Partie 4: Techniques d’étude et d’identification phénotypique des

espèces bacteriennes rencontrées dans le milieu alimentaire :

L’identification bactérienne a longtemps reposé sur des caractéristiques phénotypiques. Celles-ci ont été
de nature différente selon les avancées technologiques. Les observations microscopiques et macroscopiques
sur milieux de culture ont été les premiers tests phénotypiques qui ont permis une classification bactérienne. Des
tests biochimiques comme les fermentations de sucres ou d’activités enzymatiques ciblant des protéines ou des
lipides ont permis ensuite d’établir des tableaux d’identification pouvant inclure un grand nombre de
caractères.
Examen macroscopique des colonies
Aspect des colonies

Caractères « intrinsèques »
L’examen attentif du développement bactérien sur milieux gélo- sés permet d’obtenir quelques
renseignements utiles à l’orientation diagnostique. Ainsi les caractères suivants sont-ils intéressants à
noter.
Taille
La mesure de la taille des colonies est une donnée intéressante mais toute relative, devant prendre
absolument en compte la nature du milieu gélosé, la température, l’atmosphère et le délai d’incubation.
D’autre part, toute bactérie peut se révéler de culture difficile (« fastidious ») notamment quand elle se
trouve dans un biofilm ou en présence d’antibiotique.
Morphologie
L’aspect des colonies observées en transillumination oblique ou à la loupe binoculaire autorise leur
classement en plusieurs types. Leur réfringence permet en plus de les séparer en transparentes ou
opaques.
Dans la pratique on se contente souvent des types morpho- logiques suivants :
 le type S ou smooth = lisses, bombées brillantes, convexes,
à bords nets (ex : la majorité des entérobactéries, Staphylococcus aureus) ;
 le type R ou rough = rugueuses, plates, sèches, ridées, à bords irréguliers, à stries radiales (ex :
Pseudomonas stutzeri) ;
 le type M ou muqueux = très bombées et brillantes, lisses à bords nets, d’aspect muqueux, volontiers
confluantes, filantes sous l’œse. C’est la signature de souches capsulées ou productrices de « slime »
(Ex : Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Peudomonas aeruginosa variété). Pour
certaines espèces, ce caractère muqueux est constant et peut être utilisé comme tests d’orientation pour
l’identification (exemple : Corynebacterium mucifaciens).
Couleur et/ou pigmentation
Le caractère pigmenté spontané d’une colonie bactérienne doit être distingué du halo coloré
périphérique signant le virage d’un indicateur de fermentation sucrée ou la mise en évidence visuelle
recherchée d’un quelconque métabolite.
Les milieux gélosés non colorés sont les plus favorables à la production et à l’observation de pigment,
tels le milieu de Mueller-Hinton ou le sérum coagulé.
Les pigments non diffusibles limités à la colonie sont le plus souvent de nature caroténoïde allant du
jaune pâle à l’orangé. Certaines souches de Neisseria saprophytes, de Flavobacterium, de Weeksella, de
Capnocytophaga ochracea, de Pantoea (ex : Enterobacter) agglomerans et C. sakazakii, de Nocardia
spp, Dietzia, Rhodococcus spp, Gordonia spp et Tsukamurella spp, les mycobactéries scoto ou
photochromogènes, produisent de tels pigments.
Certaines souches de Streptococcus agalactiae peuvent développer en anaérobiose un pigment jaune
orangé. Rhodococcus equi élabore en quelques jours un pigment rose assez caractéristique.
Certains biovars non pathogènes de Serratia marcescens, Serratia rubidaea et éventuellement Serratia
plymuthica exhibent une pigmentation rose rouge du plus bel effet liée à la synthèse de prodigiosine.
Les Pseudomonas, P. aeruginosa en particulier sont susceptibles de produire des pigments diffusibles :
 hydrosolubles fluorescents et/ou phénaziniques non fluorescents.
La production de pyocyanine (pigment bleu très soluble dans le chloroforme) spécifique de P. aeruginosa
se recherche sur milieu de King A, alors que la pyoverdine, pigment fluorescent jaune vert également
produit par d’autres espèces comme P. fluorescens et P. putida, est synthétisée en quantité sur milieu de
King B.
