UM V

FSR

Filière SVI- Semestre 5

2014/2015
Acquérir les connaissances de base dans le
domaine de la biologie moléculaire

Se familiariser avec les outils

méthodologiques modernes en biologie
moléculaire

S’initier à déchiffrer une portion d’un

génome et de prévoir son expression

Etre en mesure d’envisager les

changements de la séquence susceptibles
d’influencer l’expression.
[Link]  DE  SEPARATION  ET  
2  
D ANALYSE  DES  ACIDES  NUCLÉIQUES  
 Plan  du  cours  
• Initiation   aux   techniques   usuelles   de   biologie  
I   moléculaire  
• Le  Dogme  Central  
II  

II.1   • La  réplication  

• La  transcription  
II.2   • Transcription  chez  les  Procaryotes  
• Transcription  chez  les  Eucaryotes  

II.3   • La  traduction  

• La  régulation  génétique  chez  les  

II.4   bactéries  
I.  Initiation  aux  techniques  usuelles  de  biologie  moléculaire  

1 • Introduction à la biologie moléculaire

• Méthodes d’étude des Acides nucléiques

2
(extraction et purification)
• Séparation des acides nucléiques
3
et électrophorèse

4 • Endonucléases de restriction

5 • Vecteurs de clonage (plasmides)

6 • Marquage des acides nucléiques

7 • Amplification par PCR

 1. Introduction à la Biologie Moléculaire
Historique  
  Au   XXe   siècle,   suite   à   l'élaboration   des   lois   de   la  
génétique,   de   la   découverte   des   chromosomes   et   de  
l'identi@ication   de   l'ADN   comme   support   de  
l'information   génétique,   est   apparue   La   biologie  
moléculaire.  
 Au  croisement  de  la  génétique,  de  la  biochimie  et  de  
la   physique,   la   biologie   moléculaire   est   une   discipline  
scienti@ique   dont   l'objet   est   la   compréhension   des  
mécanismes   de   fonctionnement   de   la   cellule   au   niveau  
moléculaire.  
1. Introduction à la Biologie Moléculaire

Biologie  Moléculaire  ?  
Etude   des   gènes   portant   l’information   génétique,  
leurs  transformations  et  leurs  fonctions.  
 
Le   terme   «   biologie   moléculaire   »   désigne   également  
par   extension   l'ensemble   des   techniques   de  
manipulations   d'acides   nucléiques   (ADN,   ARN),  
appelées  aussi  techniques  de  génie  génétique.  
 1. Introduction à la Biologie Moléculaire

Que  faut  il  étudier  ?  

•   Les   complexes   macromoléculaires   de   l’ADN,   de   l’ARN          
et  des  protéines  
 
•  Transfert  de  l’information:  Réplication,  Transcription    
et  Traduction  
 1. Introduction à la Biologie Moléculaire
Quelles  sont  les  conséquences                                        
du  développement  de  la  biologie  
moléculaire  ?  
•  des  connaissances  dans  le  domaine  fondamental  
•  des  applications  pratiques  :  
-­‐  production  de  protéines  d’intérêt  médical  
-­‐  vaccins  
-­‐  diagnostic  en  médecine  
-­‐  plantes  et  animaux  transgéniques…  
1. Introduction à la Biologie Moléculaire

RAPPELS:  
ADN  /  ARN    
STRUCTURES  /  FONCTIONS  
1. Introduction à la Biologie Moléculaire
RAPPEL  
Ø  50%  du  poids  sec  de  la  plupart  des  cellules  =  protéines  
Ø  Protéine  =  polymère  (chaîne)  d'acides  aminés  

Ø  Chaque  protéine  est  caractérisée  par  sa  séquence  d'acides  aminés.  

