7 Chaâbane 1434 JOURNAL OFFICIEL DE LA REPUBLIQUE ALGERIENNE N° 31 17

16 juin 2013

Art. 3. — Le présent arrêté sera publié au Journal

MINISTERE DU COMMERCE officiel de la République algérienne démocratique et
populaire.

Arrêté du 18 Safar 1434 correspondant au Fait à Alger, le 18 Safar 1434 correspondant au 31

31 décembre 2012 rendant obligatoire la décembre 2012.
méthode de recherche et de dénombrement des
organismes coliformes, organismes coliformes Mustapha BENBADA.
thermotolérants et des escherichia coli présumés ————————
dans l'eau.
———— ANNEXE

Le ministre du commerce, METHODE DE RECHERCHE ET DE

DENOMBREMENT DES ORGANISMES
Vu la loi n° 05-12 du 28 Joumada Ethania 1426 COLIFORMES, ORGANISMES COLIFORMES
correspondant au 4 août 2005, modifiée et complétée, THERMOTOLERANTS ET DES ESCHERICHIA
relative à l'eau ; COLI PRESUMES.
Vu le décret présidentiel n° 12-326 du 17 Chaoual 1433 (Méthode du nombre le plus probable)
correspondant au 4 septembre 2012 portant nomination
des membres du Gouvernement ; La présente méthode prescrit une technique de
recherche et de dénombrement des organismes coliformes,
Vu le décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, des organismes coliformes thermotolérants et des
modifié et complété, relatif au contrôle de la qualité et à la escherichia coli présumés par culture dans un milieu
répression des fraudes ; liquide dans des tubes multiples et calcul de leur nombre
le plus probable dans l'échantillon.
Vu le décret exécutif n° 02-453 du 17 Chaoual 1423
correspondant au 21 décembre 2002 fixant les attributions Cette méthode peut être appliquée à tous les types d'eau,
du ministre du commerce ; même ceux contenant une quantité appréciable de
particules en suspension.
Vu le décret exécutif n° 05-465 du 4 Dhou EL Kaada
1426 correspondant au 6 décembre 2005 relatif à Le choix des essais utilisés pour la recherche et la
l'évaluation de la conformité ; confirmation des organismes du groupe coliforme, y
compris escherichia coli, peut être considéré comme
Vu l'arrêté interministériel du 22 Dhou El Hidja 1426 faisant partie d'une séquence continue. L'importance de la
correspondant au 22 janvier 2006, modifié et complété, confirmation pour un échantillon donné dépend en partie,
fixant les proportions d'éléments contenus dans les eaux de la nature de l'eau et en partiel des raisons ayant conduit
minérales naturelles et les eaux de source ainsi que les à cet examen. Dans la pratique, la recherche d'escherichia
conditions de leur traitement ou les adjonctions coli présumés dans l'eau comme indiqué en (1.3) fournit
autorisées ; généralement une indication sur la pollution fécale
récente.
Vu l'arrêté du 14 Safar 1415 correspondant au 23 juillet
1994, modifié et complété, relatif aux spécifications 1. DÉFINITIONS
microbiologiques de certaines denrées alimentaires ;
Pour les besoins de la présente méthode, les définitions
Arrête : suivantes s'appliquent.

Article 1er. — En application des dispositions de 1.1 Organismes coliformes :

l'article 19 du décret exécutif n° 90-39 du 30 janvier 1990, Organismes capables de former des colonies en
modifié et complété, susvisé, le présent arrêté a pour objet aérobiose à 35 °C ± 0,5 °C ou à 37 °C ± 0,5 °C sur un
de rendre obligatoire la méthode de recherche et de milieu lactosé sélectif et différentiel, avec production
dénombrement des organismes coliformes, organismes d'acide (et d'aldéhyde) dans les 24 h.
coliformes thermotolérants et des escherichia coli
présumés dans l'eau. 1.2 Organismes coliformes thermotolérants :