Consistance et/ou adhérence
La notion de consistance est donnée par l’impression ressen- tie lors du prélèvement de la colonie à la
pipette boutonnée ou à l’œse. On peut ainsi décrire des colonies: filantes, grumeleuses, adhérentes ou
élastiques. Ce dernier trait est assez symptoma- tique des bactéries muqueuses (E. coli et pyocyanique
muqueux, Klebsiella pneumoniae).
L’incrustation dans la gélose qui prend au voisinage de la colonie une inflexion concave est l’apanage
de certaines souches d’Eikenella corrodens, et de Nocardia spp notamment.
Le phénomène d’adhérence peut aussi se percevoir sur la paroi de verre d’un bouillon glucosé tamponné.
La constatation d’un développement bactérien en mie de pain au fond du tube jointe à l’existence de
microcolonies adhérentes au verre signe géné- ralement la présence de streptocoques producteurs de
dextranes comme : Streptococcus mutans, S. sanguis ou S. oralis.
Odeur
Bien que les consignes d’hygiène interdisent de s’approcher de trop près d’une culture bactérienne,
quelques espèces ont une odeur suffisamment forte et évocatrice pour que dès l’ouverture d’une étuve on
puisse a priori suspecter leur présence :
une odeur « seringa » (arbuste souvent cultivé pour ses fleurs blanches et odorantes) rappelle
inévitablement la présence de Pseudomonas aeruginosa ;
une odeur « caramel » ou de « beurre rance » pour les strep- tocoques du complexe anginosus ;
une odeur « fruitée » évoque Myroides (ex. Flavobacterium) odoratum ou Alcaligenes (ex. odorans)
faecalis.
Une odeur de terre humide pour les Nocardia spp et certaines espèces de Mycobacterium.
Caractères extrinsèques
Il s’agit de caractères culturaux visibles à l’œil nu, issus d’une interaction avec d’autres composants soit
chimique soit biologique.
Hémolyse et « camp-test »
La capacité à hémolyser des érythrocytes de mouton ou de cheval (voire humains) préalablement
incorporés dans la gélose s’avère une propriété discriminante intéressante bien que relati- vement répandue
parmi les bactéries pathogènes.
En intégrant le fait que l’anaérobiose peut l’exalter, selon le degré de l’hémolyse on distingue :
 l’hémolyse alpha caractérisée par un disque étroit verdâtre ou
brunâtre autour des colonies (que l’on nomme « viridans » pour le genre streptocoque) ;
 l’hémolyse bêta caractérisée par une plage claire circulaire
plus ou moins large d’hémolyse complète autour des colo- nies. Les streptocoques des groupes A, et une
grande partie des groupes C ou G présentent une hémolyse large autour de petites colonies. Le groupe B
et quelques souches d’entéro- coques entraînent une plus petite hémolyse. L’hémolyse de Listeria
monocytogenes peut se limiter dans un premier temps au diamètre de la colonie et de ce fait n’être visible
qu’en tran- sillumination. Kingella kingae doit être suspectée devant des colonies bêta-hémolytique
provenant d’une culture de liquide articulaire chez un jeune enfant. Bacillus cereus est une espèce bêta-
hémolytique contrairement à Bacillus anthracis
Le camp-test est un test qui a été utilisé en routine pour le diagnostic de Streptococcus agalactiae et
Listeria monocytogenes. Ces espèces en effet élaborent un produit particulier le « Camp-factor » qui
potentialise l’action hémolytique d’une souche de Staphylococcus aureus productrice d’hémolysine.
Beaucoup d’autres espèces présentent néanmoins un tel carac- tère faisant de celui-ci un test peu
discriminant. On utilise une gélose Trypticase Soja supplémentée de 5 % d’hématies de mouton
préalablement lavées en eau physiologique. Une souche de Staphylococcus aureus producteur
 d’hémolysine ß est ensemencée en une strie centrale sur tout le diamètre de la boîte de Pétri. La ou les
souches à étudier sont aussi ensemen- cées en stries mais perpendiculairement en prenant soin de ne pas
chevaucher la ligne du staphylocoque, s’arrêtant à 5 mm environ. L’incubation se fait à 37 °C pendant 24
heures. Les souches présentant un camp-test positif montrent au niveau de l’intersection des plages
d’hémolyse une augmentation de la zone hémolytique d’aspect trapézoïdal et un renforcement d’intensité
de l’hémolyse.