Ex. le lysozyme (126 AA)
Lys-Val-Phé-Gly-Arg-Cys-Glu-Leu-Ala-Ala-Ala-Met-Lys-Arg-His-Gly-Leu-Asp-
Asn-Tyr-Arg-Gly-Tyr-Ser-Leu-Gly-Asn-Trp-Val-Cys-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Ser-
Asn-Thr-Gln-Ala-Thr-Asn-Arg-Asn-Thr-Asp-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr-Gly-Ilu-Leu-
Gln-Ilu-Asn-Ser-Arg-Trp-Trp-Cys-Asn-Asp-Gly-Arg-Thr-Pro-Gly-Ser-Arg-Asn-
Leu-Cys-Asn-Ilu-Pro-Cys-Ser-Ala-Leu-Leu-Ser-Ser-Asp-Ilu-Thr-Ala-Ser-Val-
Asn-Cys-Ala-Lys-Lys-Ilu-Val-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Met-Asn-Ala-Trp-Val-Trp-
Arg-Asn-Arg-Cys-Lys-Gly-Thr-Asp-Val-Gln-Ala-Trp-Ilu-Arg-Gly-Cys-Arg-Leu
 1. Introduction à la Biologie Moléculaire
RAPPEL  
ü On  connaît  actuellement  ~  8000  protéines  différentes.  
ü On  en  découvre  une  centaine  de  nouvelles  par  mois.  
ü Nombre   total   de   protéines   que   peut   fabriquer   l'organisme  
humain  =  ???      (quelque  chose  entre  50  000  et  150  000).  
ü Chaque  cellule  fabrique  les  protéines  dont  elle  a  besoin.  
ü Pour  fabriquer  une  protéine,  il  faut  deux  choses:  
• Des  acides  aminés.  
• La  «  recette  »  :  quels  acides  aminés  faut-­‐il  assembler    
et  dans  quel  ordre  ?  
 1. Introduction à la Biologie Moléculaire
RAPPEL  
«  Recettes  »  
contenues  
dans  le  noyau  

Noyau  contient  
une  matière  
appelée  
chromatine  

Chromatine  =  protéines  appelées  histones  et  l’ADN  

ADN  =  «  recettes  »  des  protéines  
 1. Introduction à la Biologie Moléculaire
RAPPEL  
ü  Crick  et  Watson,  1953  

ü  Découverte  de  la  structure  de  la  molécule    

           d'ADN  

ü  ADN  et  ARN  =  acides  nucléiques  

ü  Les  acides  nucléiques  =  polymères  de  nucléotides  

1. Introduction à la Biologie Moléculaire
RAPPEL  
ü  NUCLÉOTIDE  =  ose  +  base  azotée  +  acide  phosphorique  
Base  azotée  

Groupement  
phosphate  

4 1
Sucre  
3 2
1. Introduction à la Biologie Moléculaire
RAPPEL  
ü    Les  bases  azotées  :  puriques  ou  pyrimidiques  

Uracile
1. Introduction à la Biologie Moléculaire
ADN  :  structure  
ü  ADN  =  Acide  DésoxyriboNucléique  

ü  Polymères  de  nucléotides  reliés  entre  eux  par  des  fonctions  

esters  

4 1

5 5 3 2
3
Liaison 3 OH-5 P
ü  Ose  =  désoxyribose  

ü  Les  bases  :  Adénine,  Guanine,  Cytosine  et  Thymine  

ü  Si  on  sépare  une  molécule  d'ADN  en  nucléotides,    

           on  obtient  toujours  :  A=T  et  G=C  

ü  Pourquoi  ?  
 1. Introduction à la Biologie Moléculaire
ADN  :  structure  
ü  Hypothèse  de  Crick  et  Watson  :  A  peut  s'apparier  avec  T  et  C  avec  G:

             A  avec  T  :                
deux  liaisons  
hydrogène  

     C  avec  G  :        
trois  liaisons  
hydrogène  
1. Introduction à la Biologie Moléculaire
ADN  :  structure  
Ø  Donc  la  molécule  d ADN  est  formée  de  2  brins  de  nucléotides  

Ø  Ces  deux  brins  ont  trois  propriétés  essentielles  :  

Ø  antiparallèles  

Ø  complémentaires  

Ø  hélicoïdaux  
1. Introduction à la Biologie Moléculaire
ADN  des  différents  être  vivants    
ü  Dans  tous  les  organismes  :    
• Support  de  l information  génétique  
• Structure  en  double  hélice  (sauf  certains  virus)    

