Sécurité

Matière comburante :
Substance pouvant causer ou favoriser la combusiton d’une autre matière.

Matière corrosive :
Produit pouvant corroder les surfaces métalliques ou provoquer des brûles de la peau.

Matière explosive :

Matière inflammable :
Produit qui peut s’enflammer ou brûler facilement.

Matière nocive :

Matière toxique :
Matière toxique ayant d’autres effets graves :
Produit dont les effets sur la santé apparaissent généralement après un délai à la suite de plusieurs
expositions répétées.

Matière dangereusement réactive :

Produit pouvant être dangereux pour la santé ou la sécurité sous certaines conditions (pression,
température, …)

Rayonnement ionisant :

Rayonnement non-ionisant :

Champ magnétique :

Danger électrique :
Rayonnement laser :

Risque biologique :

Basse température :

Protections obligatoires :

Premiers secours :

Agresseurs :
 Agresseurs mécaniques (matériaux coupants, machines,…)
 Agresseurs de nature ergonomique (cadences excessives, mauvaises postures,…)
 Agresseurs physiques (bruit, rayonnement, chaleur, électricité,…)
 Agresseurs chimiques (solvants, acides, bases, fumées de métal,…)
 Agresseurs biologiques (sang, liquides biologiques, terre, poussière, eaux usées,
bioaérosols, piqures d’insectes,…)
Valeurs d’exposition :
 VEA (valeurs d’exposition admissibles)
 VEA-plafond (valeur d’exposition à ne jamais dépasser quelque soit la durée)
  VEA-VECD (valeur d’exposition admissible pour une période de 15 minutes)
 VEA-VEMP (valeur d’exposition admissible pour un quart de travail de 8 heures)
Évaluation théoriques des concentrations d’agresseurs chimiques :

 où k est une facteur de correction (entre 3 et 10), débit d’émission du

liquide en et débit de ventilation en

 où est la tension de vapeur du liquide à 25°C, sa masse molaire et

la pression atmosphérique.
Contrôle des micro-organismes :
Stérilisation :
La stérilisation est le procédé par lequel on détruit ou on élimine d’un objet ou d’un habitat toutes
les cellules vivantes, les spores viables, les virus et les viroïdes. Un objet stérilisé est exempt de
tout micro-organismes. La chaleur humide tue facilement les virus, les bactéries et les mycètes.
Une exposition à l’eau bouillante pendant 10 minutes est suffisante pour détruire les cellulkes
végétatives et les spores d’eucaryotes. La température à laquelle tous les micro-organismes
peuvent être détruit est , température à laquelle les spores meurent.
Désinfection et décontamination :
 La désinfection est la destruction, l’inhibition ou l’élimination des micro-organismes. Les
désinfectants sont des agents, habituellement chimiques, qui ne stérilisent pas
nécessairement parce qu’ils peuvent encore laisser des spores viables et quelques micro-
organismes.
 La décontamination est étroitement lié à la désinfection. Par ce processus, la population
microbienne est réduite à des niveaux considérés sans danger par les normes de santé
publiques.
Antiseptisation :
L’antisepsie est la prévention de l’infection par l’utilisation d’antiseptiques, des agents chimiques
appliqués sur le tissu dans le but de détruire ou d’inhiber le développement de l’agent pathogène.
Agent antimicrobien :
 Un germicide détruit les germes mais pas nécessairement les spores.
 Un bactéricide, fongicide, algicide ou virucide est un désinfectant ou un antiseptique qui
détruit un groupe spécifique d’organismes (bactéries, champignons, microalgues ou
virus).
 Les susbtances chimiques qui ne tuent pas les organismes mais qui empêchent leur
développement possèdent un qui se termine par statique : bactériostatique, fongiostatique,
e.t.c.
Cinétique de la mortalité microbienne :
Une population microbienne n’est pas tuée instantanément lorsqu’elle est exposée à un agent
létal. La mort d,une population est généralement exponentielle. Lorsqu’on porte le logarithme de
la population survivante en fonction du temp d’exposition à l’agent, on obtient une droite
linéaire.
Filtration :
La filtration est une autre méthode qui permet la réduction des populations microbiennes. Au lieu
de détruire les microorganismes, les filtres les retiennent. En pharmaceutique, les tests
microbiologiques sont habituellement réalisées sous des hottes biologique à flux laminaire dans
lesquels sont installés des filtres HEPA. Le niveau de captation de ces filtres est de 99,97 % de
particules à 0,3 micron.

Alcools :
Les alcools sont les désinfectants et les antiseptiques les plus largement utilisés. Les composés
phénoliques ont été les premiers antiseptique et désinfectant. Ils sont bactéricides et fongicides
mais non sporicides ; certains virus contenant des lipides sont également détruit. Les deux alcools
germicides les plus populaires sont l’éthanol et l’isopropanol à 70%. Ils agissent en dénaturant les
protéines et peut-être en dissolvant les lipides membrannaires.
Halogènes :
L’iode et le chlore sont des agents antimicrobiens très important. L’iode sert comme antiseptique
de la peau. Il tue en oxydant les constituants cellulaires et en iodant les protéines cellulaires. En
concentrations élevés il peut tuer certains spores.
Détergents :
Les détergents sont des molécules organiques qui servent d’agents mouillant et d’émulsifiants car
ils ont une extrémité hydrophile et une extrémité hydrophobe. Les détergents solubilisent les
résidus habituellement insolubles. Seuls les détergents cationiques sont des désinfectants
efficaces parce qu’ils détèriorent les membranes microbiennes et peuvent dénaturer les protéines.
Aldéhydes :
Les deux aldéhydes les plus courrament utilisés sont le formaldéhyde et le glutaraldéhyde qui se
combient aux acides nucléiques et aux protéines en les inactivants par pontage et alkylation. Ils
sont aussi sporicides.
 Tables de conversion

Unités de longueur
Nom en Symbole Multiple Nom en Symbole Multiple
lettres lettres
Exa E Deci d
Peta P Centi c
Tera T Milli m
Giga G Micro 
Mega M Nano n
Kilo k Pico p
Hecto h Femto f
Deca da Atto a

Alphabet grec
Nom en Majuscules Minuscules Nom en Majuscules Minuscules
lettres lettres
Alpha Α α Nu Ν ν
Bêta Β β Xi Ξ ξ
Gamma Γ γ Omicron Ο ο
Delta Δ δ Pi Π π
Epsilon Ε ε Rho Ρ ρ
Zêta Ζ ζ Sigma Σ σ
Êta Η η Tau Τ τ
Thêta Θ θ Upsilon Υ υ
Iota Ι ι Phi Φ φ
Kappa Κ κ Khi Χ χ
Lambda Λ λ Psi Ψ ψ
Mu Μ μ Oméga Ω ω

Pression

Énergie

Température
Constante des gaz parfaits

Longueur

Masse

Volume
 Common Organic Solvents: Table of Properties
flash
boilin meltin solubilit
densit
g g y Dielectric
Solvent formula MW y poin
point point in water Constant3,4
(g/mL) t
(°C) (°C) (g/100g)
(oC)

acetic acid C2H4O2 60.05 118 16.6 1.049 Miscible 6.15 39

acetone C3H6O 58.08 56.2 -94.3 0.786 Miscible 20.7(25) -18
acetonitrile C2H3N 41.05 81.6 -46 0.786 Miscible 37.5 6
benzene C6H6 78.11 80.1 5.5 0.879 0.18 2.28 -11
1-butanol C4H10O 74.12 117.6 -89.5 0.81 6.3 17.8 35
2-butanol C4H10O 74.12 98 -115 0.808 15 15.8(25) 26
2-butanone C4H8O 72.11 79.6 -86.3 0.805 25.6 18.5 -7
t-butyl alcohol C4H10O 74.12 82.2 25.5 0.786 Miscible 12.5 11
153.8
carbon tetrachloride CCl4 76.7 -22.4 1.594 0.08 2.24 --
2
112.5
chlorobenzene C6H5Cl 131.7 -45.6 1.1066 0.05 5.69 29
6
119.3
chloroform CHCl3 61.7 -63.7 1.498 0.795 4.81 --
8
cyclohexane C6H12 84.16 80.7 6.6 0.779 <0.1 2.02 -20
1,2-dichloroethane C2H4Cl2 98.96 83.5 -35.3 1.245 0.861 10.42 13
diethyl ether C4H10O 74.12 34.6 -116.3 0.713 7.5 4.34 -45
106.1
diethylene glycol C4H10O3 245 -10 1.118 10 31.7 143
2
diglyme (diethylene glycol 134.1
C6H14O3 162 -68 0.943 Miscible 7.23 67
dimethyl ether) 7
1,2-dimethoxy-
C4H10O2 90.12 85 -58 0.868 Miscible 7.2 -6
ethane (glyme, DME)
dimethylether C2H6O 46.07 -22 -138.5 NA NA NA -41
dimethyl-
C3H7NO 73.09 153 -61 0.944 Miscible 36.7 58
formamide (DMF)
dimethyl sulfoxide (DMSO) C2H6OS 78.13 189 18.4 1.092 25.3 47 95
 flash
boilin meltin solubilit
densit
g g y Dielectric
Solvent formula MW y poin
point point in water Constant3,4
(g/mL) t
(°C) (°C) (g/100g)
(oC)
dioxane C4H8O2 88.11 101.1 11.8 1.033 Miscible 2.21(25) 12
ethanol C2H6O 46.07 78.5 -114.1 0.789 Miscible 24.6 13
ethyl acetate C4H8O2 88.11 77 -83.6 0.895 8.7 6(25) -4
ethylene glycol C2H6O2 62.07 195 -13 1.115 Miscible 37.7 111
glycerin C3H8O3 92.09 290 17.8 1.261 Miscible 42.5 160
100.2
heptane C7H16 98 -90.6 0.684 0.01 1.92 -4
0
Hexamethylphosphoramid
179.2
e C6H18N3OP 232.5 7.2 1.03 Miscible 31.3 105
0
(HMPA)
Hexamethylphosphorous 163.2
C6H18N3P 150 -44 0.898 Miscible ?? 26
triamide (HMPT) 0
hexane C6H14 86.18 69 -95 0.659 0.014 1.89 -22
methanol CH4O 32.04 64.6 -98 0.791 Miscible 32.6(25) 12
methyl t-butyl
C5H12O 88.15 55.2 -109 0.741 5.1 ?? -28
ether (MTBE)
methylene chloride CH2Cl2 84.93 39.8 -96.7 1.326 1.32 9.08 1.6
N-methyl-2-pyrrolidinone
CH5H9NO 99.13 202 -24 1.033 10 32 91
(NMP)
nitromethane CH3NO2 61.04 101.2 -29 1.382 9.50 35.9 35
pentane C5H12 72.15 36.1 -129.7 0.626 0.04 1.84 -49
Petroleum ether (ligroine) -- -- 30-60 -40 0.656 -- -- -30
1-propanol C3H8O 88.15 97 -126 0.803 Miscible 20.1(25) 15
2-propanol C3H8O 88.15 82.4 -88.5 0.785 Miscible 18.3(25) 12
pyridine C5H5N 79.10 115.2 -41.6 0.982 Miscible 12.3(25) 17
tetrahydrofuran (THF) C4H8O 72.11 66 -108.4 0.886 30 7.6 -21
toluene C7H8 92.14 110.6 -93 0.867 0.05 2.38(25) 4
101.1
triethyl amine C6H15N 88.9 -114.7 0.728 0.02 2.4 -11
9
 flash
boilin meltin solubilit
densit
g g y Dielectric
Solvent formula MW y poin
point point in water Constant3,4
(g/mL) t
(°C) (°C) (g/100g)
(oC)
100.0
water H2O 18.02 0.00 0.998 -- 78.54 --
0
water, heavy D2O 20.03 101.3 4 1.107 Miscible ?? --
106.1
o-xylene C8H10 144 -25.2 0.897 Insoluble 2.57 32
7
106.1
m-xylene C8H10 139.1 -47.8 0.868 Insoluble 2.37 27
7
106.1
p-xylene C8H10 138.4 13.3 0.861 Insoluble 2.27 27
7
Méthodes statistiques
Chiffres significatifs
Les chiffres significatifs d’un nombre comprennent tous les chiffres dont on est certain ainsi que
le premier chiffre incertain. Règles des chiffres significatifs :
 Ne tenir aucun compte de tous les zéros initiaux.
 Ne tenir aucun compte de tous les zéros finaux sauf s’ils suivent une virgule.
 Tous les chiffres suivants sont significatifs, y compris les zéros captifs, ceux entre des
chiffres non nuls.
 Dans le cas d’une addition ou d’une soustraction, le résultat a autant de décimales que la
mesure la moins précise utilisée dans le calcul.
 Dans le cas d’une multiplication ou d’une division, le résultat a autant de chiffre
significatifs que la mesure la moins précise utilisée dans le calcul.
 Dans une série de calculs, on doit conserver les chiffres supplémentaires jusqu’au résultat
final, après quoi il faut arrondir.
 Si le chiffre a éliminer pour arrondir est inférieur à 5, le chiffre précédent demeure le
même.
 Si le chiffre à éliminer pour arrondir est supérieur à 5, le chiffre précédent est majoré de 1.
 Si plusieurs chiffres doivent être éliminés pour arrondir, on doit se baser uniquement sur
la valeur du plus à gauche.
 Pour le logarithme d’un nombre, on conserve autant de chiffres à droite de la virgule (la
mantisse) qu’il y a de chiffres significatifs dans le nombre de départ.
 Pour l’exponentielle d’un nombre, on conserve autant de chiffres qu’il y a de chiffres dans
la mantisse du nombre de départ.
Analyte :
Les analytes (ou les inconnus) sont les constituants d’un échantillon qui doivent être dosés.
Titre :
Le titre ou la teneur indique la proportion d’une substance donnée dans le matériau qui porte son
nom.
Échantillonage :
L’échantillonage consiste à obtenir une petite quantité de matière dont la composition est
excatement semblable à celle de l’ensemble du matérieu dont elle a été prélevée. L’échantillon
est cette petite quantité de matière.
Prises et aliquotes :
Les prises sont des portions de matériau qui subissent simultanément le même traitement
analytiques. Les prises sont habituellement des portions semblables de sorte que l’on parle de
prises aliquotes ou aliquotes.
Interférence :
Une interférence ou interférant est une espèce qui cause une erreur en augmentant ou en
diminuant la grandeur mesurée par l’analyse.
Techniques spécifiques et sélectives :
 Les techniques qui ne sont valables que pour une seul analyte sont dites spécifiques.
 Les techniques qui ne sont valables que pour quelques analytes sont dites sélectives.
Dosage :
Le dosage est la détermination de la quantité ou la concentration d’un analyte.

Étalon :
Un étalon est une substance qui est garantie contenir des quantités spécifiées d’un ou plusieurs
analytes.
Étalonnage :
Tous les résultats analytiques dépendant de la mesure finale X d’une propriété physique de
l’analyte. Cette propriété doit varier d’une manière connue et reproductible avec la concentration
cA de l’analytique. Idéalement, la grandeur physique mesurée est dirtectement proportionnelle à la
concentration. Ainsi, où est un facteur constant qui est déterminé à l’aide d’étalons
chimique pour lesquels cA est connu. La détermination de k s’appelle un étalonnage.
Précision et exactitude :
 La précision traduit le degré de proximité que l’on observe entre diverses mesures qui ont
été obtenues exactement de la même manière.
 L’exactitude exprime la proximité entre un résultat et sa valeur réelle ou présumée.
Erreur absolue et relative :
 L’exactitude s’exprime en termes d’erreur absolue ou d’erreur relative.
 L’erreur absolue E lors de la mesure d’une quantité est où est la valeur
réelle ou présumée.

 L’erreur relative lors de la mesure d’une quantité est .

Types d’erreurs :
 Les erreurs aléatoires, ou indéterminées, sont des erreurs qui affectent la précision des
mesures.
 Les erreurs systématiques, ou déterminées, affectent l’exactitude des résultats.
 Une valeur excentrique est un résultat accidentel qui diffère significativement du reste des
résultats dans une série de mesures.
 Le biais mesure l’erreur systèmatique associée à une analyse. Il porte un signe négatif s’il
est la cause d’un résultat trop faible et un signe positif dans le cas contraire.
 Les erreurs systématiques peuvent être constantes ou proportionnelles. Les erreurs
constantes sont indépendantes de la taille de l’échantillon analysé. Les erreurs
proportionnelles diminuent ou augmentent selon la taille de l’échantillon.
 Il existe trois types d’erreurs sytématiques : les erreurs instrumentales causées par les
imperfections des dispositifs de mesure, les erreurs dues à la méthode qui résultent du
comportement phisico-chimique non idéal des systèmes analytiques et les erreurs
personnelles dues au manque de soin, à l’inattention ou à l’incompétence de
l’expérimentateur.
Fidélité :
 À un niveau donné, étroitesse de l’accord entre les résultats obtenus en appliquant le
procédé expérimental à plusieurs reprises dans des conditions déterminées.
 Réplicabilité :
  À un niveau donné, étroitesse de l’accord entre les résultats individuels obtenus sur le
même échantillon soumis à l’essai dans le même laboratoire et dans les conditions
suivantes : même analyste, même appareil, même jour.
 Répétabilité :
 À un niveau donné, étroitesse de l’accord entre les résultats individuels obtenus sur le
même échantillon soumis à l’essai dans le même laboratoire et dont au moins l’un des
éléments suivant est différent : même analyste, même appareil, même jour.
 Reproductiblité:
 À un niveau donné, étroitesse de l’accord entre les résultats individuels obtenus sur le
même échantillon soumis à l’essai dans le même laboratoire et dans les conditions
suivantes : analyste différent, appareil différent, jour différent.
Limite de détection :
Concentration minimale qui peut être décelée à l’aide d’une méthode analytique avec une fiabilité
définie. C’est la concentration équivalent à 3 fois l’écart-type calculé à partir d’au moins 10
mesures effectuées sur des solutions-étalons ayant une concentration aussi près que possible de la
limite de détection prévue.
Limite de quantification :
Concentration minimale qui peut être quantifiée à l’aide d’une méthode analytique avec une
fiabilité définie. C’est la concentration équivalent à 10 fois l’écart-type calculé à partir d’au
moins 10 mesures effectuées sur des solutions-étalons ayant une concentration aussi près que
possible de la limite de détection prévue.
Échantillon statistique :
En statistique, un échantillon de données est un nombre fini d’observations expérimentales.
L’échantillon est traité comme une petite fraction d’un nombre infini d’observations qui
pourraient être faites si l’on disposait d’un temps infini. Ce nombre infini de données est appelée
population de données.
Amplitude, étendue :
L’amplitude, ou étendue, d’une série de mesures est égale à la différence entre le résultat le plus
élevé et le résultat le plus faible.

Moyenne et médiane :

 La moyenne de plusieurs mesures est leur moyenne arithmétique : .

 La moyenne d’un échantillon limité tiré d’une population est lorsque n est petit.
 On appelle moyenne d’une population la moyenne réelle pour cette population. Elle est

définie par en autant que .

 En l’absence d’erreur systématique, la moyenne de la population est également la valeur
vraie d’une quantité mesurée.
 Surtout lorsque n est petit, diffère de car un petit échantillon de données ne
représente pas exactement sa population. La différenc entre et diminue rapidement
si l’on augmente le nombre de mesures n. Habituellement, cette différence devient
négligeable dès que .
Médiane :
La médiane est la valeur centrale d’une série de données classées par ordre de grandeur.
Pour un nombre pair de données, la médiane est la moyenne de la paire centrale.

Écart à la moyenne :
Trois termes sont couramment utilisés pour décrire la précision d’un ensemble de données :
L’écart-type, la variance et le coefficient de variation.
Tous ces termes dépendent de l’écart à la moyenne défini par .
Écart-type :
L’écart-type de la population qui est une mesure de la précision d’une population de données est

défini par .
On représente l’écart entre un résultat et la moyenne de la population de données, exprimé en

unités d’écart-type, par .

L’écart-type d’un échantillon est défini par où est le nombre de degré

de liberté.
L’équation pour calculer un écart-type groupé à partir de t séries de données est

.
Distribution gaussienne des données expérimentales :
Une gaussienne ou courbe d’erreur normale est une courbe qui montre la distribution symétrique
des données autour de la moyenne d’un nombre infini. L’équation générale d’une gaussienne est

. Plus précisément, .
La courbe d’erreur normale est la fréquence relative y en fonction de l’écart à la moyenne. En
l’absence d’erreur systématique, la moyenne de la population est également la valeur vraie x
d’une quantité mesurée.
L’abscisse peut également être une nouvelle variable qui est définie par . Celle-ci
représente l’écart entre un résultat et la moyenne d’une population de données, exprimé en unités
d’écart-type.
Plusieurs propriétés générales caractérisent la courbe d’erreur normale :
 La moyenne correspond au point central de fréquence maximale
 Les écarts positifs et négatifs sont distributés symétriquement de part et d’autre du
maximum
 La fréquence diminue exponentiellement lorsque la valeur des écarts augmente.
 L’aire sous la courbe vaut 1. 68,3% de l’aire se trouve à un écart-type de , 95,5%
de l’aire se trouve à un écart-type de et 99,7% de l’aire se trouve à un écart-type
de .
Erreur-type :
Si une série d’échantillons comportant chacun n données sont pris au hasard dans leur population,
la moyenne de chaque série montrera de moins en moins de dispersion au fur et à mesure de
l’augmentation de n. L’écart-type de chaque moyenne est appelé l’erreur-type de la moyenne et

est définie par .

Variance :

La variance est égale au carré de l’écart-type : .

Écart-types relatifs, coefficient de variation :
Les écarts-types relatifs donnent souvent une image plus nette de la qualité des résultats que les
écart-types absolus.

L’écart-type relatif est défini par .

Lorsque l’écart-type relatif est multiplier par 100%, on l’appelle le coefficient de variation :

.
Le coefficient de variation est une mesure de dispersion des observations d'une variable
quantitative d'intervalle. C'est une mesure neutre. Elle est calculée en divisant l'écart-type par la
moyenne. On exprime souvent le coefficient de variation en pourcentage. Sans unité, il permet de
comparer facilement la dispersion des variables différentes. Plus grand est le coefficient de
variation, plus grande est la dispersion.
Écart-types de résultats calculés :
Il faut souvent estimer l’écart-type d’un résultat qui a été calculé à partir de quelques données
expérimentales qui ont chacune un écart-type d’échantillon connu.
Type d’opération exemple Ecart-type de y
Addition ou soustraction

Multiplication ou division

Exponentielle

Logarithmique

Exponentielle en base 10

Limites de confiance et loi de Student :

La valeur exacte de la moyenne m n’est jamais accessible parce que sa détermination exige un
nombre infini de mesures. Les limites de confiance définissent autour de un intervalle qui
contient probablement .
 L’intervalle de confiance est la grandeur de la limite de confiance.
 Le degré de confiance indique la probabilité que la moyenne réelle se situe entre les
limites définies.
 Lorsque s est une bonne approximation de , l’expression générale des limites de
confiance pour une seule mesure est et pour n mesures

.
 Lorsque est inconnu, on utilise le paramètre statistique t qui est défini de la même

manière que z mais où est remplacé par s : . Ce paramètre t est le paramètre

de Student. Dans cas, les limites de confiances pour la moyenne de n mesures sont

données par .
Hypothèse nulle :
Les résultats expérimentaux étant rarement en accord avec les prédictions, il faut apprécier si le
désaccord observé n’est pas qu’une simple conséquence des erreurs aléatoires inévitables dans
toute mesure ou d’une erreur systématique dans la procédure de mesure. Certains tests utilisent le
concept de l’hypothèse nulle qui consiste à supposer que les grandeurs numériques que l’on
compare sont en fait rigoureusement identiques. La probabilité que les différences observées
résultent d’une erreur aléatoire est ensuite calculé. Si la différence observée est égale ou
supérieure à la différence qui se produirait 5 fois sur 100, on peut considérer que l’hypothèse
nulle n’est pas valable et que la différence est significative.
 Les types de tests les plus souvent utilisés consistent à comparer : et considéré
comme la valeur vraie, et ou et , et .
 Un moyen usuel pour rechercher une erreur systématique (biais) dans une méthode
analytique consiste à analyser par cette méthode un échantillon de composition exacte
connue. Dans ce cas, il se peut que diffère de , la valeur présumée. Il faut alors se
demander si cette différence résulte d’une erreur aléatoire ou représente une erreur
systématique. Lorsqu’on traite ce type de problème, on compare la différence avec

la différence qui pourrait être causée par une erreur aléatoire : . Si la

différence observée est plus petite que celle qui est calculée pour un degré de probabilité
donné, on ne peut rejeter l’hypothèse nulle, et donc, et sont identiques ; on n’a pas
trouvé d’erreur systématique significative. Si est nettement supérieure que la
valeur attendue, on peut admettre que la différence est réelle et que l’erreur systématique
est significative. Si l’on a une bonne estimation de , alors on peut utiliser l’équation

.
 Les résultats d’analyses chimiques sont souvent utilisé.s pour déterminer si deux
matériaux sont identiques. Dans ce cas, le chimiste doit juger si la différence qu’il peut
détecter entre les moyennes de deux séries d’analyses effectuées est réelle et constitue la
preuve que les échantillons sont différents, ou si l’écart est simplement la conséquence

d’erreurs aléatoires les deux séries : .

Test F :
Le test F constitue une méthode simple pour comparer la précision de deux série de mesures. Il
repose sur l’hypothèse nulle et suppose donc que les précisions sont identiques. Le test F, défini

par , est calculée et comparée avec les valeurs maximales de F attendues pour un certain
degré de probabilité s’il n’y avait aucune différence entre la précision des deux séries de mesures.
Si le F expérimental est supérieur à la valeur critique trouvée dans les tables de probabilité, on
dispose d’un argument statistique pour contester l’hypothèse nulle qui présuppose que les deux
écart-types sont identiques.
Test Q :

Le test Q consiste à calculer la valeur expérimentale où w est l’étendue, le

résultat suspect et son plus proche voisin. Ce est alors comparé aux valeurs de rejet
 données par les tables. Si , le résultat suspect sera rejeté ou non selon le
degré de confiance préalablement fixé.
Estimation des limites de détection :
Pour estimer la limite de détection d’une mesure, on calcule l’écart-type à partir de plusieurs

dosages à blanc. La plus petite quantité détectable vaut .