Utilisation d’indicateurs incorporés dans la gélose d’isolement

La révélation de caractères biochimiques simples, grâce à des indicateurs pré-incorporés dans la gélose
d’isolement, peut être considérée comme un élément d’orientation voire avec précautions d’identification des
colonies bactériennes. L’utilisation de sucres fermentescibles discriminants, ajoutés dans la gélose et révélés
après culture par le virage d’un indicateur coloré en auréole autour de la colonie, a très tôt été appliquée en
technologie microbiologique comme le prouvent par exemple les milieux spécifiques suivants : BCP-lactose
(gélose lactosée au bromocrésol pourpre) ; CLED (gélose cystine-lactose-électrolyte- déficient) ; Chapman
mannité (gélose hypersalée contenant du mannitol) pour la différenciation des staphylocoques ; Drigalski
pour la différentiation des bacilles Gram négatif notamment des entérobactéries fermentant (colonies jaunes)
ou non (colonies bleues-vertes) le lactose.

EXAMEN MICROSCOPIQUE
L’examen microscopique des bactéries est très informatif car le plus en amont des schémas ou clés
d’identification. Il apprécie la taille, la morphologie, l’affinité tinctoriale, le mode éventuel de groupement des
micro-organismes et leur mobilité.

1/ Etat Frais :

 Principe :
Cet examen permet d’apprécier la forme et parfois la mobilité des germes étudiés. Il faut éviter de confondre
la mobilité d’une bactérie avec les mouvements de convention susceptibles de l’entraîner.
 Technique :
Cette préparation consiste à examiner les microorganismes vivants entre lame et lamelle. Une goutte de
suspension bactérienne est déposée au centre de la lame, puis déposer une lamelle au-dessous en évitant de
créer les bulles d’air.
L’observation se fait par microscope optique aux grossissements x 10 et x 40.
 Lecture :
Cet examen permet de savoir si on a affaire à une bactérie, à un champignon filamenteux ou à une levure.
Dans le cas des levures et moisissures, l’examen permet une étude morphologique satisfaisante.

L’étude morphologique des bactéries nécessite la préparation d’un frottis coloré selon la méthode de la
coloration de Gram.

Colorations
Il est nécessaire d’effectuer un dépôt soit en étalant sur une lame en verre propre, une à deux gouttes d’un
produit biologique ou d’une suspension bactérienne, soit en réalisant une cytocen- trifugation qui se traduit
par un dépôt concentré sur un spot. Le dépôt est séché à l’air puis fixé à l’alcool absolu. Le séchage et la
fixation peuvent aussi être réalisés simultanément par l’utilisation d’une platine chauffante. Les colorateurs
automatisés prennent en charge les lames dès que le dépôt est sec.
Coloration de Gram
 L’âge de la culture est un paramètre important à prendre en compte car les bactéries, dont la culture excède
72 h, retiennent mal le complexe violet de gentiane-iode. Classiquement la tech- nique du « Gram » comporte
les étapes successives suivantes :
 Recouvrir le frottis de la solution de violet de gentiane et
 laisser agir une minute.
 Rejeter le colorant en excès et laver à l’eau.
 Recouvrir la préparation de lugol et laisser agir une minute.
 Rejeter le lugol et laver à l’eau.
 Décolorer à l’alcool à 95° ou au mélange alcool-acétone, lames inclinées à 45°. C’est le temps critique de la
manipulation car la durée de décoloration doit s’adapter à l’épaisseur du frottis. En pratique il convient
d’arrêter la différenciation dès que les
« volutes » de violet s’interrompent.
 Rincer à l’eau courante.
 Recouvrir la lame de la solution de fuchsine diluée et laisser agir 20 secondes.
 Rejeter la fuchsine en excès et laver à l’eau.
 Sécher la lame à l’air chaud ou entre deux feuilles de papier- filtre ou buvard très propres.
 Examiner au microscope (objectif à immersion) au grossis- sement X 1 000. Les bactéries Gram positives
sont colorées en violet, les Gram négatives en rose rouge.
Coloration des spores
La méthode de Moeller comprend les étapes suivantes :
 réaliser un frottis à l’aide d’une culture en bouillon ou d’une suspension riche de la bactérie à étudier ;
 fixer à l’alcool méthylique ;
 inonder la lame porte-objet avec une solution aqueuse à 5 % de vert malachite ;
 chauffer jusqu’à émission de vapeurs et laisser agir 5 min ;
 rincer à l’eau du robinet ;
 contre-colorer avec une solution aqueuse de safranine à 0,5 % pendant 30 secondes ;
 rincer de nouveau, sécher et observer au microscope à l’im- mersion.
Les spores apparaissent colorées en vert dans des corps bacil- laires rouge orangé. En fonction de leur
forme et position on distingue trois groupes de spores : type I (centrale ou subterminale non renflée), type II
(centrale ou subterminale déformante) et type III (terminale, sphérique, déformante en tête d’épingle).
Les espèces bactériennes sporulantes appartiennent classique- ment aux genres Clostridium et Bacillus.
Des nouveaux genres ont été créés pour des espèces appartenant auparavant à un de ces deux genres cités.