ü  Différences  :    
• Nombre  de  molécules  d ADN  :  1  pour  E.  Coli  et  46  pour  
l Homme  
• Longueur  :  quelques  milliers  de  nucléotides  à  plusieurs  
millions  
• Forme  :  linéaire  ou  circulaire  
• Localisation  dans  la  cellule  :  séparé  ou  non  du  
cytoplasme  par  une  membrane  
• Séquence  en  bases  

ü  Virus  :    génomes  les  plus  petits  (quelques  milliers  de  

nucléotides)  à    ADN  ou  à  ARN  
1. Introduction à la Biologie Moléculaire
ADN  des  différents  être  vivants    
ü  Procaryotes  :  ADN  dans  le  cytoplasme  
     Un  seul  chromosome    «  circulaire  »  =  continu    
     Plusieurs  millions  de  nucléotides  
     Présence  de  plasmides  =  petits  morceaux  d ADN  
       circulaires,  indépendants  de  l ADN  principal  
 
ü  Eucaryotes  :    ADN  dans  le  noyau  
     Plusieurs  chromosomes  avec  ADN  fortement    
     compacté  et  linéaire   ADN  
     Plusieurs  milliards  de  nucléotides  
     ADN  associé  à  des  protéines  
Histones  
 
ü  Cas  de  l ADN  des  mitochondries  :      
   ADN  circulaire  
   Code  génétique  différent  de  l ADN  nucléaire  
   Transmission  maternelle  uniquement    
1. Introduction à la Biologie Moléculaire
RAPPEL  
Procaryote/Eucaryote  

Cellule  animale  

Bactérie  

Cellule  végétale  
1. Introduction à la Biologie Moléculaire
Les  3  domaines  du  vivant  
1. Introduction à la Biologie Moléculaire
ARN  :  structure    
Ø  ARN  =  Acide  RiboNucléique  

Ø  Polymères  de  nucléotides  reliés  entre  eux  par  des  fonctions  

esters  
5  
HOH2C   OH  

Ø  Ose  =  ribose   4   1  
Ribose  
3   2  

OH   OH  

Ø  Les  bases  :  Adénine,  Guanine,  Cytosine  et  Uracile  

Ø  ARN  =  un  seul  brin  

Ø  Appariement  entre  2  ARN  différents,  entre  un  brin  d’ADN  et  un  
brin    d’ARN  ou  sur  lui  même  :  A  avec  U  et  G  avec  C    
1. Introduction à la Biologie Moléculaire
Les  différents  ARNs  :  
Ø  ARNr  =    ARN  ribosomique    
   Participent,  avec  les  protéines  ribosomiques,  à  la      
   formation  des  ribosomes  (molécules  nécessaires                      
   à  la  synthèse  des  protéines)  
 
Ø  ARNt  =    ARN  de  transfert  
   Transfert  les  acides  aminés  vers  le  lieu  de  synthèse            
   des  protéines  
 
Ø  ARNm  =  ARN  messagers  
   Portent  l information  génétique  de  l ADN  vers  le  lieu  
   de  synthèse  des  protéines  
 
Ø  ARNsn=  ARN  small  nuclear    
Présent  dans  le  noyau  uniquement  
Participent  à  la  régulation  post-­‐transcriptionnelle  
1 • Introduction à la biologie moléculaire

• Méthodes d’étude des Acides nucléiques

2
(extraction et purification)
• Séparation des acides nucléiques
3
et électrophorèse

4 • Endonucléases de restriction

5 • Vecteurs de clonage (plasmides)

6 • Marquage des acides nucléiques

7 • Amplification par PCR

2. Méthodes d’étude des Acides nucléiques
(extraction et purification)

Décrire les gestes qui permettent de réaliser

l’extraction et la purification d’ADN génomique.

Faire la distinction entre les démarches à suivre

en fonction des types d’organismes .

Expliquer le principe de l’extraction de l’ARN

messager en vue de la réalisation d’une banque
d’ADNc.