Art. 2. — Pour la recherche et le dénombrement des Organismes coliformes répondant à la définition donnée
organismes coliformes, organismes coliformes en (1.1), présentant les mêmes propriétés de fermentation
thermotolérants et des escherichia coli présumés dans dans les 24 h, à 44 °C ± 0,25 °C ou à 44,5 °C ± 0,25 °C.
l'eau, les laboratoires du contrôle de la qualité et de la 1.3 Escherichia coli présumés :
répression des fraudes et les laboratoires agréés à cet effet
doivent employer la méthode jointe en annexe du présent Organismes coliformes thermotolérants répondant à la
arrêté. définition donnée en (1.1) qui produisent, en plus, du gaz
à partir du lactose (et du mannitol) ainsi que de l'indole à
Cette méthode doit être utilisée par le laboratoire partir du tryptophane dans les 24 h, soit à 44 °C ± 0,25 °C,
lorsqu'une expertise est ordonnée. soit à 44,5 °C ± 0,25 °C.

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2. PRINCIPE 3.4 Milieux de confirmation

Ensemencement d'une série de tubes à essai contenant Utiliser un ou plusieurs des milieux suivants :
un milieu de culture sélectif lactosé avec des prises d'essai
de l'échantillon dilué ou non. 3.4.1 Milieux pour la production de gaz
Examen des tubes à essai après une incubation de 24 h [Link] Bouillon (bilié) lactosé au vert-brillant
et de 48 h à 35 °C ou 37 °C ; repiquage à partir de chaque
tube à essai montrant une turbidité avec une production de [Link] Milieu (EC)
gaz dans un milieu de confirmation plus sélectif et, si l'on
recherche les escherichia coli présumés, sur un milieu sur 3.4.2 Milieu pour la production d'indole ( Eau
lequel peut être prouvée la formation d'indole. tryptonée.)
Incubation de ces milieux de confirmation pendant 48 h
au plus à 35 °C ou à 37 °C pour la recherche d'organismes 3.4.3 Milieu pour tube à essai unique pour
coliformes, et à 44 °C pendant 24 h au plus pour les production de gaz et d'indole
organismes coliformes thermotolérants et les escherichia
coli présumés. Bouillon tryptosé au mannitol, au laurylsulfate et au
tryptophane.
Au moyen de tables statistiques, calcul du nombre le
plus probable (NPP) d'organismes coliformes, 3.5 Réactifs
d'organismes coliformes thermotolérants et de escherichia
coli présumés, susceptibles d'être présents dans 100 ml de 3.5.1 Réactif de Kovacs pour la recherche de l'indole
l'échantillon, à partir du nombre de tubes donnant des
résultats de confirmation positifs. 3.5.2 Réactif à l'oxydase pour la recherche de
l'oxydase
3. DILUANTS, MILIEUX DE CULTURE ET
RÉACTIFS 4. APPAREILLAGE