CARACTÈRES BIOCHIMIQUES UTILISÉS POUR L’IDENTIFICATION

.

Type énergétique et respiratoire :

Etude du métabolisme oxydatif ou respiratoire : (Etude de la Voie d’Attaque des Glucides) :

 But :
Déterminer la voie empruntée par la bactérie pour dégrader le glucose.
Le métabolisme fermentaire engendre la formation d’acides ou d’alcool alors que le métabolisme oxydatif
n’en produit pas.
L’épreuve de HUGH et LEIFSON permet de déterminer la voie empruntée en utilisant des géloses molles,
faiblement peptonnées et présentées en culot ([Link].).
 Technique :
- 2 tubes de milieu sont régénérés par chauffage aux bains-marie puis additionnés de glucose puis
solidifiés.
- L’ensemencement se fait par piqûre centrale : Un tube est incubé en aérobiose et l’autre en
anaérobiose réalisé par dépôt d’une couche de paraffine stérile sur le milieu.
 Lecture :
M.E.V.A.G. + Vaseline M.E.V.A.G. sans vaseline Métabolisme emprunté
Colorations

Jaune Jaune Fementaire

Jaune en surface Jaune en surface Fermentaire aérobie stricte
Rouge Jaune Oxydatif
 Rouge rouge Inerte

NB: L’indicateur de pH est le rouge de phénol.

Mise en évidence d’une « respiration anaérobie » : Réduction des nitrates en nitrites :

 Principe :
Certaines bactéries anaérobies facultatives utilisent un métabolisme de type oxydatif sous des conditions
d’anaérobies. Ce procédé est la respiration anaérobie.
Les nitrates sont en principe toxiques pour la plupart des bactéries mais certaines peuvent les utiliser comme
accepteur des é et l’azote moléculaire formé est relargué dans le milieu.
Chez certaines espèces ce sont les nitrates qui sont successivement réduits en nitrites puis en azote. Ce
procédé de dénitrification est retrouvé chez les Pseudomonas.
NO3 + 2( H+, é ) Nitrate réductase NO2 -- + H2O .
-- +
2NO2 + 8 ( H , é ) Nitrite réductase N2 + 4H2O .
La présence est alors déterminée à l’aide des réactifs de GRIESS-ILOSWAY : Acide Sulfanilique & Alpha
Napha-tylamine.
 Technique :
Au bouillon de Nitrate ensemencé, ajouter 4 gouttes du réactif 1 ( acide sulfanilique) puis 4 gouttes du réactif
2 (alpha-naphtylamine).
 Lecture :
- Si la coloration rose apparaît : la bactérie possède la Nitrate réductase.
Soit les nitrates n’ont pas été réduits.
- Si le milieu reste incolore : Ou bien ils ont été transformés en Nitrites puis en Azote.
L’addition d’un réducteur comme la poudre de Zinc permet de différencier ces 2 voies :
- Si le milieu devient rose : les Nitrates sont présents La bactérie ne possède pas la Nitrate réductase.
- Si le milieu reste tel quel : Les nitrates ont été réduits en Nitrites puis en azote ammoniacal : La bactérie
possède la Nitrate réductase.