Méthode des moindres carrés :

La plupart des méthodes analytiques sont basées sur une courbe d’étalonnage déterminée
expérimentalement, où l’on porte y, une quantité mesurée, en fonction de x, la concentration
connue d’une série d’étalons. En raison des erreurs indéterminées dans la procédure de mesure,
toutes les données ne se situent pas exactement sur une droite. Il faut donc trouver la meilleure
droite compatible avec les résultats. La méthode des moindres carrés repose sur deux hypothèse.
La première suppose la relation linéaire . La seconde suppose que tout écart des points
individuels à la droite résulte d’erreurs de mesure, qu’il n’y a aucune erreur sur les valeurs de x
des points. L’écart vertical de chaque point à la droite est appelé un résidu. La droite calculée par
la méthode des moindres carrés est celle qui minimise la somme des carrés des résidus de tous les
points.
On définit comme suit les grandeurs suivantes :





 

Contrôle qualité
Qualité :
 Mesure selon laquelle un ensemble de caractéristiques inhérentes satsisfait aux exigences.
 Conformité d’un produit fini aux normes de fabrication.
 Selon iso, aptitude d’un ensemble de caractéristiques intrinsèques à satisfaire des
exigences.
 Adages de la qualité : Travail sans défaut, réduire les coûts, éviter les pannes, respecter
les délais, gestion optimale.
 Ensemble de principes, de méthodes, organisée en stratégie globale visant à mobiliser
l’entreprise pour obtenir une meilleure satisfaction du client au moindre coût.
Accreditation : procédure selon laquelle un organisme qui fait autorité délivre une
reconnaissance formelle stipulant qu’un organisme ou qu’une personne est compétent pour
effectuer des tâches spécifiques.
Certification : procédure selon laquelle un tiers délivre une garantie écrite stipulant qu’un
produit, un procédé ou un service est conforme aux exigences spécifiées.
Assurance qualité : l’assurance qualité décrit l’ensemble des mesures qu’un laboratoire met en
place pour garantir la qualité de ses services.
Contrôle qualité : ce sont les techniques opératoires et les activités qui sont utilisées pour
répondre aux exigences en matière de qualité.
Audit et revue : Lorsqu’un audit est effectué par un organisme externe indépendant, il s’agit
d’une évaluation. Lorsque l’audit est effectué à l’intérieur du laboratoire il s’agit d’un audit
interne.
Matériaux de référence : matériau dont un ou plusieurs valeurs d’une propriété donnée sont
suffisamment homogènes et bien établies pour permettre de l’utiliser pour l’étalonnage. Lorsque
le matériau de référence est accompagné d’un certificat dont plusieurs valeurs d’une propriété
donné sont certifiées par une procédure il s’agit d’un matériau de référence certifié.
Tracabilité : Propriété du résultat d’un étalon tel qu’il puisse être relié à des références
déterminées.
Iso : iso9000 (qualité fabrication) iso14000(environnement) iso18000 (santé sécurité).
Audit qualité : personnel, environnement, matériel, méthodes et procédures, étalons de mesures
et matériaux de référence certifiés, comtrole qualité, gestion des échantillons, dossiers, comptes-
rendus des analyses.
Normalisation : la normalisation vise à définir des exigences : unifier, spécifier, simplifier.
Système qualité : C’est consigner par écrits ses politiques, systèmes, programmes, procédures et
instructions dans la mesure nécessaire pour assurer la qualité des résultats d’essai et/ou
d’étalonnage.
Pourquoi système qualité : rester oudevenir compétitifs. Atteindre de nouveaux marchés, clients
plus exigeants. Produits ou services plus complexes. Éxigé par les contrats ou les lois. Qualité,
productivité et survie sont indissociables. Payant.
Management de la qualité : écoute client. Leadership. Implication du personnel. Approche par
processus. Approche système. Amélioration continue. Relation bénéfique avec les fournisseurs.
Système de management de la qualité selon iso : C’est un service permettant d’établir une
politique et des objectifs et d’atteindre ces objectifs. C’est un ensemble d’activités coordonnées
permettant d’orienter et de contrôler un organisme en matière de qualité.
Développement d’une méthode analytique : le développement d’une méthode analytique
soumis à l’assurance qualité est balisé par une procédure qui décrit la marche à suivre selon une
suite d’étapes logique. 1.études préliminaires (historique, toxicité, expositions, propriétés
physiques) [Link] d’échantillonage (capacité du système, débit d’échantillonage, efficacité
d’extraction, stabilité du système d’échantillonage, effets de l’entreposage, interférences)
[Link] analytique (étalonnage, interférences analytiques, limites de détections). 4. Méthode
d’analyse (validation de la méthode, rédaction, suivi de la méthode par les nouvelles
technologies, processus d’approbation par des pairs) 5. Validation d’une méthode d’analyse
(procédure globale, réplicabilité, répétabilité, limite de détection, valeur minimale rapportée,
exactitude, précision, incertitude).
Limite de quantification : concentration minimale qui peut être quantifiée à l’aide d’une
certitude et d’une méthode d’analyse avec une fiabilité définie. C’est la concentration équivalent
à 10 fois l’écart-type calculé à partir d’au moins 10 mesures effectués sur des solutions étalons
ayant une concentration aussi près que possible de la limite de détection.
Limite de détection : concentration minimale qui peut être décelée à l’aide d’une méthode
d’analyse avec une fiabilité définie. C’est la concentration équivalent à 3 fois l’écart-type calculé
à partir d’au moins 10 mesures effectués sur des solutions étalons ayant une concentration aussi
près que possible de la limite de détection. (Habituellement, les 10 échantillons sont des blancs.)
Fidélité : Étroitresse de l’accord entre les résultats obtenus en appliquant le procédé expérimental
à plusieurs reprises dans des conditions déterminées.
Réplicabilité : Étroitresse de l’accord entre les résultats individuels successifs obtenus sur le
même échantillon soumis à l’essai dans le même laboratoire, même analyste, même appareil,
même jour.
Répétabilité : Étroitresse de l’accord entre les résultats individuels successifs obtenus sur le
même échantillon soumis à l’essai dans le même laboratoire mais dont au moins l’un des
éléments suivants est différent : analyste, appareil, jour.
Reproductibilité : Étroitresse de l’accord entre les résultats individuels successifs obtenus sur le
même échantillon soumis à l’essai dans des laboratoires différents, analyste différent, appareil
différent, jour différent.
Précision : fidèlité à obtenir des résultats identiques. Se mesure par l’écart-type, la variance et le
coefficient de variation.
Exactitude : degré entre la concordance des résultats et la valeur vraie. Se mesure par l’erreur
relative.
Erreurs aléatoires : dues au hasard, fortuite et difficile à repérer.
Erreurs systèmatiques : qui se reproduisent et que l’on retrace. Elles sont mesurables,
constantes et répétitives.
Coefficient de variation :

Somme des contribution des imprécisions :

Ratio de conformité : où R doit être supérieur à 4 et inférieur à 10. Si plus petit que 4,
concentration trop faible et si plus grand que 10, concentration trop grande.
Récupération : La récupération est la différence entre la concentration mesurée d’un échantillon
fortifié et la concentration mesurée du même échantillon non fortifié divisée par la concentration
de la substance ajoutée pour fortifier.

Estimation de la moyenne avec écart-type connu :

Estimation de la moyenne avec écart-type inconnu :

: . Si n plus grand 20, alors

Distribution normale
Méthodes chromatographiques
Principes :
La chromatographie est une technique dans laquelle les constituants d’un mélange se séparent en
fonction des vitesses auxquelles ils sont entraînés à travers une phase stationnaire par une phase
mobile gazeuse ou liquide.
Phase stationnaire :
On appelle phase stationnaire, la phase qui reste en place soit dans une colonne, soit sur une
surface plane.
Phase mobile :
On appelle phase mobile, la phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, en
entraînant l’analyte avec elle.
Si la phase mobile est gazeuse, elle ne sert qu’à entrainer les composés à travers la colonne. Le
passage des constituants vers la phase mobile dépend de leur pression de vapeur.
Si la phase mobile est liquide, elle sert à entraîner et solubiliser les composés.
Élution :
L’élution est un processus au cours duquel des solutés sont entraînés à travers une phase
stationnaire liquide ou solide par le mouvement d’une phase mobile liquide ou gazeuse.
Les composés fortement retenus par la phase stationnaire se déplace lentement lors de l’élution
contrairement aux composés faiblement retenus par la phase stationnaire.
Éluant :
L’éluant est le solvant utilisé pour entraîner les constituants d’un mélange à travers une phase
stationnaire.
Adsorption :
L’adsorption est la fixation des molécules par une phase stationnaire solide. Cette fixation est ue
à l’établissement de liaisons secondaires de surface entre l’adsorbant et la molécule adsorbée :
dipôle-ion, dipôle-dipôle, forces de Van der Waals.

Adsorbants Polarité Capacité

d’adsorbtion
Gel de silice Forte Forte
Alumine Faible
Charbon actif Faible Forte
Talc Faible
Carbonate de sodium Faible
Chromatogramme :
Un chromatogramme est le graphique d’une fonction de la concentration en soluté en fonction du
temps d’élution ou du volume d’élution.

Classification des méthodes chromatographiques :

On distingue deux types de méthodes chromatographiques. En chromatographie sur colonne, la
phase stationnaire est maintenue dans un tube étroit et la phase mobile y progresse par gravité ou
sous l’action d’une différence de pression.

En chromatographie planaire, la phase stationnaire est présente à la surface d’un support plat
(chromatographie sur couche mince) ou immobilisée à l’intérieur des pores d’une feuille de
cellulose (chromatographie sur papier). Dans ce cas, la phase mobile se déplace à travers la phase
stationnaire par capillarité ou sous l’effet de la gravité.

La chromatographie en phase liquide s’applique aussi bien aux colonnes qu’aux surfaces planes
mais la chromatographie en phase gazeuse est limitée aux techniques sur colonne.

Chromatographie Méthode Phase stationnaire Équilibre

sur colonne
Chromatographie Liq /liq ( CLL ) ou partage liquide immobilis é Partage entre
en phase liquide sur un solide liquides non
CPL phase mobile miscibles
liquide Liquide-phase greffée Espèce organique Partage entre
liée à une surface liquide et surface
solide greffée
Liq-solide (CLS) Solide Adsorption
 Échange d’ions Résine échangeuse Echange d’ions
d’ions
Liquide-gel (CLG) ou Liquide dans les Partage ou
perméation interstices d’un tamisage
solide polymérique
Chromatographie Gaz-liquide (CGL) Liquide immobilisé Partage entre gaz
en phase gazeuse sur un solide et liquide
(CPG) phase Gaz-phase grefée Espèce organique Partage entre gaz
mobile gazeuse liée à une surface et surface greffée
solide
Gaz-solide (GCS) solide Adsorption
Chromatographie Espèce organique Partage entre
en fluide liée à une surface fluide
supercritique solide surpercritique et
(CFS) phase surface greffée
mobile : fluide
supercritique

Calculs en chromatographie :
Coefficient de distribution :
Toutes les séparations chromatographiques sont basées sur les différences de répartition des
solutés entre la phase mobile et la phase stationnaire. Pour le soluté A, cet équilibre est décrit par
l’équation et la constante d’équilibre de cette réaction est appelé coefficient

de distribution : .
Temps mort :
Le temps mort tM est le temps nécessaire pour qu’une espèce non retenue traverse une colonne.
Temps de rétention :
Le temps de rétention tR est le temps qui s’écoule entre l’injection de l’échantillon et l’apparition
d’un pic de soluté sur le détecteur d’une colonne chromatographique.
Temp de rétention corrigé :
C’est le temps de rétention moins le temps mort.
Facteur de capacité :
Le facteur de capacité est le rapport des quantité de A présentes à l’équilibre dans les deux
volumes des phases stationnaire et mobile adjacentes. Il est lié à la vitesse de progression du
soluté A dans une colonne.
Vitesses de déplacement :
La vitesse linéaire moyenne de déplacement du soluté est égale à où L est la longueur
de la colonne.
On définit aussi la vitesse linéaire moyenne des molécule de la phase mobile par .
Relation entre vitesse et coefficient de distribution :

Facteur de rétention :
Le facteur de rétention permet de décrire la vitesse de progression des solutés dans les colonnes.

Il est défini en régime isocratique et n’est pas une constante. Il est défini par .
Dès lors,
Le facteur de rétention idéal se situe entre 2 et 10. S’il est plus petit que 1, le soluté sort
rapidement dans le volume mort et s’il est plus grand que 20, le temps d’élution est trop long.
Facteur de sélectivité :

Le facteur de sélectivité d’une colonne pour les deux espèces A et B est défini par
où l’espèce B est plus lente à éluer que A, l’espèce la plus rapidement éluée. Le facteur de
sélectivité décrit donc la séparation de deux espèces. Une bonne séparation implique un facteur
de sélectivité d’au moins 1,5. Le facteur de sélectivité se déduit du chromatogramme par

Efficacité de la colonne :
L’efficacité d’une colonne chromatographique dépend du degré d’élargissement du pic qui se
produit à mesure que l’analyte parcourt la colonne. Il faut que l’élargissement des pics se
produisent moins rapidement que leur séparation. On remédie à ce problème en s’assurant que le
premier analyte migre plus rapidement que le deuxième.

La forme idéale d’un pic doit être gaussienne.

Ici,  est l’écart-type,  la largeur à mi-hauteur et  une largeur à la base du pic. Nous avons

L’aire comprise entre -2 et 2 vaut 95,4% de l’aire totale sous la courbe.

Lorsque le chromatogramme ne présente pas de pics gaussiens, l’asymétrie est traduite par deux
paramètres mesurés à 10% de la hauteur du pic : le facteur d’asymétrie et le facteur de
trainée .
Il existent deux types d’asymétrie résultant de changements du coefficient de partage. Le fronting
survient lorsque le soluté adhère trop à la phase stationnaire. Le temps de rétention est allongé de
sorte que la montée du pic est plus longue que la descente. Le tailing survient lorsque trop de
soluté est injecté dans la colonne. La phase stationnaire est saturée et la montée du pic est plus
rapide que la descente.

L’efficacité d’une colonne s’évalue généralement à partir de l’un des deux termes connues : la
hauteur équivalente à un plateau théorique H et le nombre de plateaux théoriques N. Ces deux
grandeurs sont liées par où L est la longueur de la colonne en cm et H en cm.

Le nombre de plateaux théoriques est basé sur le concept des colonnes à distillation. Le
mouvement du soluté est assimilé à un transfert d’un plateau à un autre. Plus il y a de plateaux
théoriques, plus l’efficacité de la colonne est grande. L’efficacité des colonnes augmente lorsque
le nombre de plateaux théoriques augmente ou si H diminue à longueur L constante.

Le nombre de plateaux théoriques peut varier de quelques centaines à plusieurs centaines de

milliers ; les valeur habituelles de H sont comprises entre quelques dixième de centimètre et
moins d’un millième de centimètre.

Le nombre de plateaux théoriques peut être évalué directement par la largeur à la base ou la mi-

hauteur du pic et du temps de rétention : ou .

Avec des pics asymétriques, on utilise l’équation de Dorsey-Foley :

Puisque les pics sont d’allure Gaussienne et que l’efficacité d’une colonne est liée à la largeur des
pics, on utilise la variance par unité de longueur de colonne comme mesure de son efficacité :

La résolution d’une colonne est une mesure de sa capacité à séparer deux composés A et B et peut

se calculer à partir des équations et .

Une résolution de 1.5 donne une séparation complète des composés tandis qu’une résolution de 0.75 est
nettement insuffisant.

L’objectif en chromatographie est d’optimiser la résolution en augmentant N et/ou en diminuant

H. On peut donc augmenter la longueur de la colonne (augmentation de N) mais cela entraîne une
augmentation du temps de séparation.
Il existe plusieurs causes à l’élargissement d’un pic : parcours multiples des composés dans la
colonne, diffusion des composés dans la phase mobile et sorbtion et désorbtion des composés
entre les phases mobile et stationnaire. Les paramètres affectant la largeur des pics sont :
 Vitesse linéaire de la phase mobile :

 Coefficient de diffusion dans la phase mobile :

 Coefficient de diffusion dans la phase stationnaire :

 Facteur de rétention :
 Diamètre des particules du support :
 Epaisseur de la couche liquide sur la phase mobile :

Plus le contact est long entre la phase mobile et la phase stationnaire, plus on s’approche de
l’équilibre.

En HPLC, le débit linéaire optimal est petit. Ainsi, la séparation est lente : H est grand et N petit.

En GC, le débit linéaire optimal est grand. Ainsi, la séparation est rapide : H est petit et N grand.
On compense en augmentant la longueur de la colonne.

Efficacité de la colonne en fonction du débit linéaire HPLC

Efficacité de la colonne en fonction du débit linéaire GC

Équation de Van Deemter :
Cette équation relie l’efficacité aux paramètres de la colonne et indique comment améliorer les

performances d’une colonne : .

Processus Terme

Diffusion turbulente
Diffusion longitudinale

Transfert masse phase stationnaire

Transfert masse phase mobile

Ici, (irrégularités du remplissage de la colonne) et (facteur d’obstruction) sont des constantes

dépendantes de la qualité du remplissage et f est une fonction de x.

Aussi,
 est en relation avec le profil d’écoulement de la phase mobile à travers la phase
stationnaire aussi nommé terme des effets réseaux ou diffusion turbulente d’Eddy. C’est le
contournement aléatoire des particules du support solide par le fluide. Ceci entraîne une inégalité
dans la vitesse de déplacement de la phase mobile dans la colonne remplie de particules. Cette
diffusion est indépendante du débit de la phase mobile. On réduit cette diffusion en réduisant les
espaces morts en utilisant des particules petites et uniformes.

La diffusion longitudinale d’un composé dans la phase mobile conduit à

l’élargissement des pics. C’est la dispersion des molécules dans une direction parallèle à l’axe de
la colonne et la diffusion selon le gradient de concentration. Plus le débit sera rapide, plus le
temps de résidence de l’analyte sera court et moins la contribution de ce terme sera importante
pour la valeur de H.

Le terme est le facteur dont la contribution est la plus importante à l’augmentation

de H. L’analyte prend un certain temps à s’équilibrer entre la phase stationnaire et la phase
mobile. C’est le transfert aléatoire aller-retour des molécules de soluté entre les deux phases qui
cause l’élargissement du pic compte tenu que les molécules de soluté dans la phase mobile se
déplacent à la vitesse du solvant alors que celle dans la phase stationnaire sont immobiles. Sans
débit, il y aurait équilibre des concentrations entre les deux phases. Plus la vitesse de la phase
mobile est haute, plus l’élargissement s’aggrave.

À partir de l’équation de Van Deemter on obtient que :

Optimisation :
Pour diminuer l’élargissement des pics :
 Diamètre des particules de la phase stationnaire doit être le plus petit possible
 Travailler avec une colonne plus fine
 Épaisseur de la phase mobile doit être minimisée
 Ajuster le débit de la phase mobile
 En GC, une diminution de la température diminue la diffusion longitudinale
 En LC, plus le diamètre des particules est petit, moins le débit a d’influence sur H.
Pour optimiser la colonne :
 Diamètre des particules de la phase stationnaire doit être le plus petit possible
 Diminuer la viscosité du solvant
 En GC, augmenter la température de la colonne augmente le facteur de rétention
 En LC, ajuster la composition du solvant augmente le facteur de rétention
 Changer la composition de la phase mobile incluant le pH
 Changer la température (échange d’ions)
 Changer la composition de la phase stationnaire (plusieurs colonne)
Contribution hors colonne des volumes morts (volume de l’injecteur et volume d’injection,
tubulure entre injecteur et colonne, tubulure entre colonne et détecteur, cellule de détection) :
 Il faut minimiser ces volumes morts en choisissant une tubulure fine et pas trop longue.
Gradient en chromatographie :
 L’utilisation de gradients permet d’obtenir des compromis entre le temps d’élution et la
résolution.
 Pour lorsque T augmente.
 En LC, on change la composition ou le pH ou la concentration de sel de la phase mobile
pendant l’élution.

Silice :

Le gel de silice est un polymère réticulé comportant des groupements silanols. Il tient une place
prépondérante en chromatographie. Le gel de silice existe sous forme de gel en microsphères ou
en monolithe qui forme un réseau interconnecté de canaux de taille contrôlée.
L’HEPT décroît avec la taille des particules mais à débit identique la perte de charge augmente.
Les colonnes monolithiques améliorant le transfert de masse entre les phases apparaissent
supérieures.

Chromatographie planaire sur couche mince CCM :

Les séparations sur couche mince s’effectuent sur une plaque en verre ou en aluminium
recouverte d’une couche mince de silice fininement divisée. On place une goutte de l’échantillon
près d’un des bords de la plaque de silice en marquant sa position. Après évaporation du solvant
de l’échantillon, la plaque est placée dans une cuve close saturée en vapeur de l’éluant.
L’extrémité possédant l’échantillon est immergée dans ce solvant en évitant tout contact direct
entre le solvant et l’échantillon. Lorsque le front de solvant a parcouru par capillarité les deux
tiers de la longueur de la plaque, elle retirée du récipient puis sèchée. Les composés les moins
polaires éluent plus rapidement que les composés polaires plus fortement retenus par la silice. Le
solvant polaire possède un pouvoir éluant élevé, fortement adsorbé, il déplace le soluté. En
revanche, un solvant apolaire comme l'éther de pétrole possèdera un mauvais pouvoir éluant,
mais entraînera un soluté apolaire.

On défini le rapport frontal par où de est la distance parcourue par l’échantillon et ds la

distance parcourue par le solvant. Un soluté très polaire aura un rapport frontal très petit
contrairement au composé non polaire car la phase stationnaire est habituellement de la silice qui
forme des liaisons hydrogène. Pour l’élution, on utilise généralement un mélange de solvants.

Les « spots » sont généralement révélés à l’UV ou par des agents oxydants (molybdate, KMnO 4,
iode ou anysaldéhyde).

Chromatographie de partage :
Cette chromatographie est fondée sur la (ré)partition différentielle de chacun des solutés entre
deux liquides non miscibles, l'un constituant la phase stationnaire, l'autre la phase mobile.
Elle subdivisée en chromatographie liquide-liquide et chromatographie liquide-phase greffée. En
chromatographie de partage liquide-liquide, la phase stationnaire est un solvant qui est fixé par
adsorption physique sur la surface des particules du support. En chromatographie de partage
liquide-phase greffée, la phase stationnaire est une espèce organique qui est attachée par des
liaisons chimiques à la surface des particules du support.
La plupart des supports à phase greffée sont préparés par la réaction d’un organochlorosilane
avec les groupements OH préalablement formés sur la surface de particules de silice. Le gel de
silice est un matérieu hydrophyle. Mais la présence des groupements silanols permet de greffer à
sa surface des composés organiques par liaison covalente. En chromatographie de partage à phase
normale, la phase stationnaire est polaire et la phase mobile non-polaire. Les composés non
polaires éluent plus rapidement. En augmentant la polarité de l’éluant, les composés les plus
retenus sont alors élués. En chromatographie de partage à phase inversé, les polarités sont
inversés. Habituellement, les groupements non polaires de la phase greffée sont le n-octyle ou n-
octadecyle. Les composés polaires éluent les premiers. En diminuant la polarité de l’éluant, les
composés les plus retenus sont alors élués.

Pouvoir d’élution :
En mélangeant des solvants, on peut ajuster le pouvoir d’élution de la phase mobile. Ce
changement de compoisition des solvants agit sur le pouvoir de rétention des composés via les
coefficient de partage. Cela affecte aussi la viscosité de l’éluant. La viscosité affecte le nombre de
plateaux et la pression à la tête de la colonne car dans un liquide visqueux les phénomènes de
transport sont ralentis. Cela augmente H mais diminie N, donc la résolution de la colonne.
Théorie de la partition :
La distribution d’un soluté A entre deux solvants non-miscibles, l’un aqueux, l’autre organique

relève de l’équilibre de sorte que . C’est l’équation de Nernst pour le

partage d’une substance entre 2 phases liquides non-miscibles. La transposition de cette partition
d’un composé entre deux phases liquides dans un système chromatographiques est rendue
possible par la fixation de l’un des solvants sur un support inerte, l’autre solvant constituant la
phase mobile. Un soluté très soluble dans la phase stationnaire migrera lentement, la force de
rétention prédominant sur la force d’entraînement. À l’inverse, un soluté soluble dans la phase
mobile migrera rapidement.

On défini le rapport frontal par où de est la distance parcourue par l’échantillon et ds la

distance parcourue par le solvant. Un soluté très soluble dans la phase stationnaire aura un
rapport frontal très petit contrairement au composé très soluble dans la phase mobile.
Chromatographie échange d’ions :
En chromatographie par échange d’ions, la phase stationnaire est une résine échangeuse d’ions.
Les échangeurs d'ions sont des macromolécules insolubles portant des groupements ionisables,
qui ont la propriété d'échanger de façon réversible certains de leurs ions, au contact d'autres ions
provenant d'une solution.
La résine cationique échange réversiblement des cations. Une résine cationique est chargée
négativement :
La résine anionique échange réversiblement des anions. Une résine anionique est chargée
positivement :

La chromatographie par échange d'ions se pratique le plus souvent sur colonne, mais la méthode
peut être transposée sur couche mince. Du papier échangeur d'ions est également commercialisé .
Enfin l'échange d'ions peut être réalisé en batch : la résine est mise en présence de la solution et
agitée mécaniquement. Le support peut être minéral, mais il est le plus souvent. Les groupements
fonctionnels chargés des résines sont fixés par covalence sur le support.

Résine Structure Force

sulfoniques (très fortement Résine-SO3- / Na+
ionisées, quel que soit le pH) Forte
Groupement phospho Résine-H2PO4- / Na+
Intermédiaire
carboxyliques (non ionisées en Résine-COO- / Na+
milieu fortement acide) Faible
- +
Groupement carboxyméthyl : Résine-CH2-COO / Na
Faible
- +
phénoliques (uniquement ionisées Résine-O / Na
en milieu alcalin) Très faible
 Sedaphex

Groupement amine tertiaire et Résine-NR4+ / Cl-

quaternaire Forte
Groupement amine primaire et Résine-NR2H2+ / Cl-
secondaire faible
Sedaphex

Chromatographie d’exclusion (tamisage moléculaire) :

Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On
utilise pour cela des granules de gel poreux. Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur
à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort. Les
petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur
migration est freinée. Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires. Il
existe une relation linéaire entre le volume d'élution et le logarithme de la masse moléculaire.
On utilise des gels contenant des billes minuscules :

 Gels hydratés (les plus utilisés) : le SéphadexTM (G10 à G200) qui sont des polyosides
bactériens de type dextran (poly D-glucopyranosyl a, 1 -> 6), et le Sépharose TM (agarose).
Le gain d'eau correspond au nombre de grammes d'eau fixés par gramme de substance
sêche.
 Gels permanents : ce sont des copolymères organiques ou bien des minéraux (silice). Ici,
des effets d'adsorption s'ajoutent au tamisage moléculaire.

