‫ا ﻟﺟﻣﮭورﯾﺔ اﻟﺟزاﺋرﯾﺔ اﻟدﯾﻣﻘراطﯾﺔ اﻟﺷﻌﺑﯾﺔ‬

RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

‫وزارة اﻟﺗﻌﻠﯾم اﻟﻌﺎﻟﻲ و اﻟﺑﺣث اﻟﻌﻠﻣﻲ‬

MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université des Frères Mentouri Constantine ‫ﺟﺎﻣﻌﺔ اﻻﺧوة ﻣﻧﺗوري ﻗﺳﻧطﯾﻧﺔ‬

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie ‫ﻛﻠﯾﺔ ﻋﺎوم اﻟطﺑﯾﻌﺔ و اﻟﺣﯾﺎة‬

Département: Microbiologie ‫ﻣﯿﻜﺮﺑﯿﻮﻟﻮﺟﻲ‬: ‫ﻗﺴﻢ‬

Mémoire présenté en vue de l’obtention du Diplôme de Master

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie
Filière : Sciences Biologiques
Spécialité : Ecologie Microbienne

Intitulé :

Caractérisation des bactéries isolées d’un sol destiné à la culture

céréalière
Approches phénotypique et Bioinformatique

Présenté et soutenu par: BOULEKZAZ WASSILA Le : 15/06/2015

BOUDERBALA MERIEM

Jury d’évaluation :

Présidente du jury : Mme SAKHRI N. Maitre de Conférences B Université

Frères Mentouri Constantine

Examinatrice : Mme GUERGUOURI I. Maitre Assistant A Université frères

Mentouri Constantine

Rapporteur : HAMIDECHI M. A. Pr. Université Frères Mentouri

Constantine

Année universitaire
2014 - 2015
Table des matières

Dédicaces ………………………………………………………………………………….. i
Remerciements …………………………………………………………………………… ii
Listes des figures …………………………………………………………………………. iii
Liste des tableaux ………………………………………………………………………… iii
Liste des photos …………………………………………………………………………… iv
Liste des annexes …………………………………………………………………………. v
Liste des abréviations et acronymes …………………………………………………….. vi
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
Introduction ……………………………………………………………………………….. 1
1-LES BACTERIES DU SOL ……………………………………………………………… 3
2- ELEMENTS DE LA SYSTEMATIQUE BACTERIENNE ……………………………. 4
2-1 Systématique à l’échelle phénétique ………………………………………………... 4
2-1-1 Analyse des caractères morphologiques ……………………………………… 4
2-1-2 Analyses des caractéristiques biochimiques et métaboliques ………………….. 5
2-1-3 Caractérisation physiologique …………………………………………………... 5
2-2 Systématique à l’échelle biomoléculaire (Données et outils) ……………………….. 6
2-2-1 Méthodes génotypiques ………………………………………………………... 6
2-2-2 Les marqueurs moléculaires : Cas de l’ADN 16S ……………………………… 7
PARTIE EXPERIMENTALE
A- MATERIEL ……………………………………………………………………………………. 14
1- Description du site de prélèvement ……………………………………………………………… 14
2- Echantillonnage ………………………………………………………………………………….. 14
3- Outils bioinformatiques …………………………………………………………………………… 14
B- METHODES ……………………………………………………………………………………. 15
1-1 Isolement et purification ……………………………………………………………….. 15
1-2 Caractérisation présomptive des isolats bactériens ………………………………………… 16
1-2-1 Etude des caractères morphologiques ………………………………………………. 16
1-2-2 Métabolisme glucidique ……………………………………………………………. 17
1-2-3 Etude des enzymes respiratoires terminales …………………………………… 17
1-2-4 Étude des voies fermentatives intermédiaires des acides complexes ………… 18
1-2-5 Métabolisme protéique ………………………………………………………… 18
2-Analyse bioinformatique des séquences 16S ……………………………………………… 19
 2-1 Identification des isolats …………………………………………………………….. 19
2-2 Acquisition des séquences 16S via GenBank ……………………………….………. 19
2-3 Analyse thermodynamique de la structure secondaire des ARNr 16S ………………. 20
2-4 Analyse phylogénétique des isolats ………………………………………………….. 21
PARTIE RESULTATS
1- Analyse microbiologique du sol ………………………………………………………………….. 22
1-1 Caractérisation présomptive des isolats bactériens ………………………………………… 22
1-1-1 Aspects macro et microscopique ……………….………………………………. 22
1-1-2 Les caractères biochimiques ………………………………………………… 25
1-1-3 Les caractères physiologiques …………..…………………………………….. 27
2-Analyse bioinformatique des séquences 16S des isolats ………………………………… 28
2-1 Identification et classification des isolats …………………………………………… 28
2-2 Prédiction structurale secondaire et énergie libre des ARNr ………………………. 29
2-3 Analyse phylogénétique des isolats ………………………………………………… 32
DISCUSSION GENERALE ……………………………………………………………… 34
CONCLUSION ……………………………………………………………………………. 36
Références bibliographiques …………………………………………………………….. 37
Annexes
Glossaire
Résumés
 DEDICACES
Je dédie ce mémoire à :

Mes chers parents : qui ont œuvré pour ma

réussite, de par leur amour, leur soutien, tous les
sacrifices consentis et leurs précieux conseils,
recevez à travers ce travail aussi modeste soit-il,
l'expression de mes sentiments et de mon éternelle
gratitude.

Mes frères, Ma sœur MARWA et surtout de ma

nièce NOURSINE qui n'ont cessé d'être pour moi
des exemples de persévérance, de courage et de
générosité.

Mes enseignants de la spécialité d’Ecologie

Microbienne qu’ils trouvent dans ce travail la fierté
d'un savoir bien acquis.

WASSILA

i
 Dédicace
J’ai l’honneur de dédie ce modeste travail à :

Mes chers parent qui m’avez dirigé et suivi pondant

toute mes étude, leurs conseils m’ont suivi permis
d’atteindre le bous de chemin. Soient fiers de moi
aujourd ‘hui

Amon cher et tendre époux SEIF EDDINE je noublirais

jamais ta patience avec moi et ta grande générosité

Mes frères et sœurs qui n'ont cessé d'être pour moi des
exemples de persévérance, de courage et de générosité.

MA SŒUR : HANEN et son mari SABER et ses

enfants :RAGHAD ET CHAHD

A mes beaux parent ,vers lesquels j’ai un grand respect

A mes belles sœurs ;et mon beau frère HAMZA

Mes enseignants de la spécialité d’Ecologie

Microbienne qu’ils trouvent dans ce travail la fierté d'un
savoir bien acquis.

A tous mes camarades de promotion

Egalement je dédie ce travail à ma chère ILHEM et mes

amies : IMEN, SAMIHA, BESMA

MERIEM

ii
 REMERCIEMENTS
Nous tenons à exprimer notre plus profonde reconnaissance à :

Notre encadreur Pr HAMIDECHI M. A. pour son aide et sa précieuse attention,

Mme SAKHRI N. pour avoir accepté de présider notre jury et consacré de son
temps à la lecture de notre mémoire pour y apporter les meilleurs
perfectionnements

Mme GUERGOURI I. pour sa contribution à ce jury et pour avoir donné son

appréciation sur le contenu de ce travail

A vous tous nous adressons la plus forte expression de respect et d’hommage,

car vous avez tous été nos enseignants un jour

Un remerciement particulier est adressé à Mlle BOUYOUCEF Lilia, Doctorante

en Ecologie Microbienne, pour nous avoir assisté durant toute la période de
réalisation de ce travail.

iii
Liste des figures

Figure 1 : Structure du ribosome procaryote et ses sous-unités…………………………………….8

Figure 2 : Organisation de l'opéron de l'ADNr observé chez les procaryotes (El Hilali, 2006)……8

Figure 3 : Représentation schématique de la structure secondaire d’un ARN.……………….….....9

Figure 4 : Photographie satellitaire du site de prélèvement………………………………………………….13

Figure 5 : Phylogramme des cinq souches réalisé par la méthode NJ…………………………..…32

Liste des tableaux

Tableau 1 : Les amorces les plus fréquemment utilisées et leurs séquences………………….….12

Tableau 2 : Résultats des caractères phénotypiques des cinq isolats……………………………..22

Tableau 3 : Aspects macro et microscopique des isolats……………………………………..…..23

Tableau 4 : Classification des souches identifiées………………………………………….…….28

Tableau 5 : Structures secondaires d’ARNr 16S et l’énergie libre des souches identifiées….….29

Tableau 6 : Matrice des thermodynamiques des séquences rRNA 16S…………………………….……..31

Tableau 7 : Matrice des distances (%) après alignement multiple des séquences 16S rRNA….31

iv
Liste des photos

Photo 1 : Séchage du sol à température ambiante …………………………………………………14

Photo 2 : Tamisage du sol à 2 mm………………………………………………………………….14

Photo 3 : Aspects des différentes dilutions du sol (10-1 – 10-6)…………………………………….15

Photo 4 : Interface du Classeur Excel d’identification bactérienne……………………………...…18

Photo 5 : Interface de la base de données Nucleotide de NCBI montrant les résultats des séquences
16S………………………………………………………………………………………………..…19

Photo 6 : Interface du site Internet de RNA Fold web server……………………………………...19

Photo 7 : Interface principale du Portail Mobyle…………………………………………….…….20

Photo 8 : Interface de Mega 5.2………………………………………………………………..…..20

Photo 9 : Exemple de l’aspect du milieu Mannitol-Mobilité de l’isolat S4…………………….…24

Photo 10 : Résultat obtenu de la culture de S5 sur milieu TSI………………………………..…. 24

Photo 11 : Présence des LDC, ODC et ADH chez l’isolat S1……………………………………..25

Photo 12 : RM+ et VP- chez l’isolat S1 ……………………………………………………...….. 25

Photo 13 : RM- et VP+ chez l’isolat S5……………………………………………………..……..25

Photo 14 : Présence de la nitrate réductase chez l’isolat S2…………………………………...…..26

Photo 15 : Présence de l’uréase chez S3……………………………………………………...……26

Photo 16 : Absence de l’indole chez S3……………………………………………….…………..26

Photo 17 : Réaction positive au test de l’oxydase chez S1…………………………………………27

v
Liste des annexes
Annexe 1: Séquence 16S de Salmonella sp.