Mise en évidence des enzymes respiratoires :

Recherche de l’oxydase :

 But :
Différencier chez les bacilles Gram - les Entérobactéries des pseudomonas.
 Principe :
Dans la chaîne respiratoire, le dernier cytochrome qui transfert les é à l’o2 est appelé cytochrome oxydase ou
aa3. Sa présence chez une bactérie ne peut être mis en évidence que si la cellule possède ainsi le cytochrome
c. Ces 2 cytochrome ont la propriété d’oxyder le diméthyle ou le tétraméthyl paraphénylène diamine en une
semi-quinone colorée en rouge.
Cyt c +++ + Cyt aa3 +++ + Réactif réduit (incolore).
Cyt c ++ + Cyt aa3 ++ +Réactif oxydé (rouge).
 Technique :
- Sur une lame propre, déposer un disque préalablement imprégné d’une goutte d’eau distillée stérile.
- Prélever à l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée une colonie à étudier et la déposer sur le disque.
 Lecture :
- La bactérie oxydase + : coloration rose au point du dépôt, qui vire au brun puis au noire :
Bactéries aérobies strictes ou aérobies facultatives.
- Les bactéries oxydase - : Ne change pas la couleur du réactif :Bactéries aérobies facultatives ou
anaérobies.

Recherche de la Catalase :
  But :
Différencier chez les Cocci Gram + les Staphylocoques des Streptocoques.
 Principe :
Lors de la déshydrogénation (oxydation du substrat), l’o2 moléculaire est réduit selon la formule : SH2 + O2
S H2O + ½ O2
H2O2
L’eau oxygénée qui se forme est très toxique pour les bactéries, et les bactéries aérobies possèdent des
déshydrogénases oxytrophes qui détruisent l’ H2O2, soit par catalases ou par peroxydases selon la réaction :
H2O2 H2O + ½ O2.
 Technique :
- Prélever une colonie et la déposer sur une lame propre, puis déposer sur cette colonie une goutte d’H2O2.
 Lecture :
- Dégagement des bulles gaz : La bactérie est Catalase +.
Etude du métabolisme glucidique :

Fermentation avec ou sans gaz, utilisation du Lactose et du Saccharose et production d’H2S :

 Principe :
Cette réaction est réalisée sur milieu T.S.I. (Tri-Sugar-Agar) : Ce milieu se présente en gélose inclinée
contenant du glucose à 1 g/mille et 2 Diholosides à 10 g/mille et du rouge de phénol comme indicateur et un
sel de fer.
Dans un 1er temps : il y a fermentation du glucose ce qui permet à la bactérie de produire l’énergie nécessaire
à la synthèse des enzymes spécifiques des diholosides, ce qui se traduit par une acidification du milieu qui
vire au jaune au niveau du culot.
Dans un 2eme temps : Les bactéries commencent à dégrader le les peptones contenus dans le milieu et les
diholosides si elles en possèdent les enzymes.
La dégradation libère les acides aminés qui alcalinisent le milieu, et la dégradation des diholosides libère les
acides qui acidifient le milieu. L’équilibre entre ces deux réaction aboutit à :
- Une alcalinisation si la bactérie est diholosides - : virage du milieu au rouge.
- Une acidification si la bactérie est diholosides + : Virage au jaune.
* La production du gaz : La plupart des fermentations bactériennes s’accompagnent de production de gaz, soit
C O2 , soit H2 ou bien les 2.
* Un noircissement dû à la formation du sulfure de fer traduit la production d’H2S, ce qui signifie que la
bactérie possède la Déshulfydrase : S2O3 H2S FeS noir.
 Technique :
- A partir de la suspension bactérienne, ensemencer à l’aide d’une pipette pasteur stérile le milieu
T.S.I. par des stries sur la pente et par une piqûre centrale au culot.
- Ne serrer pas complètement le tube.
- incuber le milieu à 37°C pendant 24 h.
 Lecture :
- Si le culot est jaune : la bactérie est Glucose +.
- Si la pente est jaune : la bactérie est Diholosides +.
- S’il y a noircissement au milieu du tube : la bactérie est H2S +.
- S’il y a présence d’une ou plusieurs poches de gaz : la bactérie est Gaz +.