3.1 Produits de base Matériel courant de laboratoire microbiologique,

y compris :
Pour la préparation des milieux de culture et des
réactifs, utiliser des ingrédients de qualité homogène et 4.1 Four à air chaud pour stérilisation en chaleur
des produits chimiques de qualité analytique ; suivre les sèche et autoclave
instructions données dans "le tableau B" ( Pour des
informations sur la conservation, voir la méthode de Outre l'appareillage livré stérile, la verrerie et tout autre
dénombrement des micro-organismes sur milieu de matériel doivent être stérilisés conformément aux
culture). Il est possible également d'utiliser des milieux instructions données dans la méthode de dénombrement
complets déshydratés, suivre alors à la lettre les des microorganismes sur milieu de culture.
instructions les concernant.
4.2 Incubateur ou bain d'eau, réglable à 35 °C ±
Pour la préparation des milieux, utiliser de l'eau distillée
0,5 °C ou à 37 °C ± 0,5 °C.
ou de l'eau désionisée, exempte de substances susceptibles
d'inhiber la croissance bactérienne dans les conditions de
4.3 Incubateur ou bain d'eau, réglable à 44 °C ±
l'essai.
0,25 °C ou à 44,5 °C ± 0,25 °C.
3.2 Diluant
4.4 pH-mètre.
Pour préparer les dilutions de l'échantillon, utiliser l'un
des diluants recommandés dans le "tableau "B." Préparer 5. ÉCHANTILLONNAGE
le diluant conformément aux instructions données dans" le
tableau «B». Prélever les échantillons et les transmettre au
laboratoire conformément à la méthode de dénombrement
3.3 Milieux d'isolement des micro-organismes sur milieu de culture.
Utiliser un ou plusieurs des milieux de culture suivants : 6. MODE OPÉRATOIRE
Les instructions pour la préparation sont données dans 6.1 Préparation de l'échantillon et ensemencement
"le tableau B". des milieux
3.3.1 Bouillon lactosé
Pour la préparation de l'échantillon et des dilutions et
3.3.2 Bouillon de Mac Conkey l'ensemencement des milieux d'isolement avec les prises
d'essai, suivre les instructions données dans la méthode de
3.3.3 Milieu lactosé amélioré au glutamate et au dénombrement des micro-organismes sur milieu de
formiate culture. Ensemencer des tubes à essai contenant un milieu
d'isolement double concentration avec des prises d'essai
3.3.4 Bouillon au lauryltryptose (lactose) de 5 ml ou plus.

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6.2 Incubation des tubes Note 2 : L'utilisation d'un bouillon tryptosé au

mannitol, au laurylsulfate et au tryptophane permet de
Faire incuber les tubes ensemencés à 35 °C ± 0,5 °C ou montrer la production de gaz et d'indole par les
à 37 °C ± 0,5 °C pendant 48 h. escherichia coli.

6.3 Examen des tubes à essai Note 3 : La détection d'escherichia coli présumés est
considérée comme une preuve suffisante de pollution
Examiner les cultures en tubes à essai après incubation fécale. Toutefois, des essais complémentaires des
pendant 18 h à 24 h et considérer comme réactions escherichia coli peuvent être effectués, si nécessaire (6.5).
positives, les tubes présentant une turbidité due à une
croissance bactérienne et à la formation de gaz dans les Note 4 : Lorsqu'on procède à des repiquages de
cloches de Durham, ainsi qu'une production d'acide si le colonies sur membranes dans des tubes de milieux de
milieu d'isolement contient un indicateur de pH. Faire confirmation, il est préférable de repiquer également sur
incuber à nouveau les tubes à essai qui ne présentent boîte de milieu nutritif gélosé pour l'essai à l'oxydase.
aucun de ces changements et les examiner à nouveau
après 48 h pour rechercher une réaction positive. 6.5 Essai à l'oxydase

