UNIVERSITÉ HASSAN II DE CASABLANCA ‫جامعة الحسن الثاني بالدار البيضاء‬

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Faculté des Sciences Aïn Chock
‫كلية العلوم عين الشق‬

Travaux Pratiques (SV6) BCM

Méthodes Moléculaires

Criblage des transformants, Colony-PCR & Electrophorèse

Séances assurées par : Pr A. SOUKRI

Pr B. El khalfi

Année universitaire : 2023-2024

 Avant-propos

Dans ce TP les étudiants seront amenés à effectuer les manipulations suivantes :

▪ Obtention des transformants sur milieu solide LB + Ampicilline,

▪ Colony PCR,

▪ Dosage au Nanodrop,

▪ Electrophorèse sur gel d’agarose,

▪ Analyse du gel et discussion des résultats.

Durée du TP : 2 demies journées par groupe

Note :

- Les étudiants doivent être munis de polycopie de TP et des marqueurs permanents.

- La Colony PCR est une technique très sensible, il faut éviter toute source de contamination
donc il est important :

▪ De porter une blouse et des Gants.

▪ De nettoyer les paillasses à l’éthanol 70 % avant et après manipulation.

▪ Comme on travail avec des petits volumes, il est nécessaire de bien agiter après ajout de
chacun des réactifs.

▪ De Toujours prévoir des réactions de contrôle,

▪ De préparer tout le mixte et d’y ajouter l’ADN en dernier lieu.

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 I- Criblage des transformants

Après amplification d’un gène d’intérêt par PCR, il a été digérer par deux enzymes de restriction
(BamH1 et NdeI) puis insérer dans un plasmide pET21a (Annexe-1) suivant le schéma ci-
dessous :

Les vecteurs contenant le gène d’intérêt ont été incorporés par transformation dans les bactéries
appartenant à la souche Top10 selon le protocole décrit en annexe-2.

Parmi les transformants ayant intégré le plasmide, il faut sélectionner ceux qui ont intégré le
plasmide muni de l’insert. Le criblage des transformants positifs peut se faire de deux manières :
un criblage par restriction ou bien un criblage par PCR.

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1- Préparation de boîtes de Petri

La préparation de boîtes est réalisée sous la hotte microbiologique en condition stérile.

▪ Après stérilisation du milieu LB+Agar (Annexe-3) Attendre que la température

redescende à 50°C environ, ajouter l’antibiotique à une concentration de 100µg/ml

▪ Homogénéiser sans faire de bulles.

▪ Verser 20-25 mL dans chaque boîte de Pétri.

▪ Après solidification de l’agar, fermer les couvercles et laisser sécher les boîtes à l’envers
à 37°C pendant 2h.

2- Culture des transformants

L’ensemencement des cultures doit être réalisé sur boites de Petri préparé selon le protocole ci-
dessus, à partir d’une préculture avec un rapport de 1/10ème. Mettre les boites en culture dans
l’étuve à 37°C durant 24h.

3- Criblage par restriction

Ce type de criblage peut être réalisé sur une dizaine de clones sélectionnés, à partir desquels
des minipreps d’ADN plasmidique sont préparées (Potocole TP de Génétique Moléculaire
SV5). Les minipreps sont ensuite digérées avec les deux enzymes de restriction (BamHI et
NdeI) correspondants aux sites d’insertion du clonage. Les deux enzymes sont utilisées selon
les instructions du fabricant (Promega). Les conditions d’incubation varient selon l’enzyme,
mais la plupart des enzymes ont une activité optimale à 37°C. L’arrêt de la digestion s’effectue
par la chaleur (65°C, 10 minutes).

Le mélange réactionnel contient : L’ADN plasmidique ; Le tampon Multi-CORE de Promega

(25 mM Tris-acétate pH 7,5, 100 mM acétate de potassium, 10 mM acétate de magnésium, 1
mM DTT) ; L’enzyme et Qsp d’eau ultra-pure

La digestion de l’ADN plasmidique est faite durant 2 h d’incubation. Le produit de restriction

est ensuite analysé par électrophorèse sur gel d’agarose. Les clones ayant intégré un plasmide
muni de l’insert souhaité montreront deux bandes après restriction : le vecteur linéarisé et
l’insert.

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4
4- Criblage par Colony PCR

La Colony PCR (PCR sur colonie) est un protocole qui permet d'amplifier de façon simple et
rapide de l'ADN de micro-organismes (bactéries ou levures) transformés. Cette PCR permet en
effet de cribler de nombreux transformants sans passer par l’étape des minipreps.

Dans ce TP, la technique de Colony-PCR permet la détection rapide des clones positifs qui ont
incorporé le plasmide avec l’insert, comme elle permet de déterminer la taille de l’insert et ou
son orientation dans le vecteur et ce en utilisant les amorces T7 du plasmide pET21a et les
amorces de l’insert.

▪ Avec un cure-dent stérile prélever une colonie

▪ Suspendre dans un tube eppendorf stérile contenant 50μl d’eau ultra-pure,

▪ Incuber 5min à 10min à 99°C

▪ Centrifuger 5min à 15000rpm.