Expliquer le principe de dosage des acides

nucléiques et le calcul des quantités d’acides
nucléiques à partir des données brutes fournies
par un spectrophotomètre.
 [Link]  de  l’ADN  
Différents ADN

ADN génomique
La totalité de l'ADN à
l'intérieur du noyau
=ADN nucléaire
=ADN chromosomique

Différent d :
ADN Mitochondrial
ADN Chloroplastique
ADN Extra-chromosomique
(plasmides)
 [Link]  de  l’ADN  

2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique  

=technique  permettant  d'isoler  l'ADN  de  cellules  ou  de  tissus.    

L'ADN   extrait   à   digestion,   hybridation   (Southern   blot),  
séquençage,  PCR,  clonage…    
Différents   protocoles   pour   extraire   l'ADN   avec   même   schéma   de  
principe  :    

•Lyse  des  cellules  

•Elimination  des  protéines  
•Elimination  des  autres  acides  nucléiques  (ARN...)  
•Concentration  de  l'ADN  par  précipitation  à  l'alcool  
 [Link]  de  l’ADN  
2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique  

Différentes  variantes  employées:  

L ADN   génomique   est   issu   de   tissu   (organisme   animal   ou  
végétal)    Ou  de  cellules  (micro-­‐organisme,  @luides  biologiques…)    
Plusieurs  techniques  sont  utilisées:  

Phénol/Chloroforme  à  ADN  pur  

Kits  commerciaux  à  extractions  rapides  à  l'aide    

de  réactifs  prêts  à  l'emploi.  
2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique  
Préparation  du  matériel  pour  l’extraction  
CAS  1:  à  partir  de  matière  fraiche  
FEUILLES  FRAICHES  
2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique  
Préparation  du  matériel  pour  l extraction  
CAS  2:  à  partir  de  matière  sèche  
FEUILLES  LYOPHILSEES  
2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique  
Préparation d'ADN génomique
lyse des cellules ou des tissus •disperser les bicouches lipidiques des
membranes
=broyage ou pas + extraction/détergents
•dénaturer les protéines srtt celles
associées à l'ADN dans la chromatine

l'ADN : très longs filaments

Solution très visqueuse s'opposant aux écoulements
hydrodynamiques.

déprotéinisation de la solution protéines dénaturées à précipité à

l'interface phénol-eau = « gâteau »
=extraction / solvants organiques, en
l'ADN en solution dans la phase
général du phénol +/-chloroforme
aqueuse

précipitation de l ADN
L ADN collecté/centrifugation
=addition d'éthanol ou d'isopropanol
dans la phase aqueuse à dissous dans Tampon ou Eau pure.

Pour éliminer les ARNsà Traitement par l ARNase.

2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique   Ethanol  mobilise  l eau  du  milieu  
&  diminue  la  solubilité  de  l’ADN  

Pour   éliminer   les   traces   de   phénol   et   d'autres   contaminants   (prot.,  