Annexe 2 : Séquence 16s de Chromobacterium violaceum

Annexe 3 : Séquence 16S de Pseudomonas fluorescens

Annexe 4: Séquence 16S de Enterobacter aerogenes

Annexe 5 : Séquence 16S de Enterobacter intermedius

Annexe 6 : Structure secondaire 2D 16S de Salmonella sp

Annexe 7 : Structure secondaire 2D 16S Chromobacterium violaceum

Annexe 8 : Structure secondaire 2D 16S|de Pseudomonas fluorescens

Annexe 9 : Structure secondaire 2D 16S Enterobacter aerogenes

Annexe 10 : Structure secondaire 2D 16S Enterobacter intermedius

Annexe 11 : Diagramme de l’énergie libre de salmonella sp

Annexe 12 : Diagramme de l’énergie libre de Chromobacterium violaceum

Annexe 13 : Diagramme de l’énergie libre de Pseudomonas fluorescens

Annexe 14 : Diagramme de l’énergie libre de Enterobacter aerogenes

Annexe 15 : Diagramme de l’énergie libre de Enterobacter intermedius

Annexe 16 : Diagramme de l’énergie libre de Salmonella sp. prédit par GenMark

Annexe 17 : Diagramme de l’énergie libre de Chromobacterium violaceum prédit par GenMark

Annexe 18 : Diagramme de l’énergie libre de Pseudomonas fluorescens prédit par GenMark

Annexe 19 : Diagramme de l’énergie libre de Enterobacter aerogenes prédit par GenMark

Annexe 20 : Diagramme de l’énergie libre de Enterobacter intermedius prédit par GenMark

Annexe 21 : Structure 2D consensuce des cinq séquences ARNr 16S

vi
Liste des abréviations et acronymes
ADH: Arginine DiHydrolase

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

dct: Dicarboxylate transport gene

EMBL: European Molecular Biology Laboratory

H2O2: Eau Oxygénée

H2S : sulfure d'hydrogène

ITS: Internal Transcribed Spacer

Kb: Kilobit

KNO3: Potassium nitrate

LDC: lysine décarboxylase

MEVAG : Milieu d’Etude de la Voie d’Attaque des Glucides

NaCl : chlorure de sodium

NCBI: National Centre for Biotechnology Information

nt: nucleotide

ONPG: Orthonitrophényl-β-galactoside

PCR: polymerase Chain Reaction

RDP: Ribosomal Database Project

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

RM: Rouge de Méthyle

rrs: ribosomal RNA small subunit

rrl: ribosomal RNA large subunit

S: Svedberg

vii
TDA: tryptophane désaminase

UniPro: Universal Protein Resource

VP: Voges-Proskauer

viii
 Partie Bibliographique

INTRODUCTION

Le sol est considéré, par excellence, le support de toute la biosphère continentale. Il permet aux
microorganismes d’effectuer toutes les formes métaboliques et physiologiques vitales afin de
préserver, à la fin, une chaine alimentaire équilibrée qui va du microorganisme au prédateur.

Certaines interactions sont importantes à signaler entre les différentes communautés du sol,
principalement, celles observées entre la bactérie et les racines des plantes : la symbiose. D’autres
fonctions peuvent également être attribuées au microbiote tellurique à savoir la décomposition de la
matière organique morte et le recyclage des éléments minéraux tels que le phosphore et l’azote.

C’est cet intérêt d’ordre agronomique qui a orienté la communauté scientifique (ici, les
microbiologistes) à isoler et identifier le microbiote du sol pour pouvoir utiliser les compétences de
celui-ci pour des rendements et des productions meilleurs.

Mais, les microbiologistes, particulièrement les systématiciens, se heurtent à des difficultés

insupportables du fait que l’identification formelle d’un tel ou tel isolat, n’est pas aussi facile ni
évidente face aux particularités spécifiques des différentes classes bactériennes et surtout que,
seulement une faible partie de cet ensemble bactérien (10%) est cultivable sur milieux de croissance
dans les laboratoires de microbiologie. De plus, les besoins nutritifs et les conditions
environnementales ne sont pas identiques entre les individus bactériens : On arrive à bien isoler les
bactéries organotrophes mais moins les lithotrophes.

Les méthodes d’identification sont bien nombreuses et regroupent plusieurs interfaces :

phénotypique, biomoléculaire, chimique, etc. et leur emploi requiert des connaissances
approfondies ; ce qui n’est pas évident au sein des utilisateurs de ces techniques.

C’est dans cette même perspective que nous avons tracé un plan de travail pratique afin de
proposer une approche, à la fois microbiologique classique (tests phénotypiques) et analytique in
silico (analyse bioinformatique des séquences d’ARNr 16S).

Les objectifs de ce travail se résument donc comme suit :

 Caractériser phénotypiquement les germes isolés à partir d’un sol de culture céréalière
 Confirmer les liens de parenté, à l’échelle de la systématique, entre les isolats bactériens
par une approche bioinformatique : comparaison des structures primaires des séquences
16S et prédiction de leurs structures 2D.

1
 Partie Bibliographique

Ce travail entre dans le cadre d’un projet de recherche CNEPRU (enregistré au Ministère de
l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique sous le code F00920140056) et est réalisé
au laboratoire de Biologie Moléculaire et Cellulaire intitulé : Biologie moléculaire et Phylogénie
des microorganismes.

Notons, enfin, que les séquences 16S de nos propres isolats devaient être fournies par l’institut
Pasteur de Paris (France) ; mais à défaut, nous avons utilisées celles de GenBank.

2
 Partie Bibliographique

1- LES BACTERIES DU SOL

La majorité des bactéries du sol sont hétérotrophes vis à vis du carbone et montrent une large
diversité quant aux rôles et fonctions exercés au sein de cet environnement. En effet, les bactéries
du sol, en dehors de leurs multiples interactions, vont réagir avec d’autres organismes tels que les
végétaux pour assurer des bénéfices réciproques représentés principalement par un métabolisme
énergétique qui va favoriser la multiplication du microbiote tellurique. Les végétaux, en sécrétant
dans le milieu extérieur des exsudats racinaires (molécules organiques, qui représentent, selon les
espèces, entre 5 et 40% du la carbone photo synthétisé !), vont 'réveiller' les bactéries qui vont
croitre et atteindre de fortes populations dans la zone rhizosphérique (jusqu'à 1010 à 1012 bactéries
par gramme de sol : entre 10 milliards et 1000 milliards !), bien plus que dans le sol environnant.
Cette sécrétion des produits synthétisés par la plante dans le sol par les racines porte le nom de
rhizodéposition. Sous le terme exsudats racinaires sont englobés diverses molécules organiques qui
différent selon les espèces de plantes.

On peut classer en trois grandes catégories les bactéries stimulées par la rhizodéposition :

- Les bactéries symbiotiques : c'est le cas des bactéries des genres Rhizobium,
Bradyrhizobium, Sinorhizobium et Azorhizobium. Elles vont permettre la nutrition azotée des
végétaux de la famille des Fabacées en fixant l'azote atmosphérique (N2).

Les fonctionnements de l'échange de stimuli qui précède la constitution de la nodosité sont

connus : les rhizobiums exercent une action stimulante sur la plante en synthétisant des flavanones
et chalcones à proximité des racines. Suite à l'accroche des bactéries en limite de zone d'élongation
de la racine. Puis elles 'infectent' les poils racinaires après qu'ils se soient recourbés en prenant une
forme de crosse, qui évoluera vers la nodosité. La plante répond aux stimuli des bactéries en
synthétisant des nodulines, précédant et accompagnant l'infection. Plusieurs gènes vont être
impliqués pour accompagner la symbiose, sur plusieurs actions :

- Déformation des poils racinaires,

- formation du cordon d'infection,

- morphogénèse de la nodosité,

- formation de la membrane enveloppante,

- alimentation énergétique des bactéries,

3
 Partie Bibliographique

- transport d'oxygène,

- assimilation de l'azote.