6.4 Essais de confirmation Certaines bactéries présentes dans l'eau peuvent, à de

nombreux égards, être conformes à la définition des
Il convient de noter que les réactions positives dans les organismes coliformes, mais elles ne peuvent produire de
tubes à essai contenant un milieu d'isolement n'indiquent gaz à partir du lactose qu'à des températures inférieures à
que la présence d'organismes coliformes présumés. Il est 37 °C. Elles donnent donc des résultats négatifs lors des
donc important de procéder à des essais de confirmation. essais de confirmation normalisés pour les organismes
coliformes et leur présence dans l'eau n'est donc pas
considérée comme significative. Parce que les espèces
6.4.1 Repiquage, incubation et examen
d'aéromones qui se présentent naturellement dans l'eau
interfèrent seulement à une température de 37 °C et en
Faire un repiquage à partir de chaque tube de milieu dessous, il est seulement nécessaire d'effectuer l'essai à
d'isolement présentant un résultat positif dans un ou l'oxydase en déterminant des coliformes.
plusieurs tubes contenant des milieux de confirmation
(3.4) pour la production de gaz et d'indole.
6.5.1 Effectuer l'essai à l'oxydase avec des cultures
pures d'organismes en faisant fermenter le lactose,
Note 1 : Si on utilise le bouillon lactosé le moins cultivés sur un milieu nutritif à la gélose, comme suit :
inhibiteur pour l'isolement, il est recommandé de repiquer
sur l'un des deux milieux de confirmation les plus sélectifs — placer 2 ou 3 gouttes de réactif à l'oxydase
[bouillon (bilié) lactosé au vert-brillant ou bouillon EC] nouvellement préparé (3.5.2) sur un papier filtre dans une
pour confirmation. boite de pétri ;
— avec une tige de verre, un coton-tige ou une boucle
[Link] Organismes coliformes
en platine (non en nickel-chrome), étaler une partie de la
culture sur le papier filtre préparé (voir note 4) ;
Pour confirmer la présence d'organismes coliformes,
faire incuber un tube à essai de bouillon (bilié) lactosé au — considérer l'apparition d'une coloration bleu violet
vert-brillant (3.4,1.1) à 35 °C ou à 37 °C et rechercher la foncé dans les 10 s comme une réaction positive.
production de gaz dans les 48 h.
Note 5 : Chaque fois qu'est employé le réactif à
[Link] Organismes coliformes thermotolérants et l'oxydase, effectuer des essais de contrôle avec des
escherichia coli présumés cultures d'organismes connues pour donner une réaction
positive (Pseudomonas aeruginosa) ainsi qu'avec une
Pour confirmer la présence d'organismes coliformes culture donnant une réaction négative (escherichia coli).
thermotolérants, faire incuber un autre tube à essai de
milieu EC ([Link]) à 44 °C pendant 24 h et rechercher la 7. EXPRESSION DES RÉSULTATS
production de gaz.
A partir du nombre de tubes de milieu d'isolement ayant
Pour confirmer la présence d'escherichia coli présumés, donné des réactions positives aux essais confirmatifs,
faire incuber un tube à essai d'eau tryptonée (3.4.2) pour calculer, par référence aux tables statistiques de la
la recherche d'indole à 44 °C pendant 24 h. Puis ajouter méthode de dénombrement des micro-organismes sur
0,2 ml à 0,3 ml de réactif de Kovacs (3.5.1) dans le tube milieu de culture, le nombre le plus probable d'organismes
contenant de l'eau tryptonée : l'apparition d'une coloration coliformes, d'organismes coliformes thermotolérants et
rouge après l'avoir mélangé avec précaution indique la d'escherichia coli présumés présents dans 100 ml
présence d'indole. d'échantillon.

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Tableau A Bouillon de MacConkey

Informations microbiologiques complémentaires Milieu double concentration.