On peut porter le logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution:

On définit le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel par où Vt

est le volume total, Vm le volume mort et Ve le volume d'une substance totalement exclue.
Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc
éluées les premières, au niveau du volume mort. Les petites et moyennes molécules sont éluées
plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée. Une molécule totalement
incluse sera éluée avec un volume d'élution , où Vi est le volume d'eau interne aux
granules de gel. Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires :
On considère une colonne de volume total remplie d’un gel solvaté : où Vi est le
volume d'eau interne aux granules de gel et Vg le volume de gel. Un soluté est ditribué dans l’eau
interne et l’eau externe selon un coefficient de partage K.

 Si K = 0, le soluté est totalement exclu

 Si 0 < K < 1, le soluté est partiellement inclus
 Si K = 1, valeur théorique d’un soluté totalement inclus
 Si K > 1, le soluté est inclus et adsorbé

Si l’on dépose un mélange de 2 solutés A et B, dont les constantes de distribution sont

respectivement 0 et 1, alors et
Chromatographie d’affinité :
Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un support macromoléculaire
chimiquement inerte sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique pour
un soluté de l'échantillon à analyser.
Trois types d'affinités sont utilisées :
 affinité enzyme-substrat
 affinité ligand-récepteur
 affinité antigène-anticorps
Très souvent, la molécule fixée sera le substrat, le ligand, ou bien l'anticorps. Ceci permettra de
purifier l'enzyme, le récepteur ou l'antigène, respectivement.

Le mélange de molécules contenant le composé à purifié est chargé sur la colonne d'affinité.
Seule la molécule présentant une affinité pour la colonne sera retenue par l'effecteur greffé sur la
phase stationnaire. En continuant à faire passer du tampon dans la colonne, toutes les molécules
contaminantes sont éliminées et éluées. La molécule purifiée est déccrochée de la colonne et est
recueillie dans l'éluat.
Souvent, l'un des deux partenaires de l'interaction au moins est une protéine (P), l'autre sera
qualifié de ligand (L) de cette protéine : L'association de P et de L forme le

complexe PL. La constante définissant cet équilibre est : .

La phase stationnaire (le gel d'affinité) est constituée d'un effecteur fixé par covalence à un
support (carboxyméthylcellulose, Séphadex, gel de polyacrylamide) par l'intermédiaire d'un bras
de fixation ("spacer" en anglais).
 La CM-aminohexylique : permet la fixation d'un effecteur à fonction carboxyle.
- O - CH2 - CO - NH - (CH2)6 - NH2 (spacer long)
 La CM-hydrazide : permet la fixation d'un effecteur à fonction carboxyle.
- O - CH2 - CO - NH - NH2 (spacer court)
 La CM- aminohexylique (ou aminododécylique) succinylée : permet la fixation d'un
effecteur à fonction -NH2 réactive. - O - CH2 - CO - NH - (CH2)n -NH - CO - CH2 - CH2 -
COOH (n = 6 ou 12, spacer long)

La longueur du bras est choisie de manière à limiter les contraintes stériques.

Les effecteurs sont:
 Affinité enzyme-substrat : substrats, analogues, inhibiteurs réversibles, effecteurs
allostériques, coenzymes.
 Affinité ligand-récepteur : haptènes, antigènes, anticorps.
 Affinité antigène-anticorps : hormones, peptides, analogues peptidiques.
L’élution peut être réalisée de différentes façons :
 Tampon de pH différent de celui ayant permis la charge : changement de l'état d'ionisation
d la protéine : désorption
 Tampon de force ionique différente de celle ayant permis la charge : changement de
conformation de la protéine.
 Compétition avec un ligand libre.
Chromatographie en phase gazeuse GC :

Cette méthode permet de séparer des composés volatils par migration différentielle sur une phase
stationnaire liquide ou solide. La principale contrainte est que les composés doivent être volatils
et thermiquement stables. Mais les avantages sont : sensibilité rapidité, polyvalente et possibilités
d’automatisation. Dans la chromatographie gaz-liquide (partage), la phase stationnaire est un
liquide non volatil fixé par imbibition d'un support inerte. Le soluté se partage entre le gaz
vecteur et le liquide stationnaire. Plus un soluté est soluble dans la phase stationnaire, plus le RF
est petit et le temps d'émergence élevé. Dans la chromatographie gaz-solide (adsorption), la
phase stationnaire est un solide adsorbant (gel de silice, alumine…). Plus l'adsorption d'un soluté
sur la phase stationnaire est élevée, plus le RF est faible et le temps d'émergence élevé. Dans les
deux cas, le gaz vecteur est le gaz qui véhicule les solutés ; la phase mobile est constituée du gaz
vecteur et des solutés gazeux.
Les échantillons liquides sont injectés dans la chambre de vaporisation à l'aide d'une
microseringue. La température est telle (c'est généralement celle du four) que la vaporisation est
immédiate. Les limites de sensibilité sont, selon les appareils, de l'ordre du ng et même du pg.
Le traitement de l'échantillon varie selon les substances analysées. Lorsque les solutés sont
directement volatilisables, les substances sont solubilisées dans un solvant et chromatographiées.
Phase mobile :
La migration des composés dépend de leur coefficient de partage entre la phase stationnaire et la
phase mobile. Le coefficient de partage est inversement proportionnel à la volatilité du composé.
Ainsi, plus le composé est volatil moins il passe de temps dans la phase stationnaire. La volatilité
est déterminée par la pression de vapeur des composés donc de leur point d’ébullition.
Lorsque les solutés ne sont pas volatils à la température du chromatographe ou bien sont
décomposés à cette température, il faut les transformer en dérivés volatils stables : les acides
aminés sont ainsi estérifiés par le butanol, les acides gras estérifiés par le méthanol, les oses
réduits en alditols, puis acétylés… La phase mobile est un gaz vecteur car sa seule fonction est de
transporter les molécules dans la colonne, sans contribution à la sélectivité chromatographique.
Donc, elle n’affecte pas le coefficient de partage. Ce gaz est inerte chimiquement (He, N 2, Ar,
CO2), non toxique et ininflammable. Cependant, la viscosité du gax et son débit affectent
respectivement la dispersion des composés dans la PS et leur diffusion dans la PM. Donc, il y a
un effet sur N et la sensiblité de détection. Le débit est maintenu constant à 1-25ml/min. et la
pression est de 0.5 à 3.5 Atm.
Phase stationnaire :
La phase stationnaire peut-être un liquide à point d’ébullition élevée, un polymère ponté, un
adsorbant ou une combinaison. Ces phases sont utilisables entre deux température : la
température minimale sous laquelle les équilibres de concentration sont trop lents à sefaire et la
température maximale au-dessus de laquelle il y a dégradation.
La chromatographie gaz-solide est basée sur l’adsorption des composés gazeux sur des surfaces
solides. Le coefficient de partage est beaucoup plus élevés qu’en chromatographie gazeuse
liquide.
Dans le cas des phases stationnaires liquides (gaz-liquide), il existe des colonnes avec des phases
stationnaires greffée. La polarité de la phase stationnaire doit correspondre à celle des analytes et
l’ordre d’élution se fait selon leur points d’ébullition.
Les silanols donnent une adsorption trop élevée des composés polaires ou polarisables. Ils sont
donc désactivés par silanisation.

Injection :
L’échantillon est introduit rapidement sous forme de bouchon de vapeur (0.1-10L).

L’injection de type split est la plus répandue. Elle est employée sur des échantillons concentrés
de 0.1-20g/L. Le gaz vecteur arrive dans la chambre d’injection où il se mélange avec
l’échantillon. Une vanne de fuite divise ce débit en deux fractions, la plus importante étant
éliminée et entraînée vers la sortie. Une bonne partie de l’échantillon est donc éliminée. Seule
une petite fraction pénètre dans la colonne. Pour analyser des traces d’analytes, on utilise la
méthode spit mais avec la sortie split fermée.
Dans l’injection directe, tout l’échantillon est introduit et vaporisés puis envoyé dans la colonne.
Cette méthode est utile pour les composés thermosensibles.

L’analyse de l’espace de tête consiste à analyser les échantillon présent dans l’espace de tête qui
est la partie gazeuse au-dessus d’un échantillon liquide ou solide. Cette méthode est intéressante
pour les échantillons complexes.
La température : La température est le seul facteur de modification importante. On adopte
généralement une température légèrement supérieure au point de vaporisation du constituant le
moins volatil. D'un point de vue technique, la colonne est maintenue dans un four à bain d'air
thermostaté.
Les supports utilisés : le chromosorb (brique réfractaire pilée), le kieselguhr (terre de diatomées),
le quartz... Le liquide stationnaire est un hydrocarbure, un silicone, un ester, un polyol,
caractérisé par sa température d'utilisation et sa polarité.
Les colonnes :
Elles peuvent être métalliques, en plastique pour des séparations à basse température, en verre et
joints Téflon. Diverses formes ont été utilisées : rectilignes, en U, en spirales (la plus répandue).
En CPG d'adsorption on utilise des colonnes de 1 m de long. En CPG de partage on travaille avec
des colonnes pouvant atteindre 5 m. Elles sont placées dans une enceinte thermostatée à 0.1°C.
Les colonnes capillaires possèdent les avantages d’être efficaces et d’avoir un pouvoir de
résolution élevé, d’offrir un transfert de masse plus rapide ce qui minimise l’élargissement des
pics et d’avoir plus de plateaux théoriques. Le seul inconvénient est que l’échantillon doit être
très petit.
Les détecteurs :

Le détecteur à ionisation de flammes est le détecteur le plus largement utilisé. L’effluenbt de la

colonne est mélangé avec H2 qui est enflammé électriquement. La plupart des composés
organiques sont pyrolisés par cette flamme et produisent des ions et des électrons qui peuvent
conduire l’électricité è travers la flamme. Ce courant est alors mesuré. Une différence de
potentiel est qppliquée entre le bout du brûleur et une électrode collectrice. Le courant résultant
est amplifié et mesuré. Le nombre d’ions produit est proportionnel au nombre d’atomes de C
réduits dans la flamme. Il est plutôt sensible à la masse qu’à la concentration. Ses avantages sont
sa sensibilité élevée et son domaine de réponse linéaire étendu mais il possède l’inconvénient de
détruire l’échantillon.

Le détecteur thermoionique est spécifique aux composés contenant de l’azote ou du phosphore. Il

est fait d’un cylindre en céramique dopé avec un sel alcalin auquel on applique une tension
électrique pour entretenir un petit plasma alimenté par combustion air/H 2. C’est essentiellement
un détecteur FID mais la flamme est plus petite. Les fragments de décomposition des composés
azotés et phosphorés sont des ions négatifs et sont détectés par une électrode collectrice.

Chromatographie en phase gazeuse capillaire (CPGC) : C'est une chromatographie de partage

gaz-liquide, utilisant une colonne capillaire (longueur 5 à 10 m, diamètre : 100 à 250 mm), sans
support inerte ; la paroi interne du capillaire sert de support. Elle permet d'obtenir un nombre de
plateaux égal à 100000/m.
Chromatographie liquide haute performance HPLC :

Ce type de chromatographie consiste en une séparation par différence de migration sur une
colonne contenant une phase stationnaire de microparticules. L’échantillon est transporté par un
liquide sous haute pression. La HPLC est très sensible, facilement adaptable à des analyses
quantitatives précises et permet la séparation de composés volatils ou thermosensisbles. Elle est
cependant moins précises que la GC, prend plus de temps à répondre (1 à 13sec. vs 1 à 2 sec.), la
colonne est beaucoup plus courte qu’en GC mais les phases stationnaires sont beaucoup plus
diversifiées. Il existe la HPLC liquide/liquide (partage), liquide/solide (adsorption), échange
d’ions, exclusion stérique.

Le système d’apport de solvant contient : une pompe, un réservoir à solvant, un système de

dégazage pour éliminer les bulles d’air et une chambre de mélange pour les gradients de solvants.
Le detecteur génère un signal electrique qui peut etre amplifié et présente sous forme de
chromatogramme la concentration des constituants du melange en fonction du temps.

L’échantillon s’injecte par une seringue (0.5 à 20 L) dans la boucle d’échantillonage. La
précision des volumes injectés affecte la reproductibilité des mesures. La phase mobile passe
dans la boucle et entraîne l’échantillon dans la colonne.

Les colonnes sont des tubes en acier inoxydable remplis de microparticules. La plupart des
colonnes ont une longueur de 10 à 30 cm et un diamètre de 4 à 10 mm avec des tailles
particulaires de 5 à 10 m. Ce type de colonne offre de 40 000 è 60 000 plateaux par mètres.
Mais il existe des microcolonnes à haut performance qui ont un diamètre de 1 à 4,6 mm et une
longueur de 3 à 7,5cm. Elles offres jusqu’à 100 000 plateaux par mètre et offre une plus grande
rapidité et une moins grande consommation de solvant.

On utilise souvent une précolonne (colonne de garde) en amont de la colonne analytique afin d’en
augmenter la durée de vie en éliminant les poussières et les impuretés contenus dans le solvant.
En mode liquide/liquide, elle sert aussi à saturer la phase mobile avec une portion de la phase
stationnaire afin de minimiser les pertes en phase stationnaire de la colonne analytique.
La phase mobile doit être d’une grande pureté. On utilise toujours des solvants de grade HPLC,
de l’eau nanopure et des tampons de haute qualité. Les bulles d’air perturbent la détection et la
stabilité du débit. Un dégazage est donc nécessaire et est réalisé par pompage à vide, sonication
ou barbotage à l’hélium. L’élution se fait en mode isocratique (solvant de composition constante)
ou en gradient d’élution. Contrairement à la GC, la phase mobile inlfuence la rétention et la
sélectivité.

On appelle volumes hors colonne, les volumes autres que Vm situés entre le dépôt de l’échantillon
et l’arrivée au détecteur. Les modules sont reliés entre eux par des canalisation de très faible
diamètre interne. L’ensemble des canalisations doit être le plus réduit possible (< 10% Vm). La
vitesse de la phase mobile est maximale au centre de la canalisation et minimale sur les parois.

La phase stationnaire est une silice chimiquement modifiée ou non, une résine polymérique ou un
gel.
RP-HPLC (phase inversée) :
C’est la méthode la plus utilisée en HPLC pour les avantages suivants :
 Large spectre d’utilisation
 Flexibilité des phases greffée non polaire
 Phase mobile peut coûteuse
 Applicable à la séparation de composés ioniques
 Equilibration rapide de la phase mobile
On utilise un solvant très polaire comme l’acetonitrile ou le methanol à des quantités variables.
Mais il faut éviter que le pH soit > 7.5 car les groupes siloxanes seront hydrolysées.
Chromatographie liquide chirale :
Il existe des composés greffés qui permettent de séparer des mélanges racémiques.

Chromatographie de paires ioniques :

C’est une variante de la chromatographie de partage en mode inversée qui permet de séparer des
composés ioniques ou très polaires qui consiste à réduire le caractère ionique des analytes pour
augmenter leur rétention à la phase stationnaire en modifiant la phase mobile. Cela peut se faire
en modifiant le pH ou en ajoutant un contre-ion à la phase mobile. On utilise aussi des détergents
cationiques ou anioniques.

Détecteur UV :

Cette détection est basée sur l’absorbance de la radiation UV ou visible des composés. Les
composés qui absorbent dans l’UV-visible contiennent des groupements chromophores
(conjugaison de liaisons doubles). Si le composé n’absorbe pas dans l’UV, on fait une dérivation
post-colonne, dans une chambre spéciale qui contient de la ninhydrine. Il est aussi nécessaire que
la phase mobile n’absorbe pas elle-même. L’intensité d’absorption dépend de la concentration et
du coefficient d’absorptivité selon la loi de Beer-Lambert. Cette détection possède les avantages
d’être proportionnel à la concentration de l’échantillon, d’être sélectif et très sensible.
Détecteur réfractromètre :

Ce détecteur est quasi-universel et est basé sur la différence entre le rayon incident de la phase
mobile pure et celle contenant l’analyte ce qui conduit à des pics positifs ou négatifs. Cette
méthode est fiable et indépendante du débit. Cependant, elle est moins sensible que l’UV, très
sensibles aux variations de température et ne peut être utilisée qu’en mode isocratique. Elle est
particulièrement utile pour les composés qui n’absorbent pas en UV.
Détecteur ELSD :
Nébulisation de l’éluant, le transformant en aérosol. Ce nuage traverse une zone chauffée où la
phase mobile s’évapore laissant un plus petit nuage de particules d’analyte. Ces particules
traverse un faisceau de lumière et dispersent une partie de la lumière qui est convertie en signal
électronique. Ce détecteur est universel : il voit tous les composés car il est indépendant du
coefficient d’absorption.

Principaux détecteurs :
Analyse quantitative
Méthodes quantitatives en GC et HPLC :
La GC et HPLC remplissent deux fonctions : techniques de séparation et techniques d’analyse.
En analyse, il existe deux méthodes :
 Analyse qualitative : les temps de rétention sont utilisés pour identifier des composés,
peuvent être comparé avec un échantillon standard mais donne une faible quantité de
d’information en comparaison avec la spectroscopie.
 Analyse quantitative : comparaison des aires sous les pics avec des standard
Analyse quantitative par la hauteur et l’aire du pic :
 Hauteur de la droite qui jhoint la ligne de base et son sommet. Méthode précise s’il n’y a
pas de variations d’efficacité de la colonne pendant l’obtention des chromatogrammes.
 Méthode plus fiable car l’aire du pic est indépendante des effets d’élargissement. Aire
fournie par un intégrateur électronique ou par calcul : hauteur du pic multiplié par la
largeur à mi-hauteur.
Étalonnage :
L’étalonnage relie le signal analytique à la concentration de l’analyte.
Étalonnage externe :
On prépare une série d’étalons contenant des concentrations connues de l’analyte à doser, et on
mesure la réponse pour chaque étalon. En principe, on obtient une fonction linéaire sur un
domnaine de concentration assez étendue qui est une droite passant par l’origine. On augmente la
préciusion en injectant plusieurs fois chaque étalon dont on fait la réponse moyenne et si on
utilise plusieurs étalons et si la concentration de l’échantillon et celles des étalons sont du même
ordre de grandeur.
Les sources d’erreurs les plus importantes sont :
 Incertitude sur les concentrations en analyte dans les étalons
 Incertitude relative au volume d’échantillon injecté
 Vitesse d’injection (injecteur à haute température : possibilité d’évaporation prématurée
de l’échantillon).
Dans le cas des échantillons complexes, il y a un manque de similarité entre la matrice contenant
l’échantillon et la solution étalon. On appelle ceci l’effet de matrice.
Étalonnage interne :
Cette méthode repose sur l’utilisation du coefficient de réponse relatif de chaque composé à doser
vis-à-vis d’un marqueur introduit comme référence. La méthode nécessite deux
chromatogrammes, l’un pour calculer les coefficients de réponse relatifs et l’autre pour l’analyse
de l’échantillon. Les aires des pics des produits à quantifier sont comparées avec celle d’un étalon
introduit à concentration connue. En ayant un chromatogramme d’une solution de concentration
connue de la substance à analyser et de l’étalon interne, on déduit le raport relatif de réponse.
Pour les calculs, on a : et où m est la
masse injectée, K le coefficient de réponse absolu de i, A l’aire du pic d’élution du composé i et C
la concentration du composé i injecté.

La courbe de calibration par l’étalon interne, permet de minimiser les incertitudes dues à
l’injection de l’échantillon, à la vitesse de la phase mobile et aux variations de l’état de la
colonne. Si les signaux de l’analyte et de l’étalon interne sont proportionnels aux fluctuations de
la méthode, le rapport des signaux sera donc imdépendant de ces fluctuations.
On ajoute à l’échantillon et aux solutions-étalons, un composé non présent dans le mélange à
analyser. Il faut que l’étalon interne IS soit bien séparé des pics de tous les constituants de
l’échantillon Rs >1.25 et voisin du pic de l’analyte étudié. Il peuvent coéluer si on utilise la MS
comme détecteur.

La courbe d’étalonnage est le rapport entre le signal de l’analyte et l’étalon interne pour les
solutions-étalons, en fonction de la concentration de l’analyte. On mesure le rapport entre le
signal de l’analyte et celui de l’étalon interne pour notre échantillon et on utilise la courbe de
calibration pour déterminer la concentration.
Méthode de détermination par ajouts dosés :
Cette méthode s’applique à la plupart des techniques d’analyse et est utilisée à la place d’une
courbe de calibration pour résoudre le problème d’effet de matrice.

L’effet de matrice se produit lorsque l’échantillon contient de nombreuses impuretés inconnues.

Si les impuretés intewragissent avec l’analyte de manière à changer la réponse instrumentale ou
produisent eux-mêmes un signal, une courbe d’étalonnage donnera une mauvaise réponse
quantitative.

Une solution de concentration connue de l’analyte est ajouté à l’inconnu de sorte que toutes lkes
impuretés dans l’inconnu sont pris en compte dans l’étalonnage. On ne sait pas la concentration
initiale, mais on sais combien de solution standard a été ajouté et comment les lectures chagent
avant et après l’ajout. On peut alors extrapoler et déterminer la concentration d’abord dans
l’inconnu.
Spectroscopie de masse MS
Principe :

La spectrometrie de masse est basée sur la détermination des masses des molécules présents dans
l’échantillon. On commence à transformer une très petite quantité du composé à analyser en ions
par bombardements. Ces ions sont soumis à un champ électromagnetique et les forces qui
s’exercent sur ces ions permettent de déterminer leur rapport masse/charge.

L’échantillon est introduit en très petite quantité (<1mol) et est porté à l’état gazeux. Il est
ensuite ionisé dans la source en produisant un mélange d’ions négatifs et positifs. Ces ions sont
ensuite séparés dans l’analyseur selon leur masse/charge et terminent leur course dans le
détecteur qui envoie un signal électrique proportionnel aux charges des ions reçus.
Un système de vide poussé est nécessaire afin d’éviter la collision des ions formes avec les
molécules qui seraient présentes dans l’air.

Le système d’introduction de l’échantillon est lié au type d’échantillon et au mode d’ionisation.

Si l’échantillon est volatil, il est possible d’utiliser une source d’ionisation sous vide, avec un
système d’introduction qui mène l’échantillon neutre dans le vide du MS. Si l’échantillon n’est
pas très volatil, il est plus pratique d’utiliser une source d’ionisation à pression atmosphérique et
d’introduire les espèces chargées dans le vide du MS.

Le choix de la source dépend de la nature de l’échantillon étudié et de son état physique. Les
sources d’ionisation classiques fonctionnant sou vide sont : impact électronique EI, ionisation
chimique CI et bombardement par atomes FAB.

Les modes d’ionisations peuvent être classées en 2 catégories. L’ionisation peut se faire sous vide
à sous pression atmosphérique.
  ionisation sous vide : l’échantillon est vaporisé puis ionisé. Cette méthode est limitée aux
molécules thermiquement stables Teb<500°C et aux molécules de masse moléculaire
<1000Da.
 Ionisation a pression atmosphérique : l’ion est généré à partir du liquide ou solide.
Applicable aux molécules non volatiles ou thermosensibles ou aux macromolécules
jusqu’à 100000Da et plus.
La classification peut aussi se faire de cette manière :
 Sources énergétiques dures EI : fragmentation ionique
 Sources énergétiques faibles CI, ESI, MALDI : ion moléculaire.
Méthode EI :
Les molécules ionisées par impact avec un faisceau d’électrons rapides qui ont été accélérés par
une différence de potentiel de 70eV. Donne principalement des ions positifs avec une seule
charge.

Méthode CI :
Les molécules sont ionisées par collision avec des ions déjà dans la source. Ces ions sont produits
par bombardement d’électrons d’un gaz réactif. On utilise surtout le méthane qui produit des ions
CH4.+ et CH3+.
Méthode ESI :

À pression atmosphérique, la solution est pompée à travers une aiguille capillaire à un dBit de
L-mL/min. Une différence de potentiel de plusieurs kV entre l,aiguille et l’enveloppe
cylindrique qui entoure l’aiguille, forme un brouillard composé de fines goutelettes chargées. Le
spray est entraîné par un gaz porteur N2 dans un capillaire où le solvant est évaporé.
Méthode APCI :

Cette technique est utilisée pour les substance moins plaire et moins suceptible à s’ioniser en
solution. C’est une ionisation chimique à pression atmosphérique. Dans l’environnement de la
décharge, il y a arrachement d’électrons formant les espèces N 2+ et O2+. Ces espèces réagissent
avec le solvant formant H3O+, NH4+…Il y a ensuite don ou abstraction d’un proton pour former
[M+H]+ ou [M-H] +.
Sources de désorption FAB, MALDI:
Les sources de désorption permettent d’analyser les échantillons thermolabiles et de masse
moléculaire élevée >105Da. Au lieu de volatiliser et d’ioniser la substance, l’énergie est cédée à
l’échantillon liquide ou solide provoquant la formation directe d’ions gazeux sans effecteur les
molécules fragiles.
Dans le système FAB, un faisceau d’atomes neutres est dirigé sur un solide provoquant sa
désorption et son ionisation. Il y a peu de fragmentation et donne des ions moléculaires intenses.
Dans le système MALDI, l’échantillon est mélangé à une matrice organique qui absorbe dans
l’UV. La matrice doit être soluble dans le solvant et être en grand excès par rapport à
l’échantillon. Le mélange est déposé et la solution est évaporée sous vide. Il reste un mélange
solide échantillon/matrice qui est irradié par un laser pulsé UV. L’analyte est distribué dans les
critaux de matrice et est donc désorbé en phase gazeuse par l’irradiation du laser. L’énergie du
laser est absorbé par la matrice qui cause l’ionisation des molécules.