enz…)   à   dialyse   ou   puri@ication   par   chromatographie   en   colonne   de  
gel    dénaturant  ou    d'adsorption.   33  
Commentaire  :  
La  puri@ication  d'une  solution  d'ADN  se  fait  le  plus  souvent  par  
précipitations  répétées  dans  l'alcool.    
Une   solution   d'ADN,   portée   à   haute   force   ionique   par   addition  
de  NaCl  3  M  (1/10  du  volume),  est  additionnée  d'un  large  excès  
d'éthanol   absolu   à   -­‐20°C.   Au   bout   de   quelques   minutes   au  
maximum,   on   voit   apparaître   un   précipité   blanchâtre,  
translucide   et   @ilamenteux   (la   «   méduse   »)   constitué   de   longs  
@ilaments  d'ADN  précipité.    
On  recueille  ce  précipité  par  centrifugation  à  10000  g  pendant  
un   quart   d'heure   environ.   Pour   laver   l'ADN   on   resuspend   le  
précipité   dans   de   l'éthanol   à   75   %   toujours   à   -­‐20°C.   puis   on  
centrifuge  à  nouveau.  Le  culot  de  cette  dernière  centrifugation  
est  égoutté,  puis  séché  sous  vide.    
On   peut   conserver   l'ADN   à   sec   ou   le   redissoudre  
immédiatement   soit   dans   de   l'eau   pure   stérile,   soit   dans   un  
tampon  Tris-­‐EDTA.  
2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique  
2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique  
Exemple  1  
GENOMIC  DNA  ISOLATION  FROM  RICE  
SEEDLINGS  
• DNA  extraction  buffer  
– Cell  wall  and  cell  
membranes’  disruption  with  
SDS/Mercaptoethanol  
• Protein  denaturation  
– Chloroform/  phenol  
• DNA  precipitation  
– Absolute  Ethanol  
• Washing  
– 70%  Ethanol  
• DNA  renaturation  
– TE  buffer  
2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique  
Exemple  2  
GENOMIC  DNA  ISOLATION  FROM                  
DATE  PALM  SEEDLINGS  
• DNA  extraction  buffer  
– Cell  wall  and  cell  
membranes’  disruption  with  
CATB  &  PVPP  
• Protein  denaturation  
– Dichloromethane  
• DNA  precipitation  
– Absolute  Isopropanol  
• Washing  
– 70%  alcohol  
• DNA  renaturation  
– TE  buffer  
2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique  
Comparaison de différentes méthodes:
méthode classique versus kits comerciaux

Phénol/ Kit Puregene Kit Qiagen

Chloroforme

Quantité/ 2 3 1
Rendement
Pureté de l extrait 3 1 2

Rapidité 1 2 3

Coût 3 2 1

Sécurité du 1 3 3
manipulateur

1= la moins bonne; 3= la meilleure.

2.1.1.    Extraction  de  l’ADN  génomique  
RECAPITULATIF  
L extraction/puri[ication  de  l'ADN  =  2  Etapes:    
 
Extraction  à  digestion  des  tissus  et  lyse  des  cellules  
 
Puri@ication   à   séparation   de   l ADN   des   autres   constituants  
cellulaires.  
2.1.2.    Extraction  de  l’ADN  plasmidique  
Les  plasmides:  Généralités  

ü Petites   molécules   d’ADN   double   brin,   habituellement  

circulaires  
ü A  localisation  extrachromosomique  
ü Présents   chez   la   plupart   des   espèces   bactériennes  
(qques  levures  et  mycètes)  
Chromosome  
bactérien  circulaire   Plasmides  
4millions  pb   Milliers  pb  

Bactérie  
40
 2.1.2.    Extraction  de  l’ADN  plasmidique  
Les  plasmides:  Généralités  
ü A  réplication  autonome  (=réplicons)  indépendamment  
des  chromosomes  

ü A  taille  très  variable  (1Kb  à  1  Mb)  

ü Portent  un  nombre  de  gènes  très  réduit  (≤30)  

ü A   information   génétique   non-­‐essentielle   pour   l’hôte  

mais  procurant  un  avantage  sélectif  

ü En  nbr.  variable:  