liées à l'examen de l'eau et à la recherche d'organismes
du groupe coliforme Sels Biliés ............................................................... 10 g
Peptone ................................................................... 40 g
Pour l'examen de routine de l'eau, le groupe coliforme
peut être décrit généralement en termes microbiologiques Lactose .................................................................... 20 g
quoique non taxonomiques comme suit :
Chlorure de sodium ................................................ 10 g
les organismes coliformes sont des bactéries en forme Pourpre de bromocrésol [solution éthanolique à 1%
de bâtonnets, Gram négatif, ne formant pas de spores, (V/V)] ................................................................... 2 ml
présentant une réaction négative à l'oxydase, pouvant
croître en aérobiose, et éventuellement en anaérobiose en Eau distillée ...................................................... 1000 ml
présence de sels biliés (ou autre dérivé tensio-actif
présentant des propriétés d'inhibition de croissance — dissoudre la peptone, le chlorure de sodium et les
similaires), et également capables de faire fermenter le sels biliés dans l'eau en chauffant et conserver à 4 °C
lactose (et le mannitol) avec production d'acide, de gaz et pendant toute une nuit. Filtrer alors que le mélange est
d'aldéhyde dans les 48 h lorsqu'on les fait incuber à une froid, ajouter le lactose et dissoudre.
température comprise entre 35 °C et 37 °C.
— ajuster le pH à 7,4 ± 0,2 et ajouter le pourpre de
bromocréso1. Obligatoire
Les organismes coliformes thermotolérants sont des
organismes coliformes qui présentent les mêmes Milieu simple concentration
propriétés biologiques et de fermentation lorsqu'on les fait
— Préparer le milieu simple concentration par dilution
incuber à une température de 44 °C à 44,5 °C.
du milieu double concentration avec un volume égal d'eau
distillée ou le préparer directement en divisant par deux la
les escherichia coli présumés sont des organismes concentration des ingrédients.
coliformes thermotolérants qui sont également capables de
produire de l'indole à partir du tryptophane. — Répartir le milieu simple concentration par volumes
de 5 ml et le milieu double concentration par volumes de
On peut considérer comme un escherichia coli 10 ml ou 50 ml dans des tubes à essai ou des flacons
présumé, un escherichia coli qui donne également un contenant une cloche de Durham. Placer en autoclave à
résultat positif lors de l'essai au rouge de méthyle et peut 115 °C pendant 10 min.
décarboxyler de l'acide L-glutamique, mais qui n'est pas Milieu lactosé amélioré au glutamate et au formiate
capable de produire de l'acétylméthylcarbinol, d'utiliser le
citrate comme seule source de carbone ou de croître dans Milieu double concentration
un bouillon au cyanure de potassium (KCN).
Lactose .................................................................... 20 g
Tableau B
Sel de sodium de l'acide L( +) glutamique .......... 12,7 g
Milieux de culture, réactifs et diluants Monochlorhydrate de L(+) arginine .................. 0,048 g

MILIEU D'ISOLEMENT Acide L( -) aspartique .......................................... 0,04 g

L(-) Cystine ......................................................... 0,04 g
Bouillon lactosé
Formiate de sodium ............................................... 0,5 g
Milieu double concentration
Monohydrogénophosphate de potassium .............. 1,8 g

Peptone ................................................................... 10 g Chorure d'armmonium .............................................. 5 g

Sulfate de magnésium (MgS04, 7H20) ................ 0,02 g
Lactose .................................................................... 10 g
Chlorure de calcium (CaCI2, 2H20) .................... 0,02 g
Extrait de viande ....................................................... 6 g
Cristaux de citrate de fer (III) .............................. 0,02 g
Eau distillée ...................................................... 1000 ml Thiamine (hydrochlorure d'aneurine) ................ 0,002 g
Acide nicotinique ............................................... 0,002 g
— dissoudre les ingrédients dans de l'eau bouillante.
Acide pantothénique .......................................... 0,002 g
— ajuster le pH si nécessaire de sorte qu'après Pourpre de bromocrésol [ solution à 1 % (m/m) dans
stérilisation il soit de 6,9 ± 0,2. Préparer un milieu simple l'éthanol] ............................................................... 2 ml
concentration par dilution du milieu double concentration
Eau distillée, compléter à ................................. 1000 ml
avec un volume égal d'eau distillée.

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Le milieu est préparé de préférence par quantités de Afin de préparer 10 l de milieu double concentration,
10 litres ou plus, s'il n'est pas réparti dans des tubes à essai dissoudre les quantités appropriées de sel de sodium,
immédiatement, il convient de ne pas incorporer le lactose acide L( +) glutamique, de formiate de sodium,
et la thiamine et de les ajouter uniquement avant monohydrogénophosphate de potassium, de chlorure
l'utilisation. Il est plus facile d'ajouter certains ingrédients d'ammonium et de sulfate de magnésium dans 9 l d'eau
sous forme de solutions séparées préparées comme suit : distillée chaude. Puis ajouter la totalité des solutions 1, 2,
3 et 4 et 4 ml de la solution 5. Ajuster le pH à 6,8 ou plus,
Solution 1 si nécessaire, de sorte que le pH final après stérilisation
soit de 6,7. Si le même matériel et les mêmes méthodes de
Monochlorate de L(+) arginine ............................ 0,4 g stérilisation sont utilisés, il devrait toujours se produire la
même variation de pH au cours de la stérilisation. Des
Acide L(-) aspartique .......................................... 0,48 g essais préliminaires peuvent être nécessaires pour établir
Eau distillée .......................................................... 50 ml le pH correct avant stérilisation.