Analyseurs :
L’analyseur doit pouvoir distinguer des masses dont la différence est très petite, et permettre le
passage d’un nombre suffisant d’ions pour que le courant ionique soit facilement mesuré par le
détecteur. La capacité d’un spectromètre à différencier deux masses est définie par .
Les différents analyseurs sont : quadripôle, temps de vol TOF et trappe d’ions.
Analyseur quadripôle :

C’est le plus commun des analyseurs, le plus compact, le moins cher et le plus robuste. Son
domaine de masse est 3000-4000M/Z. Cependant, il est de basse résolution ; il sépare facilement
des ions dont la différence de masse est unitaire.
Analyseur TOF :

C’est un tube de 1m dans lequel il n’y a apas de champ électrique. Les ions arrivent dans le tube
et ont la même énergie cinétique, donc leur vitesse est inversement proportionnelle à leur masse,
de sorte que les plus lourds arrivent au détecteur après les plus légers. Il est simple, robuste, accès
facile à la source d’ions, gamme de masses pratiquement illimitée et rapidité d’acquisition des
données. Cependant, les variations d’énergie cinétique et de positions de départ des ions affectent
la résolution.
Analyseur à piègage d’ions :

C’est une trappe d’ions : les anions et cations gazeux peuvent être confinés pendant de longues
durées dans des champs électriques et/ou magnétiques. Il est robuste, compact, le moins cher et
possède un domaine de masse de 1000-2000Da.
GC/MS :

Le débit de sortie de la colonne capillaire est suffisamment faible pour permettre l’interfaçage
avec un spectre de masse. On couple le GC principalement à des spectromètres à quidripôle avec
ionisation EI/CI.
LC/MS :

La difficulté en LC/MS est de se débarrasser de la phase mobile liquide et de pouvoir travailler

sous vide dans le spectromètre de masse. Le LC est couplée avec des souyrces d’ionisation ESI
ou APCI.
MS/MS :

C’est des spectromètres de masse couplés en série. Le premier sert à séparer les ions provenant
des différents constituants de l’échantillon, tandis que le dernier permet de séparer les ions
fragments produits dans la cellule de collision.
Méthodes électrophoriques
Définition :
L’électrophorèse est une technique analytique qui permet de séparer des molécules chargées.
C’est le déplacement d’un ion produit par une tension électrique appliquée. La séparation est
basée sur la quantité de charge par rapport à la taille relative hydrodynamique des analytes. Il est
aussi appelé le rapport charge/masse.

La force électrique qui s’exerce sur un ion porteur d’une charge q dans un champ électrique E est
. Au déplacement électrophorétique de l’ion dans la solution s’oppose une force de
friction où v est la vitesse de déplacement de l’ion et f son coefficient de friction. Le
coefficient de friction est une mesure de la résistance que la solution exerce sur l’ion qui se
déplace. Ce coefficient dépend de la taille, de la forme et de l’état de solvatation de l’ion et de la
viscosité de la solution. Dans un champ électrique constant, . La motilité

électrophorétique d’un ion se définit par . Cette équation n’est valable que pour les
ions en solution diluée à l’infini et dans un solvant non conducteur.
Électrophorèse sur papier (de zone) :

Dans l’électrophorèse sur papier, l’échantillon est déposé en un point au milieu d’une
banmdelette plastique recouverte d’un gel poreux semi-solide imbibée de solution tampon. Les
extrémités de la bande plongent dans deux réservoirs de tampon séparés dans lesquels sont
placées les électrodes. Quand on fait passer un courant continu, les ions de l’échantillon migrent
vers les électrodes de signe opposé, à des vitesses différentes pour former finalement des bandes
bien séparées. Lorsque l’électrophorétogramme est achevé, la bande est séchée et les constituants
de l’échantillon sont localisés par les sels d’argent ou le bleu de Coomassie.
Électrophorèse en gel :

Dans l’électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE), les gels sont formés par la
polymérisation d’acrylamide et de N-N’-méthylènebisacrylamide dans un tampon choisi.
Habituellement, on coule le gel sous forme d’une fine plaque rectangulaire, dans laquelle
plusieurs échantillons peuvent être analysés simultanément en parallèle. Le tempon qui est le
même dans les deux réservoirs et dans le gel, a un pH tel que les macromolécules ont toutes une
charge nette négative et vont donc migrer vers l’anode dans le réservoir inférieur.

Dans une technique ingénieuse, appelée électrophorèse à pH discontinu, les bandes se trouvent
fortement affinées. Ici, on utilise deux gels et plusieurs tampons. Le premier gel, dit gel de
séparation, est préparé de la même manière que dans le cas précédent ; on coule sur celui-ci un
gel à larges pores, dit gel de concentration ou gel espaceur, de faible hauteur. Le tampon du
réservoir inférieur et du gel de séparation est comme déjà décrit, mais celui de la solution de
l’échantillon et du gel de concentration a un pH inférieur d’environ deux unités à celui du
précédent. Le tampon du réservoir supérieur est ajusté à un pH proche de celui du réservoir
inférieur. Lorsque le courant est mis, les ions du tempon du réservoir supérieur migrent dans le
gel de concentration tandis que les ions du tempon du gel de concentration migrent devant eux. Il
en résulte que les ions du tampon du réservoir supérieur trouvent unpH très inférieur à leur pK.
Ils prennent alors la forme neutre, ce qui les rend électrophorétiquement immobiles. Ceci
entraînent un déficit en porteurs de charges : la résistance électrique augmente dans cette région.
Compte tenu du besoin d’un courant constant dans tout le circuit électrique, ceci entraîne une
forte augmentation du champ électrique local. Les anions macromoléculaires migrent rapidement
jusqu’à ce qu’ils atteignent la région où se trouvent les ions du tampon du gel de concentration.
Ainsi, les ions macromoléculaires vont atteindre le gel de séparation sous forme de bandes ou de
disques très fins rangés selon leur mobilité.
Révélation des bandes de gel :
Après séparation par électrophorèse en gel, les bandes obtenues peuvent être localisées par
différentes techniques. Les protéines sont souvent révélées par coloration au bleu de Coomassie :

Lorsque la quantité de protéines est très faible, on peut les révéler par coloration à l’argent. La
fluorescamine est une molécule non fluorescente qui après réaction avec des amine primaires
forme un produit fluorescent après irradiation par UV.
Comme d’autres substances, les protéines peuvent être détectées par absorption en UV sur toute
la longueur du gel. Si l’échantillon est radioactif, on peut soit sècher le gel sous vide, soit
l’envelopper de plastique. Après un certain temps, le film est développé et l’autoradiographie
obtenue donne la position des composés radioactifs.
Buvardage Wester blot :
Si l’on dispose d’un anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt, on peut détecter spécifiquement
cette protéine sur le gel en présence d’autres protéines par immunotransfert. Une fois
l’électrophorèse terminée, le gel est appliqué sur une feuille de nitrocellulose. Celle-ci lie
fortement les protéines de façon non spécifiques. Les sites d’adsorption en excès sur la
nitrocellulose sont saturés par une protéine non spécifique comme la caséine afin d’éviter
l’adsorption non spécifique des anticorps. La feuille est traitée par un anticorps de lapin dirigé
contre la protéine d’intérêt. Avoir avoir éliminé, par lavage, l’excès d’anticorps primaire, la
feuille est mise en présence d’un anticorps de chèvre dirigé contre touts les anticorps de lapin
auquel est lié une enzyme facile à doser. Un nouveau lavage permet d,éliminer l’excès
d’anticorps secondaire, après quoi l’enzyme liée à celui-ci est mise en évidence par une réaction
colorée, ce qui fait apparaître la protéine recherchée.
SDS-PAGE :

Les savons et les détergents sont agents dénaturants puissants des protéines. Le dodécyl sulfate de
sodium SDS se lie très fortement aux protéines en leur conférant une forme de bâtonnet. La forte
charge négative globale apportée par le SDS masque la charge intrinsèque des protéines, si bien
que les protéines traitées au SDS ont tendance à avoir des rapports charge-masse identiques et des
formes semblables. Par conséquent, l’électrophorèse de protéines en gel de polyacrylamide
contenant du SDS sépare celles-ci en fonction de leur masse moléculaire, par effet de filtration
sur gel. Le SDS-PAGE permet de déterminer la masse moléculaire des protéines.
Focalisation isoélectrique :
Une protéine porte des groupes chargés positivement et négativement et possède donc un pI. Si
un mélange de protéines est soumis à une électrophorèse dans une solution ayant un gradient de
pH stable et dont le pH augmente lentement de l’anode vers la cathode, chaque protéine va
migrer jusqu’à l’endroit où le pH du gradient est égal à son pI. Chaque protéine se trouve donc
concentrée sous forme d’une bande étroite autour de son pI. On appelle ce processus focalisation
isoélectrique.
Électrophorèse capillaire :

L’électrophorèse capillaire est une adaptation de l’électrophorèse de zone qui est une méthode
classique pour séparer les molécules biologiques de masse moléculaire élevée. Elle est effectuée
sur un support poreux (gel) sauf que les molécules chargées migrent à l’intérieur d’un capillaire.
Electrophorèse capillaire de zone :
La plus populaire ; elle utilise une solution tampon.
Électrophorèse capilaire électrocinétique micellaire :
Solution de micelles qui séparent les espèces non chargées.
Électrophorèse capillaire sur gel :
Le capillaire est rempli d’un gel d’exclusion.
Instrumentation :

L’appareil contient un flacon d’échantillon, un flacon source et destination, un capillaire, des

électrodes, une sources de courant haute tension, un détecteur et un ordinateur.

En CE, on utilise un tube capillaire ouvert en silice fondue de diamètre (15-150m), de longueur
l (20-80cm) et rempli d’un électrolyte tampon. La différence de potentiel va jusqu’à 600V/cm et
le capillaire est dans une enceinte thermostatée. Le détecteur est placé au bout de la colonne.
Le volume d’injection est < 1-2% de la longueur du capillaire car un volume plus élevé cause
l’élargissement des pics.

La vitesse de migration dépend de la taille et de la charge des espèces. Plus le rapport

charge/taille est grand, plus la vitesse est élevée.

La colonne possède une très grande efficacité : N > 105-106 nL.

En injection hydrodynamique, l’injection se fait par aspiration ou par vide en plogeant l’extrémité
du capillaire dans l’échantillon et en provoquant l’aspiration ou le vide à l’autre bout. En
injection électro-cinétique qui est la méthode la plus commune, on remplace le réservoir de
tampon par le vial contenant l’échantillon et on applique un voltage ce qui fait pénétrer
l’échantillon dans le capillaire. On remet ensuite les extrémités du capillaire et l’lectrode dans la
solution tampon.
Méthode de détection :

La détection UV mesure l’intensité de lumière à travers le capillaire où on enlève une zone de

revêtement. Le trajet optique étant petit, ce mode de détection est peu sensible si l’analyte
obsorbe peu. Une dérivation pré-post-colonne est possible.

La détection par fluorescence est plus sensible si la source est un laser car celui-ci aide à focaliser
la lumière sur le capillaire. Une dérivation pré-post-colonne est possible.

La détection électrochimique se fait au moyen de minuscules électrodes insérées dans le

capilaire.

La détection par MS se prête bien au faible débit du capilaire. Elle permet d’analyser des
mélanges compolexes et nécessite des tampons volatiles.
Mobilité électrophorique :

Les particules portent une charge électrique dont lka grandeur et le signe dépendent à la fois de
leur taille, de leur nature et de celle de l’électrolyte, en particulier de son pH. Pour chaque ion la

vitesse limite de migration est dépendant de la force électrique exercée par un champ
E sur une particule de charge q et du frottement relié à la viscosité du milieu et au rapport
volume/charge de l’ion hydraté. La séparation dépend approximativement du rapport
masse/charge de chaque espèce. Les anions de petites tailkles arrivent en dernier car se sont les
ions qui progresseraient le plus vite vers l’anode, s’il n’y avait pas le flux électro-osmotique qui
les drainent dans l’autre sens.

La séparation est basée sur la vitesse de migration des analytes dans un champ électrique :

où est la mobilité électrophorique. Le temps de migration est .

Comme la mobilité électrophorique est proportionnelle à la charge de l’analyte et inversement

proportionnel à la force de friction, alors . Mais durant l’électrophorèse, la force

électrique est égale à la force de friction : d’où et l’équation de Huckel est

. L’intensité du champ électrique varie en fonction de la tension appliquée vet de la distance

des électrode : .

Le champ électrique agit uniquement sur les espèces chargées. La séparation est donc possible si
deux espèces ont des charges différentes ou si elles subissent des forces de freinage différentes.
La force de freinage est déterminée par la viscosité du milieu et par la taille et la forme de l’ion.
Pour des ions de même taille, celui avec la charge la plus élevée sera plus rapide. Pour des ions
de même charge, les espèces les plus petites sont plus rapides

Le flux électro-osmotique FEO est un paramètre fondamental en CE. C’est le mouvement du

liquide à l’intérieur du capillaire, généré par une différence de potentiel, qui fait migrer le tampon
de la cathode vers l’anode. À ph > 3, la paroi interne du capillaire en silice est chargée
négativement. Ces charges négatives attirent les cations de la solution tampon qui s’accumulent
créant une couche fixe et une couche diffuse. Sous l’effet du voltage, les cations de la couche
diffuse hydratés migrent vers la cathode et entraînent le solvant et les analytes avec eux.
Il y a une différence de potentiel entre la couche fixe et la couche mobile, très près de la paroi du
capilaire : c’est le potentile zeta :

 où e est la constante diélectrique.

 où tmn est le temps de rétention d’une substance neutre.

Les principaux facteurs qui peuvent affecter la mobilité du FEO sont le potentile zeta, la
constante diélectrique du tampon et la viscosité.
 La constante diélectrique décrit la réponse d’un milieu à un champ électrique
 Une solution visqueuse ralentira le FEO
 La viscosité change en fonction de la température
 Le potentiel zeta est proportionnel à la densité de charges sur la paroi du capillaire qui
dépendent du pH.
 Le FEO s’établit si la silice est chargée mnégativement, il dépend donc aussi du pH de la
solution mais aussi de la présence d’ions sur la paroi.
 Le FEO devient significatif è pH > 4. Il est important de regénérer la colonne en lavant le
capillaire avec une solution NaOH concentrée.
 L’augmentation de la force ionique du tampon aura pour effet de compresser la double
couche ce qui résulte en une diminution du potentiel zeta et donc une diminution de la

vitesse du FEO :
Le FEO est suffisant pour entraîner vers la cathode toutes les espèces ionisables ou non, qui sont
donc détectées. L’ordre d’arrivée des molécules vers la cathode est : petits cations, gros cations,
neutres, gros anions, petits anions.

La mobilité apparente est définie par .

Un ion se déplace sous l’influence combinée de deux phénomènes : l’électrophorèse et l’électro-

osmose :
Pour un neutre :

Pour un ion :

La mobilité électrophorique varie selon : de sorte que

En CE, il n’y a pas de force de friction le long de la paroi dû au FEO. Les pics en CE sont donc
beaucoup plus étroits qu’en HPLC et le nombre de plateaux théoriques est significativement plus
élevé. L’écoulement du FEO génère un profil plat et alors ne contribue pas à l’élargissement des
pics. L’élargissement dû au transfert de masse et aux effets de réchauffement sont minimisés avec
un capillaire de petit diamètre. Le seul facteur contribuant à l’élargissement de bandes CE est la
diffusion longitudinale.
Le FEO est appelé plugflow à cause de sa forme. En raison de ce débit stable et très plat,
l’efficacité est très grande. En CE, les particules se déplacent de façon égale è la cathode, étant
tiré par des forces égales. En HPLC, le flux parabolique montre la forme du débit en raison de la
friction des parois de la colonne. La pression appliquée est uniforme mais une résistance se
produit sur les parois réduisant le nombre de plateaux théoriques qui peuvent être atteints.

Le nombre de plateaux théoriques est avec .

Nous avons parce qu’en CE, il n’y a pas de transfert de masse entre deux phases. La

résolution se calcule de la même manière : .

La production de chaleur dans le capillaire en raison des forces de friction est un effet Joule.
Lorsque le chauffage se produit, un gradient de température parabolique est formé dans le
capillaire. Un gradient de viscosité se forme aussi de sorte qu’il y a élargissement des pics. La
chauffage du capillaire cause :
 Elargissement des pics
 Baisse de viscosité de 2.4% par °C
 Ebullition du tampon
 Dégradation de l’échantillon
On peut ajouter un surfactant cationique sur la paroi de silice. Il inversera le flux
électroosmotique alors qu’un polymère neutre recouvrant les parois l’éliminera.

Avantages du CE : simple et rapide, peu dispendieuse,bien adaptée à l’analyse des peptides, très
grande sensibilité, mécanisme complémentaire à la HPLC, consommation négligeable de solvants
et de réactifs.
Désavantages du CE : moins robuste que HPLC, reproductibilité difficile, limite de détection
élevée en terme de concentration
Purification et dosage des protéines
Source de protéines :
 Possibilité de se procurer facilement des quantités suffisantes.
 Teneur élevée en enzyme ciblée.
Clonage moléculaire :
Cette technique permet de cloner un fragment d’ADFN afin d’isoler et de reproduire des gènes
via l’introduction d’un fragment d’un gène d’intérêt dans un organisme unicellulaire.

1 1. Isoler le gène codant

3
, pour l’enzyme désirée
2 4
2. Modifier le gène
d’intérêt (promoteur,
mutagenèse dirigée,
5 ajout d’un tag, etc)

3. Insérer le gène dans

un vecteur d’expression
(ex: plasmide avec gène
de sélection) et
purification de la
construction.

4. Transformation
bactérienne

5. Multiplication
(clonage), isolation,
purification du vecteur
et séquençage.
Rupture des cellules :
L’extraction de la protéine d’intérêt qui n’est pas sécrétée constitue la première étape de la
purification protéinique.
Il est nécessaire d’établir des conditions pour préserver l’activité de la protéine :
 Tampons physiologiques
 pH
 inhibiteurs à protéases
 basses températures (4°C)
Méthode chimique :
 Choc osmotique
 Détergents comme le triton.
  Solvants organique comme l’acétone pour les cellules animales et le toluène pour les
levures.
 Digestion enzymatique par les lysozymes.
Méthode mécanique :
 Ultrasonication : effet mécanique d’ondes ultrasonores. Formation de microbulles, de
vibrations violentes et d’implosions. Génération de chaleur et radicaux libres pouvant
mener à la dénaturation de la protéine.
 Cycle congélation/décongélation au N2 et au bain d’eau.
 Homogénéisation mécanique ou manuelle.
Solubilité des protéines :
La solubilité d’une protéine en solution aqueuse est fonction de la concentration en sels dissous.
La concentration en sels est exprimée par la force ionique . La solubilité d’une protéine pour une
force ionique donnée varie selon la nature des ions en solution. L’ordre d’efficacité de ces différents ions
pour modifier la solubilité des protéines est pratiquement le même pour différentes protéines et semble
essentiellement dû à la taille et à l’hydratation de l’ion.

Figure 1. Solubilité de protéines dans le sulfate d’ammonium

Figure 2. Solubilité d’une protéine en fonction d’ions différents

La solubilité d’une protéine à faible force ionique augmente généralement avec la concentration en sel. Ce
phénomène, appelé solubilisation saline, est expliqué de cette manière : à mesure que la concentration
ensel augmente, les contre-ions ajoutés entourent de manière plus efficace les multiples charges ioniques
des protéines augmentant ainsi leur solubilité.
Pour des forces ioniques élevées, la solubilité des protéines diminue. Cet effet, appelé précipitation saline,
est dû essentiellement à la compétition entre les ions salins ajoutés et les autres solutés dissous. Dans ce
cas, il y a tellement d’ions ajoutés qui sont solvatés, que la quantité de solvant disponible est insuffisante
pour dissoudre les autres solutés.

La précipitation saline est à la base des méthodes les plus courantes de purification des protéines.
En amenant la concentration ensel d’une solution protéiques à une valeur tout juste inférieure à
celle pour laquelle la protéine désirée précipite, on élimine de la solution beaucoup de protéines
indésirables.

Au point isoélectrique d’une protéine, la molécule possède une charge nette nulle et reste par
conséquent immobile sai on la place dans un champ électrique. Par conséquent, les propriétés de
solubilité de molécules non chargées sont insensibles à la concentration saline. Donc, une
protéine à son point isoélectrique ne devrait pas être mise en solution. Par contre, au fur et à
mesure que le pH s’écarte du pI de la protéine, la solubilité saline se trouve facilité en raison de
l’augmentation des interactions électrostatiques entre molécules voisines. Ainsi, dans des
solutions de concentrations salines moyennes, la solubilité d’une protéine en fonction du pH
atteindra un minimum au pI de la protéine et augmentera lorsque le pH s’écartera du pI. Étant
donné que le pI diffère d’une protéine à une autre, une méthode de purification, dite précipitation
isoélectrique, consiste à amener le pH d’une solution de protéines à la valeur du pI de la protéine
que l’on veut isoler, afin de diminuer sélectivement sa solubilité.

Figure 3. Solubilité d’une protéine en fonction du pH à différentes concentration en sel.

Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium :
Cette technique utilise la solubilité différentielle des protéines. Comme chaque protéine est plus
ou moins soluble en solution selon sa composition, on peut en séparer plusieurs en fonction de
leur tendance à précipiter plus ou moins vite quand on change la force ionique de la solution qui
les contient. Une force ionique élevée peut avoir deux effets sur la solubilité: neutraliser certaines
charges ioniques requises en surface pour le maintien de la solubilité, et compétitionner avec les
protéines pour les molécules d'eau disponibles en solution. Quand la concentration en sel est
assez élevée pour priver une protéine des molécules d'eau qui l'hydratent, celle-ci sort de solution
et précipite. C'est ce qu'on appelle le phénomène de salting-out. Les protéines seront
éventuellement toutes précipitées par une teneur en sel assez élevée, mais certaines d'entre elles
seront remarquablement résistantes alors que d'autres précipiteront très facilement. C'est cette
différence de solubilité qui permet de les séparer. La série de Hofmeister ci-dessous décrit les
effets relatifs de différents ions sur la précipitation des protéines ou la promotion de leurs
interactions hydrophobiques. (L'anion phosphate et le cation ammonium sont est les plus
efficaces pour précipiter les protéines; l'anion chlorate et le cation Ca 2+ sont au contraire les plus
efficaces pour les remettre en solution. Notez que ce ne sont pas toutes les combinaisons de ces
ions qui donnent un sel soluble).
précipitation PO43- > SO42- > COO- > Cl- > Br- > NO3- > ClO4- chaotropique
NH4+ > Rb+ > K+ > Na+ > Cs+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+
(salting out) (salting in)

Le sel le plus utilisé en laboratoire pour précipiter les protéines est le sulfate d'ammonium
(NH4)2SO4. Sa solubilisation n'affecte pas la température de la solution (au contraire du NaCl,
dont la solubilisation exothermique aide à faire fondre la glace dans les rues l'hiver), il ne
dénature pas les protéines et ne coûte pas cher.
La procédure suivie d'habitude quand on travaille en aveugle est de préparer quelques précipitats
avec des concentrations croissantes de sulfate (qu'on peut ajouter directement à la solution
protéique):
(1) Ajustement à 20% sulfate Centrifugation et récupération du culot

(fraction C20)
(2) Ajustement du surnageant Centrifugation et récupération du culot

à 40% sulfate (fraction C40)

(3) Ajustement du surnageant Centrifugation et récupération du culot

à 60% sulfate (fraction C60)

(4) Ajustement du surnageant Centrifugation et récupération du culot

à 80% sulfate (fraction C80)

(5) Ajustement du surnageant Centrifugation et récupération du culot
à 100% sulfate (fraction C100)

Notre protéine se trouvera dans une des fractions C20, C40, C60, C80 ou C100.
Bien sûr, si on sait à l'avance comment notre protéine réagit au salting-out, on peut viser avec
plus de précision. Si elle précipite à environ 35% sulfate, on fera une première coupure avec 30%
sulfate, une deuxième à 40% sulfate, et une dernière (juste au cas) à une teneur en sel plus élevée.
Mais nous saurons déjà que notre protéine se trouve dans la fraction C40, et qu'elle est débarassée
de tout ce qui précipite en-deçà de 30% sulfate et au-delà de 40%.
Les culots de protéines peuvent alors être resuspendus. Ils contiendront cependant encore une
grande quantité de sulfate dont il faut se débarasser.
Dialyse :
La méthode la plus utilisée pour changer la concentration en sels d'une solution protéique est la
dialyse. Dans une dialyse, les protéines dans une concentration de sels donnée sont séparées d'une
solution à la concentration en sels différente par une membrane poreuse. Les pores de cette
membrane peuvent avoir différentes tailles; certaines membranes ne laisseront passer que des
ions alors que d'autres laisseront même passer de petites protéines (jusqu'à des poids moléculaires
de 50 000 Da).
Les sels auront tendance à équilibrer leur concentration de part et d'autre de la membrane. En
utilisant un volume de tampon de dialyse beaucoup plus grand que celui de la solution protéique,
on changera rapidement la teneur en sels de celle-ci en la même que celle du tampon de dialyse.
Afin d'accélérer le processus, il vaut mieux changer souvent le tampon de dialyse pour du tampon
neuf plutôt que d'utiliser une seule quantité (même grande) de tampon. Voyez plutôt: puisque
C1V1=C2V2, la dialyse de 10mL de solution protéique à 500mM dans 1000mL de tampon de
dialyse à 100mM donnera une concentration de 104 mM à l'équilibre.
(500mM x 10 mL) + (100mM x 1000mL) = 1010 mL x 104mM
On aurait pu atteindre la même concentration en dialysant dans un plus petit volume et en
changeant le tampon une fois:

1) (500mM x 10mL) + (100mM x 100mL) = 110mL x 136 mM

2) (136mM x 10mL) + (100mM x 100mL) = 110mL x 103 mM

La vitesse de dialyse dépend beaucoup de la quantité de matériel à dialyser et de la viscosité des

solutions. Notez que l'eau sera la première à diffuser: il n'est pas rare de voir un tube de dialyse
gonfler progressivement alors que l'eau y pénètre pour en réduire la concentration en solutés.

Stabilisation des protéines :

Les protéines ont une demi-vie allant de quelques secondes à plusieurs années en fonction de
leurs structures qui modulent leur susceptibilité face à la protéolyse enzymatique, à la
dénaturation et aux modification chimiques.

 Les protéines doivent être protégées facent aux hydrolyses (haute température, acide fort,
protéases) On ajoute habituellement de l’EDTA et on conserve à basse température.
 Les protéines doivent être protégées facent aux déphosphorylations en ajoutant des
inhibiteurs tels que : molybdate, imidazole, vanadate et tartrate.