Plasmide  à  copie  unique       Plasmides  à  copies  multiples  

(1  à  3/cellule  hôte)     (20  à  2000/cellule  hôte)  
Plasmide  Stringent     Plasmide  relâché    
Réplication  stringente   Réplication  relâchée  
41
2.1.2.    Extraction  de  l’ADN  plasmidique  
Les  plasmides:  Généralités  
ADN  double  brin  Superhélical  avec  3  formes:  
•  Confèrent  à  la  bactérie-­‐hôte  une  grande  souplesse  génétique.  
•  Augmentent  son  patrimoine  génétique.  
•  Procure  un  avantage  sélectif.  
Différentes  formes  d'un  plasmide  
L'axe   de   la   double   hélice   d'ADN   peut  
lui-­‐même   s'enrouler   en   une   super  
hélice   droite   ou   gauche.   Cette   forme  
superenroulée  de  l'ADN  joue  un  rôle  
b i o l o g i q u e   t r è s   i m p o r t a n t  
(compaction,  stabilité  de  l'ADN).    
Une   coupure   sur   un   seul   des   deux  
brins   d'ADN   superenroulé   (forme   I)  
déverrouille  la  superhélicité  et  permet  
le   relâchement   spontané   de   la  
molécule   sous   forme   circulaire  
ouverte  (forme  II).    
La   réparation   de   cette   coupure   par  
une   ligase   produit   une   forme  
circulaire  fermée  (forme  Ir).    
Une   coupure   sur   les   deux   brins   d'une  
molécule   superenroulée   ou   d'une  
molécule   circulaire   fermée   produit  
une  molécule  linéaire  (forme  III).  
43
2.1.2.    Extraction  de  l’ADN  plasmidique  
Les  plasmides:  Généralités  
Les   plasmides   peuvent   être   éliminés   des   cellules  
hôtes=CURAGE  (curing)  
" Spontané/Induit    
"   Principe:   traitements   inhibant   la   réplication   des   plasmides  
sans   affecter   la   reproduction   des   cellules   hôtes     à   Plasmides  
inhibés   progressivement   &   dilués   au   cours   de   la   multiplication  
bactérienne  
Méthodes  de  curage:  
" Mutagènes  dérivés  de  l’acridine  
" Radiations  UV  ou  ionisantes  
" Privation  de  thymine  
" Températures  supra-­‐optimales   44  
 2.1.2.    Extraction  de  l’ADN  plasmidique  
Puri[ication  des  plasmides:  La  lyse  alcaline  
ü Parmi   les   techniques   les   plus   courantes   de   la   biologie   moléculaire   =  
noms   abrégés:   miniprep,   midiprep   et   maxiprep   (volume   de   la   culture  
bactérienne).  
BUT   :   Extraire   de   façon   rapide   l'ADN   plasmidique   a@in   de   l'analyser   avec   des  
enzymes   de   restriction   et   électrophorèse   en   gel   d'agarose.   Obtenir   plusieurs   mg  
d'ADN   partiellement   puri@ié   et   Réaliser   plusieurs   digestions   enzymatiques   pour  
véri@ier  un  clone,  ou  établir  une  carte  de  restriction.  

ü Préparation  sélective  de  l'ADN  du  plasmide  contenu  dans  les  bactéries,  
tout  en  éliminant  l'ADN  du  chromosome  bactérien.    

ü Différentes  variantes  ou  améliorations  de  cette  méthode  existent  

ü kits   commerciaux   (grd   nbr)   avec   petites   colonnes   de   résine  

chromatographique  échangeuse  d'ion  à  améliorer  la  pureté  de  l'ADN.  45  
2.1.2.    Extraction  de  l’ADN  plasmidique  
Puri[ication  des  plasmides:  La  lyse  alcaline  

Lyse  des  cellules  /détergent  (SDS)  en  présence  de  soude  (pH  13)  
Dénaturation  de  l'ADN  total  

Neutralisation  rapide  /acétate  de  potassium    (pH  5,5)  

Renaturation  de  l’ADN  plasmidique   Précipitation  de  l’ADN  Chromosomique  

Concentration  de  l'ADN  plasmidique  par  précipitation  à  l'alcool  

Récupération  de  l’ADN  par  centrifugation  

Suspension  de  l’ADN  plasmidique  dans  TE  ou  Eau  pure  

Elimination  des  ARN/ribonucléases  (hydrolyse  sélective  des  ARN/  ADN  intact)  

46
 [Link]  de  l’ARN  
=technique  permettant  d'isoler  l’ARN  de  cellules  ou  de  tissus.    
L’ARN   extrait   à   hybridation   (Northern   blot),   banques   ADNc,   RT-­‐
PCR…    
Différents   protocoles   pour   extraire   l ARN   avec   même   schéma   de  
principe  :  
" Lyse   cellulaire   mécanique   (congélation,   billes   de   céramique   ou  
détergents)  ou  enzymatique  (lysozyme  ou  la  lyticase)+Protection  des  
ARN  de  l’action  des  ARNases.  
"  2  grands  principes:    
 1)  les  différences  de  propriétés  physico-­‐chimiques  ARN/protéines  ;    
 2)  l’adsorption  sélective  des  ARN  sur  support  solide.  
 [Link]  de  l’ARN  
Inhibition  des  ARNases  au  cours  de  l’extraction  des  ARNs  
Le pyrocarbonate d'éthyle ou diéthyl pyrocarbonate,
diéthyl dicarbonate, DEPC, est un composé organique utilisé en
biochimie pour sa capacité à réagir spécifiquement avec les
acides aminés histidine et, dans une moindre mesure, tyrosine
des protéines.