On peut aussi citer dans ce groupe une autre espèce fixatrice d'azote, chez les monocotylédones :
Azospirillum brasilense.

- la seconde, regroupe les bactéries qui vont stimuler la plante de manière indirecte :

- Soit en minéralisant des composés organiques, ces minéraux devenant absorbables par les poils
absorbants.

- Soit en rendant disponibles des éléments qui l'étaient peu, en sécrétant des acides organiques (ex :
solubilisation des phosphates calciques).

- Soit en contrôlant le développement de pathogènes (par production d'antibiotiques, par

parasitisme, ou par appauvrissement du milieu en éléments nutritifs).

- la troisième catégorie : regroupe des microorganismes stimulant la croissance du végétal, en

émettant des phytohormones (gibbérellines, cytokinines, acide indolacétique...), des vitamines et
certains acides aminés.

2- ELEMENTS DE LA SYSTEMATIQUE BACTERIENNE

2-1 Systématique à l’échelle phénétique

L'analyse préliminaire dans l'identification microbienne se fait souvent avec une ou plusieurs
méthodes phénotypiques. Les méthodes phénotypiques conviennent aux microorganismes qui sont
cultivables et qui ont des paramètres de croissance, ainsi qu'un profil physiologique et biochimique
bien établis.

2-1-1 Analyse des caractères morphologiques

Ces méthodes utilisent les colonies et la morphologie des cellules afin d'obtenir une
identification initiale du microorganisme. On y parvient en isolant simplement le microorganisme,
en le cultivant et par la suite en l'observant visuellement à l'aide d'un microscope. Les propriétés
morphologiques comprennent :

- La forme,
- la taille,

4
 Partie Bibliographique

- la pigmentation,
- les caractéristiques des parois cellulaires (coloration de Gram),
- les caractéristiques de sporulation,
- la motilité,
- les inclusions cellulaires et les caractéristiques ultrastructurales.

2-1-2 Analyses des caractéristiques biochimiques et métaboliques

Les méthodes d'identification phénotypiques comprennent l'étude du profil biochimique et des

propriétés métaboliques d'un microorganisme.

Les tests biochimiques utilisent des milieux de croissance, des éléments nutritifs et des produits
chimiques pour provoquer une réponse biochimique observable et mesurable chez le
microorganisme ; ce qui permet son identification et sa caractérisation. Ces tests comprennent :

- L'utilisation de sources de carbone et d'azote,

- la production d’intermédiaires de la fermentation,
- la production d'enzymes,
- la production de composés antimicrobiens.
- les tests d'oxydation / fermentation,
- les tests de Rouge de Méthyle (RM),
- les tests de Voges-Proskauer (VP),
- la réduction des nitrates,
- l'hydrolyse du tryptophane,
- la voie d’attaque des glucides test MEVAG (Milieu d’Etude de la Voie d’Attaque des
Glucides).

Plusieurs systèmes commerciaux miniaturisés et automatisés sont actuellement offerts et

permettent l'identification rapide des microorganismes.

2-1-3 Caractérisation physiologique

Basée sur l’étude du comportement des bactéries vis-à-vis des conditions naturelles ou
contrôlées du milieu dans lequel elles vivent, cette caractérisation peut être réalisée par :

- L’étude de l’influence des facteurs abiotiques sur la croissance bactérienne

5
 Partie Bibliographique

Certains facteurs abiotiques peuvent influencer et intervenir, de façon primordiale, dans la

croissance des bactéries et par conséquent dans l’obtention d’une culture optimale. Parmi ces
facteurs on trouve :
- La température de croissance (afin de déterminer l’intervalle de température dans lequel les
bactéries peuvent croitre en plus de la température optimale),
- le pH (capacité de croissance à des pH acides et basiques),
- la pression osmotique (capacité de croitre à différentes concentrations de NaCl),
- la pression partielle d’oxygène (détermination du mode respiratoire aérobie stricte/aéro-
anaérobie facultative /micro-aérophile /anaérobie stricte/ anaérobie aérotolérant).

- La recherche d’enzymes d’intérêt

Certaines enzymes ont une grande importance lors de l’établissement des critères de
l’identification des bactéries telles que :

- La catalase dont la principale fonction est de prévenir l’accumulation de niveaux toxiques de

peroxyde d’hydrogène (H2O2),
- L’oxydase est une enzyme présente dans certaines chaines respiratoires bactériennes et qui
catalyse une réaction d’oxydo-réduction en impliquant une molécule d’oxygène comme
accepteur final d’électrons,
- La nitrate-réductase dont le rôle est la réduction des nitrates en nitrites,
- Recherche de la β-lactamase (résistance aux antibiotiques β-lactames),
- Résistance aux métaux lourds : Des mécanismes de résistance aux métaux lourds tels que la
biominéralisation diffèrent de véritables résistances aux métaux lourds. Ces mécanismes sont liés
à la présence de gènes portés par les plasmides.

2-2 Systématique à l’échelle biomoléculaire (Données et outils)

La mise au point de méthodes moléculaires a grandement amélioré la capacité de déceler,

d'identifier et de classer les microorganismes rapidement et d'établir la relation taxonomique entre
les genres et les espèces étroitement apparentées. L'identification à l'aide de méthodes
moléculaires repose sur la comparaison de séquences d'acides nucléiques (ADN, ARN) ou des
protéines d'un microorganisme avec les données documentés d'organismes connus (bases et
banques de données).

6
 Partie Bibliographique

2-2-1 Méthodes génotypiques

Il s'agit des méthodes telles que l'hybridation d'acide nucléique et les technologies basées sur la
PCR et le séquençage. L’identification repose également sur des comparaisons de séquences
(Blasting et alignements) de régions génomiques hautement conservées telles que l'ARNr 16S ou
l’ARNr 18S, ou sur des RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), de AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism) ou pourcentage GC dans l'ADN, avec les données
correspondantes sur les organismes connus.

Une identification génotypique fiable nécessite des bases de données dotées d'informations
exactes et complètes sur des séquences obtenues auprès d'un grand nombre de taxons. Parmi les
bases de données de séquences de gènes couramment utilisées, on compte :

- GenBank,
- Ribosomal Database Project (RDP),
- European Molecular Biology Laboratory (EMBL),
- Universal Protein Resource (UniProt).

2-2-2 Les marqueurs moléculaires : Cas de l’ADNr 16S

Un marqueur biochimique et moléculaire est une protéine, une enzyme (isoenzyme) ou une
séquence d’ADN résultant d’un polymorphisme, facilement détectable et transmissible
génétiquement, dont l'expression est indépendante de l'environnement et peut être utilisé pour
caractériser les espèces bactériennes et évaluer leur diversité génétique aux niveaux intra- et inter-
populations. Parmi ces marqueurs on trouve :

Les gènes ribosomiques, plus particulièrement les gènes 16S et 23S, ont fait leur preuve en tant
que marqueurs moléculaires dans les études systématiques et phylogénétiques de différents
microorganismes en raison de leur universalité, leur abondance, leur taille convenable aux analyses
comparatives (Ludwig et Schleifer, 1999). Les ADNr contiennent par ailleurs des régions de
séquences hautement conservées, très utiles pour la désignation des amorces (Hillis et Dixon, 1991 ;
Stahl et Amman, 1991) et d'autres régions de séquences suffisamment variables pour servir comme
un excellent moyen taxonomique (Bouvert et Grimont, 1986).

Chez les procaryotes, le ribosome est formé de deux sous-unités:

- La petite sous-unité (30S) contient l’ARNr 16S et 21 protéines,

7
 Partie Bibliographique

- la grande sous-unité
unité (50S) contient respectivement deux ARNr différents (le 23S et le 5S)
et 31 protéines (Mears et al., 2002) (figure 1).

Ribosome assemblé Sous-unités Protéines ARNr

50S Total : 31

70S 5S 23S

30S Total : 21

16S

Figure 1 : Structure du ribosome procaryote et ses sous-unités.

sous

Les gènes codant pour ces trois ARNr sont organisés en opérons qui contiennent également des
espaces intra-géniques ainsi que d'autres gènes codant pour les ARNt (figure 2)
2).

Espaces Intra--géniques
Transcrits (ITS)

rrl rrf
rrs

5’ 3’

ADNr 16S ADNr 23S ADNr 5S ARNt

Figure 2 : Organisation de l'opéron de l'ADNr observé chez les procaryotes (El Hilali, 2006)

L'ADNr 5S est très peu utilisé dans les études de diversité vu sa petite taille d'environ 120
nucléotides. Contrairement à ce dernier, l'ADNr 16S codant pour la petite sous unité ribosomique
d'environ 1500 pb (opéron rrs)
rrs et l'ADNr 23S codant pour la grandee sous unité d'environ 2500 à

8
 Partie Bibliographique

3000 pb (opéron rrl) (Gürtler et Stanisich, 1996) sont très utilisés. L'espace entre les deux opérons
rrs et rrl est transcriptionnel d'où la désignation ITS (Normand et al., 1996). Il est aussi utilisé dans
les études phylogénétiques. Toutefois, depuis que Woese (1987) a montré que le gène de l'ADNr
16S est présent chez toutes les bactéries (universalité), qu'il a la même fonction et que sa structure
est conservée, plusieurs chercheurs l'ont préférentiellement utilisé comme une approche rapide pour
évaluer la variabilité génétique entre les souches de Rhizobia (Laguerre et al., 1994 ; Nour et al.,
1994b).