Après ajustement du pH, ajouter 20 ml d'une solution

Chauffer pour dissoudre. éthanolique à 1% de pourpre de bromocrésol. Compléter
pour obtenir un volume final de 10 l. Ceci devrait
Solution 2 nécessiter environ 810 ml d'eau distillée. Si le milieu
entier n'est pas utilisé immédiatement, le mettre en
L(-) cystine ............................................................ 0,4 g bouteille de 500 ml et le placer à l'autoclave à 115 °C
hydroxyde de sodium (5 mol/l) ............................ 10 ml pendant 10 min. Pour l'emploi, ajouter si nécessaire, une
quantité de lactose et de solution de thiamine (solution 6),
Eau distillée .......................................................... 90 ml laisser dissoudre, puis répartir en prises de 10 ml et 50 ml.
Chaque tube à essai ou flacon doit contenir une cloche de
Durham. Il est important de s'assurer, qu'après passage à
Chauffer pour dissoudre. l'autoclave et avant l'emploi, la cloche de Durham soit
Solution 3 complètement remplie de milieu. Sinon, on risque
d'obtenir un résultat positif erroné pour la production de
gaz. Stériliser à 115 °C pendant 10 min ou placer dans
Acide nicotinique ................................................. 0,02 g
une étuve à 100 °C durant 30 min pendant trois jours
Acide pantothénique ............................................ 0,02 g consécutifs.
Eau distillée ............................................................ 5 ml Milieu simple concentration
— préparer un milieu simple concentration en diluant le
Chauffer à froid. milieu double concentration avec un égal volume d'eau
distillée et répartir, en volume de 5 ml, dans des tubes
Solution 4 contenant une cloche de Durham ;
Cristaux de citrate de fer ....................................... 0,2 g — stériliser à 115 °C pendant 10 min ou placer dans
une étuve à 100 °C durant 30 min pendant trois jours
Eau distillée .......................................................... 10 ml consécutifs

Chauffer pour dissoudre. Note 6 : L'addition d'hydrolysat de caséine à 0,1%

(m/m) exempt de vitamine peut donner des résultats plus
Solution 5 rapides.

Chlorure de calcium (CaCl2, 2H20) .......................... 5g Bouillon tryptosé au laurylsulfate

Eau distillée ........................................................ 100 ml
Milieu double concentration
Acide chlorhydrique concentré ........................... 0,1 ml
Tryptose .................................................................. 40 g
Dissoudre à froid et stériliser à 121 °C pendant 20 min.
Conserver comme solution mère. Lactose .................................................................... 10 g

Solution 6 Chlorure de sodium ................................................ 10 g

Solution de thiamine à 0,1 % stérile dans de l'eau Monohydrogénophosphate de potassium .............. 5,5 g
distillée.
Dihydrogénophosphate de potassium .................... 5,5 g
Il est préférable de préparer cette solution en ajoutant le
contenu d'une ampoule (100 mg) de façon aseptique à 99
Laurylsulfate de sodium de haute pureté ............... 0,2 g
ml d'eau distillée stérile. Cette solution doit être conservée
à 4 °C et ce qui reste de cette solution éliminé après un
Eau distillée ...................................................... 1000 ml
délai de 6 semaines.