Utilisation en Extraction des ARN

Cette particularité permet d'utiliser cette molécule pour
inactiver les RNases. Ces protéines sont en effet très résistantes
aux agents dénaturants. La réaction avec le DEPC modifie les
histidines du site actif de ces enzymes.
L'inactivation des RNAses est recommandée au cours
d'expériences mettant en jeu des ARNs afin d'éviter leur
dégradation.
 [Link]  de  l’ARN  
Au laboratoire
• La vaisselle de laboratoire peut être décontaminée par
trempage dans une solution à 1% de DEPC pendant environ
une heure.
• L'eau utilisée pour faire les diverses solutions en contact avec
les ARN est aussi traitée avec le DEPC. On obtient ainsi de
l'eau sans RNases.
• Le DEPC n'ayant pas réagi est dégradé en éthanol et dioxyde
de carbone par une courte phase de chauffage sous pression à
120 °C dans une autoclave.
Ce produit est considéré comme mutagène
àA manipuler avec précaution …
[Link]  de  l’ARN  
Extraction  des  ARN  totaux  
Broyage/Homogéneisation  
Trizol  (pH  5)  

Séparation  de  l’ARN  

Chloroforme  

Précipitation  de  l’ARN  

Ethanol  Absolu  froids  …  

Suspension  de  l’ARN  

Eau  pure  (RNAse  free)  
 GuSCN:  agent   [Link]  de  l’ARN  
puissant  de   Extraction  des  ARN  totaux   beta2-­‐
mercaptoéthanol  à    
dénaturation  des  
rupture  des  ponts  
protéinesà  Lyse    
disulfures  protéiques  

+Phénol/Chlrfà  accélérer  la  

procédure  d'extraction  
Pour   extraire   l’ARN   d’un   tissu   ou   d’une   suspension   de   cellules,   il   faut  
51  
impérativement  inhiber  toute    trace      d ARNase.    
 Commentaire  :  

L'homogénéisation   dans   le   tube   de   Potter   se   fait   dans   un   tampon  

Tris-­‐EDTA   en   présence   de   thiocyanate   de   guanidinium   4   M   et   de  
SDS.  Les  débris  cellulaires  sont  sédimentés  en  10  min  à  10  °C.    
Le   surnageant   contenant   les   acides   nucléiques   est   déposé   sur   un  
gradient   de   densité   comprenant   au   fond   du   tube   une   solution   très  
dense  de  CsCl  5,7  M  surmontée  d'une  couche  intermédiaire  de  CsCl  
2,4   M.   Ce   gradient   est   ultracentrifugé   durant   24   heures   à  
30000  tours/min  à  la  température  ambiante.    
On   peut   alors   recueillir   un   culot   d'ARN   de   masses   moléculaires  
élevées   qui   seront   soumis   à   l'extraction   par   le   phénol   et   le  
chloroforme.  
 [Link]  de  l’ARN  
Puri[ication  des  ARNm  

Parmi  les  acides  ribonucléiques  extraits  des  cellules  à  les  ARN  
messagers  =  ARNm  =  classe  la  plus  étudiée  

se  caractérisent  par  la  présence  du  côté  3'-­‐terminal  d'une  longue  

queue  poly(A)  synthétisée  à  la  phase  post-­‐transcriptionnelle.    