Mannitol Mobilité :

 Principe :
Le milieu se présente sous forme de gélose molle (4 g pour mille d’ager) contenant du mannitol, du rouge
de phénol et des nitrates à 1 g/1000.
La présence de nitrate de potassium dans le milieu inhibe les enzymes responsables de dégagement gazeux.
 Technique :
- D’abord, ensemencer la colonie à étudier dans un bouillon Nutritif (Entérobactéries) ou dans un BGT
(Streptocoques) ou alors dans un BHIB (Staphylocoques), et l’incubation se fait à 37°c pendant 24h et cela
afin de permettre à la bactérie de synthétiser les flagelles nécessaires à son déplacement (1 ère lois de la
thermodynamique).
- Le milieu est ensemencé par piqûre centrale unique, ce qui permet d’apprécier en plus de
l’utilisation du mannitol, la mobilité du germe.
 Lecture :
- Si le milieu prend une coloration jaune : la bactérie est mannitol +.
- Si la milieu reste rouge : la bactérie est mannitol -.
- Si les bactéries sont mobiles, elles se disperseront à partir de la piqûre d’ensemencement créant un
trouble dans le milieu, sinon la bactérie est mobilité -.

Caractérisation d’enzymes :

Recherche de l’O.N.P.G. Hydrolase : Test de l’O.N.P.G. :

 But :
Etudier l’existence d’une Béta-Galactosidase chez le germe, donc la possibilité de la fermentation effective du
lactose indépendamment de la perméase bactérienne.
 Principe :
La Béta-Galactosidase hydrolyse le lactose en Glucose + Galactose. En plus, elle présente 2 caractéristiques :
- Elle est intracellulaire et ne peut agir sur le lactose que s’il pénètre à l’intérieur de la cellule.
- Elle est inductible est n’est synthétisée que si la bactérie est cultivée en présence de lactose,
ce qui nécessite la présence dans le milieu d’une petite quantité de Glucose suffisante à l’initiation de la
synthèse de la perméase.
Pour déceler cette Béta-Galactosidase, on va mettre la bactérie en présence d’un réctif analogue au Lactose :
Ortho Nitro Phényl Galactopyranoside (O.N.P.G.). Ce produit donne le Lactose et d e l’Orthonotrophényl qui
présente une coloration jaune.
 Technique :
La présence d’une Béta-Galactosidase est recherchée chez les bactéries récoltées sur un milieu gélosé
lactosé dont les colonies sont mises en suspension dans de l’eau distillée stérile à laquelle est ajoutée un
disque de papier imprégné d’O.N.P.G. La suspension est mise au bain-marie toutes les 15 mn.
 Lecture :
La plupart des réactions donnent une coloration jaune en 15 à 30 mn, mais certaines peuvent être tardives
donc la lecture se fait après 24 d’incubation avant de conclure que la réaction est -.

Etude d’intermédiaires de métabolisme :

Recherche de la Citrate perméase

 But :
Permet de déceler la présence du cycle de Krebs chez la bactérie.
 Principe :
Il s’agit de la recherche de l’utilisation du citrate comme seule source de Carbone, possible uniquement chez
les bactéries douées de pouvoir respiratoire et qui peuvent oxyder le citrate par l’intermédiaire du cycle de
Krebs.
La source de carbone est fournie dans le milieu de culture sous forme de sel d’acide organique : le Citrate de
Sodium.
Un résultat de citrate – doit être interpréter non pas l’absence d’une capacité de métaboliser le citrate mais
comme l’absence d’une perméase spécifique qui assure l’entrée du citrate dans la cellule : la citrate perméase.
Si la bactérie utilise la source de carbone, elle se développera et utilisera également la source d’azote, ceci se
manifeste par une libération d’ammoniaque qui alcalinisera le milieu provoquant le virage de l’indicateur
coloré (bleu bromothymol qui est jaune vert à pH 6 et bleu à pH 7,6).
 Technique :
- A partir d’une colonie caractéristique, ensemencer le milieu en surface par des stries serrées
uniquement la moitié du milieu, l’autre moitié servira comme témoin.
 - Incubation à 37°c pendant 24 h.
 Lecture :
- Si le milieu de culture vire au bleu : les bactéries sont pourvues d’une citrate perméase.
- Si le milieu reste jaune vert : les bactéries n’ont pas pu se développer, elles ne synthétisent pas la
citrate perméase.