▪ Prélever l’équivalent de 100ng d’ADN, l’ajouter au tube de PCR contenant le mixte :

tampon de réaction Green GoTaq® Reaction Buffer, dNTP, les amorce sens et anti-
sens, Mgcl2 et la GoTaq® DNA Polymerase pour un volume final de 15μl.

5- Amorces utilisés

F (NdeI) 5’-GGAATTCCATATGACTCTCCGTATCGCAATC-3’
Amorces de R (BamH1) 5’-CGGGATCCTTACTCGGCGTTATGCAGCGC-3
l’insert
F 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3
T7 Amorces du
R 5’-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3’
plasmide

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6- Le programme de la Colony-PCR

Le programme se déroule en cycles d'amplification successifs (35 cycles) avec une température
d’hybridation de 55°C comme suit :

95ºC,2’/(94ºC, 40’’/ 55ºC, 40’’/ 72ºC,1’)x35 /72ºC,10’/4ºC, 5’

II- Quantification d’ADN Par Nanodrope

La concentration et la pureté d’ADN ont été mesurées à l’aide d’un NanoDrop® ND-1000.

Ainsi, trois mesures de densité optique (DO) sont effectuées à différentes longueurs d’onde :
230, 260 et 280 nm, permettant de calculer les rapports de DO 260/280 et 260/230.

Le dosage par Nanodrop présente plusieurs avantages :

• 1 μl d'échantillon suffisant ; Pas de dilution préalable ; Manipulation simple ; Pas de dépôt en

cuve de quartz ; Nettoyage en quelques secondes ; Permet de mesurer des acides nucléiques,
protéines et densités cellulaires.

Seuls des échantillons ayant des ratios strictement supérieurs à 1,8 doivent être retenus pour le
présent TP.
III- Electrophorèse sur gel d’agarose :
Pour préparer un gel d’agarose 1%, peser 1g d’agarose dans un erlenmeyer et ajouter 100ml du
tampon TBE (1×), porter à ébullition puis laisser refroidir. Ajouter 2µl de bromure d’éthidium
(BET) à 10 mg/ml mélanger puis verser dans la cuve horizontale d´électrophorèse sur laquelle
est fixé un peigne.

Lorsque le gel est solidifié, enlever le peigne puis recouvrir le gel par le tampon TBE (1×).

Déposer les échantillons, mélangés avec la solution de dépôt, dans les puis et mettre
l’électrophorèse en marche.

Après le dépôt des échantillons, la migration doit être réalisée au moyen d’un générateur de courant
sous un voltage de 120 Volts. Celle-ci est arrêtée lorsque le témoin de migration atteint les trois-
quarts de la longueur du gel, soit une durée de 45 min environ. Puis, transférer le gel à un
transmetteur de la lumière UV relié à un à un appareil de photo et appareil d’enregistrement pour
le visualiser et l’analyser.

Bon courage

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 Annexe1

Plasmide utilisé c’est le pET-21a commercialisé par Invitrogen

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 Annexe 2

Transformation dans des bactéries compétentes

Nous avons utilisé la souche Top10 qui a une forte efficacité de transformation ce qui en fait
de bons hôtes pour le clonage.

Préparation des bactéries compétentes :

Une préculture de bactéries Top10 est obtenue en ensemençant environ 5 ml du milieu de

culture LB avec une colonie puis incubée une nuit à 37 ºC sous agitation.

▪ Ensemencer 50 ml du milieu LB avec 500 µl de la préculture puis incuber à 37ºC sous

agitation.
▪ Prélever 1,5ml de la culture, en phase exponentielle, et les mettre dans un tube
eppendorf, puis centrifuger à 12 000 tours/min pendant 3 à 5 min.
▪ Eliminer le surnageant et si nécessaire prélever à nouveau 1,5 ml et répéter le processus.
▪ Resuspendre le culot dans 750 µl de CaCl2 stérile et prérefrigéré.
▪ Laisser 15 min dans la glace puis centrifuger (3 à 5 min à 12 000 tours /min)
▪ Resuspendre le culot dans 150 µl du CaCl2 et garder le tube dans la glace pendant au
moins 30 min. les cellules sont alors compétentes et peuvent être conservées 2 à 3 jours à 4
ºC.

Transformation des bactéries compétentes par l’ADN plasmidique :

▪ Prendre le tube eppendorf contenant 150µl de cellules compétentes et

ajouter l’équivalent de 100 ng de l’ADN plasmidique.
▪ Mettre le tube eppendorf dans la glace pendant 45 min
▪ Placer par la suite le tube eppendorf dans un bain marie à 42ºC pendant 2 min avant de
remettre à nouveau dans la glace pendant 2 min
▪ Ajouter stérilement l’équivalent de 1 ml de LB
▪ Homogénéiser puis incuber à 37ºC pendant une heure
▪ Centrifuger et resuspendre le culot dans 200 µl de LB
▪ Etaler 100 µl dans une boite de LB + Ampicilline.
▪ Incuber une nuit à 37°C dans l’étuve.

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 Annexe 3

Composition du milieu LB+Agar (1L)

▪ 10 g de tryptone

▪ 5 g d’extrait de levure

▪ 5 g NaCl

▪ 15g/l Agar (pour le

milieu gélosé)

▪ H2O qsp 1l