La structure secondaire de l’ARNr 16S est prédite à la suite d’un alignement multiple des
séquences. Elle est bien conservée et riche en segments hélicoïdaux (tiges) séparés par des boucles
contenant des bases non appariées (Reginald et al., 2000) (figure 3).

Figure 3 : Représentation schématique de la structure secondaire d’un ARN.

Seule les paires Watson-Crick sont représontées (lignes pleines).Les nucléotides non impliqués dans ces paires (en
pointillés) appartiennent aux boucles terminales, aux bulles internes (symétriques ou asymétriques),aux brins qui lient
les diférentes hélices d’une jonction ou aux simples brins.

9
 Partie Bibliographique

L’ARNr 16S possède de nombreuses fonctions parmi lesquelles on compte :

- Rôle structural : définissant les positions des protéines ribosomales,

- l’extrémité 3’ contient une séquence "anti-Shine-Dalgarno" (AGGAGG) qui se lie en amont
du codon AUG (start codon) de l’ARNm. L’extrémité 3’ de l’ARNr 16S se lie aux protéines
S1 et S21 connues pour être impliquées dans l’initiation de la synthèse des protéines,
- interagit avec le 23S, contribuant ainsi à la liaison des deux sous-unités ribosomiques (30S
et 50S),
- stabilise l’appariement codon-anticodon sur le site A du ribosome par l’intermédiaire de la
formation d’une liaison hydrogène entre l’atome N1 des résidus Adenine 1492 et 1493 et le
groupe 2’OH de l’épine de l’ARNm.

Carl Woese et George E. Fox (1977) ont été les premiers à avoir utilisé l’ARNr 16S en
phylogénie. Cependant, son utilisation à des fins taxinomiques présente des limites. En effet, malgré
sa structure composée d'une alternance de régions variables et très conservées, le nombre de
substitutions nucléotidiques est trop faible pour permettre une analyse phylogénétique entre des
espèces très proches (Garcia-Martinez et al., 1999 ; Kolbert et Persing, 1999).

Pour pallier cette insuffisance, en plus de l’analyse du gène ADNr 16S, il existe d’autres
marqueurs phylogénétiques tels que les régions ITS, présentant une grande variabilité tant du point
de vue taille que séquence ; ce qui permet une distinction entre des espèces phylogénétiquement très
proches (Gurtler et Stanisich, 1996), ainsi que les " gènes de ménage".

L’amplification des gènes 16S, pour les analyses phylogénétiques et taxonomiques passe par leur
amplification (PCR). Les amorces (oligonucléotides d'ADN monocaténaires) utilisées lors des PCR
servent à borner l'amplicon. Elles sont synthétisées par une primase. Ces amorces peuvent être droite
ou gauches (sens et anti-sens). Lors du séquençage, on n'utilise qu'une seule des deux amorces du
produit PCR. Il ne faut jamais faire passer les deux séquences "sens" et "anti-sens" ensemble dans
le séquenceur.

Le choix des amorces est sans doute le paramètre le plus important pour le succès de la PCR. En
effet, plusieurs variables doivent être prises en considération. En voici quelques-unes des plus
importantes:

10
 Partie Bibliographique

- D’une façon générale, les amorces utilisées doivent avoir une longueur de 17–30 nucléotides
(Coutouly et al., 2006), ce qui autorise une température d’hybridation raisonnablement
élevée.
- Le couple d’amorces doit être riche en G et C (l’idéal entre 55 et 65%)
- Les amorces doivent être exemptes de suites de séquences de polybases (poly-dG, par
exemple) ou de motifs répétitifs, ceux-ci pouvant s’hybrider de manière inadéquate avec la
matrice.
- Il convient d’éviter les séquences répétées inversées afin d’empêcher la formation de
structures secondaires dans l’amorce (formation d’épines ou de boucles), ce qui empêcherait
l’hybridation avec la matrice.
- Les séquences complémentaires d’autres amorces utilisées dans la PCR devraient également
être évitées afin d’empêcher l’hybridation entre amorces ou la formation de dimères
d’amorce (particulièrement important pour l’extrémité 3’ de l’amorce).
- Si possible, l’extrémité 3’ de l’amorce devrait être riche en bases de G et C pour une
meilleure hybridation de l’extrémité qui sera étendue.
- La distance entre les amorces devrait être inférieure à 10 Kb.

La séquence d’amorce renseigne sur plusieurs propriétés, telles que la position et la longueur du
produit, sa température de fusion et finalement le rendement (Innis et Gelfand, 1994). Une amorce
mal conçue peut empêcher le fonctionnement de la réaction PCR, conduire à une production faible,
voire nulle, en raison d’une amplification non spécifique et/ou à la formation de dimères d’amorces,
qui peuvent devenir suffisamment compétitifs pour inhiber la formation de produit.

La paire d’amorces la plus courante, nommée 27F et 1492R, a été initialement utilisée par
Weisburg et al. en 1991 (tableau 1). Souvent, la 8F est utilisée plutôt que la 27F puisque les deux
amorces sont pratiquement identiques, mais cette dernière contient un M à la place d’un C dans la
8F.

11
 Partie Bibliographique

Tableau 1 : Les amorces les plus fréquemment utilisées et leurs séquences.

Amorces Séquences (5’-3’) Références

8F AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
Eden P.A. et al. (1991)
U1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T
928F TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GG
Weidner S. et al. (1996)
336R ACT GCT GCS YCC CGT AGG AGT CT
1100F YAA CGA GCG CAA CCC
1100R GGG TTG CGC TCG TTG
337F GAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG
907R CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT
785F GGA TTA GAT ACC CTG GTA
805R GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC
533F GTG CCA GCM GCC GCG GTA A
518R GTA TTA CCG CGG CTG CTG G
27F AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG
Jiang, H. et al. (2006)
1492R CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT
R (PuRines) = A,G ; Y (pYrimidines) = T,C ; K (Keto) = T,G ; M (aMino) = A,C ; S (Strong) = G,C ; W (Weak) =
A,T.

Les séquences types de l’ARNr 16S de la plupart des souches bactériennes et Archaea sont
disponibles sur les bases de données publiques telles que NCBI ([Link]/).
Cependant, la qualité de ces séquences n’est pas validée pour la plupart d’entre elles. Par
conséquent, les bases de données spécifiques qui recueillent seulement les séquences d'ARNr 16S,
sont plus fiables. Les bases de données les plus fréquemment utilisées sont :

- EzTaxon-e ([Link]
- RDP ( [Link]
- SILVA ([Link]),
- Greengenes ([Link]

12
 Partie Expérimentale

A- MATERIEL

1- Description du site de prélèvement

L’échantillon du sol utilisé pour cette analyse a été prélevé au mois d’avril 2015 à Constantine, à partir d’un
champ destiné à la culture céréalière (Triticum durm et T. estivum) . Le site de prélèvement (figure 4) est situé sur les
terres agricoles sises entre Ain Smara (36,27° N latitude ; 6,5° E longitude) et Ali Mendjeli (36,15° N latitude ; 6,35°
E longitude) de la Daira du Khroub (Wilaya de Constantine).

Figure 4 : Photographie satellitaire du site de prélèvement

2- Echantillonnage
Le prélèvement des échantillons a été effectué aléatoirement et au milieu du champ de culture afin d’éviter les
bordures car plus exposées aux contraintes de l’environnement et la densité céréalière n’est pas significative ; ce qui
influe sur la qualité bactériologique des prélèvements.
3- Outils bioinformatiques
Le matériel bioinformatique retenu pour cette analyse se compose principalement de :
- Logiciel d’identification bactérienne : Classeur Excel d’identification ([Link]
[Link]/enseigne/biotech/[Link]?article58 )
- Portails bioinformatique NCBI ([Link]/) et Mobyle ( [Link] )
- Logiciels de prédiction des structures secondaires des ARN : RNAFold ([Link]
bin/[Link] ) et GenMark ([Link] )
- Logiciel de phylogénie moléculaire et alignement multiple : MEGA 5.2

13
 Partie Expérimentale

B- METHODES
1- Analyse microbiologique du sol
1-1 Isolement et purification : L’échantillon a été transporté au laboratoire de Zoologie
(Faculté SNV, Université Frères Mentouri Constantine) où il a été séché à température ambiante
pendant 24h (photo 1), puis tamisé à 2 mm (photo 2).