 Les protéines doivent aussi être protégées contre l’oxydation. Les résidus sensibles à
l’oxydation sont : Met, Cys, His et Trp.
Ultracentrifugation :

L’ultracentrifugation consiste à utiliser la force centrifuge pour séparer les macromolécules

présentent dans une solution. La vitesse à laquelle une particule sédimente est fonction de sa
masse. La force de sédimentation est donnée par . Cependant, il existe aussi
une force de friction due à la présence de la solution : de sorte qu’à l’équilibre

. Puisque , alors . On peut alors définir

le coefficient de sédimentation dont l’unité est le Svedberg

S.
Pour des particules sphériques non solvatées de rayon r, le coefficient de friction peut être calculé
à partir de l’équation de Stokes : où est la viscosité.
Ultracentrifugation zonale :

Dans l’ultracentrifugation zonale, une solution de macromolécules est soigneusement déposée au-
dessus d’un gradient de densité. Le rôle de ce gradient est d’assurer le passage en douceur des
différentes plages macromoléculaires en minimisant le mélange de la solution par convexion. Le
saccharose, qui donne une solution sirupeuse et biochimiquement inerte, est souvent utilisé pour
former ce gradient de densité. La pente du grandient de densité obtenu est généralement faible,
car la densité maximum de la solution doit être inférieure à celle de la macromolécule d’intérêt la

moins dense. D’après l’équation , l’ultracentrifugation

zonale sépare des macromolécules de formes identiques essentiellement en fonction de leurs
masses moléculaires.
Ultracentrifugation en gradient de densité :

Dans l’ultracentrifugation en gradient de densité à l’équilibre, également appelée

ultracentrifugation isopycnique, l’échantillon est dissous dans une solution relativement
concentrée d’une substance dense, qui diffuse rapidement, comme CsCl ou Cs 2SO4, puis est
centrifugé à grande vitesse jusqu’à ce que la solution soit à l’équilibre. La force centrifuge élevée
crée un gradient de forte pente dans le soluté de faible masse moléculaire ; les composants de
l’échantillon vont s’y équilibrer sous forme de bandes aux endroits où leur densité est égale à
celle de la solution, i.e. lorsque . Ces bandes recueillies en fractions séparées, après
ponction du tube.

Dosage par spectrophotométrie :

Les spectrophotomètres sont des instruments qui mesurent la quantité de lumière absorbée à une
longueur d'onde donnée par les molécules en solution. On emploie deux termes pour mesurer
l’absorption de la lumière : la transmittance et l’absorbance. La transmittance du milieu est
définie comme la fraction de rayonnement incident qui est transmise par le milieu : et
est souvent exprimée en pourcentage : . L’absorbance A d’une solution est
définie par l’équation . Contrairement à la transmittance, l’absorbance
d’une solution augmente lorsque l’atténuation du faisceau augmente. L’absorbance suit la loi de

Beer-Lambert: où est la longueur de la cellule contenant la solution

traversée par la lumière (généralement égale à 1 cm), ε le coefficient d'extinction molaire qui
caractérise la substance étudiée et c la concentration de la substance. Cette loi est exacte
seulement pour les solutions diluées; des déviations par rapport à la loi surviennent dans les
solutions concentrées à cause des interactions entre les molécules de soluté, dissoutes dans le
solvant. On constate donc que l'absorbance est proportionnelle à la concentration de la substance,
par conséquent il suffira de faire une droite d'étalonnage de l'absorbance en fonction de la
concentration pour pouvoir déterminer par la suite des concentrations inconnues.
Courbe d’étalonnage :
Expérimentalement, on commence généralement par construire une courbe d’étalonnage
à partir de solutions de concentrations connues du composé à doser, soumises au
même traitement que l’échantillon. On utilise une solution de concentration connue, et on réalise,
par exemple, des dilutions 0%, 25%, 50%, 75% et 100% généralement en duplicata. Le blanc est
une solution qui contient le solvant et tous les réactifs utilisés lors d’une analyse, à l’exception de
l’échantillon lui-même. Il est l’équivalent de l’échantillon 0%. On obtient alors un graphique de
l’absorbance mesurée en fonction de la concentration des solutions et la droite linéaire est la
courbe d’étalonnage. Elle permet de déduire la concentration c de la solution connue. La droite

linéaire est de la forme . On ajuste la droite à zéro de sorte que .

Dosage des protéines :

Le tryptophane absorbe fortement à 280 nm de même que, dans une moindre mesure, la tyrosine.
La phénylalanine et la cystine ont aussi de faibles absorptions dans cette région de l'U.V.
rapproché. Il est donc possible de doser les protéines en mesurant l'A 280. Évidemment l'absorption
à cette longueur d'onde dépend principalement du nombre de tryptophanes dans le mélange
proté[Link] solution contenant 1 mg de protéines/mL a une A 280 de l'ordre de 0.5 à 2.0. Pour
une protéine pure, il est possible de déterminer empiriquement le coefficient d'absorption. Il s'agit
de calculer l'A280 due à chacun des quatre acides aminés mentionnés précédemment et d'en faire le
total. En effet, on s'est aperçu qu'il y a très peu de masquage de l'A 280 et que la somme de l'A280
des acides aminés émettant à 280 nm est très près de celui de la protéine. Cependant, la plupart
du temps, on se sert de valeurs mesurées expérimentalement. On peut donc déterminer assez
précisément la concentration de ces protéines en appliquant la relation de Beer-Lambert. Pour un
mélange de protéines, cette mesure donne une approximation qui est passablement fiable, surtout
pour comparer des mélanges de composition semblable. On utilise même directement cette valeur
d'absorption pour exprimer la concentration de protéines. Les avantages de cette méthode sont sa
relativement bonne sensibilité, sa simplicité et sa rapidité d'exécution. Elle permet en outre de
récupérer la solution protéique si besoin est, car elle ne nécessite pas que les protéines de la
solution soient détruites par une réaction quelconque. Elle est particulièrement utile pour suivre le
contenu en protéine de l'effluent d'une chromatographie. Elle a cependant un désavantage majeur,
la présence de contaminants ayant une absorption à 280 nm. Parmi ces contaminants potentiels,
on retrouve les acides nucléiques. Ils absorbent fortement dans l'U.V., avec un maximum autour
de 254 nm, et contaminent souvent les préparations de protéines. Parmi les autres contaminants
potentiels, les produits tampons et les détergents peuvent aussi être souvent problématiques. Une
façon simple d'éliminer ce facteur est d'inclure ces produits dans le [Link] autre facteur à
considérer est le pH et la force ionique de la solution contenant les protéines. En effet,
l'absorption du tryptophane et des autres acides aminés est dépendante de ces facteurs physiques
et il faut les maintenir constants.
Colorimétrie :
Une solution est, par exemple, rouge non parce que le complexe ajoute un rayonnement rouge au
solvant, mais parce que ce complexe absorbe la composante verte de la lumière blanche. Ainsi,
lors d’une analyse colorimétrique d’une solution rouge, c’est le rayonnement vert qui subit la plus
grande variation d’absorbance en fonction de la comcentration. Ainsi, le rayonnement utilisé pour
une analyse colorimétrique est la couleur complémentaire de la solution d’analyte.

Longueur d’onde (nm) Couleur visible Couleur complémentaire

400-435 Violet Jaune-vert
435-480 Bleu Jaune
480-490 Bleu-vert Orange
490-500 Vert-bleu Rouge
500-560 Vert Pourpre
560-580 Jaune-vert Violet
580-595 Jaune Bleu
595-650 Orange Bleu-vert
650-750 Rouge Vert-bleu

Dosage de Lowry :
Cette méthode a été développée par Lowry et al (1951) qui ont combiné une réaction au biuret et
une réaction au réactif de Folin-Ciocalteu. Ce dernier, à base de phosphomolybdate et de
phosphotungstate, réagit avec les tyrosines et les tryptophanes, pour donner une coloration bleue
qui s'ajoute à celle du biuret. Cette méthode a été tellement utilisée que l'article original de Lowry
est un des articles scientifiques les plus cités au monde ! Encore aujourd'hui on publie de
nouvelles vaiantes de cette métode. La grande sensibilité de la méthode de Lowry est sa
principale qualité. Elle peut atteindre 5-10 µg. La zone de linéarité de la réaction est cependant
étroite et il faut utiliser la portion linéaire de la courbe qui correspond à l'absorption de l'inconnu.
Cette méthode est très sensible à de très nombreuses substances interférentes: certains peptides et
acides aminés. le saccharose, le tris, le glycérol, les dérivés mercaptan, l'EDTA, de nombreux
détergents, etc. Des listes exhaustives ont même été dressées à cet effet (Bensadooun,1976;
Peterson, 1979). De nombreuses variantes ont été développées pour contrer ces défauts. Entre
autres, citons une méthode permettant d'éliminer les substances interférentes par
microprécipitation des protéines à l'acide trichloroacétique après complexation avec du
déoxycholate.
Dosage au Biuret :
Cette méthode a été développée par Gornall et al (1949) qui ont appliqué la réaction du biuret
pour obtenir une méthode quantitative de dosage des protéines. Cette réaction du biuret est la
formation d'un complexe pourpre entre le biuret (NH 2-CO-NH-CO-NH2) et deux liens
peptidiques consécutifs en présence de cuivre en milieu alcalin. Le complexe de coordination
résultant absorbe fortement dans le bleu. Même si cette méthode est peu sensible (1-20 mg) elle
est relativement rapide. Sa principale qualité est d'avoir une absorption égale pour toutes les
protéines. Encore une fois, le défaut de cette méthode est sa sensibilité à certains interférents
comme les peptides, le saccharose, le tris, le glycérol, etc.
Méthode du bleu de Coomassie
Bradford et al (1976) ont développée une méthode basée sur l'adsorption du colorant bleu de
Coomassie G250. En milieu acide ce colorant s'adsorbe sur les protéines et cette complexation
provoque un transfert de son pic d'adsorption qui passe du rouge au bleu. De nombreuses
variantes ont été développées par la suite et on peut se procurer dans le commerce des trousses
("kits") de divers fabriquants. C'est une méthode très sensible (2-5 µg de protéines) et très rapide.
Elle est aussi assez résistante à la plupart des interférents qui nuisent à la plupart des autres
méthodes. Seuls les détergents, comme le Triton et le dodécylsulfate de Na (SDS), et des bases
fortes interfèrent avec cette méthode. Son principal défaut est sa réactivité très différente face à
diverses protéines. Un détail souvent oublié est que la protéine souvent utilisée pour la courbe
d'étalonnage, l'albumine sérique bovine, réagit beaucoup plus fortement que la moyenne et n'est
donc pas appropriée. La γ-globuline est un meilleur étalon Un autre petit détail à surveiller est
que le réactif a tendance à s'adsorber sur le verre des cuvettes de spectrophotomètre et qu'il faut
donc les nettoyer consciencieusement après usage ou employer des cuvettes jetables de
polystyrène.
Acide bicinchonique
L'acide bicinchonique (BCA) réagit avec les complexes de Cu 2+ et de protéines de façon très
similaire à la réaction du biuret. En formant de tels complexes, il prend une couleur pourpre
typique. C'est une méthode sensible et rapide qui résiste aux détergents comme le Triton ou le
SDS.

Méthode de Kejdahl
Cette méthode consiste à mesurer la quantité d'azote organique d'un échantillon. Il faut
évidemment savoir, pour l'échantillon analysé, quelle est la relation entre la quantité d'azote et
celle de protéines. Elle requiert un équipement coûteux et complexe. On ne l'applique qu'à des
échantillons difficiles à homogénéiser. comme du matériel végétal.
Séquencage et détermination des chaînes polypeptidiques des protéines :
Chaque chaîne polypeptidique a un résidu N-terminal et un résidu C-terminal en autant qu’elle ne
soit pas circulaire ou bloquée chimiquement. En identifiant ces groupes terminaux, nous pouvons
déterminer le nombre de polypeptides qui différent chimiquement dans une protéine.
Chlorure de Dansyl :
Le chlorure de Dansyl réagit avec les amines primaires pour donner des polypeptides dansylés.
Une hydrolyse acide libère le résidu N-terminal sous forme d’acide aminé dansylé qui présente
une fluorescence jaune forte et peut être identifié par chromatographie.
Dégradation d’Edman :
La méthode la plus utilisée pour identifier le résidu N-terminal est la dégradation d’Edman. Le
réactif d’Edman réagit avec les groupes N-terminaux en milieu légèrement alcalin pour former
leur adduit phénylthiocarbanyl. Ce produit est traité par un acide fort anhydre qui libère le résidu
N-terminal sous sa forme dérivée thiazolinone mais sans hydroliser les autres liaisons
peptidiques. Le dérivé thiazolinone de l’acide aminé est extrait sélectivement par un solvant
organique et transformé en PTH.
Par conséquent, la méthode d’Edman permet de déterminer la séquence en acides aminés depuis
l’extrémité N-terminale vers l’intérieur de la chaîne en soumettant le polypeptide à des cycles
répétés de la dégradation et, après chaque cycle, en identifiant le nouveau PTH-aminoacide
libéré.
Coupures des ponts disulfure :
La seconde étape consiste à rompre les ponts disulfure entre les résidus Cys pour permettre la
séparation des chaînes polypeptidiques et empêcher la conformation de la protéine native qui est
stabilisée par ces ponts. On coupe ces ponts par réduction avec le 2-mercaptoéthanol. Pour
s’assurer que tous les ponts disulfure soient exposés à l’agent réducteur, la réaction se fait dans
des conditions qui dénaturent la protéine.
Fragmentation spécifique des polypeptides par les endopeptidases :
 La trypsine permet de fragmenter les polypeptides au niveau du carboxyle des résidus Lys
et Arg.
 La chymotrypsine permet de fragmenter les polypeptides au niveau du carboxyle des
résidus aromatiques.
 La elastase permet de fragmenter les polypeptides au niveau du carboxyle des résidus Ala,
Gly, Ser et Val.
 La thermolysine permet de fragmenter les polypeptides au niveau du carboxyle des
résidus Ile, Met, Phe, Trp, Tyr et Val.
 La pepsine permet de fragmenter les polypeptides au niveau du carboxyle des résidus
Leu, Phe, Trp, Tyr.
Séquencage :
Avant de commencer le séquencage d’un polypeptide, il est utile de connaître sa composition en
acides aminés. La composition en acides aminés d’une sous-unité est déterminée après hydrolyse
totale suivie par l’analyse quantitative des acides aminés libérés. L’hydrolyse d’un peptide peut
être obtenue par des méthodes chimiques (acide ou basique) ou enzymatiques et la composition
en acides aminés d,un hydrolysat de polypeptide peut être déterminé par HPLC. Les polypeptides
qui ont plus de 40 à 100 résidus ne peuvent être séquencés directement. Les polypeptides de taille
supérieure doivent donc être hydrolysés en fragments suffisamment petits pour être séquencés.
Une fois obtenus, par hydrolyses spécifiques, les fragments peptidiques sont soumis à des cycles
répétés de la dégradation d’Edman. Ensuite, les PTH-aminés sont identifiés par HPLC. Les
fragments peptidiques ayant été séquencés individuellement, reste à élucider l’ordre dans lequel
ils se trouvent dans le polypeptide original. Ceci est obtenu en comparant les séquences en acides
aminés d’une série de fragment peptidiques avec celles d’une deuxième série dont les sites
d’hydrolyse recouvrent ceux de la première série.

Activité enzymatique

Séquencage peptidique
Complémentarité des methodes de séquençage de la proteien et de l,ADN :
 La séquence partielle en aa est requise pour corroborer celle déduite à partir de l’ADN.
 La séquence partielle en aa est nécessaire pour la synthèse d’outils de détection
spécifiques comme les peptides qui serviront à la production Ac et d’oligonucléotides
complémentaires à l’ADN.
  La chimie des protéines est absolument requise pour déterminer la présence et la
localisation des ponts S-S et des modifications co et post traductionnelles. Dans le dernier
cas, la comparaison entre les séquences protéique et nucléotidique est riche en
information.
 L’ADN complémentaire est disponible pour les etudes de mutagenese dirigée, pour la
synthèse de nouvelles protéines et pour l’expression dans des systèmes cellulaires
heterologues.
 L’ADN complémentaire est un outil indispensable pour etudier un gène.

Biologie moléculaire
Enzymes de restriction :
 Les enzymes de restrictions appartiennent à la classe des endonucléases et sont capables
de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’un acide
nucléique.
 Les endonucléases se distinguent des exonucléases qui dégradent l’ADN à partir de l’une
de ses extrémités.
 Les enzymes de restriction reconnaissent des séquences de nucléotides dites
palindromiques. Ces séquences palindromiques sont des séquences où la succession des
nucléotides lue dans le sens 5-3 pour le premier brin est identique à la séquence lue dans
le sens contraire pour le second brin. Ces séquences palindromiques sont le plus souvent
constituées de 4 ou 6 paires de bases.

 La fréquence de coupure statistique est définie par où n est le nombre de paires de

bases.

 Les enzymes de restriction sont nommés selon une nomenclature : la première lettre en
majuscule correspond au genre de la bactérie d’où a été extraite l’enzyme. La seconde et
troisième lettre en minuscules correspondent à l’espèce de la bactérie d’où est extraite
l’enzyme. Quelquefois, une quatrième lettre indique la souche bactérienne et finalement le
chiffre romain indique l’ordre de caractérisation de ces enzymes.
 Des enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître des mêmes sites spécifiques.
On les appelle isoschizomères. Les isoschizomères fournissent souvent des fragments
dont les extrémités sont différentes.

 Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupures : à bouts francs et à
bouts collants. La coupure à bouts collants correspond à une coupure qui se fait de part et
d’autre du centre de symétrie tandis que la coupure à bouts frances aboutit à une coupure
au milieu de la séquence palindromique.
  La plupart des enzymes de restriction utilisées en laboratoire sont des enzymes de type II,
soit des enzymes qui possèdent un site de reconnaissance souvent palindromique et un site
de coupure identique ou proche du site de reconnaissance.
 Les enzyme de type I reconnaissent des séquences sur l’ADN sans aucune symetrie. Ils p
coupent non pas au site de reconaissance mais 1000 à 5000 pb plus loin.
 Les enzymes de type III coupe à une 20aine de pb plus loin que le site de reconaissance.
Methylation des sites de restriction :
 L’ADN bactérien présente des sites de restriction susceptiobles d’être repérés par les
enzymes de restriction que poss`dent la bactérie. Pour éviter une auto-destruction, les
enzymes de modification de l’ADN bactérien interviennent. Les methgylases bactériennes
sont capables de methyler la cytosine ou l’adenine appartenant à des sites de restriction.
Clonage moléculaire :
 Les enzymes de restriction permettent de fractionner l’ADN, d’insérer un insert dans un
vecteur comme un plasmide.
 Le clonage moléculaire consiste un insérer un fragment d’ADN dans un vecteur
plasmidique. La culture bactérienne de la cellule hôte avec ce plasmide permet ensuite
d’obtenir des mutants.

Autres enzymes utiles :

 La Dnase est une endonucléase qui coupe l’ADN double brin et saimple brin. Elle conduit
à des coupures faites au hasard sans reconaissance d’un site spécifique. Elle est utilisée
pour des marquages de sondes radioisotopiques.
 La nucléase S1 extraite d’un champignon n’attaque que l’ADN simple brin.
 L’exonucléase III catalyse l’hydrolyse séquentielle des nucléotides à partir de l’extrémité
3’OH. Elle poss`de aussi une activité 3’ phosphatase.
  Les ligases sont capables de lier par une liaison estert un fragment avec un groupement 5’
phosphate et un groupement 3’OH en présence d’ATP. Elles peuvent effectuer des
ligatures avec bouts francs ou collants.
 Les phosphatases sont des enzymes capables d’enlever des groupes phosphates. Elles sont
utilisées pour préparer de l’ADN recombinant.
 Les kinases permettent de fixer un groupement phosphate en présence d’ATP.
 Les ADNpolymerases sont capables de recopier une chaîne d’ADN dans le sens 5-3.
Cette synthèse se produit de manière complémentaire et antiparallèle. Elle ont besoin de
NTPs et de dNTPs et d’une amorce d’acide nucléique. Ce sont des enzymes
ADNdépendantes.
Purification des acides nucléiques :
 L’extraction se réalise par le phenol-chloroforme.
 Le phenol est un agent dénaturant des protéines et permet donc de séparer efficacement
les protéines des acides nucléiques. Cette phase est ensuite éliminée par l’extraction au
chloroforme. La séparation des deux phases se fait par centrifugation. La phase aqueuse
contient les acides nucléiques.
 Les acides nucléiques sont ensuite récupérés sous forme solide à la suite de précipitation
par l’alcool ethylique ou isopropylique.
 On peut estimer la quantité d’ADN par spectrophotometrie dans l’UV à 260nm et ensuite
par l’absorption à 280nm pour estimer la contamination par des protéines. Le rapport
inmdique l’ampleur de la contamination lorsque .
Électrophorèse des acides nucléiques :
 Les fragments d’ADN après digestion par les enzymes de restriction peuvent être séparés
par électrophorèse. Les migrations dépendent de la taille du fragment. Plus le fragment est
gros moins la migration sera importante.
 La détermination précise des tailles se fait par l’utilisation d’un étalon de poids
moléculaire connu.
 Les fragments sont révélés par UV ou par bromure d’ethidium.
 Le tampon de l’électrophorèse est basique, le plus souvent du TBE (tris-borate-EDTA).
 L’électrophorèse en champ pulsé permet de séparer des grands fragments d’ADN. On
applique au gel un champ électrique de nature variable et dans plusieurs directions.
Southern Blot :
 Permet de détecter des fragments d’ADN transférés sur filtre par leur hybridation à des
séquences complémentaires radioisotopiques.
Sondes nucléotidiques :
 Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotides mono brin qui permet de
rechercher de manière spécifique un fragment d’acide nucléique. Sa taille est très
variable. Elle est complémentaire et antiparallèle du fragment recherché.
 Une sonde oligonucléotidique peut être fabriquée par synthèse chimique si la séquence de
l’ADN à repérer est connue. Si cette séquence est inconnue, on peut étudier la protéine
correspondante grâce au code génétique.
 Une sonde peut être un ADNc.
 L’hybridation sonde-fragment nécessite des conditions physico-chimiques parfaites que
l’on appelle la stringence.
 Le marquage de la sonde peut se faire aux extrémités par la technique de « nick
translation ou la technique dite de « random priming ».
  L’ADN peut être marquée à son extrémité 5’ par une kinase.
 La technique de Nick translation consiste a traité l’ADN double brin par la Dnase I pour
le cliver au hasard. La réparation des coupures necessite de l’ADNpolymerase I en
présence de dNTP marqué au 32P.

 La technique de random priming consiste à séparer les deux brins d’ADN par chauffage
suivi d’un refroidissement brutal. Le mélange oligonucléotidique est ajouté. Les
oligonucléotides vont s’hybrider avec la sonde et ont besoin de fragment de Klenow en
présence de dNTPs 32P.

 Plusieurs facteurs peuvent affecter l,hybridation moléculaire : le temps et la concentration

en acides nucléiques.
Carte de restriction :
 Les enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau de séquences parfaitement définies.
Il est donc possible d’établir une véritable carte d’un gène donné par la technique de
Southern.
  L’ADN à étudier est réparti en différentes fractions. Chaque fraction est traitée par une
enzyme de restriction.
Vecteurs :
 Les vecteurs sont de petits ADN dans lesquels on insère un fragment d’ADN que l’on
veut étudier. Ces petits ADN sont généralement des plasmides ou des bactériophages.
 Les plasmides sont des petits fragments d’ADN circulaire présents dans la cellule
bactérienne et indépendants du genome bactérien. Leur ADN est bicaténaire, circulaire
avec un nombre de nucléotides inférieur à 10kb. Les plasmides portent normalement des
gènes qui leur confèrent un avantage sélectif comme une résistance à un antibiotique.
Leur réplication est indépendante du genome bactérien.
 Les bactéries contenant les plasmides sont mises en culture dans un grand volume. Quand
la concentration bactérienne atteint une valeur suffisante, on traite par un antibiotique qui
empêche la croissance bactérienne sans affecter la réplication des plasmides. On récupère
les bactéries par centrifugation et on permabilise la paroi bactériennen poiur obtenir un
passage en solution des plasmides qui sont plus légers que l’ADN. La purification des
plasmides est ensuite réalisée par HPLC ou ultra-centrifugation en gradient de densité.
 Après l’action de l’enzyme de restriction, le plasmide circulaire est linéarisé. Le fragment
d’ADN est insérer en présence d’une ligase.
 Les plasmides ont l’avantage d’être de petite taille, d’être sélectifs par les antibiotique. En
revanche, ils ont une faible efficacité pour la transformation bactérienne et il est
impossible d’insérer de larges fragments d’ADN.
 Deux phages sont très utilisés comme vecteurs : le phage  et le phage M13. Les
séquences de ces phages sont connues. Les extrémités de cet ADN sont simples brins sur
une longueur réduite et complémentaires l’une de l’autres. Elles forment des séquences
cos (cohésives).
 Le bactériophage  se multiplie selon deux modes possibles : multiplicaqtion lytique et
multiplication lysogénique. Dans la multiplication lytique, le virus s’adsorbe
spécifiquement à la surface des bactéries. Il injecte son ADN à la cellule hôte. La
réplication de nombreuses particules virales se fait à l’intérieur du cytoplasme bactérien.
La lyse bactériennen provoque la libération des particules virales. Dans la multiplication
lysogénique, l’ADN viral s’intègre à l’ADN bactérien.
 Les phages poss`dent les avantages de pouvoir insérer des fragment d’ADN plus grand
que ceux des plasmides. La transformation des bactéries est plus efficaces. En revanche,
le nombre de sites de restriction est resatreint, il y a obligation d’empaqueter l’ADN et il
existe des contraintes de taille pour l’ADN à insérer.
 Les cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides : phage-plasmide. Ils ont l’avantage de
pouvoir insérer des fragments de 50kb, leur incorporation dans les bactéries est plus
efficace que pour les plasmides main il y a obligation d’empaqueter l’ADN.