Caractérisation de divers types fermentaires :

Test du R.M. (Rouge de méthyle) & Test du V.P. (Voges Proskrover ) :

Test du RM :
 Principe :
Permet de mettre en évidence les grandes quantités d’acides produites par les bactéries qui n’empruntent pas
la voie Butylène-Glycol. L’acidification importante du milieu est révélé par l’addition d’un indicateur de pH,
le rouge de méthyle au milieu où auront poussé les bactéries. Le milieu utilisé est celui de CLARK et LUBS
qui permet de mettre en évidence2 voies de dégradation de l’Acide pyruvique :
 La formation d’Acétoîne = Acetyl-Methyl-Carbinol par décarboxylation : réaction de Voges
Proskrover.
 La formation d’acides acétiques et formiques en aérobiose et en anaérobiose : réaction au rouge
méthyle.
 Technique :
A 1 ml de milieu de culture ensemencé et incubé sont ajoutées qqs gouttes du réactif RM.
 Lecture :
- Si le milieu prend une coloration rouge, son pH est <4,4 : la réaction est RM +.
- Si le milieu reste jaune, son pH est  6 : la réaction est RM -.

Glucose

Acide pyruvique
Acides mixtes :
- A. succinique Acétoîne : CH3 – CO – CHOH – CH3
- A. propionique
- A. acétique
- A. lactique CH3 – ( CHOH)2 – CH3
- A. formique 2.3 Butylène-Glycol = Butanediol

Test du V.P. :
 Principe :
la voie Butylène –Glycol est identifiée indirectement par la recherche du métabolite intermédiaire, l’Acétoîne.
Ce métabolite en présence de KOH est oxydé en diacétyl qui peut réagir :
- soit avec de la créatine : réaction de O’MEARA,
- soit avec l’alpha naohtol : réaction de BARITT,
- soit avec les 2 réactifs précédents : réaction de BARRY et FEENEY pour donner un complexe de
coloration rose-rouge.
 Technique :
- A 1 ml de milieu de culture ensemencé et incubé, on ajoute 0,5 ml de la solution naphtol et 0,5 ml de
la solution de soude,
- Agiter le tube dans lequel se déroule la réaction afin de favoriser l’oxydation par l’air. Le temps de
réaction est de 15 mn.
 Lecture :
 - Si une coloration rouge violacée apparaît en surface : la réaction est VP +.
- Si aucune réaction n’apparaît : la réaction est VP-.

Etude du métabolisme azoté et protéique :

Dégradation de l’Urée :

 But :
La recherche de l’uréase est un élément important des germes qui utilisent l’urée comme source d’azote.
 Principe :
L’urée est hydrolysée par une urée – hydrolase ou UREASE qui libère de l’ammoniac selon la réaction
suivante : CO (NH2) + H2O 2 NH3 + CO2
CO2 + 2NH3 + H2O CO3 ( NH2 )4
Cette réaction se traduit par un indicateur de pH qui vire au rouge violacé. L’identification est réalisée
indirectement par la recherche des produits de l’hydrolyse de l’urée.
 Technique :
La recherche de l’uréase s’effectue par culture sur milieu FERGUSON (milieu Urée- Indole) qui contient,
en plus du tryptophane, de l’urée et indicateur de pH : le rouge de phénol (rouge à pH alcalin et jaune à pH
acide.
- Ensemencer une anse de platine de germes dans le milieu FERGUSON.
- Incuber à l’étuve à 37°c pendant 24 h.
 Lecture :
Si la bactérie possède une uréase et hydrolyse l’urée contenue dans le milieu, la production de NH3 alcalinise
le milieu et fait virer l’indicateur au rouge violacé.
NB : Sur le milieu FERGUSON, faire d’abord la réaction de l’urée et réaliser ensuite les réactions de l’Indole
et TDA.

Métabolisme des acides aminés: Décarboxylation :

 Principe :
Les acides aminés Lysine, Ornithine et Arginine peuvent être décarboxyléspar action de décarboxylases
spécifiques dont l’action aboutit à la formation de catabolites alcalins respectivement : Cadaverine,
Putrescine, Agmatine puis Putrescine.
LDC
NH2 – (CH2)4 – CH – COOH NH2 – (CH2) – NH2 : Cadaverine (Penta-Methylène
NH2 Diamine).
OD C
NH2 – (CH2) – CH – COOH NH2 - (CH)4 – NH2 : Putrescine
C
NH2
ADH
NH = C( NH2) – NH – (CH2)3 – CH – (COOH) NH2 + 2 H2O NH2 – (CH2) – NH2 +
2 NH3 + 2CO2