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— ajouter le tryptose, le chlorure de sodium, le lactose Eau tryptonée (pour réaction à l'indole)
et les phosphates à l'eau et chauffer pour dissoudre ;
— ajouter le laurylsulfate de sodium et mélanger Certaines peptones donnant des résultats satisfaisants
doucement pour éviter la formation de mousse ; dans les essais à 35 °C ou 37 °C ne sont pas satisfaisantes
pour l'essai à l'indole à 44 °C. La tryptone s'est avérée
— ajuster le pH à 6,8 ± 0,2 ; satisfaisante et est recommandée.
— préparer un milieu simple concentration en diluant le
milieu double concentration avec un volume égal d'eau Tryptone ................................................................. 20 g
distillée ;
— répartir le milieu simple concentration en volumes Chlorure de sodium .................................................. 5 g
de 5 ml et le milieu double concentration en volumes de
10 ml et de 50 ml. Chaque tube à essai ou flacon doit Eau distillée ...................................................... 1000 ml
contenir une cloche de Durham ;
— placer à l'autoclave à 115 °C pendant 10 min ; — dissoudre les ingrédients dans l'eau et ajuster le pH à
7,5 ;
MILIEUX DE CONFIRMATION
— Répartir en volume de 5 ml et placer à l'autoclave à
Bouillon (bilié) lactosé au vert-brillant (pour production 115 °C pendant 10 min ;
de gaz)
Note 7 : L'addition de tryptophane D ou DL à 0,1%
Peptone ................................................................... 10 g (m/m) peut améliorer la performance du milieu.

Lactose .................................................................... 10 g Bouillon tryptosé au mannitol, au laurylsulfate et au

tryptophane
Bile de bœuf déshydratée ....................................... 20 g
(Flacon unique pour production de gaz et d'indole)
Vert-brillant [solution à 0,1 %( m/m)] ................. 13 ml
Eau distillée, compléter à................................. 1000 ml Tryptose .................................................................. 20 g
Manitol ..................................................................... 5 g
— dissoudre la peptone dans 500 ml d'eau distillée ;
Chlorure de sodium .................................................. 5 g
— ajouter 20g de bile de bœuf déshydratée dissoute
dans 200 ml d'eau distillée. Cette solution devrait avoir un Monohydrogénophosphate de potassium ........... 2, 75 g
pH compris entre 7,0 et 7,5 ;
Dihydrogénophosphate de potassium .................. 2,75 g
— compléter avec de l'eau distillée à environ 975 ml ;
— ajouter le lactose et ajuster le pH à 7,4 ; Laurylsulfate de sodium ........................................ 0,1 g

— ajouter la solution de vert-brillant et compléter avec Tryptophane L(-) ................................................... 0,2 g

de l'eau distillée à 1000 ml ;
Eau distillée ...................................................... 1000 ml
— répartir en prises de 5 ml dans des tubes à essai
contenant des cloches de Durham renversées et placer à
l'autoclave à 115 °C pendant 10 min. — ajouter à l'eau le tryptose, le chlorure de sodium, le
mannitol, les phosphates et le tryptophane et chauffer pour
Milieu (EC) (pour production de gaz) dissoudre ;
— ajouter le laurylsulfate de sodium et mélanger
Tryptose ou trypticase ............................................ 20 g doucement pour éviter la formation de mousse ;
Lactose ...................................................................... 5 g — ajuster le pH à pH 6,8 ± 0,2 ;
Mélange de sels biliés ou sels biliés n° 3 .............. 1,5 g — répartir par volumes de 5 ml dans des tubes
Monohydrogénophosphate de potassium ................. 4 g contenant une cloche de Durham ;

Dihydrogénophosphate de potassium .................... 1,5 g — placer à l'autoclave à 115 °C pendant 10 min.

Chlorure de sodium .................................................. 5 g RÉACTIFS

Eau distillée ...................................................... 1000 ml Réactif de Kovacs pour l'indole

Avant stérilisation, répartir dans des tubes à essai de p-Diméthylaminobenzaldéhyde ................................ 5 g

sorte que le milieu recouvre au moins partiellement la
cloche de Durham après stérilisation. Alcool amylique ................................................... 75 ml

Acide chlorhydrique (p = 1,18 g/ml) .................... 25 ml

Le pH devrait être de 6,9 après stérilisation.