Photo 1 : Séchage du sol à température ambiante Photo 2 : Tamisage du sol à 2 mm

La réalisation des dilutions, à partir de l’échantillon, a été faite géométriquement à raison de dix
(Bastide et al., 1986).

- Peser 1g de sol tamisé dans un tube stérile contenant 9ml d’eau physiologique (solution
mère à 10-1).
- Mélanger pendant 5 min à l’aide d’un vortex pour obtenir une solution homogénéisée et
détacher les cellules bactériennes des particules du sol.
- Effectuer des dilutions géométriques successives jusqu’à obtention de la dilution 10-6
(photo3).

14
 Partie Expérimentale

Photo 3 : Aspects des différentes dilutions du sol (10-1 – 10-6)

La mise en culture s’est effectuée par étalement, à l’aide d’un râteau, de 0,1ml prélevé des trois
dernières dilutions (10-4, 10-5 et 10-6), sur boîtes de Pétri contenant de la GN.

Après incubation de 18 à 24h à 37°C, les colonies développées ont été repiquées sur GN dans un
but de purification.

1-2 Caractérisation présomptive des isolats bactériens

Des tests morphologiques, physiologiques et biochimiques ont été utilisés pour une
caractérisation des isolats.

1-2-1 Etude des caractères morphologiques

Cette étude a été basée sur des observations macroscopiques et microscopiques (x100) pour différencier l’aspect
des colonies sur boites de Pétri, le type de Gram, la forme cellulaire ainsi que la disposition et la mobilité des cellules
bactériennes (isolées ou regroupées).

- Examen macroscopique : L’observation de l’aspect macroscopique des colonies sur GN a

concerné les éléments suivants (Thomas et al. (2002) :

- La forme des colonies : circulaires, avec contours régulier ou irrégulier,

15
 Partie Expérimentale

- La couleur de la colonie,
- L’élévation : convexes, concaves, plates, à centre élevé,
- L’opacité : opaque, translucide ou transparente,
- La surface : lisse, rugueuse, sèche, dentelée.

- Aspect microscopique : Observation des bactéries sous microscope après coloration de Gram selon
le protocole de Nicolle (1895):

- Préparer et fixer un frottis bactérien à la chaleur du bec Bunsen,

- Recouvrir au violet de Gentiane pendant 1 à 5 min. Eliminer l'excès par l'eau courante,
- Ajouter du Lugol : deux bains de 4 à 6 secondes, Laver l'excès par l'eau courante,
- Traiter au mélange alcool/acétone (3/1), puis rinçage à l'eau,
- Recolorer à la Fuchsine pendant 20 secondes, puis rinçage à l'eau, et en fin, séchage.
- L'observation à l'huile à immersion.

1-2-2 Métabolisme glucidique

- Utilisation du Mannitol

Ensemencement au fil droit d’une anse de platine, par piqûre centrale du milieu jusqu’au fond du
tube, à partir de la suspension bactérienne à tester. Incubation à 37°C pendant 18-24h.

- Fermentation du lactose, saccharose et production de gaz

Le milieu TSI a été ensemencé en réalisant une piqûre centrale dans le culot et des stries serrés sur la pente.
Remettre le bouchon du tube sans le revisser complètement pour permettre un dégagement suffisant du H2S afin
d’éviter un noircissement du milieu. Incubation à 37°C pendant 18-24h.

1-2-3 Etude des enzymes respiratoires terminales

- Recherche de l’oxydase

Sur une boite de Pétri stérile vide, déposer un disque d'oxydase imprégné de diméthyl-para-phénylènediamine. À
l'aide d’une anse de platine stérile prendre une colonie (culture pure de 18-24heures) et la déposer
sur le disque. L’apparition d'une coloration violette immédiate signifie que la bactérie est oxydase positive.

16
 Partie Expérimentale

- Recherche de la catalase

Une colonie bactérienne a été déposée sur lame stérile, puis dépôt d’une goutte d’eau oxygénée (à 10 volumes)
sur cette colonie. L’effervescence est signe d’une réaction positive (la bactérie est dite catalase positive).

- Recherche de la nitrate réductase

Bouillon nitrate à 1‰ KNO3 ensemencé à partir de la suspension bactérienne. Après une

incubation 18-24h à 37°C, deux réactifs (Acide Sulfanilique : NR1 et α-naphtylamine : NR2) ont
été ajoutés au milieu. La lecture s’est faite après une simple agitation. Une pincée de poudre de Zinc
est ajoutée dans le cas où le milieu reste incolore.

1-2-4 Étude des voies fermentatives intermédiaires des acides complexes

- Réaction au rouge de méthyle

- Réaction de Voges-Proskauer (Production d’acétoïne)

Une colonie de chaque isolat a été ensemencée sur le milieu Clark et Lubs puis incubée à 37°C/18-24h. Après
culture, le bouillon a été partagé dans deux tubes stériles.

- Dans le premier tube trois gouttes de RM ont été ajoutées avec une légère agitation. La
lecture a été faite immédiatement.
- Quant au deuxième tube, trois gouttes d’alpha naphtol (VP1) et de KOH (VP2) ont été
ajoutées. Le tube a été incliné pour permettre une bonne oxygénation et la lecture a été faite
après quelques minutes.

1-2-5 Métabolisme protéique

- Milieu Urée-Indole

La recherche de l’uréase : Ensemencement du milieu par quelques gouttes de la suspension

bactérienne. Incubation à 37°C durant 24h.

La production d’indole : addition du réactif de Kovacs (trois gouttes) au milieu Urée-Indole

précédemment ensemencé.

17
 Partie Expérimentale

- Recherche des décarboxylases : LDC, ODC et ADH

Le test a été réalisé sur le milieu Moeller réparti dans des tubes à hémolyse
hémolyse. Ces derniers ont été
ensemencés à partir de la suspension bactérienne à tester, puis 1ml de vaseline stérile a été ajouté dans chaque tube
pour favoriser l’anaérobiose. Incubation à 37°C pendant 18-24h.

2- Analyse bioinformatique des séquences 16S

2-1
1 Identification des isolats

Nous avons identifié les cinq souches par l’utilisation d’un classeur probabiliste Excel
d’identification (photo 4). Ce dernier permet l’identification d’une souche microbienne à partir de
son profil obtenu sur une minigalerie d’identification. Les dix tests retenus pour l’identification
proposés par ce programme sont :

1. ONPG 6. H2S
2. ADH 7. UREE
3. LDC 8. TDA
4. ODC 9. INDOLE
5. CIT 10. VP

Photo 4 : Interface du Classeur Excel d’identification bactérienne

2-2
2 Acquisition des séquences 16S via GenBank
Les séquences ont été téléchargées à partir de la base de données GenBank du portail
informatique NCBI.. La procédure de téléchargement des séquences pour Salmonella sp. (la S1 pour
notre cas) est la suivante :

18
 Partie Expérimentale

1. Télécharger la page web du portail NCBI (National

National Centre for Biotechnology Information
Information),
2. Sélectionner dans le menu "All Databases" la banque "Nucleotide",
"Nucleotide",
3. Taper dans la zone de texte les mots clés pour la recherche des séquences : "16S rRNA AND
Salmonella sp".. Cliquer sur le bottons "Search". GenBank va proposer plusieurs séquences
16S de Salmonella sp.. Choisir celle dont la séquence est complète
complète (aux environs de 1400
pb)
4. Télécharger la séquence au format Fasta (photo 5)
5. Répéter l’opération (étapes 1 à 4) pour les autres isolats.

Photo 5 : Interface de la base de données Nucleotide de NCBI montrant les résultats des séquences
16S

2-3 Analyse thermodynamique de la structure secondaire des ARNr 16S

La structure secondaire de l’ARNr 16S et l’énergie libre ont été prédites par logiciel RNAFold
dont l’interface est représentée sur la photo 6.

Photo 6 : Interface du site Internet de RNA Fold web server

19
 Partie Expérimentale

- Matrice thermodynamique des différences des énergies libres : a été calculée sur le
portail Mobyle (Photo 7).

Photo 7 : Interface principale du Portail Mobyle

2-4
4 Analyse phylogénétique des isolats

Le phylogramme des cinq souches a été construit par la méthode des distances Neighbor Joining
en utilisant le logiciel Mega 5.2 (Photo 8).

Photo 8 : Interface de Mega 5.2

20
 Partie Expérimentale

1- Analyse microbiologique du sol

1-1 Caractérisation présomptive des isolats bactériens

Les résultats de l’analyse des caractères morphologiques, biochimiques et physiologiques sont

portés sur le tableau 2. Ces derniers ont permis une identification présomptive de cinq isolats (S1,
S2, S3, S4 et S5).

1-1-1 Aspects macro et microscopique

Ces aspects diffèrent d’un isolat à un autre. En effet, les colonies des isolats S1, S2, S3 et S5 ont
une forme circulaire avec un contour régulier, convexe, une couleur beige translucide et une surface
lisse. Quant l’isolat S4, nous avons relevé une forme circulaire avec un contour irrégulier, plate, une
couleur blanchâtre opaque et une surface sèche (tableau 3).

