocharge d’essai d’au moins 107 UFC au maintien de la préparation inoculée à une température
par centimètre carré de surface filtrante utile, en utilisant prescrite, au prélèvement d’échantillons à partir du récipient
un microorganisme d’essai approprié. Cet essai doit simuler à intervalles de temps donnés et au dénombrement des
autant que possible le procédé de filtration réel. Lorsque cela organismes dans les échantillons ainsi prélevés.
est réalisable, il est conduit dans le produit lui-même et dans
Les propriétés de conservation de la préparation sont
les conditions de filtration spécifiées. En cas d’impossibilité, adéquates si, dans les conditions de l’essai, une diminution
par exemple dans le cas d’un produit présentant des propriétés
importante ou, selon le cas, l’absence d’augmentation du
antimicrobiennes, il convient d’utiliser pour l’essai un milieu
nombre de microorganismes dans la préparation ensemencée
aussi proche que possible du produit. se produit après les temps et aux températures prescrits. Les
6-1. MICROORGANISMES D’ESSAI critères d’acceptation, en terme de diminution du nombre
Pour les procédés utilisant un système de filtration sur de microorganismes en fonction du temps, varient pour
membrane avec un diamètre nominal de pores inférieur ou les diverses catégories de préparations, selon le degré de
égal à 0,22 μm, il est recommandé d’utiliser une suspension protection recherché (voir tableaux 5.1.3.-1, 5.1.3.-2, 5.1.3.-3).

676 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.0 5.1.3. Efficacité de la conservation antimicrobienne

Microorganismes d’essai spécifique. Lorsque des procédés de dilution sont utilisés,

