PLATEFORME DE GENOMIQUE FONCTIONNELLE

LABORATOIRE DE BIOTECHNOLOGIES
UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP VEGETALES
DAKAR, SENEGAL

COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

Pour les étudiants de Licence 2 SV

Chapitre II : Les Outils du Génie Génétique

Dr. DIAGA DIOUF

Professeur titulaire
Chapitre IV : La mutagénèse

1. La mutagénèse dirigée
1.1. La mutagénèse dirigée par PCR
1.2. La mutagénèse dirigée par PCR inverse
2. La mutagénèse aléatoire
2.1. La mutagénèse physique
2.2. La mutagénèse chimique
2.3. L’application en amélioration végétale
2.4. Mutagénèse par insertion
2.4.1. Transformation génétique des bactéries
2.4.1.1. Transformation génétiques des bactéries pour la production
d’insuline humaine
2.4.2. Transformation génétique des plantes
2.4.2.1. Méthode directe : utilisation du canon à particules
2.4.2.2. Méthode indirecte : utilisation d’Agrobacterium
2.4.2.3. Application de la transgénèse végétale à l’amélioration des
plantes
2.4.3. La transgénèse animale
2.4.3.1. Application de la transgénèse animale pour l’amélioration de la
production
 mutagénèse
La mutagénèse est la modification de la séquence d’ADN soit au hasard, on parle de
mutagénèse aléatoire ou à un endroit précis, on parle de mutagénèse dirigée.

Mutagénèse Mutagénèse
dirigée

Mutagénèse
aléatoire

Mutagénèse par
insertion

Mutagénèse
Mutagénèse chimique
physique

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 Mutagénèse dirigée
Mutation dirigée à partir d’un ADN double brin:
Par PCR inverse
La mutation est induite à un endroit précis au niveau de la séquence
d’ADN. Elle est induite en utilisant un ADN simple brin ou un
ADN double brin.

On amplifie avec deux amorces dont l’une

porte une mutation

Après la PCR on réalise une ligation

Les amplifiats ou bien les amorces sont phosphorylés afin de permettre la ligation

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On réalise deux amplifications séparées, chacune avec un oligonucléotide externe et un
oligonucléotide portant la mutation. Les deux fragments obtenus séparément sont ensuite
amplifiés ensemble avec les deux amorces les plus externes. On digère ensuite les deux
extrémités par des enzymes de restriction et on ligature dans le plasmide original.

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 Mutagénèse par insertion

Utilisation
-d’Agrobacterium tumefaciens permet d’insérer d’une manière stable et au hasard des
gènes dans le génome des plantes
- de transposons ou de rétrotransposons ce qui a permis de caractériser certains gènes
- d’ARNi (ARN interférant)

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 Transformation génétique des bactéries et sélection sur milieu
de culture
ADN étranger
Gène de résistance
à un antibiotique
Gène de
résistance Gène d’intérêt
à un antibio-
tique

Culture sur milieu

+ antibiotique
Plasmide n’ayant
pas intégré ADN recombinant
le nouveau gène introduire par
Bactérie électroporation

Clonage
(multiplication) chromosome

Seules les bacéries ayant

l’ADN recombinant poussent
sur le milieu sélectif

Clones
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 Structure primaire de l’insuline humaine

Production de l’insuline humaine par génie génétique

Méthode 1. Production de bactéries compétentes

Elle consiste à cultiver les bactéries (généralement E. coli) sur un milieu

contenant du CaCl2 afin de fragiliser leur paroi pour favoriser l’entrée de
l’ADN (plasmide recombinant qui porte le gène qui code pour l’insuline).

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 Production de l’insuline par génie génétique
2. Production séparée des deux chaines

Introduction des plasmides dans

des bactéries compétentes

Culture des bactéries dans un

milieu contenant de l’ampicilline.
On induit l’expression du gène qui
code pour chaque chaine de
l’insuline

Extraction de chaque chaîne

séparément et clivage

Purification des chaines A et B

On incube ensemble les deux chaines

A et B en présence d’enzymes
appropriées pour l’établissement des
ponts disulfures intra et interchaines.