La coloration de Gram est négative pour tous les isolats. Cependant, ceux-ci possédant des
formes cellulaires différentes : bacille (S3 et S5), streptobacille (S2) et cocobacille (S1 et S4)
(tableau 3).

21
 Partie Expérimentale

Tableau 2 : Résultats des caractères phénotypiques des cinq isolats

Isolats
S1 S2 S3 S4 S5
Tests
Circulaire Circulaire Circulaire Circulaire Circulaire
forme des Contour Contour Contour Contour Contour
colonies régulier régulier régulier irrégulier régulier
Convexe Convexe Convexe Plate Convexe
Couleur des Beige Beige Beige Blanchâtre Beige
Morphologiques

colonies Translucide Translucide Translucide Opaque Translucide

Surface des Lisse Lisse Lisse Lisse

Sèche
colonies Brillante Brillante Brillante Brillante

Forme
cellulaire Coccobacille Streptobacilles Bacille Coccobacille Bacille

Gram - - - - -
Mobilité - + + + +
Mannitol - + + + +
Lactose - - + + +
Saccharose + + + + +
Gaz en
- - - + +
Biochimiques

Glucose
H2S - - - - -
LDC + + - + -
ODC + - - + +
ADH + + + - -
VP - - - - +
RM + + + + -
Indole - - - - -
Physiologiques

NR + + + + +
Uréase - - + - -
Catalase + + - + +
Oxydase + - - - -
(+) : présence du caractère étudié ; (-) : absence du caractère étudié

22
 Partie Expérimentale

Tableau 3 : Aspects macro et microscopique des isolats

Aspect macroscopique Aspect microscopique

S1

S2

S3

S4

S5

23
 Partie Expérimentale

1-1-2 Les caractères biochimiques

- Milieu Mannitol-Mobilité
Mobilité

Tous les isolats, mis à part S1, ont fermenté le mannitol en l’utilisant comme source de carbone,
ce qui explique le virage de la couleur de l’indicateur de pH du milieu du rouge au jaune
jaune-orangé
(photo 9).

La mobilité se traduit parr une diffusion du voile ou du trouble au-delà

au delà de la piqûre centrale de
l’ensemencement. Seul l’isolat S1 est immobile.

Photo 9 : Exemple de l’aspect du milieu Mannitol-Mobilité

Mannitol de l’isolat S4

- Milieu TSI

Les trois isolats S3, S4 et S5 ont fermenté les deux sucres (lactose et saccharose) contrairement à
S1 et S2. Aucun résultat positif dans le cas de la production de l’H2S n’a été observé. En revanche,
la production de gaz en glucose est observée chez la S4 et la S5 par la présence de bulles d’air
(photo 10).

Photo 10 : Résultat obtenu de la culture de S5 sur milieu TSI

24
 Partie Expérimentale

- Production de LDC, ODC et ADH

L’isolat S1 présente un résultat positif pour chacune des trois enzymes testés (photo 11) se
traduisant par une ré-alcalinisation
alcalinisation du milieu (milieu violacé).
violacé). Les autres isolats ontexprimé des
résultats différents d’un acide aminé à l’autre.

Photo 11 : Présence des LDC, ODC et ADH chez l’isolat S1

- Test VP/RM

Les quatre isolats S1, S2, S3 et S4 ont montré des résultats similaires par obtention d’une
coloration rose pour un RM positif et une absence de coloration pour un VP négatif (photo 12).
L’isolat S5 est RM négatif et VP positif (photo 13).

Photo 12 : RM+ et VP- chez l’isolat S1 Photo 13 : RM- et VP+ chez l’isolat S5

25
 Partie Expérimentale

1-1-3 Les caractères physiologiques

- La nitrate réductase : Les cinq isolats ont montré un test positif.

Photo 14 : Présence de la nitrate réductase chez l’isolat S2

- Milieu Urée-Indole
Indole

Tous les isolats sont uréase négative sauf S3. Mais le test de l’indole
’indole a montré que toutes les
souches sont négatives.

Photo 15 : Présence de l’uréase chez S3 Photo 16 : Absence de l’indole chez S3

26
 Partie Expérimentale

- Production de la catalase : Seul, l’isolat S3 est catalase négative.

- Production de l’oxydase : Seul l’isolat S1 a donné un résultat positif (photo 17).

Photo 17 : Réaction positive au test de l’oxydase chez S1

2- Analyse bioinformatique des séquences 16S des isolats

2-1 Identification et classification des isolats

Les isolats identifiés par le classeur probabiliste Excel d’identification (classification tableau 4)
sont :

S1 : Salmonella sp

S2 : Chromobacterium violaceum

S3 : Pseudomonas fluorescens

S4 : Enterobacter aerogenes

S5 : Enterobacter intermedius

27
 Partie Expérimentale

Tableau 4 : Classification des souches identifiées

Domaine Bacteria
Phylum Proteobacteria
Classe Gammaproteobacteria Betaproteobacteria Gammaproteobacteria Gammaproteobacteria Gammaproteobacteria

Ordre Enterobacteriale Neisseriale Pseudomonadale Enterobacteriale Enterobacteriale

Famille Enterobacteriaceae Neisseriaceae Pseudomonadaceae Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae

Genre Salmonella Chromobacterium Pseudomonas Enterobacter Enterobacter

Espèce Salmonella sp C. violaceum P. fluorescens E. aerogenes E. intermedius
Isolat S1 S2 S3 S4 S5

2-2 Prédiction structurale secondaire et énergie libre des ARNr 16S

Après récupération des séquences d’ARNr 16S au format Fasta, sur le portail du NCBI, la
structure secondaire des ARNr 16S ainsi que les énergies libres ont été prédites. Les résultats sont
portés sur le tableau 5.

Il ressort que l’architecture 2D des molécules 16S diffère chez les cinq isolats ; cependant, il est
à noter que les isolats S4 (E. aerogenes) et S5 (E. intermedius) ont montré des topologies similaires
du fait de leur appartenance au même genre. L’isolat S1 (Salmonella sp.), une Enterobacteriaceae,
présente un profil largement similaire à celui de S4 et S5. L’isolat S2 (Chromobacterium
violaceum) a exprimé une différence nette dans l’architecture 2D par rapport à l’ensemble des
isolats. Pseudomonas fluorescens (Gammaproteobacteria) présente un profil 2D plus proche de S1,
S4 et S5 que S2 (Betaproteobacteria).

Ces résultats 2D sont corroborés par les diagrammes des énergies libres standars (ΔG° :
Kcal/mol). En effet, les mesures des différentes ΔG° ont révélées des valeurs plus proches pour S4
et S5 (-429,66Kcal/mol et -565,22Kcal/mol respectivement). Par contre, la S3 a exprimé une
énergie libre significativement différente (-381,06Kcal/mol).

28
 Partie Expérimentale

Tableau 5 : Structures secondaires

secondaire d’ARNr 16S et l’énergie libre des souches identifiées

Structure secondaire de
Energie libre
l’ARNr 16S
Salmonella spp

ΔG°= -491,43kcal/mol
Chromobacterium violaceum

ΔG°= -376,97kcal/mol

29
 Partie Expérimentale

Pseudomonas fluorescens

ΔG°= -381,06kcal/mol
Enterobacter aerogenes

ΔG°= -429,66kcal/mol
Enterobacter intermedius

ΔG°= -565,22kcal/mol

30
 Partie Expérimentale

Les différences des énergies libres entre les paires de séquences des rRNA 16S (tableau 6) ont montré des écarts
d’énergie significatifs expliqués par la divergence de leurs structures primaires.

Tableau 6 : Matrice des thermodynamiques des séquences rRNA 16S

Salmonella Chromobacterium Pseudomonas Enterobacter

sp. violaceum fluorescens aerogenes
Chromobacterium
597 ,089
violaceum
Pseudomonas
620,812 481,675
fluorescens
Enterobacter
462,967 448,901 385,523
aerogenes
Enterobacter
242,246 555,395 561,251 418,63
intermedius

2-3 Analyse phylogénétique des isolats

Le phylogramme (figure 5) a été réalisé à l’aide de la matrice de distance (tableau 7) obtenue

suite à l’alignement multiple des séquences d’ARNr 16S des cinq isolats sur le logiciel Mega 5.2.

Tableau 7 : Matrice des distances (%) après alignement multiple des séquences 16S rRNA

Salmonella sp. Chromobacterium Pseudomonas Enterobacter

violaceum fluorescens aerogenes
Chromobacterium 0,494
violaceum
Pseudomonas 0,132 0,519
fluorescens
Enterobacter 0 ,030 0,508 0,143
aerogenes
Enterobacter 0,025 0,498 0,142 0,009
intermedius

31
 Partie Expérimentale

Figure 5 : Phylogramme des cinq souches réalisé par la méthode NJ

32
 Partie Expérimentale

DISCUSSION GENERALE

Les cinq souches isolées durant notre travail, ont été identifiées sur la base de leurs caractères
morphologiques, physiologiques et biochimiques. Ces tests ne sont pas suffisants pour prétendre
une identification définitive et formelle (Holt et al., 1994 ; Prescott et al., 2003 ; Joffin et al., 2006).
Certains caractères, tels que la production ou non d’indole ont été corroborés par des études de
plusieurs auteurs (Alves et al., 2006 ; Zarei et al.,2010 ; Nkang et al., 2009). Le caractère de
l’uréase de nos isolats est confirmé par les travaux de Dhayanithi et al., (2010) ; Xian et al., (2011).
Cependant, les résultats négatifs sont supporté par ceux de Keri et al.,(2002) ; Prischmann et al.,
(2008).

