Exercice:
On se propose d'analyser les mécanismes de l'importation de deux
protéines vers la lumière des peroxysomes : la catalase et la thiolase.
Les expériences suivantes ont été réalisées :
1. ces deux protéines sont purifiées à partir d'une fraction cytosolique
isolée, par fractionnement cellulaire, après homogénéisation de
cellules de foie de rat. Elles sont ensuite marquées radioactivement
par une technique qui ne les dénature pas ;
2. Une fraction de peroxysomes purifies, issus de ces mêmes cellules, est
également obtenue après fractionnement cellulaire ;
3. les deux protéines radiomarquées sont ensuite mises en présence de
peroxysomes purifiés pendant 15 min, in vitro, dans un milieu
réactionnel approprié.
4. quatre conditions expérimentales différentes sont comparées, selon
que l'on ajoute ou pas au milieu réactionel un certain volume de
fraction cytosolique (FCS), ou bien un peu d'ATP.
L'efficacité relative de l'entrée des protéines est exprimée en %;
on obtient des
résultats très voisins pour les deux protéines :
-FCS+ATP Efficacité :0
-FCS-ATP Efficacité :0
+FCS +ATP Efficacité : 100
+FCS-ATP Efficacité : 15
Quelle conclusion tirez-vous de ces expériences, et quelles
hypothèses formulez-vous au sujet des mécanismes d'importation
mis en jeu?
5. un lot de peroxysomes purifiés est soumis à l'action d'une protéase
diluée pendant un temps bref; ces organites sont ensuite mis en
présence de chacune des deux protéines marquées, en présence de
FCS et d'ATP, comme précédemment. On observe que les protéines
sont alors incapables de pénétrer dans les peroxysomes.
Quel est le résultat attendu de l'action de la protéase, et quelle
nouvelle hypothèse pouvez-vous formuler concernant les
mécanismes mis en jeu ?
6. grâce aux techniques du génie génétique, il est possible d'obtenir des
formes tronquées de ces deux protéines, c'est-à-dire amputées d'une
dizaine d'acides aminés, soit du côté N-terminal, soit du côté C-
terminal. Ces 4 protéines sont ensuite radiomarquées et utilisées dans
des expériences identiques à celles où on a ajouté au milieu des
extraits cytosoliques (FCS) et de l'ATP. Enfin, l'efficacité de l'entrée in
vitro des protéines dans les organites a été mesurée
Quelles informations apportent ces nouvelles expériences ?
Présenter un modèle résumant l'ensemble des
hypothèses formulées.