Méthode 2. Production de la pro-insuline puis élimination du peptide C

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 Transformation génétique des plantes

Il existe deux méthodes: méthode directe et méthode indirecte

1. Transfert direct d’ADN par canon à particules

Canon à particules

Particule d’or de tungsten enveloppée

d’ADN

Cellule ayant Culture dans un milieu Régénération

Intégré l’ADN de sélection (antibiotique de plante Acclimatation
étranger ou sucre) en serre

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 2. Transfert indirect d’ADN par Agrobacterium tumefaciens

Chromosome Plasmide

Agrobacterium transfère un fragment d'ADN (l'ADN-T) dans le génome

de la plante

L'infection de la plante par Agrobacterium tumefaciens induit le développement d'une galle

suit au transfert d’un fragment d’ADN (ADN-T)
Plantes hôtes: en majorité les dicotylédones (mais pas toutes)

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 Carte du plasmide Ti d’Agrobacterium tumefaciens

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 Mécanisme de transfert direct de l’ADN-T

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Processus d’obtention de plantes transgéniques grâce à A. tumefaciens

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 Application de la transgénèse végétale

Maïs BT Pyrale (Ostrinia nubilalis)

La pyrale adulte (papillon)
pond des œufs lesquels
évoluent en larves (chenilles)
Pyrale qui ravagent les cultures

Œuf de pyrale Chenille ravageuse

Œuf de pyrale

Dégâts de la pyrale sur le maïs

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 Transgénèse animale
1. Microinjection
La microinjection est la première technique mise au point pour obtenir des animaux
transgéniques. Elle a été mise au point par Gordon et al. en 1980. Après injection dans
le pronucleus, l’ADN va s’intégrer dans le génome mais on ne sait pas le site
d’intégration du gène étranger

Œuf fécondé

microinjection de l’ADN dans

Le pronucleus mâle
Pipette aspirante pour tenir
la cellule

Cellule hôte Implantation

dans l’utérus
de la femelle

Souris transgénique (génétiquement modifiée)

Gordon et al. (1980). Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 77:
7380-7384.

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 2. Transfert de gènes dans des cellules souches
Les cellules souches sont des cellules embryonnaires totipotentes (propriété d’une
cellule de se différencier en n’importe cellule pour donner un individu entier). Elles
sont isolées à partir de la masse cellulaire interne d'un blastocyste

Cellules souches contenant le gène

d’intérêt

Lot de cellules internes

microinjection

blastocyste

Implantation du blastocyste dans l’utérus d’une femelle

Souris transgénique (génétiquement modifiée) ayant des

cellules provenant du blasotcyste et des cellules souches

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 3. Transfection d'embryons précoces avec des vecteurs
porteurs d’un gène d'intérêt
Plasmide
portant
un gène d’intérêt Transfert dans l’utérus
d’une souris

Injection dans le noyau

Souris transgénique (génétiquement modifiée)

Ex: Etude la fonction d’un gène: Inactivation du gène BMP-7 par
recombinaison homologue
- Agénésie oculaire
- Hypoplasie rénale
Wild-type BMP7-/- Wild-type BMP7-/-

(Dudley et al., 1995)

Le gène BMP7 est nécessaire à l’organogenèse de l’oeil et du rein
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 Applications de la transgénèse animale

Augmentation de la production de lait chez le porc et la croissance des

descendants suite à l’introduction du gène α-lactalbumine bovine. Augmentation
de la production accroît la survie des petits

Réduction de la pollution par introduction du gène de la phytase (gène

bactérien). Expression spécifique dans les glandes salivaires d’où digestion de la
phytate et moins de pollution par phosphore de l’environnement.

Réduction du temps d’élevage suite à une croissance rapide

Lutter contre le paludisme

Mieux comprendre le développement de certaines maladies et dégager des

solutions

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