Les résultats obtenus pour le test d’utilisation du mannitol sont en parfait accord avec ceux
décrits par Phibbs et al., 1978. Concernant Salmonella sp (S1), un résultat négatif (isolat S1) a été
observé, comme signalé par Matsen et al., 1972 ; Nkang et al., 2009 qui ont travaillé sur des
salmonelles.

Le test de mobilité pour les souches S2, S3, S4, S5 est positif. Ces résultats sont corroborés par
les études de Dhayanithi et al.,2010 ; Zarei et al., (2010) ; Catherine et al., (1999). Nous avons
obtenu un résultat négatif avec la souche S1 comme celui rapporté par Alves et al., (2006).

Les isolats S2, S3, S4, S5 sont touts oxydases négatives comme exprimés dans les travaux de Le
Minor et al., (1989) ; Dhayanithi et al., (2010) qui ont testé les mêmes souches.

Toutes les souches, excepté S3, ont présenté un caractère positif de la catalase comme indiqué
dans les travaux de Khan et al., (2011). Par contre l’espèce Pseudomonas fluorescens (S3) donne
une réponse négative au test identiquement au signalement de Dhayanithi et al.,( 2010).

Les résultats du métabolisme des acides aminés sont confirmés par ceux de Matsen et al., (1972),
Le Minor et al., (1989), Prischmann et al., (2008), Zarei et al.,( 2010).

- Analyse bioinformatique

La prédiction des structures secondaires 2D des ARNr 16S d’une part, et le calcul de l’énergie
libre de ces structures prédites pour nos cinq isolats, montre que Salmonella sp, E. aerogenes et E.
intermedius sont proches voire apparentées par rapport à P. fluorescens et C. violaceum. Nous
notons à ce stade une très forte similarité 2D entre les deux isolats du genre Enterobacter (S4 et S5).
Ces observations sont expliquées par les similitudes et les divergences présentes entre les
différentes structures secondaires des ARNr 16S et les courbes d’énergie libre de nos cinq isolats.

33
 Partie Expérimentale

En effet, les profils énergétiques des cinq isolats ont fait ressortir des niveaux d’énergie libre avec
des pics différents ; ce qui explique la différence dans la structure primaire entre les différents
isolats.

La topologie de l’arbre phylogénique a révélé trois familles différentes : Enterobacteriaceae,

Pseudomonadaceae et Neisseriaceae. Le clade regroupant E. aerogenes et E. intermedius est plus
apparenté à Salmonella sp. (car Enterobacteriaceae) et à un degré moindre de P. fluorescens
(Gammaproteobacteria). L’individu C. violaceum est le groupe le plus éloigné génétiquement ; il
peut être considéré comme un out group (Betaproteobacteria).

34
 Partie Expérimentale

CONCLUSION

Le microbiote tellurique est une communauté complexe par ses exigences nutritionnelles et par
ses interactions intra et interspécifiques.

Son identification reste sujette à discussion au sein du monde microbiologiste. Les chercheurs
proposent diverses techniques d’identification du fait de l’avancement technologique et de la
disponibilité de l’information via Internet.

Notre travail constitue une approche nouvelle adoptée par plusieurs laboratoires de
microbiologie, qui repose sur le principe de l’identification polyphasique. En effet, deux phases
d’identification ont été proposées dans ce travail : Phénotypique et Bioinformatique.

Les résultats obtenus pour les deux phases sont en parfait accord et se complètent entre eux. La
caractérisation phénotypique a révélé des taxons appartenant à trois familles différentes :
Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae et Neisseriaceae. Les profils 2D des ARNr 16S et le
calcul des énergies libres ont confirmé cette classification en offrant des profils et des topologies
des diagrammes énergétiques différents.

En fin, nous considérons que notre approche phéno-bioinformatique est justifiée mais doit être
vérifiée sur des effectifs d’isolats plus importants que le nôtre et doit être supportée par d’autres
analyses bioinformatiques plus approfondies telles que la prédiction des structures 3D des
séquences 16S, l’application des techniques biomoléculaire de type spectrométrie de masse afin
d’enrichir la procédure d’identification bactérienne.

35
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taxonomique/fra/1346524491267/1346527009874

39
ANNEXES

Annexe 1: Séquence 16S de Salmonella sp.

>gb|AF130955.1| Salmonella sp. 16S ribosomal RNA 1091bp

GTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACC
AGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT
ATTGCACAATGGGCGCAAGCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG
GTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGA
CGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAG
GGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGT
CGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTTGAG
TCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGG
AATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCG
TGGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTT
GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGG
GGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT
GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCAC
AGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGC
TGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAT
CCTTTGTTGCCAGCGRTTMGGYCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGA
GGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGC
TACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGT
GCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTA
ATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC
ACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACTTCGGGAGGGCGCTTAC
CACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGT
Annexe 2 : Séquence 16s de Chromobacterium violaceum

>gb|EU880917.1| Chromobacterium violaceum strain UCP1470 16S ribosomal RNA gene 988bp

GAAAGCCGGATTAATACCGCATACGCCCTGAGGGGGAAAGCGGGGGATCGAAAGACC
TCGCGTTATACGAGCAGCCGACGTCTGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGAGCTCACCA
AGGCGACGATCAGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACAC
GGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTG
ATCCAGCCATGCCGCGTGTCTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGGACTTTTGTCAGG
GAGGAAATCCCGCTGGTTAATACCCGGCGGGGATGACAGTACCTGAAGAATAAGCACC
GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATT
ACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTGTGCAAGTCTGATGTGAAAGCCCCGGGCTT
AACCTGGGAACGGCATTGGAGACTGCACAGCTAGAGTGCGTCAGAGTGGGGGAGTAC
GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGAT
GTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTGCTCTTGACATGTACGGAACTTG
CCAGAGATGGCTTGGTGCCCGAAAGGGAGCCGTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGT
CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAG
TTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT
GGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGAGCAGGGCTTCACACGTCATACAATG
GTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCAGAAAACCGATCGTA
GTCCGGATCGCACTCTGCAACTCGAGTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGA
TCAT
Annexe3: Séquence 16S de Pseudomonas fluorescens

>gb|KM198476.1| Pseudomonas fluorescens strain MP03 16S ribosomal RNA gene, 1020 bp

GCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCCGAAAGGAACGCTAATACCGCGTACGTCCTACGG
GAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCT
AGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGAT
CAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAA
TATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTC
GGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCGTTTGGCTAATATCCAGGCGTTTT
GACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGA
AGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAA
GTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAG
AGTACGGTAGAGGGTGGTGGCATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAA
GGAACACCAGTGGCGAAAGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAG
CGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACT
AGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGG
GGGAGTACGGCCGCAAGGTTAGAAACTCACATGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGC
GGTGGGAGCATGTGGTTTAATTTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACA
TGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCTCAGAACACAGGTGCTG
CATGGCTGTCGTCAGCTCCTGTCGTTGAGATGCTGGGTTAAAGTCCCGTAACGAAGCGC
AACCCTTCGTCCTTACTTACCAGCAACGTTATGGT
Annexe 4: Séquence 16S de Enterobacter aerogenes

>gb|KP896306.1| Enterobacter aerogenes strain BGMCC01 16S ribosomal RNA gene, 1084bp

TAACACAGAGAGCTTGCCCTCGGGTGACGAGCGGCAGACGGGTGAGTAATGTCTGGGA
CACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCG
CAAGACCAAAATGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATT
AGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGA
TGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGG
GGAATATTGCACAATAGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGC
CTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGGCGTTAAGGTTAATAACCTTGGC
GATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
ACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTG
TCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGG
CTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATC
TGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCG
AAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTC
GACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCG
CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAA
GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACAT
CCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCA
TGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC
TTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGA
Annexe 5 : Séquence 16S de Enterobacter intermedius