Banque d’ADN :
 Banque d’ADNc provenant des ARNm. Donc, ne possèdent pas d’introns.
 Le clivage de l’ADN genomique par des enzymes de restriction génèrent de nombreux
fragments. L’insertion de ces fragments dans des vecteurs permet de constituer une
banque d’ADN genomique.
Transformation bactérienne :
  Les bactéries sont placées dans certaine sconditions physico-chimiques pour permettre
aux plasmides d’être incorporés à l’intérieur de celles-ci. Les bactéries traitées et prêtes à
recevoir l’ADN étranger sont appelées bactéries compétentes. L’incorporation des
plasmides dans les bactéries est appelée tranformation bactérienne.
 On utilise une résistance à un antibiotique. La transformation d’une bactérie sensible à un
antibiotique par des plasmides portant un gène de résistance au même antibiotique aboutit
à l’apparition d’une résistance uniquement pour les bactéries ayant incorporé les
plasmides. Ceci permet donc de séparer les bactéries transformées de celles sans
plasmides. Mais cela ne permet pas de dinstinguer les bactéries avec plasmides intacts des
bactéries avec plasmides recombinants.
 Dans ce cas, on utilise une résistance à un second antibiotique telle que l’insertion du
fragment d’ADN dans le plasmide doit inactiver le gène de résistance au deuxième
antibiotique. Les bactéries transformées sont donc résistants au premier antibiotique mais
sensible au deuxième.
Technique du PCR :
 Le PCR est une technique rapide de réplication d’ADN qui nécessite seulement une petite
quantité d’ADN. Par contre, le PCR est très sensible aux contaminations.
 Cette technique permet d’amplifier des séquences d’ADN de mani` ;eres spécifique et
d’augmenter de manière considérabnle la quantité d’ADN dont on dispose initialement.
Elle nécessite de connaître la séquence des régions qui délimitent l’ADN à amplifier. Ces
séquences serviront à synthétiser des amorces oligonucléotidiques. Ces oligonuclé.otides
serviront à délimiter la portion d’ADN à amplifier et l’ADNpol les utilisera comme
amorces dans la réplication.
 La technique comporte des cycles successifs. Chaque cycle comprend une succession de
trois phases : une phase de dénaturation par la chaleur pour séparer les deux brins. Une
phase d’hybridation avec les deux amorces spécifiques et une phase d’extension par
l’ADNpol.
  La Taq pol possède une activité 5-3’ exonucléasique mais elle est dénuée d’activité
exonucléasique 3-5. Elle peut insérer des bases qui ne suivent pas la règle classique
d’appariemment et ceci au hasard.
Technique de séquencage de Sanger :
 Cette technique enzymatique est basée sur la copie d’un fragment d’ADN monocaténaire
que l’on désire séquencer par une ADNpol. On utilise du ddNTP qui ne poss`dent pas
d’OH en 3’. L’incorporation de ce ddNTP par l’ADNpol bloque l’allongement de la
molécule d’ADN.
 En présence d’un ADNpol et en excès de dATP, dGTP, dTTP, dCTP, la réation de
réplication commence. On répartit le mélange dans quatres tubes respectivement A,T,C et
G. Les quatre réactions de séquence sont déposées côte à côte sur un gel de
polyacrylamide dans des conditions dénaturantes.
Technique de Maxam Gilbert :

Méthodes de synthèse organique

Chauffage à reflux :
Agent dessiccant

Sortie d’eau

entrée d’eau

Le reflux permet la réalisation d’une réaction à température constante voisine de la température

d’ébullition du solvant, sans consommation notable de ce dernier. Le reflux est l’état d’équilibre
thermique obtenu lorsque le mélange réactionnel est à l’ébullition et que les vapeurs dégagées se
condensent sur les parois froides du réfrigérant. Le corps qui distille est le plus volatil du
mélange, généralement le solvant pur. Il est ainsi constamment recyclé. La nature du réfrigérant
dépend du solvant porté à reflux ; ainsi les réfrigérants les plus grands ou les réfrigérants à double
corps seront choisis lors de l’utilisation de solvants très volatil. Dans certains cas, on ajoute un
agent dessiccant afin d’éviter que la vapeur d’eau atmosphérique ne se mélange aux vapeurs de
solvant. Le ballon ne doit jamais contenir plus de la moitié de son volume en liquide. On y ajoute
toujours quelques morceaux de pierre ponce ou de carborundum avant le début de chauffage. Ces
particules solides régulent l’ébullition en favorisant la formation des bulles gazeuses au sein du
liquide. Le système de chauffage peut-être le bain-marie, le bain d’huile (qui permet d’atteindre
des températures plus élevées) ou le chauffe-ballon. Dans le cas des mélanges hétérogènes, il est
nécessaire d’agiter vigoureusement le milieu réactionnel avec un agitateur magnétique.
Distillation :
La distillation est la principale méthode de séparation des consituants d’un mélange liquide,
utilisant les différences entre leurs températures d’ébullition respectives. Outre la purification des
composés liquides, la distillation est également utilisée pour isoler un produit en cours de
réaction, déplacer un équilibre ou éliminer un solvant.
Évaporateur rotatif :

1. Bain-marie d'eau distillée 2. Thermostat 3. Ballon contenant le solvant à extraire 4. Conduit de vapeur 5. Bouton
pour le réglage de la vitesse de rotation du ballon 6. Réfrigérant 7. Entrée et sortie d'eau du réfrigérant 8. Connexion
à la trompe à eau : notice trompe à eau 9. Ballon récepteur du solvant extrait [Link] de mise sous vide

La distillation simple, c’est-à-dire la condensation dans un récipient séparé de la vapeur

directement émise par un mélange liquide à ébullition, n’est en fait utilisée au laboratoire que
dans l’évaporateur rotatif. Cet appareil permet d’éliminer rapidement les solvants d’une solution.
L'évaporateur rotatif utilise une technique rapide et efficace de séparation : elle permet
l'extraction d'un solvant dont la température d'ébullition est abaissée en travaillant sous pression
réduite. Pour estimer la température d'ébullition d'un solvant sous pression réduite, utiliser les
abaques.
Méthodologie :
 Faire chauffer l'eau déionisée du bain-marie en réglant sa température à l'aide du
thermostat : la température du bain-marie sera adaptée au point d'ébullition sous pression
réduite du solvant à extraire.
 Faire circuler l'eau dans le réfrigérant.
 Déclencher la trompe à eau : le robinet doit être ouvert au maximum de son débit.
 Fixer le ballon, contenant le solvant à extraire, au conduit de vapeur à l'aide d'un clip
adapté.
 Fermer doucement le robinet de mise sous vide pour mettre l'ensemble de l'appareil sous
pression réduite.
 Mettre le ballon en rotation.
 Descendre le ballon pour le mettre en contact avec l'eau du bain-marie.
 Adapter la vitesse de rotation à la vitesse d'évaporation (si l'évaporation est trop
importante, augmenter la vitesse de rotation).
 L'extraction commencée, on aperçoit des gouttes de solvant se condenser sur le réfrigérant
et dans le ballon récepteur. Parfois les vapeurs n'apparaissent pas et ne sont pas
 condensées : elles sont entraînées directement dans la trompe à eau. C'est le cas de solvant
très volatil.
 L'extraction terminée, retirer le ballon du système de chauffage au bain-marie.
 Attendre le refroidissement du ballon.
 Couper la rotation.
 Remettre l'ensemble à la pression atmosphérique en ouvrant doucement le robinet de mise
sous vide.
 Enlever le clip et retirer le ballon dans le prolongement du conduit.
 Poser le ballon bouché sur le valet.
 Fermer la trompe à eau et la circulation d'eau dans le réfrigérant.
 Vider le contenu du ballon récepteur dans le bidon de récupération de déchets chimiques
approprié.
 Eteindre le thermostat du bain-marie et le système de rotation.

Distillation sous pression atmosphérique :

 L’ensemble du montage doit être fermement maintenu, si possible en trois points. On doit
également accrocher le réfrigérant s’il n’est pas solidaire de la tête à distiller.
 Le support élévateur est indispensable car la distillation doit être stoppée à tout moment et
très rapidement. Le montage sera fixé assez haut pour permettre à l’élévateur de jouer
pleinement son rôle.
 Le ballon ne doit pas être rempli au-delà de la moitié de son volume. Il ne sera cependant
pas choisi trop grand car l’augmentation du volume du montage limite le rendement de la
distillation. On placera quelques morceaux de carborundum dans le ballon avant la
distillation afin de réguler l’ébullition.
  La taille de la colonne dépend des produits à séparer. Plus la colonne est haute, meilleur
est la séparation. Si les produits à séparer ont des températures d’ébullition voisines, on
choisira une grande colonne, qu’il conviendra de calorifuger en l’entourant de laine de
verre ou de papier d’aluminium.
 La parti supérieure du montage est consituée d’un raccord col de cygne, qui permet le
transfert des vapeurs pures de la colonne vers le réfrigérant, ainsi que la mesure de leur
température.
 Le thermomètre est fixé soit par l’intermédiaire d’un rodage soir par celui d’un logement
en verre dans lequel on aura soin de placer préalablement quelques gouttes de glycérine
pour assurer le contact thermique.
 Le réfrigérant est généralement de type Liebig.
Distillation sous pression réduite :

Appareil de Dean-Stark :

Filtration sous vide :

Sèchage des produits :

Microbiologie
Postulats de Koch :
1. Le microorganisme doit être présent dans chaque cas de maladie, mais absent des
organismes sains.
2. Le micro-organisme suspect doit être isolé et cultivé en culture pure.
3. La même maladie doit se développer quand le microorganisme isolé est inoculé à un hôte
sain.
4. Le même microorganisme doit de nouveau être isolé de l’hôte malade.
Dépôt de l’échantillon :
Fixation :
Les cellules colorés observées au microscope devraient ressembler le plus possible aux cellules
vivantes. La fixation est le procédé par lequel les structures internes et externes des cellules et des
organismes sont conservées et fixés en place. Elle inactive les enzymes qui peuvent détruire la
morphologie cellulaire et durcit les structures pour qu’elles ne se modifient pas durant la
coloration et l’observation. Ils existe deux types de fixation : la fixation à la chaleur et la fixation
chimique. La fixation à la chaleur se réalise en chauffant doucement le dessous de la lamelle qui
contient l’échantillon. Ceci conserve correctement la morphologie générale mais pas les
structures intracellulaires. La fixation chimique est utilisée pour protéger les structures cellulaires
et la morphologie des organismes plus grands et plus délicats.

Coloration simple :
Les colorants basiques (bleu de méthylène, fuchsine basique, cristal violet, safranine, vert
de malachite) sont cationiques et se fixent aux molécules chargés négativement comme
les acides nucléiques et de nombreuses protéines. La surface des cellules bactériennes est
chargée négativement, aussi ce sont les colorant basiques qui sont le plus souvent utilisés
en bactériologie.
 Les colorants acides sont anioniques et se lient aux structures cellulaires chargés
positivement.
Coloration différentielle Gram :
La coloration Gram a été développée en 1884 par le medecin danois Christiant Gram. Cette
coloration est l’une des techniques de coloration la plus largement utilisée en bactériologie parce
qu’elle permet, en outre, de colorer les microorganismes, mais aussi, de les différencier selon
qu’ils soient Gram + ou Gram -. La coloration Gram se déroule en quatres étapes :

1. Coloration du frottis au cristal violet. On laisse agir pendant une minute. On rince à l’eau.
2. Traitement à l’iode. On laisse agir pendant une minute. On rince à l’eau.
3. Décoloration à l’éthanol ou à l’acétone. On rince à l’eau.
4. Traitement à la safranine. On laisse agir pendant trente secondes. On rince à l’eau.

Figure 1. Étapes de la coloration Gram

Les deux premières étapes de la coloration consiste à colorer en violet le contenu de la bactérie.
Le traitement à l’iode aide à la fixation du cristal violet. La troisième étape est l’étape qui permet
de différencier les bactéries gram+ des bactéries gram-. Les bactéries gram- sont décolorées
tandis que les bactéries gram+ demeure coloré en violet. La décoloration des gram- se produit
parce que la paroi de ces bactéries contiennent qu’une mince couche de peptidoglycane ce qui
permet l’infiltration du décolorant le cytoplasme de la bactérie. L’étape 4 est une contre
coloration qui permet de colorer les bactéries gram- en rose.

Figure 2. Bactéries gram+(à gauche) et gram- (à droite)

Coloration différentielle acido-alcoolo-résistante de Ziehl-Neelsen :

Quelques espèces, en particulier celles du genre Mycobacterium ne fixent pas facilement les
colorants simples et doivent être colorées par un traitement sévères. La coloration de Ziehl-
Neelsen consiste à chauffer l’échantillon avec un mélange de fuchsine basique et de phénol. Dès
que la fuchsine basique est entrée dans la cellule grâce à la chaleur et au phénol, les cellules
acido-alcoolo-résistantes ne sont pas décolorées par lavage à l’aide d’alcool-acide et restent
rouge.

1. Recouvrir le frottis d’un papier filtre imprégné de fuchsine de Ziehl. Chauffer à émission
de vapeur pendant 10 minutes sans sècher le papier. Rincer à l’eau distillée stérile.
2. Tremper la lame deux minutes dans une solution acide. Rincer. Tremper la lame 5
minutes dans une solution d’alcool 90%. Rincer.
3. Colorer la lame 2 minutes au bleu de méthylène. Rincer.

Coloration des spores de Schaeffer-Fulton :

La coloration de Schaeffer-fulton consiste à colorer les endospores par chauffage au vert de
malachite. L’échantillon est ensuite lavé à l’eau et contre-colorés à la safranine.
Culture microbienne :
Milieux sélectifs :
Les milieux sélectifs favorisent la croissance de micro-organismes particuliers.
Milieux différentiels :
Les milieux différentiels sont des milieux permettant de distinguer différents groupes de bactéries
et même d’identifier des micro-organismes sur base de leurs caractéristiques biologiques.
Technique des stries :
Des colonies pures s’obtiennent par la technique des stries. Le mélange microbien est transféré au
bord d’une boîte gélosée à l’aide d’une boucle d’inoculation et étalé sur la surface en quatre
étapes suivant le motif suivant :
À certains moments, des cellules isolées se détachent de la boucle en mouvement et se
développent en colonies séparées.
Technique d’étalement en surface :

Technique d’étalement en profondeur :

L’échantillon de départ est dilué plusieurs fois afin de diminuer la concentration en bactéries. Les
échantillons les plus dilués sont alors déposés sur des géloses. Les cellules isolées poussent en
colonies et peuvent être utilisées pour établir des cultures pures.

Morphologie des colonies :

Milieu nutritif ordinaire :

Ces milieux permettent la culture des bactéries peu exigeantes.

Composition

Formule en g/L d'eau distillée :

Peptone pancréatique d’organe 10 g

Extrait de viande 10 g

Chlorure de sodium 5g

Agar 20 g
 pH = 7.5

Rôles des composants

- peptone : protéine plus ou moins dégradée par action enzymatique avec des peptides et des acides
aminés

source d’azote organique

- extrait de viande : protéines peu dégradées source d’azote organique

glucides source de carbone organique et d’énergie

sels minéraux

vitamines hydrosolubles

Les milieux nutritifs ordinaires conviennent à la culture de bactéries peu exigeantes, dont ils
maintiennent l’aspect morphologique classique macroscopique et microscopique. Ils peuvent
servir de base aux milieux enrichis. Parmi les milieux nutritifs ordinaires, on compte : l’eau
peptonée, bouillon nutritif ou peptonée et la gélose nutritive. Ce sont des milieux contenant de
l’eau, de l’extrait de viande et du peptone permettant la croissance de la grande majorité des
bactéries.
Milieu de sang :

Gélose columbia + 0.5 mL sang de mouton défibriné

Principe

C’est un milieu riche d’autant plus par la présence de sang.

Technique

Préparation de la gélose au sang :

- liquéfier au bain-marie bouillant la gélose (desserrer les bouchons des tubes).
- la maintenir à 45°C.
- à l’aide d’une pipette Pasteur, prélever le sang stérilement.
- déposer dans la boite 20 gouttes de sang, bien réparties.
- rajouter par-dessus, la gélose en surfusion.
- homogénéiser par des mouvements lents de rotation.
- laisser sécher à l’étuve.
Ensemencer.

Lecture

Hémolyse b : zone claire d’hémolyse totale de diamètre 3-4 mm

entourant les colonies.
Hémolyse a : zone floue et granuleuse, verdâtre de 1 à 2 mm de
diamètre

C’est un milieu d’isolement enrichi sur lequel les Streptocoques se développent bien. Il permet, la
lecture du caractère hémolytique des bactéries.
Milieu MacConkey :

La gélose MacConkey est un milieu complexe de type sélectif pour l'isolement des bacilles
Gram- Salmonella et Shigella ainsi que des bactéries coliformes dans les eaux, les produits
alimentaires, les produits pharmaceutiques et biologiques. Le milieu contient un critère de
différenciation, le lactose, sucre dont on veut étudier la fermentation : colonies rouges entourées
d’un hâlo opaque de la même couleur : lactose+ ; colonies jaunes ou incolores : lactose-. Si la
bactérie ensemencée fermente le lactose, le milieu devient rouge, par virage du rouge neutre, du
fait de l’acidification du milieu.
Formule en g/L d'eau distillée :

Peptone 20
Lactose 10
Sels biliaires 1.5
Cristal violet 0.001
Rouge neutre 0.05
Chlorure de sodium 5
Agar 15

pH = 7,1

Rouge neutre
Milieu sélectif pour l'isolement des bacilles Gram - Salmonella et Shigella ainsi que des bactéries coliformes dans les eaux, les produits
alimentaires, les produits pharmaceutiques et biologiques .

è Ce milieu contient deux inhibiteurs de la flore Gram+, les sels biliaires et le cristal violet.

è Le milieu contient un critère de différenciation, le lactose dont l’utilisation est révélée par l’indicateur coloré du milieu, le rouge
neutre.

Il vire au rouge en milieu acide.

Isolement par la méthode des cadrans.

Incuber 18 à 24 h à 37 °C.

Lecture

Colonies rouges entourées d’un hâlo opaque de la même couleur du à la précipitation des sels biliaires:
lactose+

Colonies jaunes ou incolores : lactose-

Milieu Chapman-Stone :

Sa composition, en grammes par litre d'eau distillée, est la suivante :

Peptones 11,0 g
Extrait de viande 1,0 g
Chlorure de sodium 75 g
Mannitol 10,0 g
Rouge de phénol 0,025 g
Agar 15 g
Eau distillée (qsp) 1000 mL

Rouge de phénol
 L'utilisation du mannitol se traduira par une acidification du
milieu, provoquant le virage au jaune de l'indicateur de pH.
Les colonies mannitol + sont entourées d’une auréole jaune.
L'utilisation du mannitol est un caractère discriminatif important
dans le genre Staphylococcus, Staphylococcus aureus étant mannitol +.

Ne pas confondre la pigmentation des colonies et le virage de l’indicateur coloré.

Ainsi des colonies pigmentées en jaunes et mannitol + : forte suspicion de S. aureus

Ce milieu contient un inhibiteur : fortes concentrations en chlorure de sodium (75 g.L -1), ce qui permet un
isolement sélectif de Staphylococcus tolérant les fortes concentrations en NaCl.
On peut étudier la fermentation du mannitol par virage au jaune de l’indicateur coloré, le rouge de phénol,
autour des colonies.
L'ensemencement doit être massif, en stries serrées ou par inondation.
Ne pas sécher le milieu à l’étuve avant l’ensemencement : la déssication du milieu pourrait entraîner une
augmentation de la concentration en NaCl et rendre le milieu trop inhibiteur.

Le milieu de Chapman-Stone est un milieu sélectif qui permet l’isolement sélectif des halophiles,
comme les Staphylococcus, sur la base d’une tolérance à forte teneur en NaCl.

Milieu Mueller-Hinton :

(formule en grammes par litre d'eau distillée)

Infusion de viande de bœuf 300,0

Hydrolysat de caséine 17,5
Amidon 1,5
Agar 17,0
Eau distillée (qsp 1L
Cette gélose permet de tester l'action des antibiotiques sur les bactéries.
Milieu Hektoen :
 La gélose Hektoen est un milieu d'isolement des Salmonelles et des Shigelles, bien que de nombreuses
bactéries à Gram négatif puissent se développer sur ce milieu. L'identification d'entérobactéries pathogènes repose
sur la non utilisation des glucides présents dans le milieu. L'ensemencement se fait par les techniques habituelles.
Deux indicateurs sont présents dans le milieu :- le bleu de bromothymol (indicateur de pH) - la fuschine acide (qui
se colore en présence d'aldéhyde. trois types de glucides : la salicine (qui est un hétéroside), le saccharose et le
lactose. La production d'H2S à partir de thiosulfateColonies saumon : Escherichia, Levinea, Citrobacter diversus,
Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Yersinia Colonies saumon à centre noir : Citrobacter freundii, Proteus vulgaris,
Colonies bleu-vert à centre noir : Suspicion de Salmonella, à différencier de Proteus mirabilis Colonies bleu-vert ou
vertes : Suspicion de Shigella ou de Salmonella En g par litre d'eau distillée

Protéose peptone 12g

Extrait de levure 3g
Chlorure de sodium 5g
Thiosulfate de sodium 5g
Sels biliaires 9g
Citrate de fer III et d'ammonium 1,5g
Salicine 2g
Lactose 12g
Saccharose 12g
Fuschine acide 0,1g
Bleu de bromothymol 0,065g
Agar 14g
Eau distillée (qsp) 1000mL

Bleu de bromothymol

Ce milieu contient trois types de glucides : la salicine (qui est un hétéroside), le saccharose et le lactose.
L'orientation de l'identification des colonies isolées est fondée sur l'attaque de ces trois glucides, les salmonelles et
les shigelles n'attaquant aucun de ces glucides.
Un autre caractère biochimique que l'on peut suivre sur ce milieu est la production d'H2S à partir de
thiosulfate. Elle se traduit par l'obtention de colonies à centre noir, coloration due à la formation de sulfure de fer. Ce
caractère est important car il permet de différencier les Salmonella (H2S +) des Shigella (H2S -).

Deux indicateurs sont présents dans le milieu :

- le bleu de bromothymol (indicateur de pH)
- la fuschine acide (qui se colore en présence d'aldéhyde. On observe alors une teinte saumonée si
la souche utilise un ou plusieurs des glucides présents).
Colonies saumon Colonies saumon à Colonies bleu-vert Colonies bleu-vert
centre noir à centre noir ou vertes
Escherichia, Levinea, Citrobacter Suspicion de Suspicion de
Citrobacter diversus, freundii, Proteus Salmonella, à Shigella ou de
Klebsiella, vulgaris, différencier de Salmonella
Enterobacter, Serratia, Proteus mirabilis
Yersinia

Milieu SS :

Gélose Salmonella-Shigella. Milieu sélectif permettant l’isolement d'entérobactéries pathogènes. Il est très
utilisé pour la recherche de Salmonella dans les selles et les denrées alimentaires peu pour les Shigella car trop
sélectif. Isolement par la méthode des cadrans. Incuber 18 à 24 h à 37°C. Le milieu contient 3 inhibiteurs - sels
biliaires, - vert brillant - forte concentration en citrate de sodium. Ceux-ci empêchent la pousse de toutes bactéries
Gram+, et rendent difficile la croissance des bactéries Gram - autres que Salmonella et Shigella. Le milieu contient du
lactose pouvant être fermenté. Le milieu contient du thiosulfate pouvant donner du H 2S. colonies rouges : lactose +
colonies incolores : lactose– colonies à centre noir : H2S + Formule en g/L d'eau distillée :

Extrait de viande de bœuf 5

Bio-polytone 5
Sels biliares 8,5
Lactose 10
Citrate de sodium 8,5
Thiosulfate de sodium 8,5
Citrate ferrique 1
Vert brillant 0,330 mg
Rouge neutre 0,025
Agar 13,5
pH = 7,0

Rouge neutre
 Le milieu contient 3 inhibiteurs : sels biliaires, vert brillant et forte concentration en citrate de
sodium. Ceux-ci empêchent la pousse de toutes bactéries Gram+, et rendent difficile la croissance des bactéries
Gram- autres que Salmonella et Shigella.
Le milieu contient du lactose dont la fermentation est révélée par le virage de l’indicateur

coloré, le rouge neutre, à sa teinte acide.

Si la bactérie ensemencée fermente le lactose, le milieu devient rouge, par virage du rouge neutre, du fait de l’acidification du
milieu.

Le milieu contient du thiosulfate à partir duquel les bactéries qui en sont capables peuvent

produire H2S, qui sera révélé par le citrate ferrique.

Si la bactérie ensemencée produit H2S, en présence du fer III, un précipité noir se forme au centre de la colonie.

Isolement par la méthode des cadrans.

Incuber 18 à 24 h à 37°C.

Milieu EBM :

Milieu Eosine Bleu de Méthylène. Milieu d'isolement des bacilles Gram-. Il est très utilisé pour l’isolement des
coliformes. Isolement par la méthode des cadrans. Ce milieu contient deux colorants, l’éosine et le bleu de
méthylène qui inhibent la majeure partie de la flore Gram+ (sauf Streptocoques D). Bien que les Entérobactéries
lactose - puissent s’y développer, la culture des Entérobactéries lactose + y est favorisée. Le milieu contient un
critère de différenciation, le lactose colonies violettes : semi-bombées de 2 à 3mm de diamètre avec éclat
métallique, centre sombre : E. coli très bombées muqueuses de diamètre 5 mm centra gris marron sans reflet
Klebsiella colonies grisâtres : - 1 à 2 mm de diamètre transparentes, grises ambrées : Salmonella, Shigella. - 2 mm
de diamètre, grisâtres avec une pellicule autour de la colonie : Proteus morganii punctiformes et grisâtres :
Enterococcus.
Formule en g/L d'eau distillée :

Peptone 10
Lactose 10
 Eosine 0,4
Bleu de méthylène 0,065
Hydrogénophosphate de potassium 2
Agar 15
pH = 6,8

Milieu Eosine Bleu de Méthylène.

Milieu d'isolement des bacilles Gram-.

Il est très utilisé pour l’isolement des coliformes.

è Peptone de viande ou de gélatine : base nutritive ordinaire.

è Ce milieu contient deux colorants, l’éosine et le bleu de méthylène qui inhibent la majeure

partie de la flore Gram+ (sauf Streptocoques D). Bien que les Entérobactéries lactose - puissent s’y

développer, la culture des Entérobactéries lactose + y est favorisée.

è Le milieu contient un critère de différenciation, le lactose .

 lactose + : colonies violet foncé

 lactose - : colonies grisâtres ou incolores

è Agar : permet d’avoir un milieu solide

è Eau indispensable à tout milieu de culture.

 colonies violettes :
semi-bombées de 2 à 3mm de diamètre avec éclat métallique, centre sombre : E. coli

très bombées muqueuses de diamètre 5 mm centra gris marron sans reflet Klebsiella

 colonies grisâtres :
1 à 2 mm de diamètre transparentes, grises ambrées : Salmonella, Shigella.
2 mm de diamètre, grisâtres avec une pellicule autour de la colonie : Proteus morganii
punctiformes et grisâtres : Enterococcus.