Le milieu de base utilisé est celui de MOELLER- FALKOW qui est additionné de l’acide aminé à étudier. Ce
milieu contient du Pourpre de Bromocrésol comme indicateur de pH.
Pour chaque test de recherche des décarboxylases, utiliser un milieu témoin sans acides aminés.
Dans le 1er temps, la bactérie utilise le glucose du milieu qui s’acidifie et fait virer l’indicateur au jaune. Dans
un 2 ème temps, la décarboxylation de l’acide aminé alcalinise le milieu et refait virer l’indicateur au bleu
violacé, alors que le tube témoin reste jaune.
 Technique :
À partir de la suspension bactérienne, introduire dans le milieu de MOELLER-FALKOW quelques gouttes de
la suspension et les recouvrir d’une couche de l’huile de vaseline (témoin et la réaction) stérile ce qui
n’autorise que les réactions anaérobies.
 Lecture :
  Si le témoin vire au jaune, continuer la lecture :
- S’il y a coloration violette du tube de la réaction, la réaction est positive.
- Si le milieu est jaune : réaction négative.
 Si le témoin reste violet : la réaction est refaire.

Désamination et formation d’indole :

 Principe :
Le catabolisme du tryptophane peut suivre 2 voies différentes :
 L’action d’une tryptophanase hydrolyse la molécule en indole, acide pyruvique et ammoniac :
Certaines bactéries dégradent le tryptophane en acide indoloacétique ou en acide indolocarboxylique. Seules
les bactéries indologènes poursuivent cette réaction jusqu’à la
Formation d’indole.

CH2 – CH – COOH

NH2 + H2O + CH3 – CO – COOH

+ NH3

Cette réaction est mise en évidence par la recherche d’indole dans le milieu FERGUSON par la réaction
d’EHRLIC-KOVACS qui est constitué de Paradiméthylaminobenzaldehyde (P.D.A.B.) qui réagit avec
l’indole pour formé un colorant rose, le rosindole.
 L’action d’une tryptophane désaminase (T.D.A.) de l’acide indole pyruvique qui a la propriété de
réagir avec les ions ferriques de perchlorures de fer pour donner un complexe coloré en brun rouge.
 Technique :
Sur le milieu FERGUSON, faire d’abord la réaction de l’urée. Le lendemain, diviser le tube en 2 : l’un servira
à la recherche de l’indole par l’adjonction de quelques gouttes du réactif d’EHRLIC-KOVACS. L’autre
servira à la recherche de T.D.A. par l’adjonction de quelques du réactif de T.D.A.
 Lecture :
- 1er tube : S’il y a formation d’anneau rouge en surface : la bactérie est Indole +
- 2ème tube : S’il y a virage de la couleur au brun rouge : la bactérie est T.D.A. +

Mise en évidence d’une enzymes participant au pouvoir pathogène :

Recherche de la Staphylocoagulase :

 But :
Déterminer la pathogénicité d’un staphylocoque. Il s’agit d’une enzyme coagulant le plasma ce qui gène la
phagocytose.
 Principe :
Il faut préciser que les staphylocoques peuvent élaborer 2 types de coagulase qui diffèrent par les facteurs de
coagulation mis en jeu, les techniques d’études et leurs spécificités :
 La coagulase liée ou « Clumping Factor » qui est une enzyme endocellulaire. On la met en
évidence en émulsionnant sur lame une parcelle de culture prélevée sur gélose nutritive dans une goutte de
plasma.
- Si la suspension reste homogène : la bactérie est coagulase –
- S’il y a formation d’agglutinats : la bactérie est coagulase +.
NB : Dans une technique commercialisée (« Staphyloside Test » Biomérieux), le plasma est remplacé par les
hématies de mouton sensibilisées par le fibrinogène.
  La coagulase libre : C’est une enzyme libérée dans le milieu au cours de la culture ; sa mise en
évidence permet d’affirmer la présence d’un staphylocoque pathogène. Cette enzyme a la propriété de
coaguler le fibrinogène par l’intermédiaire de la thrombine qu’elle active en thrombine.
 Technique :
- À partir de milieu Chapman déjà ensemencé, prendre une colonie et la mettre dans un bouillon BHIB
et l’incuber à 37°c pendant 24 h.
- Mesurer dans un tube à essai : 0,5 ml de dilution de plasma de lapin + 0,5 ml du BHIB et l’incuber à
37°c pendant 24 h.
 Lecture : - La coagulation se traduit par la prise en masse du contenu du tube.