>gb|AF310217.1| Enterobacter intermedius 16S ribosomal RNA gene, 1453 bp

CGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTTGGGTGAC
GAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCCGATGGAGGGGGATAACTAC
TGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGC
CTCACACCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACC
TAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACAC
GGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG
ATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAG
GAGGAAGGCATTGTGGTTAATAACCGCAGTGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACC
GGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATT
ACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTC
AACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATT
CCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGC
CCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGA
TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTG
GCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAA
CTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC
AACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGT
GCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATG
TTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGG
GAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTC
ATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAG
CGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTG
CAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGA
ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAG
AAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGAAATTCATGACTGTGAA
ATGT
Annexe 6 : Structure secondaire 2D 16S de Salmonella sp.
Annexe 7 : Structure secondaire 2D 16S Chromobacterium violaceum
Annexe 8 : Structure secondaire 2D 16S|de Pseudomonas fluorescens
Annexe 9 : Structure secondaire 2D 16S Enterobacter aerogenes
Annexe 10 : Structure secondaire 2D 16S Enterobacter intermedius
Annexe 11 : Diagramme de l’énergie libre de Salmonella sp. prédit par RNAfold
Annexe 12 : Diagramme de l’énergie libre de Chromobacterium violaceum prédit par RNAfold
Annexe 13 : Diagramme de l’énergie libre de Pseudomonas fluorescens prédit par RNAfold
Annexe14 ; Diagramme de l’énergie libre de Enterobacter aerogenes prédit par RNAfold
Annexe 15 : Diagramme de l’énergie libre de Enterobacter intermedius prédit par RNAfold
Annexe 16 : Diagramme de l’énergie libre de Salmonella sp. prédit par GenMark
Annexe 17 : Diagramme de l’énergie libre de Chromobacterium violaceum prédit par GenMark
Annexe 18 : Diagramme de l’énergie libre de Pseudomonas fluorescens prédit par GenMark
Annexe 19 : Diagramme de l’énergie libre de Enterobacter aerogenes prédit par GenMark
Annexe 20 : Diagramme de l’énergie libre de Enterobacter intermedius prédit par GenMark
Annexe 21 : Alignement multiple des cinq séquences ARNr 16S
Annexe 22 : Structure
tructure 2D consensus des cinq séquences ARNr 16S
GLOSSAIRE

Alignement multiple : En bio-informatique, l'alignement de séquences (ou alignement

séquentiel) est une manière de représenter deux ou plusieurs séquences de macromolécules
biologiques (ADN, ARN ou protéines) les unes sous les autres, de manière à en faire ressortir les
régions homologues ou similaires. L'objectif de l'alignement est de disposer les composants
(nucléotides ou acides aminés) pour identifier les zones de concordance. Ces alignements sont
réalisés par des programmes informatiques dont l'objectif est de maximiser le nombre de
coïncidences entre nucléotides ou acides aminés dans les différentes séquences. Ceci nécessite en
général l'introduction de "trous" à certaines positions dans les séquences, de manière à aligner les
caractères communs sur des colonnes successives.

Bactéries symbiotiques : Les bactéries symbiotiques sont des bactéries vivant en symbiose
avec un autre organisme. Les bactéries symbiotiques sont présentes chez les plantes et les animaux,
par exemple au sein du système digestif elles aident à la digestion des aliments. Les bactéries
symbiotiques peuvent également être associées avec d´autres bactéries

BLAST : BLAST (acronyme de basic local alignment search tool) est une méthode de recherche
utilisée en bio-informatique permettant de trouver les régions similaires entre deux ou plusieurs
séquences de nucléotides ou d'acides aminés et de réaliser un alignement de ces régions
homologues. Ce programme permet de retrouver rapidement dans des bases de données, les
séquences ayant des zones de similitude avec une séquence donnée

Facteurs abiotiques : les facteurs abiotiques représentent l'ensemble des facteurs physico-
chimiques d'un écosystème influençant sur une biocénose donnée. C'est l'action du non-vivant sur le
vivant. Opposables aux facteurs biotiques, ils constituent une partie des facteurs écologiques de cet
écosystème. (températures, l’air, lumière, …)

Hétérotrophe : Un organisme hétérotrophe est un organisme qui ne synthétise pas sa propre

matière organique et qui, par conséquent, est amené à consommer des molécules organiques pour
s'approvisionner en carbone. Il s'agit des organismes incapables de réaliser la photosynthèse.

Hybridation : L'hybridation de l’ADN est un principe de biologie moléculaire, fondé sur les
propriétés d’appariement des bases complémentaires d'acides nucléiques. Ce principe est utilisé
dans différentes techniques permettant la mise en évidence de la présence de molécules d'acides
nucléiques particulières.
 Locus : un locus est un emplacement physique précis et invariable sur un chromosome. Un locus
peut être un endroit du chromosome où se situe un gène et plus.

Marqueurs moléculaires: Le marqueur génétique est un gène ou une séquence polymorphe

d'ADN aisément détectable grâce à un emplacement connu sur un chromosome. Un marqueur
génétique peut être une séquence d'ADN courte, comme une séquence autour d'une seule paire de
bases, ou de séquences répétées.

Taxon : Un taxon correspond à une entité d’êtres vivants regroupés parce qu’ils possèdent des
caractères en communs du fait de leur parenté, et permet ainsi de classifier le vivant à travers la
systématique.

Phylogénie : La phylogenèse ou phylogénie est l'étude des relations de parenté entre êtres
vivants (Entre individus, Entre populations, Entre espèces niveau interspécifique).

Polymorphisme : Le concept de polymorphisme génétique (du grec « poly » plusieurs et

« morphê » forme) désigne la coexistence de plusieurs allèles pour un gène ou locus donnés, dans
une population bactérienne. Il explique qu'une espèce présente des individus aux caractères
phénotypiques différents (appelés morphotypes) au sein d'une même population.
Résume

L’objectif de ce travail est de proposer une approche double phasique pour l’identification des
bactéries isolées d’un sol destiné à la production céréalière.

Ces deux phases sont la caractérisation phénotypique classique (morphologie, biochimie et

physiologie des isolats) et l’analyse bioinformatique des séquences 16S par la prédiction des
structures 2D des ARNr 16S et la détermination des liens phylogénétiques.

Les résultats des deux méthodes sont en accord. Les souches isolées sont : Salmonella sp.,
Chromobacterium violaceum, Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes et Enterobacter
intermedius.

Mots clés : Sol agricole, ARNr 16S, Prédiction Structure 2D, Phylogénie
Abstract

The aim of this work is to propose a dual phasic approach for the identification of bacteria
isolated from a soil for grain production.

These two phases are classical phenotypic characterization (morphology, biochemistry and
physiology of isolates) and bioinformatic prediction of 2D structures of 16S rRNA and
determination of phylogenetic relationships.

The results of the two methods are in agreement. The isolated strains: Salmonella sp,
Chromobacterium violaceum, Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes, and
Enterobacter intermedius.

Keywords : Agricultural Soil, rRNA 16S, 2D Structure Prediction, Phylogeny.

 ‫ﻣﻠﺧص‬
‫اﻟﮭﺪف ﻣﻦ ھﺬا اﻟﻌﻤﻞ ھﻮ اﻗﺘﺮاح ﻧﮭﺞ ﻣﺰدوج ﻟﺘﺼﻨﯿﻒ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ اﻟﻤﻌﺰوﻟﺔ ﻣﻦ اﻟﺘﺮﺑﺔ ﺣﻘﻞ ﻟﺰراﻋﺔ اﻟﻘﻤﺢ اﻟﺼﻠﺐ ‪.‬ھﺎ ﺗﺎن‬
‫اﻟﻤﺮﺣﻠﺘﺎن ﺗﺼﻔﺎن اﻟﻨﻤﻂ اﻟﻈﺎھﺮي ) اﻟﺸﻜﻞ‪،‬اﻟﻜﯿﻤﯿﺎء اﻟﺤﯿﻮﯾﺔ وﻓﺰﯾﻮﻟﻮﺟﯿﺎ اﻟﻌﺰﻻت (‪ ،‬واﻟﺘﺤﻠﯿﻞ اﻟﻤﻌﻠﻮﻣﺎﺗﻲ اﻟﺤﯿﻮي ﻟﻠﺘﻨﺒﺆ ﻟﻼﺷﻜﺎل‬
‫ﺛﻨﺎﺋﯿﺔ اﻻﺑﻌﺎد وﺗﺤﺪﯾﺪ اﻟﻌﻼﻗﺎت ﻟﺪراﺳﺔ اﻟﺮواﺑﻂ اﻟﻮراﺛﯿﺔ ‪.‬‬

‫ﻧﺘﺎﺋﺞ اﻟﻄﺮﯾﻘﺘﯿﻦ اﻟﻤﺘﺤﺼﻞ ﻋﻠﯿﮭﺎ ﻣﺘﻤﺎﺛﻠﺔ ﻓﯿﻤﺎ ﺑﯿﻨﮭﺎ‪ .‬اﻟﺴﻼﻻت اﻟﻤﻌﺰوﻟﺔ ‪,Salmonella sp,Chromobacterium violaceum :‬‬
‫‪.Pseudomonas fluorescens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter intermedius‬‬

‫اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﯿﺔ ‪:‬ارض ﻓﻼﺣﯿﺔ‪ ،‬ﺗﻨﺒﺆ ﺑﺎﻟﺒﻨﯿﺔ ﺛﻨﺎﺋﯿﺔ اﻻﺑﻌﺎد‪ ،‬دراﺳﺔ اﻟﺮواﺑﻂ اﻟﻮراﺛﯿﺔ‪.‬‬