Milieu Cled :
 Le milieu CLED (Cystine Lactose Electrolyte Déficient) est un milieu non sélectif, très utilisé dans l'étude des
bactéries contenues dans l'urine. Etant un milieu non sélectif de nombreuses bactéries, tant Gram + que Gram -,
pourront se développer. L’absence d’électrolytes (pas de NaCl) limite le phénomène d’envahissement par les
Proteus. La lecture s'effectue après 18 à 24 heures d'incubation à 37°C. lactose + apparaissent jaunes lactose –
apparaissent bleues vertes

Le milieu CLED (Cystine Lactose Electrolyte Déficient) est un milieu non sélectif, très utilisé dans l'étude
des bactéries contenues dans l'urine. Etant un milieu non sélectif de nombreuses bactéries, tant Gram + que Gram -,
pourront se développer.
L’absence d’électrolytes (pas de NaCl) limite le phénomène d’envahissement par les Proteus.
Peptones 4g
Extrait de viande 3g
Hydrolysât trypsique de caséine 4g
L-cystine (la L-cystine est un acide aminé soufré) 0,128g
Lactose 10g
Bleu de Bromothymol (indicateur de pH) 0,002g
Agar 15g
Eau distillée (qsp) 1L

La lecture s'effectue après 18 à 24 heures d'incubation à 37°C.

Bleu de Bromothymol (indicateur de pH)

Milieu BCP :
C’est un milieu utilisé pour la détection et l’isolement des entérobacteriacées dans l’eau, les produits
alimentaires, l’urine et les selles Ce milieu facilite la différenciation des colonies par le caractère
lactose. Il inhibe l’envahissement de la surface de la boite par des nappes de Proteus car il ne contient
pas d'électrolytes. C’est un milieu non sélectif qui est utilisé pour l’isolement de nombreuses espèces
n’appartenant pas aux entérobactéries. C’est un milieu contenant une base nutritive ordinaire
permettant la pousse des bactéries non exigeantes. Il contient un critère de différenciation : la
fermentation du lactose révélée par le virage en milieu acide de l’indicateur coloré de pH, le
bromocrésol pourpre. Il est déficient en électrolytes : absence d'ions minéraux. Isolement 18 à 24 h à
37°C - Non selectif - Dépourvu en électrolyte - Bromocrésol pourpre - Espèces n’appartenant pas aux
entérobactéries - Fermentation du lactose Colonies bleues : bactéries lactose – Colonies jaunes :
bactéries lactose +
Peptone 5g
Extrait de viande 3g
Lactose 10g
Agar 15g
Pourpre de bromocrésol 0,025g
Eau qsp 1L
pH7

Pourpre de bromocrésol

Réaliser un isolement.

Incuber 18 à 24 h maximums à 37°C.

Principe

C’est un milieu non sélectif qui est utilisé pour l’isolement de nombreuses espèces n’appartenant pas aux
entérobactéries.

C’est un milieu contenant une base nutritive ordinaire permettant la pousse des bactéries non exigeantes.

Il contient un critère de différenciation : la fermentation du lactose révélée par le virage en milieu acide de
l’indicateur coloré de pH, le bromocrésol pourpre.

Il est déficient en électrolytes : absence d'ions minéraux.

Lecture

La fermentation du lactose se traduit par le virage du bromocrésol pourpre à sa teinte acide jaune.
 Colonies jaunes ® bactéries lactose +
Colonies bleues ® bactéries lactose –

Milieu Baird Parker :

Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus Ce milieu contient une base nutritive riche. Il contient des
accélérateurs de la croissance : le pyruvate de sodium et le glycocolle. Isolement 18 à 24 h à 37°C Il contient 2
inhibiteurs :le chlorure de lithium le tellurite de potassium Contient 3 critères de différenciation : réduction du
tellurite protéolyse des protéines du jaune d'œuf hydrolyse par une lécithinase des lécithines du jaune d'œufen
tellure noir halo clair autour de la colonie liseré blanc opaque autour de la colonie

Le tellurite et le jaune d'œuf sont ajoutés au milieu au moment de l’emploi.

Formule en g/L d'eau distillée :

Bio-Trypcase 10
Extrait de viande de bœuf 5
Extrait de levure 2
Chlorure de lithium 5
Pyruvate de sodium 10
Glycocolle 12
Tellurite de potassium 1 mL
Emulsion de jaune d'œuf à 10 % 1 mL
 Agar 15

pH = 7,2
Ce milieu contient une base nutritive riche.
Il contient des accélérateurs de la croissance : le pyruvate de sodium et le glycocolle
Il contient 2 inhibiteurs : le chlorure de lithium et le tellurite de potassium.
Il contient 3 critères de différenciation :
- réduction du tellurite en tellure noir
- protéolyse des protéines du jaune d'œuf Þ halo clair autour de la colonie
- hydrolyse par une lécithinase des lécithines du jaune d'œuf Þ liseré blanc opaque autour de la
colonie

Lécithine + H20 diglycérides + choline

S. aureus donne des colonies :

- noires
- brillantes, convexes
- de 1 à 2 mm de diamètre
- entourées d'un halo clair.
La plupart des autres espèces de staphylocoques sont inhibées ou ne produisent pas de colonies
caractéristiques en 24 heures.
Les microcoques, Bacillus et quelques levures peuvent pousser sur ce milieu.

Milieu BEA :

Milieu d'isolement sélectif des Streptocoques D (entérocoques et non entérocoques). Le milieu présenté en boite de
Pétri est destiné à un isolement. Le milieu présenté en tube est à beurrer avec une culture pure car il entre dans la
galerie d’identification des coques gram + de culture facile. C’est un milieu sélectif des streptocoques peu
[Link] contient 2 inhibiteurs : - la bile de bœuf- l’azide de sodium. l’esculine révélée par le citrate de fer
ammoniacal Pousse de petites colonies sur le milieu Streptocoques D Colonies entourées d'un halo noir : esculine
+

Formule en g/L d'eau distillée :

Bio-Trypcase 17
Bio-Thione 3
Extrait de levure 5
Bile de bœuf 10
Chlorure de sodium 5
Citrate de sodium 1
Esculine 1
Citrate de fer ammoniacal 0.5
Azide de sodium 0.25
 Agar 13.5

pH = 7,1

Ce milieu contient une base nutritive riche grâce aux 2 peptones et à l’extrait de levure.
Il contient 2 inhibiteurs : la bile de bœuf et l’azide de sodium. Ces 2 inhibiteurs permettent de sélectionner
la culture des streptocoques du groupe D.
Il contient un critère de différenciation : l’hydrolyse de l’esculine révélée par le citrate de fer ammoniacal :

Esculine + H2O ® Glucose + Esculétine

¯ citrate de fer ammoniacal
Coloration noire
Les bactéries esculines + présentent des colonies noires.
C’est un milieu sélectif des streptocoques peu exigeants.

Technique

Le milieu présenté en boite de Pétri est destiné à un isolement.

Le milieu présenté en tube est à beurrer avec une culture pure car il entre dans la galerie d’identification des
coques gram + de culture facile.

Lecture :

Pousse de petites colonies sur le milieu ® Streptocoques D

Colonies entourées d'un halo noir ® esculine +

Milieu Slanetz :

Milieu de dénombrement des entérocoques en microbiologie alimentaire. Son emploi est surtout réservé aux eaux,
après filtration. Isolement Filtration. Il contient un inhibiteur des gram -, qui sélectionne les Streptocoques : l’azide
de sodium. le TTC qui lors de sa réduction donne une coloration des bactéries en rouge. Les Entérocoques donnent
des colonies de taille moyenne, roses ou rouges. Les Bacillus peuvent pousser et donner le même aspect de colonies,
mais de taille plus importante.
 Milieu de dénombrement des entérocoques en microbiologie
alimentaire. Son emploi est surtout réservé aux eaux, après filtration.

Composition

Formule en g/L d'eau distillée :

Peptone 20
Glucose 2
Azide de sodium 0.4
TTC triphényltétrazolium 0.1
Hydrogénophosphate de sodium 4
Agar 10

pH = 7,2

Principe

Ce milieu contient un critère de différenciation : le TTC (voir gélose lactosée au TTC et Tergitol 7) qui lors
de sa réduction donne une coloration des bactéries en rouge.
Il contient un inhibiteur des gram -, qui sélectionne les Streptocoques : l’azide de sodium.

Lecture

Les Entérocoques donnent des colonies de taille moyenne, roses ou

rouges.
Les Bacillus peuvent pousser et donner le même aspect de colonies,
mais de taille plus importante.

R : si obtention de colonies rouges violacées en 18 à 24 h, conclure E. faecalis.

Milieu cétrimide :

La gélose au cétrimide est un milieu sélectif, qui permet l'isolement des Pseudomonas et notamment de
[Link]. Ce milieu gélosé est relativement pauvre, et contient un antiseptique: le cétrimide (bromure de N-
cétyl-N, N, N-triméthylammonium). Ce milieu, proche du milieu King A, favorise aussi la production de pigments
par [Link]. Ensemencer la surface du milieu au moyen de l'anse. Incuber durant 24 heures à 37°C, voire
même de préférence à 42°C (l'incubation à 42°C permet un isolement spécifique de [Link]). Sur ce milieu de
très nombreuses bactéries sont inhibées de par la présence de l'antiseptique cétrimide(bromure de N-cétyl-N, N, N-
triméthylammonium)., ainsi que par la présence de l'antibiotique acide nalidixique (inhibiteur de nombreuses
bactéries à Gram négatif). –pyoverdine -pyocyanine Milieu bleu : pyocyanineMilieu jaune- vert : pyoverdine

La gélose au cétrimide est un milieu sélectif, qui permet l'isolement des

Pseudomonas et notamment de [Link]. Ce milieu gélosé est relativement
pauvre, et contient un antiseptique: le cétrimide (bromure de N-cétyl-N, N, N-
triméthylammonium). Ce milieu, proche du milieu King A, favorise aussi la
production de pigments par [Link].

Composition

(En grammes par litre d'eau distillée)

Peptone 20 g
Sulfate de potassium 10 g
Chlorure de magnésium 3g
Hydrogénophospate de potassium 0,3 g
Cétrimide 0,2 g
Acide nalidixique 0,015 g
Agar 13 g
Eau distillée (qsp) 1000 mL

Technique

Ensemencer la surface du milieu au moyen de l'anse. Incuber durant 24 heures à 37°C, voire même de
préférence à 42°C (l'incubation à 42°C permet un isolement spécifique de [Link]).

Lecture

Sur ce milieu de très nombreuses bactéries sont inhibées de par la présence de

l'antiseptique cétrimide, ainsi que par la présence de l'antibiotique acide nalidixique
(inhibiteur de nombreuses bactéries à Gram négatif). A 37°C se développent
[Link], et éventuellement, [Link], [Link] et [Link]. A 42°C il y a
développement presque exclusif de [Link].

Milieu bleu : pyocyanine

Milieu jaune- vert : pyoverdine

Milieu Sabouraud :
La gélose de Sabouraud constitue un milieu classique pour la culture, l'isolement et l'identification des levures et des
moisissures saprophytes ou pathogènes. Elle est recommandée essentiellement pour l'isolement des moisissures dans
les prélèvements peu chargés en bactéries, les contrôles de stérilité des produits pharmaceutiques, cosmétiques ou
alimentaires, la culture des moisissures en vue de réaliser leur identification. Dans le cas de prélèvements fortement
contaminés, il est préférable d'utiliser la gélose Sabouraud + chloramphénicol . - Transférer l'échantillon à analyser
sur le milieu. - Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un étaleur en verre stérile. - Incuber à 20 - 25°C de 3 à 5 jours.
L'ajout de triphényltétrazolium à raison de 100 mg par litre en fait un milieu de différenciation pour les Candida.

La gélose de Sabouraud constitue un milieu classique

pour la culture, l'isolement et l'identification des levures et des
moisissures saprophytes ou pathogènes.
Elle est recommandée essentiellement pour l'isolement
des moisissures dans les prélèvements peu chargés en bactéries,
les contrôles de stérilité des produits pharmaceutiques,
cosmétiques ou alimentaires, la culture des moisissures en vue de
réaliser leur identification.
Dans le cas de prélèvements fortement contaminés, il est
préférable d'utiliser la gélose Sabouraud + chloramphénicol.

Composition

En g par litre de milieu :

Peptone pepsique de viande 10

Glucose 35
Agar agar 15

pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 5, 7 +/- 0,2.

500 g de poudre permettent de préparer 8,3 litres de milieu.

Préparatlon

- Mettre en suspension 60 g de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau distillée ou déminéralisée - Porter à
ébullition lentement en agitant jusqu'à dissolution complète
- Répartir en tubes ou en flacons.
- Stériliser à l'autoclave à 120°C pendant 15 minutes.

Tout chauffage excessif du milieu conduit à la dénaturation de l'agar en pH acide et par conséquent à
l'obtention d'un milieu trop mou.

Principe
 La gélose de Sabouraud est un milieu peptoné et glucosé permettant la croissance des levures et des
moisissures, et en particulier des dermatophytes.

La gélose de Sabouraud peut servir de base à la préparation de milieux spéciaux par addition d'antibiotiques,
de sang ou de vitamines.
L'ajout de triphényltétrazolium à raison de 100 mg par litre en fait un milieu de différenciation pour les
Candida.

Technique

- Transférer l'échantillon à analyser sur le milieu.

- Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un étaleur en verre stérile.
- Incuber à 20 - 25°C de 3 à 5 jours.

Milieu Sabouraud plus chloramphenicol :

- Transférer l'échantillon à analyser sur le milieu.- Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un étaleur en verre stérile. -
Incuber à 20-25°C de 3 à 5 jours. Chloramphénicol Recherche des champignons

La gélose de Sabouraud constitue un milieu classique pour la culture, l'isolement et l'identification des
levures et des moisissures saprophytes ou pathogènes.

Elle est recommandée essentiellement pour l'isolement des moisissures

dans les prélèvements peu chargés en bactéries, les contrôles de stérilité des
produits pharmaceutiques, cosmétiques ou alimentaires, la culture des
moisissures en vue de réaliser leur identification.

Dans le cas de prélèvements fortement contaminés, il est préférable

d'utiliser la gélose Sabouraud + chloramphénicol .
Composition

Formule en g/L d'eau distillée :

Peptone pepsique de viande 10

Glucose 20

Chloramphénicol 0.5

Agar 15

pH = 7,0

pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C: 5, 7 +/- 0,2.

500 g de poudre permettent de préparer 8,3 litres de milieu.

Principe

La gélose de Sabouraud est un milieu peptoné et glucosé permettant la croissance des levures et des
moisissures, et en particulier des dermatophytes.

La gélose de Sabouraud peut servir de base à la préparation de milieux spéciaux par addition
d'antibiotiques, de sang ou de vitamines.

L'ajout de triphényltétrazolium à raison de 100 mg par litre en fait un milieu de différenciation pour les
Candida.

Ensemencement

- Transférer l'échantillon à analyser sur le milieu.

 - Etaler l'inoculum en surface à l'aide d'un étaleur en verre stérile.

- Incuber à 20 - 25°C de 3 à 5 jours.

Lecture

Milieu CIN :

Milieu d'isolement sélectif des Streptocoques D (entérocoques et non entérocoques). Isolement. 2 inhibiteurs permet
de sélectionner la culture des streptocoques du groupe D.:- la bile de bœuf et l’azide de sodium. l’esculine révélée
par le citrate de fer ammoniacal Pousse de petites colonies sur le milieu Streptocoques DColonies entourées d'un
halo noir : esculine +

Ce milieu est sélectif des Yersinia enterolitica, il permet l’isolement de

ces germes à partir des matières fécales ou à partir d’un aliment.

Composition

Formule en g/L d'eau distillée :

 biopolytone 3

extrait de levure 20

mannitol 1

sels biliaires 1

chlorure de sodium 2

pyruvate de sodium 0.010

sulfate de magnésium 0.030

rouge neutre 0.010

cristal violet 0.015

cefsulodine 0.004

irgasan 0.0025

novobiocine 13.5

agar

eau distillée QSP 1L

pH = 7.4

Rouge neutre

Principe

Ce milieu contient des inhibiteurs des bactéries Gram+ et de la plupart des bactéries Gram- :

- les sels biliaires, le cristal violet (inhibiteur des Gram+)

- irgasan, cefsulodine et la novobiocine (inhibiteur des gram – sauf Yersinia enterocolitica)

On peut étudier la fermentation du mannitol grâce à un colorant : le rouge neutre.

Technique

Réaliser un isolement classique.

Ensemencer le milieu 24 à 48 h à 22 à 32°C.

Lecture

Les Yersinia cultivent sous forme de petites colonies de 1 mm de

diamètre, à centre rouge entourées d’une zone translucide.

Après 48 h, les colonies sont facilement visibles et peuvent être entourées d’une
zone de précipitation due aux sels biliaires.

Colonies rouges : mannitol +

Colonies jaunes : mannitol -

Milieu de lait :

Faire une strie centrale à la surface du milieu. Incuber 24H à 7jours à la température désirée.’hydrolyse de la caséine
L’hydrolyse de la caséine se traduit par l’apparition d’une zone claire autour de la culture.
 Mise en évidence de l’hydrolyse de la caséine, protéine du lait.

Composition

Gélose nutritive additionnée à 45 °C d’un volume de lait stérile.

Technique

Milieu présenté en boîte.

Faire une strie centrale à la surface du milieu.
Incuber 24H à 7jours à la température désirée.

Lecture

L’hydrolyse de la caséine se traduit par l’apparition d’une zone claire autour de la culture.

Caséinase - Caséinase +

Milieu Amidon :

Ensemencer par une strie à la surface du milieu. Incuber un à huit jours à la température désirée. l’hydrolyse de
l’amidon. Hydrolyse mise en évidence par l’ajout d’une solution iodée : une coloration bleu-rouge due à l’amidon,
montre qu’il n’a pas été hydrolysé la disparition de cette coloration montre son hydrolyse.

Recherche de l’hydrolyse de l’amidon.

Composition

Gélose Nutritive additionnée de 1% d’amidon de pomme de

terre.

Technique

Milieu présenté en boite.

Ensemencer par une strie à la surface du milieu.
Incuber un à huit jours à la température désirée.

Principe

Les bactéries qui produisent une amylase sont capables d’hydrolyser l’amidon :

Amylase
Amidon maltose + glucose

Cette hydrolyse est mise en évidence par l’ajout d’une solution iodée :
- une coloration bleu-rouge due à l’amidon, montre qu’il n’a pas été hydrolysé
- la disparition de cette coloration montre son hydrolyse.

Lecture

Faire la lecture quand la pousse est suffisante.

Deux possibilités pour la lecture :

* Recouvrir le milieu de lugol : l’iode et l’amidon donnent une coloration bleue-violette. Seule la zone où
l’amidon a été hydrolysé ne se colore pas.
Un halo clair autour de la culture après addition de lugol indique une hydrolyse de l’amidon.
R : faire un témoin avec une boîte non ensemencée.

Avant ajout de lugol Après ajout de lugol test - Après ajout de lugol test +
 * Recouvrir le milieu par de l’alcool éthylique à 95°C : le milieu s’opacifie sauf dans la zone où l’amidon a
été hydrolysé.
Un halo clair autour de la culture indique une hydrolyse de l’amidon.

Milieu Œuf :

Faire une strie à la surface du milieu, ou éventuellement des touches. Incuber pendant 24 h ou plus à 37°C. La
lécithinase l'action de la lécithinase libère de la choline soluble et un diglycéride peu soluble qui précipite dans le
milieu provoquant un hâlo autour de la culture

De nombreux micro-organismes peuvent hydrolyser les phospholipides.

La prolifération de ces microorganismes dans des aliments riches en lipides (lait
et dérivés, jaune d’œuf, viandes) est à l'origine d'altérations de ces aliments. La
recherche et l'identification des bactéries lipolytiques ont un intérêt tout
particulier en microbiologie alimentaire.
La lécithine purifiée étant très coûteuse on utilise comme source de
lécithine le jaune d’œuf, jaune d’œuf qui est incorporé dans une gélose
ordinaire.

Principe

La lécithinase est recherchée : l'action de la lécithinase libère de la choline soluble et un diglycéride peu
soluble qui précipite dans le milieu provoquant un hâlo autour de la culture.

Composition

Gélose Nutritive additionnée de jaune d’œuf stérile dilué au 1/2 en eau physiologique (concentration finale
10% soit 2,5 mL pour 25 mL de milieu).

Technique

Milieu présenté en boite.

Faire une strie à la surface du milieu, ou éventuellement des touches.
Incuber pendant 24 h ou plus à 37°C.

Milieu Drigalski :
Milieu sélectif permettant l’isolement des bactéries Gram - non exigeantes. Il est utilisé pour l’isolement des germes
urinaires et pour la coproculture Isolement par la méthode des cadrans. Contient deux inhibiteurs de la flore Gram + : -
le désoxycholate de sodium - le cristal violet. Fermentation du lactose Les colonies de bactéries lactose + sont
jaunes. Celles de bactéries lactose – sont bleues.

Formule en g/L d'eau distillée :

Peptone 15
Extrait de viande 3
Extrait de levure 3
Lactose 15
Désoxycholate de sodium 1
Thiosulfate de sodium 1
Cristal violet 0,005
Bleu de bromothymol 0,02
Agar 1L
pH = 7,4
Ce milieu contient un critère de différenciation, le lactose dont la fermentation est révélée par

le virage de l’indicateur coloré, le bleu de bromothymol, à sa teinte acide.

ð si la bactérie ensemencée fermente le lactose, le milieu devient jaune, par virage du bleu de bromothymol, du fait
de l’acidification du milieu.

Le milieu contient deux inhibiteurs de la flore Gram+, le désoxycholate de sodium et le cristal violet.

Ensemencement

Isolement par la méthode des cadrans.

Lecture
 Les colonies de bactéries lactose + sont jaunes.
Celles de bactéries lactose – sont bleues.

Milieu TCBS :

La gélose TCBS est un milieu sélectif, préconisé par l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé) pour la recherche
et l'isolement des vibrions pathogènes présents dans les prélèvements poly microbiens. La forte concentration en bile
et en citrate, associée à un pH élevé (pH = 8,6) permet l'élimination de nombreuses bactéries. La croissance des
Entérobactéries et des Enterococcus n'est cependant que ralentie. Ensemencer à partir de la selle. Incuber 24 heures à
37°C. La forte concentration en bile et en citrate, associée à un pH élevé (pH = 8,6) permet l'élimination de
nombreuses bactéries Recherche et l'isolement des vibrions pathogènes présents dans les prélèvements poly
microbiens - Colonies jaunes (Vibrions saccharose +) - Colonies vertes (Vibrions saccharose -) - Petites colonies
jaunes - Petites colonies vertes Colonies à centre noir : colonies H2S +.

Formule en g/L d'eau distillée :

Peptone de caséine 5,0 g

Peptone de viande 5,0 g
Citrate de sodium 10,0 g
Citrate de fer III 1,0 g
Bile de bœuf desséchée 8,0 g
Thiosulfate de sodium 10,0 g
NaCl 10,0 g
Saccharose 20,0 g
Bleu de bromothymol 0,04 g
Bleu de thymol 0,04 g
Agar 14,0 g
Eau distillée (qsp) 1000 mL

La principale source de carbone est le saccharose (dioloside : glucose-fructose). L'utilisation du saccharose se traduit
par une diminution du pH, et par le virage de l'indicateur de pH, qui vire au jaune. Les colonies saccharose positives
apparaissent donc jaunes. La présence de thiosulfate et de citrate de fer III permet d'autre part de suivre la production
d'H2S.

Colonies jaunes Colonies vertes Petites colonies jaunes Petites colonies vertes
Vibrions Vibrions saccharose - : Escherichia coli Enterococcus faecalis
saccharose + :[Link] [Link] Klebsiella
V. alginolyticus [Link] Shigella
V. fluvialis [Link] [Link]
[Link]
[Link]

Milieu ADN :

Milieu utilisé pour la mise en évidence de la DNase thermo-résistante de Staphylococcus (Microbiologie alimentaire
et médicale).Percer la gélose de [Link] avec quelques gouttes d'un bouillon creurcervelle ensemencé
auparavant et bouilli 10 minutes. Incuber 4 heures à 37 oC. la DNase thermo résistante de Staphylococcus halo rose
signant la DNase autour des trous percés sur le fond bleu de la gélose

ADN 0,3 g
Bleu de toluidine à 0,1 [Link]-3 3 ml
Tampon TRIS pH 9 [Link]-3 1L
Chlorure de calcium 10 [Link]-3 1 mL
Chlorure de sodium 10 g
Agar 10

pH=9

DNAse + DNAse -

Milieu lactosée au désoxycholate 0.1% :

 Milieu de dénombrement des coliformes en microbiologie alimentaire (analyse des eaux et des aliments). -
Isolement2 inhibiteurs des bactéries Gram+ à faible concentration :- le désoxycholate (sels biliaires) - le citrate de
sodium. le lactose Colonies rouges  bactéries lactose+ , coliformes Colonies incolores  bactéries lactose- Milieu de
dénombrement des coliformes en microbiologie alimentaire (analyse des eaux et des aliments). Il sera incubé à 30°C
pour la recherche des coliformes totaux et à 44°C pour la recherche des coliformes thermotolérants.

Formule en g.L-1 d'eau distillée :

Peptone 10
Lactose 10
Citrate de sodium 1
Rouge neutre 0.03
Désoxycholate de sodium 1
Chlorure de sodium 5
Hydrogénophosphate de potassium 2
Agar 13

pH = 7,3
Colonies rouges ® bactéries lactose+ Þ coliformes
Colonies incolores ® bactéries lactose-

Milieu TTC tergicol :

 Milieu de recherche et de dénombrement des coliformes. Il est surtout utilisé
pour la colimétrie des eaux par la méthode de filtration.
TTC = chlorure 2-3-5 triphényl-tétrazolium

Composition

Formule en g/l d’eau distillée.

Peptone 10
Extrait de viande 5
Extrait de levure 6
Lactose 20
Tergitol 7 0.01
TTC 0.025
Bleu de bromothymol 0.05
Agar 13

pH = 7,2

Indicateur pH Bleu de bromothymol

Principe

Ce milieu contient une base nutritive riche.

Il contient 2 critères de différenciation :
- le TTC qui montre le pouvoir réducteur des bactéries :
TTC ® formazan (composé rouge) par réduction
- le lactose dont l’utilisation est révélée par le virage du bleu de bromothymol

Il contient 1 inhibiteur permettant de sélectionner les coliformes : le Tergitol 7 (il inhibe aussi
l’envahissement par Proteus).
Couleur finale du milieu :

Lecture
On observe :
- la couleur des colonies :
 colonie rose-rouge : réduction du TTC
 colonie jaune : absence de réduction du TTC
- la couleur des halos dans la couche de gélose sous-jacente aux colonies :
 halo bleu-vert : lactose-
 halo jaune : lactose+

E. coli et Enterobacter aerogenes donnent des colonies jaunes

Les autres coliformes donnent des colonies rouges.

Milieu au sang cuit :

Ce milieu contient des facteurs de croissance variés par la présence d’un mélange
de peptone. C’est un milieu riche.

L’amidon de maïs neutralise les substances toxiques libérées par les

cultures.