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16 juin 2013

— dissoudre l'aldéhyde dans l'alcool amylique ; — dissoudre les ingrédients et répartir en volumes
utilisables ;
— ajouter l'acide concentré avec soin. Mettre à l'abri de
la lumière et conserver à 4 °C. — stériliser à l'autoclave à 121 °C ± 1 °C pendant 15
min. Le pH final devrait être de 7,0 ± 0,1.
Note 8 : La coloration du réactif doit aller du jaune clair
au brun clair; certains échantillons d'alcool amylique Solution tampon au phosphate
s'avèrent insatisfaisants et donnent une coloration foncée
avec l'aldéhyde.
Dihydrogénophosphate de potassium ............... 42,5 mg
Réactif à l'oxydase
Chlorure de magnésium ..................................... 190 mg
Dichlorate de p-phénylène diamine ....................... 0,1 g
Eau distillée ...................................................... 1000 ml
Eau distillée .......................................................... 10 ml

Ce réactif ne se conserve pas et doit donc être préparé en Préparation

petites quantités avant chaque utilisation.
a) Solution de phosphate
DILUANTS
Diluant à la peptone (0,1 %) — dissoudre 34 g de phosphate dans 500 ml d'eau
distillée ;
Peptone ..................................................................... 1 g
— ajuster le pH à 7,2 ± 0,5 avec une solution
Eau distillée ...................................................... 1000 ml d'hydroxyde de sodium à 1 mol/l et compléter à 1000 ml
avec de l'eau distillée.
— dissoudre la peptone dans environ 950 ml d'eau ;
— ajuster le pH avec la solution d'hydroxyde de sodium b) Solution de chlorure de magnésium
ou une solution d'acide chlorhydrique (l mol/l) de sorte
qu'après stérilisation, il soit de 7,0 ± 0,1 ; dissoudre 38 g de chlorure de magnésium dans
1000 ml d'eau distillée.
— compléter avec de l'eau pour obtenir 1000 ml,
répartir en volumes utilisables et placer à l'autoclave à Solution finale
121 °C ± 1 °C pendant 15 min.
Solution saline peptonée Pour l'utilisation, ajouter 1,25 ml de la solution de
phosphate (a) et 5,0 ml de solution de chlorure de
Peptone ..................................................................... 1 g magnésium (b) à 1000 ml d'eau distillée. Répartir en
volumes utilisables et stériliser à l'autoclave à 121 °C ±
Chlorure de sodium ............................................... 8,5 g 1 °C pendant 15 min. Le pH final doit être de 7,0 ± 0,1.
Eau distillée ...................................................... 1000 ml
Gélose nutritive

— dissoudre les constituants dans environ 950 ml d'eau

portée à ébullition ; Extrait de viande .................................................... 1,0 g

— ajuster le pH avec l'hydroxyde de sodium ou la Peptone .................................................................. 1,0 g

solution d'acide chlorhydrique (l mol/l) de sorte qu'après
stérilisation il soit de 7,0 ± 0,1 ; Chlorure de sodium ................................................. 5 g

— compléter avec de l'eau pour obtenir 1000 ml, Gélose ..................................................................... 15 g

répartir en volumes utilisables et placer à l'autoclave à
121 °C ± 1 °C pendant 15 min.
— verser les ingrédients dans l'eau et chauffer pour
Solution de Ringer (diluée au quart) dissoudre ;

Chlorure de sodium ............................................. 2,25 g — ajuster le pH à environ 8,2 au moyen d'hydroxyde de

sodium (l mol/l) et faire bouillir pendant 10 min ;
Chlorure de potassium ..................................... 0, 1 05 g
Chlorure de calcium (anhydre) ............................ 0,12 g — clarifier par filtration et régler le pH à 7,2 ±7,4 ;

Hydrogénocarbonate de sodium ......................... 0,05 g — répartir dans des flacons de 100 ml de

Eau distillée ...................................................... 1000 ml capacité et passer à l'autoclave à 121 °C ± 1 °C
pendant 15 min.

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