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ; NCIMB 8626 ;
tenez compte de la réduction de la sensibilité dans la détection
CIP 82.118. de petits nombres de microorganismes viables. Lorsqu’un
Staphylococcus aureus ATCC 6538 ; NCTC 10788 ; neutralisant spécifique est utilisé, la capacité du système
NCIMB 9518 ; CIP 4.83. à permettre la croissance des microorganismes d’essai est
Candida albicans ATCC 10231 ; NCPF 3179 ; IP 48.72. confirmée à l’aide de contrôles appropriés.
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 ; IMI 149007 ; La méthode est validée afin de vérifier sa capacité à mettre en
IP 1431.83. évidence la réduction requise du nombre de microorganismes
viables.
Les essais sont effectués à l’aide de souches uniques. Aux
microorganismes prescrits peuvent être ajoutées, dans les CRITÈRES D’ACCEPTATION
cas appropriés, d’autres souches ou espèces qui peuvent
représenter des contaminants potentiels de la préparation. Les critères pour l’évaluation de l’activité antimicrobienne sont
Il est recommandé d’utiliser, par exemple, Escherichia coli donnés dans les tableaux 5.1.3.-1, 5.1.3.-2 et 5.1.3.-3 en termes
(ATCC 8739 ; NCIMB 8545 ; CIP 53.126) pour toutes les de réduction logarithmique du nombre de microorganismes
préparations orales et Zygosaccharomyces rouxii (NCYC 381 ; viables par rapport à la valeur obtenue pour l’inoculum.
IP 2021.92) pour les préparations orales à concentration élevée Tableau 5.1.3.-1. – Préparations parentérales, préparations
en sucre. ophtalmiques, préparations intra-utérines et préparations
Préparation de l’inoculum intramammaires
Avant l’essai, ensemencez la surface d’un milieu gélosé aux Réduction logarithmique
peptones de caséine et de soja (2.6.12) pour les bactéries ou
6h 24 h 7j 14 j 28 j
celle d’un milieu Sabouraud dextrosé-gélosé sans addition
d’antibiotique (2.6.12) pour les champignons, avec la culture Bactéries A 2 3 - - NR
mère récemment obtenue de chacun des microorganismes - -
B 1 3 NI
spécifiés. Incubez les cultures bactériennes à une température
de 30-35 °C pendant 18-24 h, la culture de C. albicans à Champignons A - - 2 - NI
une température de 20-25 °C pendant 48 h et la culture - - -
B 1 NI
de A. brasiliensis à une température de 20-25 °C pendant
1 semaine ou jusqu’à obtention d’une sporulation satisfaisante. NR : non retrouvé
Des subcultures peuvent être nécessaires après reprise des NI : pas d’augmentation du nombre de microorganismes viables par
microorganismes, avant qu’ils n’atteignent leur état optimal, rapport à la lecture précédente
mais il est recommandé de maintenir au minimum le nombre
Les critères A représentent l’efficacité qu’il est recommandé
de repiquages.
d’atteindre. Dans des cas justifiés, lorsque les critères A
Pour récolter les cultures bactériennes et de C. albicans, ne peuvent être respectés, par exemple en raison d’une
utilisez un liquide de suspension stérile contenant 9 g/L augmentation du risque de réactions indésirables, les critères B
de chlorure de sodium R. Dispersez et transférez la culture s’appliquent.
développée en surface dans un récipient approprié. Ajoutez
une quantité de liquide de suspension suffisante pour réduire
le nombre de microorganismes à environ 108 par millilitre. Tableau 5.1.3.-2. – Préparations auriculaires, préparations
Pour récolter la culture de A. brasiliensis, utilisez un liquide de nasales, préparations pour application cutanée et préparations
suspension stérile contenant 9 g/L de chlorure de sodium R et pour inhalation
0,5 g/L de polysorbate 80 R et ajustez le nombre des spores à Réduction logarithmique
environ 108 par millilitre avec la même solution.
2j 7j 14 j 28 j
Prélevez immédiatement un échantillon approprié de chaque
suspension et déterminez le nombre d’unités formant colonie Bactéries A 2 3 - NI
par millilitre dans chaque suspension par dénombrement sur B - - 3 NI
plaques ou par filtration sur membrane (2.6.12). Ce chiffre sert
à déterminer l’inoculum et le niveau de base à employer dans Champignons A - - 2 NI
l’essai. Les suspensions doivent être utilisées immédiatement. B - - 1 NI
PROCÉDÉ NI : pas d’augmentation du nombre de microorganismes viables par
rapport à la lecture précédente
Pour le dénombrement des microorganismes viables dans
les préparations ensemencées, utilisez le même milieu gélosé Les critères A représentent l’efficacité qu’il est recommandé
que celui employé dans la culture initiale du microorganisme d’atteindre. Dans des cas justifiés, lorsque les critères A
correspondant. ne peuvent être respectés, par exemple en raison d’une
Ensemencez une série de récipients du produit à examiner augmentation du risque de réactions indésirables, les critères B
avec une suspension de l’un des microorganismes d’essais s’appliquent.
afin d’obtenir un inoculum de 105 à 106 microorganismes
par millilitre ou par gramme de préparation. Le volume de
Tableau 5.1.3.-3. – Préparations orales, préparations buccales
la suspension de l’inoculum ne dépasse pas 1 pour cent du
et préparations rectales
volume du produit. Mélangez soigneusement pour assurer
une répartition homogène. Réduction logarithmique
Maintenez le produit ensemencé à une température de 14 j 28 j
20-25 °C à l’abri de la lumière. Prélevez des échantillons
Bactéries 3 NI
appropriés de chaque récipient, par exemple 1 mL ou 1 g,
au temps zéro et aux intervalles appropriés, selon le type de Champignons 1 NI
préparation, et déterminez le nombre de microorganismes
viables par dénombrement sur plaques ou par filtration NI : pas d’augmentation du nombre de microorganismes viables par
rapport à la lecture précédente
sur membrane (2.6.12), en vérifiant que toute activité
antimicrobienne résiduelle dans la préparation est éliminée Ces critères représentent l’efficacité qu’il est recommandé
par dilution, par filtration ou par l’utilisation d’un neutralisant d’atteindre.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 677