C’est un milieu d’isolement enrichi préconisé pour l’étude des Neisseria

notamment le méningocoque. Il est aussi utilisé pour la culture de Haemophilus
influenza.

Il ne permet pas l’observation d’une hémolyse éventuelle puisque les

hématies sont détruites par le chauffage.

Composition

Gélose de base : Gélose Mueller-Hinton ou Gélose Columbia.

Ajouter au moment de l’emploi à la gélose fondue 5 à 10 % de sang frais défibriné.

Technique

Ajouter 5 % de sang dans une gélose fondue dont la température a été

ramenée aux environs de 45°C.

Bien mélanger.

Porter le tube ou le flacon dans un bain-marie dont la température est

voisine de 80°C et l’y maintenir pendant 15 minutes.

Laisser refroidir aux environs de 45°C.

Bien homogénéiser et couler en boîtes de Pétri.

Faire sécher les boites.

Ensemencer.

Milieu Massel :

Le milieu est utilisé en alimentaire pour observer une éventuelle

contamination à Bacillus cereus.

L’utilisation de se milieu doit être orienté préalablement. Les bactérie

doivent être mannitol – .

Le milieu contenant du jaune d’œuf, on peut mettre en évidence la

précense de la lécithinase.

Ce milieu doit selectionner uniquement les Bacillus cereus des autres espèces pouraaient avoir les mêmes
profils d’orientation. Il est donc ajouté au milieu de la polymyxine en quantité variable selon la pollution présumée.

Composition
 Valeur données en g.L-1

Extrait de viande 1

Peptone 10

D-mannitol 10

Chlorure de sodium 10

Rouge de phénol 0,025

Agar 12

pH 7.1

Apprès autoclavage ajouter :

Jaune d’œuf au ½ 10 mL

Polymyxine 1, 2, 5 ou 10 mL selon
contamination

Répartir une goute étalée sur le milieu.

La lecture s'effectue après 18 à 24 heures d'incubation à 37°C.

Rouge de phénol (indicateur de pH)

Lecture
Les bactéries Baccilus cereus

 Colonie rouge mannitol -

 Colonie avec halo
blanchâtre lécithinase +
Virologie
Culture virale :
Puisque les virus sont incapables de se multiplier à l’extérieur des cellules vivantes, les virus sont
habituellement cultivés dans des œufs embryonnés. Pour préparer l’œuf à la multiplication des
virus, la surface de la coquille est d’abord désinfectée à la teinture d’iode, puis perçée avec une
fine mèche stérile. Après l’inoculation, le trou est bouché à la gélatine et l’œuf est incubé.
Parfois, le virus n’est capable de se multiplier que dans certaines parties de l’embryon ; certains
se multiplient mieux dans l’allantoïde alors que d’autres se développent parfaitement sur la
membrane chorioallantoïdienne.

Titrage de virus :
Spectrophotométrie
Spectrophotométrie :
La spectrophotométrie est une méthode spectroscopique d’absorption. L’absorption est un
phénomène au cours duquel une espèce chimique dans un milieu transparent atténue
sélectivement l’intensité du rayonnement électromagnétique incident, à certaines fréquence. À la
température ambiante, l’état fondamental prédomine. Lorsqu’un photon passe au voisinage d’une
particule, il peut être absorbé si et seulement si l’énergie du photon est exactement égale à la
différence d’énergie entre l’état fondamental et un des états d’énergie plus élevé de la particule.
Dans ces conditions, l’énergie du photon est transférée à l’atome, l’ion ou la molécule, qui passe
à un état d’énergie plus élevée qu’on appelle état excité. Après un cours temps l’énergie excité
revient à son état fondamental initial en cédant son excès d’énergie à d’autres atomes ou
molécules.
Transmittance et absorbance :
Pour décrire commodément les propriétés absorbantes d’une espèce, on utilise son spectre
d’absorption. On emploie deux termes pour mesurer l’atténuation du faisceau : la transmittance et
l’absorbance.

La transmittance du milieu est définie comme la fraction de rayonnement incident qui est
transmise par le milieu : et est souvent exprimée en pourcentage : .
L’absorbance A d’une solution est définie par l’équation . Contrairement
à la transmittance, l’absorbance d’une solution augmente lorsque l’atténuation du faisceau
augmente.
Loi de Beer-Lambert :
Considérons le volume de matière absorbante. Un faisceau parallèle de rayonnement
monochromatique de puissance y pénètre perpendiculairement à la surface ; après qu’il ait
traversé une épaisseur de matière (longueur de la cellule) qui contient n particules absorbantes,
sa puissance est réduite à P en raison de l’absorption. Considérons à présent un volume
d’échantillon de section S et d’épaisseur infinitésimale dx, qui contient dn particules absorbantes.
L’aire totale de la projection orthogonale de ces surfaces de capture sur la section de l’échantillon
est désigné par dS. Le rapport de l’aire de capture à l’aire de la section est égal, en terme de
moyenen statistique, à la probabilité de capture d’un photon par la section. La puissance du
faisceau rencontrant la section à la distance x de la face d’entrée de l’chantillon est
proportionnelle au nombre de photons par centimètre carré et par seconde, et est la quantité
absorbée par seconde par le volume Sdx d’échantillon. La fraction absorbée vaut donc
et ce rapport est aussi égal à la probabilité moyenne de capture. Le signe négatif indique que P
diminue. Dès lors, . dS doit être proportionnelle au nombre de particules, soit
où a est une constante de proportionalité appelée section efficace de capture. Ainsi,

L’aire S de la section peut aire exprimée en fonction du volume et de sa longueur :

Puisque a la forme d’une concentration, il vient :

de sorte que

La constante e est le coefficient d’absorption molaire habituellement exprimé en .

Spectroscopie RMN du proton
Concept :
 L’hydrogène ordinaire fait partie des éléments et des isotopes dont le noyau se
comporte comme le ferait un petit aimant en rotation sur un axe. En raison de cette
propriété, ces noyaux peuvent lorsqu’ils sont placés dans un champ magnétique très
puissant et exposés à une radiation électromagnétique, absorber de l’énergie par un
processus appelé résonance magnétique. Cette énergie est absorbée d’une manière
spécifique ce qui produit un spectre caractéristique pour chaque composé. L’absorption
d’énergie ne survient que si l’intensité du champ magnétique et la fréquence de la radiation
électromagnétique prennent des valeurs précises.
 Un spectromètre de résonance magnétique nucléaire est un appareil qui mesure l’énergie
absorbée pas des noyaux de . Muni d’un aimant très puissant, cet appareil
soumet un échantillon à une radiation électromagnétique dont la fréquence correspond aux
ondes radio.
 La résonance magnétique nucléaire nous donc permet de détecter les noyaux atomiques et
nous dit dans quel type d’environnement ils se trouvent à l’intérieur d’une molécule.
 Un noyau dans un champ magnétique intense peut avoir deux niveaux d’énergie. Il peut
être aligner contre ou avec le champ. La quantité nécessaire pour retourner le spin du noyau
peut être fournie par des ondes radio. Ces ondes radio font passer le noyau de l’état
d’énergie inférieur à l’état d’énergie supérieur. Le noyau veut alors retourner à l’état
inférieur et, lorsqu’il le fait, l’énergie est libérée, ce que détecte le spectromètre.
 Chaque noyau est entouré d’électrons, et dans un champ magnétique, ceux-ci provoquent
un minuscule courant électrique. Ce courant induit son propre champ magnétique qui
s’oppose au champ magnétique appliqué. On dit que les électrons blindent le noyau contre
le champ magnétique appliqué.
Spin nucléaire :
 Tous les noyaux étant chargés, cette charge effectue une rotation autour de l’axe nucléaire
conférant un moment magnétique I :

 Ce spin nucléaire est à l’origine du signal RMN.

 Chaque noyau atomique est caractérisé par un nombre quantique de spin I.
 pour tout les noyaux dont le nombre atomique, la masse atomique ou les deux sont
des nombres impairs. Autrement les atomes sont invisibles par RMN.
 En absence d’un champ magnétique externe, les moments magnétiques des noyaux sont
orientés dans toutes les directions :

 Mais en présence d’un champ magnétique, ces moments magnétiques sont soit alignés
(énergitiquement favorable) au champ externe ou opposés au champ externe (requiert
de l’énergie) :

 Ces deux orientations possibles du proton dans le champ magnétique appliqué ne sont pas
d’égale énergie. Ces deux possibilités fournissent la conditions nécessaire pour la
spectroscopie : l’irradiation de l’échantillon avec une source présentant exactement la
fréquence adéquate pour combler la différence d’énergie existant entre les étants et
produit la résonance qui se manifeste par l’absorption d’énergie lorsqu’un proton
bascule vers l’état de spin :
  Le mouvement adopté par un noyau lors de l’application d’un champ magnétique
entraîne sa précession dont la fréquence correspond à la radiofréquence ayant l’énergie
nécessaire pour effectuer l’inversion de spin :

Blindage et déblindage :
 En présence d’un champ externe, les électrons d’une liaison se déplacent selon
certaines voies prédominantes et, en raison de ce phénomène et du fait qu’ils possèdent
une charge, génèrent de faibles champs magnétiques.

 Ce faible champ créé par ces électrons est appelé champ induit. Dans le cas du proton, ce
champ magnétique induit s’oppose au champ magnétique externe. Il s’ensuit que
l’intensité nette du champ magnétique s’exerçant sur le proton est légèrement plus faible
que celle du champ externe. On dit que les électrons provoquent le blindage du proton.
 Un proton fortement blindé par des électrons absorbe de l’énergie à une intensité plus
élevée du champ externe. Le champ externe devra être plus élevé pour annuler l’effet du
blindage. En résumé, le blindage est la diminuation du champ effectif ressenti par un
noyau en raison d’une haute densité électronique locale et nécessite un champ externe
plus fort ou une plus haute fréquence de résonance :
 Le mouvement des électrons d’une liaison qui sont délocalisés engendre aussi un
champ magnétique qui blinde ou déblinde les protons adjacents. C’est la localisation du
proton dans le champ induit qui détermine s’il y aura blindage ou déblindage.
 L’absorption par les protons rattachés aux différents carbones hybridés se fait selon cet
ordre :

 Le déblindage est une augmentation du champ effectif ressenti par un noyau en raison
d’une basse densité électronique locale et nécessite un champ externe plus faible ou une
plus basse fréquence de résonance :

 L’électronégativité des substituants dans le voisinage du noyaux et leur effet inductif

affectent la densité électronique autour du noyau.
 S’il y a diminution de la densité électronique autour des noyaux, alors il y a le déblindage
des noyaux.
 S’il y a augmentation de la densité électronique autour des noyaux, alors il y a blindage
du noyaux.
 L’effet de déblindage par l’électronégativité est additif et atténué par la distance :

 L’électronégativité apparente des carbones augmente avec le caractère s de leur

hybridation.
  Les formes de résonance d’une molécule montrent comment la densité électronique peut
être délocalisée et il y a alors possibilité de blindage et de déblindage.

Composé de référence :
Le déplacement chimique résulte du blindage ou du déblindage causé par le mouvement des
électrons dans les liaisons chimiques. Ce déplacement chimique est mesuré par comparaison avec
l’absorption d’énergie par des protons d’un composé de référence. Le composé de référence le
plus utilisé est le TMS parce que son seul signal découle de l’absorption de douze protons
équivalents, ce qui sert à établir le point zéro. En outre, la densité électronique autour des protons
du TMS apporte un effet de blindage particulièrement prononcé.

Déplacement chimique :
 Dans une molécule, certains protons se situent dans des régions où la densité électronique
est plus élevée, et c’est pourquoi l’intensité du champ magnétique à laquelle se produira
l’absorption d’énergie sera légèrement différente pour certains noyaux par rapport à
d’autres.
 Il s’ensuit que les signaux correspondant à ces protons apparaîtront à des positions
différentes dans un spectre. On dit de ces signaux qu’ils présentent un déplacement
chimique différent.
 L’intensité du champ à laquelle l’absorption survient dépend beaucoup de l’environnement
magnétique où se trouve chaque proton. Cet environnement résulte de l’interaction entre les
champs magnétiques engendrés par les électrons en mouvement et les champs magnétiques
induits par d’autres protons situés à proximité.
Considérons le spectre du 1,4-diméthylbenzène :
  Le déplacement chimique, symbolisé par , indique la position des pics sur une échelle
exprimée en parties par million (ppm).
 L’intensité du champ magnétique augmente de la gauche vers la droite dans le spectre. Les
signaux situés dans la partie gauche du spectre apparaissent vers les champs faibles, tandis
que ceux situés dans la partie droite apparaissent vers les champs forts.
 Le déplacement chimique est égal à la fréquence de résonance, normalisée par rapport à
la force du champ magnétique :

ou
Intégration de l’aire sous les pics :
 Il existe un lien entre le nombre de signaux dans le spectre et le nombre de différents types
d’hydrogènes présent dans un composé.
 L’aire sous le pic d’un signal est directement proportionnel au nombre d’hydrogène
produisant ce signal.
Équivalence chimique :
 Les noyaux qui sont chimiquement équivalents présentent un seul signal au même
déplacement chimique.
 Pour vérifier l’équivalence chimique, on peut faire un test de substitution ce qui identifie
les hydrogènes.
 Les éléments de symétrie moléculaire permettent de déceler les noyaux chimiquement
équivalent :

 L’équivalence rotationnelle permet aussi de déceler les noyaux chimiquement

équivalents :
  À la température ambiante, l’interconversion des conformères est beaucoup plus rapide
que le phénomène de résonance. Les spectres RMN présentent des signaux moyens des
différents conformères.
 Si le remplacement sucessif de deux hydrogènes par un autre groupe donne le même
composé, les hydrogènes sont homotopiques et chimiquement équivalents :

 Si le remplacement successif de deux hydrogènes par un autre groupe donne deux

énantiomères, les hydrogènes sont énantiotopiques et chimiquement équivalent :

 Si le remplacement successif de deux hydrogènes par un autre groupe donne deux

diastéréoisomères, les hydrogènes sont diastéréotopiques et ne sont pas chimiquement
équivalents :

Fragmentation du signal :
 La fragmentation ou multiplicité d’un signal résulte de l’effet exercé par les champs
magnétiques des protons sur les atomes adjacents. Cette fragmentation du signal relève du
couplage spin-spin.
 Les effets du couplage spin-spin sont transmis via les électrons des liaisons et ne se
manifeste habituellement pas lorsque des protons sont séparés par plus de trois liaisons .
 Le signal des protons chimiquements équivalents n’est pas fragmenté parce qu’ils
possèdent exactement le même déplacement chimique.
 Dans un champ magnétique externe, les protons peuvent s’orienter de deux manières, soit
parallèlement ou antiparallèlement. Ainsi, le moment magnétique d’un proton situé près
d’un proton adjacent peut affecter de seulement deux façons le champ magnétique où se
trouve le proton dont le signal est observé. Le léger effet de renforcement ou de
perturbation des spins des protons voisins provoque donc l’apparition d’un pic plus petit
vers les champs forts et un autre vers les champs faibles. On dit qu’il y a couplage entre
deux protons. Les deux orientations possibles du spin d’un proton occasionne donc une
fragmentation du signal :

 La distance J est la constante de couplage.

 Le couplage résulte exclusivement des forces internes, alors la valeur des constantes de
couplage ne dépend pas de l’intensité du champ externe.
 Lorsqu’un proton est situé à proximité de deux protons équivalents se trouvant sur un
carbone voisin, le signal se scinde en un triplet :

 Lorsqu’il y a trois protons équivalents à proximité du proton étudié, alors le signal se

scinde en un quadruplet. Ainsi, la présence de n protons équivalents sur les atomes
adjacents du proton étudié fragmente le signal de ce dernier en pics.
 La distance entre les pics d’un multiplet donne la valeur de la constante de couplage.
Lorsqu’on recherche des doublets, des triplets, e.t.c., qui ont la même constante de
couplage, il est probable que ces multiplets soient couplés entre eux, car la fragmentation
de leurs signaux est le fruit d’un couplage spin-spin réciproque. Les deux protons d’un
 groupe éthyle, par exemple, se présentent comme un triplet et un quadruplet si le groupe
éthyle est rattaché à un atome qui ne porte aucun autre atome d’hydrogène. La distance
entre les pics du triplet et entre ceux du quadriplet sera le même puisque les constantes de
couplage sont les mêmes.

Considérons le spectre du bromopropane :

La multiplicité du signal du groupe CH 3 et CH2Br est assez facile à prévoir. Cependant, celui du
groupe CH2 est plus complexe. Les protons du groupe CH3 ne sont pas équivalent à ceux du
groupe CH2Br. Si les constantes de couplage et présentaient des valeurs assez
différentes, alors le signal des protons du groupe CH 2 serait fragmneté en un quadruplet par les
protons du groupe CH3 et chaque pic du quadruplet se scinderait en un triplet en raison de l’effet
des deux protons du groupe CH2Br.
 Ici, .

Considérons le spectre de l’éthanol :

Le spectre de l’éthanol ordinaire révèle que le signal provenant du proton hydroxyle est un
singulet et que le signal des protons du groupe CH2 est un quadruplet. L’interaction entre le
proton hydroxyle et les protons du groupe CH 2 ne donne pas lieu à un couplage, même si les
protons sont portés par des atomes adjacents.
En revanche, l’examen du spectre d’un éthanol très pur montre que le signal du proton hydroxyle
est scindé en un triplet et que le signal des protons du groupe CH 2 est fragmenté en un multiplet
de huit pics.
Le couplage entre les protons hydroxyliques et les protons méthyléniques dépend de la durée du
rattachement d’un proton à une molécule d’éthanol donné. En effet, il se produit un échange
chimique rapide pour les protons qui sont attachés aux atomes électronégatifs dotés de paires
d’électrons libres, tels que l’oxygène ou l’azote. Ces protons peuvent se transférer rapidement
d’une molécule à l’autre. Dans l’éthanol très pur, cet échange chimique se produit lentement, et
c’est pourquoi on peut observer dans le spectre une fragmentation des signaux découlant du
couplage entre le proton hydroxylique et les protons voisins.
Déplacement chimique typique :

Spectroscopie RMN du carbone 13

Principes :
 Chaque atome de carbone donne lieu à un seul pic.
 Aucun couplage carcone-carbone n’entraîne une scission des signaux en pics multiples.
Ceci est dû aufait qu’un seul atome de carbone sur cent ne possède un noyau de carbone
13. Par conséquent la probabilité que deux atomes de carbone 13 soient adjacents dans
une molécule est extrêmement improbable.
 Les carbones liés à d’autres carbone ou à des hydrogènes sont à l’origine des pics qui
apparaissent vers les champs forts.
 Les carbones liés à des atomes plus électronégatifs sont à l’origine des pics qui
apparaissent vers les champs faibles.
 À apparaît le pic du solvant .
Déplacement chimique typique :

Spectroscopie infrarouge
Principes :
La spectroscopie infrarouge est idéale pour confirmer la présence de groupes fonctionnels.
L’absorption de radiations électromagnétiques par une molécule induit une transition
vibrationnelle s’il s’agit de radiation infrarouge. Les radiations infrarouges de fréquences
comprises entre 4000 et 400 cm-1 sont absorbées par une molécule en tant qu’énergie de vibration
moléculaire. Ces absorptions sont quantifiées ; la fréquence d’oscillation dépend des masses des
atomes et de la force du lien selon la Loi de Hooke :

où
 est le nombre d’onde en cm-1
 f est la constante de force de liaison en dyne
 c est la vitesse de la lumière
 mx et my sont les masses des atomes x et y.
Modes vibrationnels :
L’élongation est la variation de la distance internucléaire entre deux atomes alors que la
déformation est la variation de l’angle entre deux liens adjacents. Les groupes d’atomes où au
moins deux atomes sont identiques ont deux modes d’élongation et deux modes de déformation
angulaire i.e symétrique et asymétrique. De plus, les déformations angulaires peuvent être hors
du plan ou dans le plan. Les élongations requièrent généralement plus de hautes énergies que les
déformations angulaires de sorte que ce sont les élongations qui sont les plus visibles dans un
spectre IR :

Effet de la force de liaison :

Selon l’équation de la Loi de Hooke, plus la force de liaison est grande, plus la fréquence
d’oscillation l’est aussi et plus la masse des atomes est élevées, moins la fréquence d’oscillation
l’est. Il en résulte les région d’absorption suivantes :
Effet de la polarisation du lien :
Seule les vibrations impliquant une variation du moment dipolaire de la molécule s’observent en
IR. La vibration de liens polarisés donne lieu à des bandes intenses alors que les bandes de liens
non-polarisés sont peu ou pas visibles.
Interprétation des spectres :

 La section droite d’un spectre est appelée « empreinte digitale ». Cette

région du spectre révèle peu d’information structurelle.

 La section gauche comporte la plupart des bandes qui sont caractéristiques

de groupes fonctionnels.
 Il est peu probable que deux composés donnent exactement le même spectre IR, sauf dans
le cas des énantiomères.
 Les stéréoisomères sont non différentiables en spectroscopie IR.

Groupe fonctionnel Liaison Nombres d’ondes Intensité

Alcane 3000-2840 Faible, moyenne

Alcène 3150-3050 Faible, moyenne

Alcène 1680-1620 Faible

Alcyne 3330-3260 Moyenne, fine

Alcyne 2260-2220 Faible

Alcool 3650-3200 Moyenne, forte

Alcool/Éther/Ester 1200-1000 Moyenne

Acides 3300-2500 Extrême, large

Acides 1760-1710 Forte

Aldéhyde 2850-2750 Faible

Aldéhyde/Cétone 1750-1690 Forte

Ester 1750-1735 Forte

Amine 3500-3300 Moyenne

 Amine 1670-1640 Forte

Nitrile 2260-2220 Faible

Énantiomères :

Il est peu probable que deux composés donnent exactement le même spectre IR, saus dans le cas des
énantiomères.

Spectrométrie de masse
Principes :

 Le spectre de masse est un histogramme où l’axe des y représente l’abondance relative en

pourcentage et l’axe des x le rapport d’une distribution d’ions où M correspond à la
masse et Z la charge de l’ion.
 La masse de ces ions correspond à la masse de la molécule analysée ou à des fragments de celle-
ci.
 Le pic le plus intense se nomme pic de base (ou pic parent) et on lui assigne arbitrairement une
intensité 100%. L’intensité des autres pics prendra une valeur proportionnelle relative au pic de
base.
 Les masses des ions dans un spectre de masse à basse résolution sont celles que l’on calculerait
pour ces ions en utilisant les masses atomiques arrondies au plus près nombre entier.
 Habituellement, le pic le plus intense représente l’ion moléculaire. Cependant, ce pic peut
souvent représenter un fragment moléculaire. Dès fois, le pic de l’ion moléculaire est si peu
intense qu’il est indétectable.
Pics dû à l’existence d’isotopes plus lourds :

 Les atomes des éléments qui constituent les molécules ont généralement plus d’un isotope
d’occurrence naturelle.
 Les molécules comportant des atomes tels l’oxygène, le souffre, le silicium, le chrole ou le
brome, qui ont un isotope lourd +2 auront, elles, un pic à dans leur spectre de masse.
La présence d’un pic très intense est généralement indicatif de la présence d’un chlore
ou d’un brome dans la molécule


Détermination des formules moléculaires :

La plupart des atomes communs ont un isotope plus lourd que l’isotope le plus abondant par une unité
de masse. Quelques atomes ont aussi un isotope plus lourd par deux untiés de masse. Conséquemment,
les spectres de toutes les molécules ayant un pic pour l’ion moléculaire auront aussi un pic
et quelques-unes un pic . Les intensités relatives de ces trois pics nous permettent de
déterminer la formule moléculaire en suivant les trois lignes directrices suivantes :
  Si le pic de l’ion moléculaire n’est pas le pic de base, on recalcule l’intensité des pics ,
, en assignat la valeur 100% au pic .
 Si a une masse paire, le composé comporte un nombre pair ou nul d’azote.
 Si a une masse impaire, le composé le composé comporte un nombre impair d’azote.
 L’intensité du pic nous permet de déterminer le nombre d’atomes de carbone à l’aide

de la formule :
 L’intensité du pic nous permet de confirmer la présence ou l’absence de souffre(4,4%),
chlore(33%)ou de brome(100%).
 La formule moléculaire peut alors être établit en déduisant le nombre d’hydrogène et d’oxygène
requis pour arriver à la masse moléculaire de la molécule.
Calcul du degré d’insaturation :

Une fois la formule moléculaire établit, il est très utile de calculer le degré d’insaturation :

 Calculer le nombre d’hydrogène qu’aurait l’hydrocarbure saturé :

 Ajouter un hydrogène pour chaque éléments du groupe V et soustraire un hydrogène pour
chaque élément du groupe VII.
 De ce nombre, soustraire le nombre réel d’hydrogène dans la formule et diviser la différence par
deux pour obtenir le degré d’insaturation.
Fragmentation :

Les modes de fragmentation de l’ion moléculaire sont en partie prévisibles particulièrement en méthode
d’ionisation par impact électronique. Le patron de fragmentation d’une molécule revèle beaucoup
d’information sur la structure de celle-ci. La fragmentation de l’ion moléculaire par impact électronique,
un radical-cation, résulte souvent du bris d’une liaison simple. Ce bris génère deux fragments, un cation
et un radical et le bris peut se faire de plusieurs manières :

Hexane :
Nous avons aussi :
Isopentane :

 La ramification accroît la probabilité de clivage à l’embranchementétant donné la stabilité accrue

du carbocation plus substitué résultant.

 Les alcènes se fragmentent de façon à générer un cation allylique stabilisé par résonance.
 Les liens carbone-carbone adjacent à un hétéroatome se brisent facilement car le cation
résultant est stabilisé par résonance.

 Les liens adjacent au groupe carbonyle d’une cétone ou d’un aldéhyde se brisent facilement car
cela mène à la formation d’ions acylium stabilisés par résonance.
 Les benzènes substitués par un groupe alkyle perdent un hydrogène ou un groupe alkyle de
façon à former le cation aromatique tropylium.

 Les benzènes monosubstitués perdent fréquement leur substituant de façon à former le cation
phényle.

 Plusieurs pics dans les spectres émanent de fragmentations impliquant le bris de plusieurs liens .
Lorsqu’un radical-cation se clive ainsi, le résultat est un nouveau radical-cation ainsi qu’une
molécule neutre.
 Les alcools présentent souvent un pic important qui résulte de la perte d’une molécule
d’eau :
 Les composés carbonylés avec un hydrogène exécute souvent un réarrangement de
McLafferty :

 Les cyclohexènes peuvent se fragmenter via une réaction rétro-Diel-Alder.