PURIFICATION  

chromatographie   d'af[inité   entre   cette   queue   poly(A)   et   une  

colonne  dont  la  phase  @ixe  est  pourvue  de  fragments  d'oligo(dT)  
de  quelques  dizaines  de  nucléotides  qui  peuvent  s'hybrider  avec  
les  RNA  poly(A).    
[Link]  de  l’ARN  
Puri[ication  des  ARNm  
Commentaire  :  
Après avoir lavé la colonne en milieu alcalin
(potasse), on charge les ARN totaux à haute force
ionique (KCl 0,5 M) puis on rince la colonne avec du
KCl 0,1 M en surveillant l'absorbance de l'éluat à
260 nm pour s'assurer de l'élimination des ARN non
retenus par la colonne (ARNr, ARNt,... ). Enfin, on
élue la fraction retenue par la colonne en abaissant
la concentration de KCl à 0,01 M et en élevant la
température.
Un micro essai avec la reverse transcriptase permet
de s'assurer de la qualité de ce RNA poly(A) comme
matrice pour la synthèse de cDNA.
[Link]  de  l’ARN  
Puri[ication  des  ARNm  
 [Link]érisation  des  acides  nucléiques  
2.3.1.  Spectres  d absorption  des  acides  nucléiques  
Les spectres d absorption des acides nucléiques présentent
une bande d absorption maximale autour de 260 nm.
 [Link]érisation  des  acides  nucléiques  
2.3.1.  Spectres  d absorption  des  acides  nucléiques  
Tous les nucléotides ont leur λmax autour de 260 nm, valeur qui
n est pas affectée par le composant glucidique et le phosphate.
 [Link]érisation  des  acides  nucléiques  
2.3.1.  Spectres  d absorption  des  acides  nucléiques  
 [Link]érisation  des  acides  nucléiques  
2.3.2. Dosage des acides nucléiques
ü L absorbance à 260 nm peut être mesurée pour estimer la
concentration d acide nucléique.
ü Cette estimation est indispensable après extraction d ADN
à partir d un matériel biologique.
ü P o u r d e s d é t e r m i n a t i o n s a p p r o x i m a t i v e s d e l a
concentration des acides nucléiques purs, on peut assumer
qu une solution aqueuse contenant 50 µg/ml d ADN
double brin ou 25µg/ml d ADN simple brin ou 40 µg/ml
d ARN donne une valeur de A260nm = 1.
ü Dosage très sensible; on peut descendre jusqu à une
concentration massique de 2-3 µg/mL.
 [Link]érisation  des  acides  nucléiques  
2.3.2. Dosage des acides nucléiques
ü L absorbance à la longueur d onde caractéristique de 280
nm (i.e. A280nm) est communément utilisée pour estimer la
concentration totale de protéines dans un échantillon.

ü Les protéines sont des interférents. Il est donc indispensable

de mesurer également l absorption à 280 nm.

ü Pour des échantillons d ADN pur, A260nm/A280nm= 1.8.

Un rapport < 1.8 indique la présence de protéines, tandis
qu un rapport > 1.8 indique la présence d ARN.
1 • Introduction à la biologie moléculaire

• Méthodes d’étude des Acides nucléiques

2
(extraction et purification)
• Séparation des acides nucléiques:
3
électrophorèse

4 • Endonucléases de restriction

5 • Vecteurs de clonage (plasmides)

6 • Marquage des acides nucléiques

7 • Amplification par PCR

 3. Séparation des acides nucléiques:
électrophorèse

La technique la plus utilisée pour la séparation

des acides nucléiques: L électrophorèse

Principe général:
Dans un milieu donné, la séparation des particules se fait en
fonction de leur charge électrique et pour des charges
identiques, en fonction de leur taille.
 3. Séparation des acides nucléiques:
électrophorèse
= technique de biologie moléculaire à séparer des fragments
d ADN de différentes tailles en les faisant migrer dans un
gel en les soumettant à un courant électrique.

" Le gel est constitué d'une matrice de polymère baignant dans

un tampon conducteur.

" Deux principaux polymères sont utilisés : l'agarose et le

polyacrylamide.

Cette technique est assez simple à mettre en œuvre si on dispose

des bons outils et de quelques astuces. 65
 3. Séparation des acides nucléiques:
électrophorèse
Principe:
basée sur la séparation des acides nucléiques chargés
négativement à pH 7~8, vers l'anode (+) sous l'effet d'un
champ électrique. Cette séparation s'effectue à travers la
matrice du gel en fonction de la taille des molécules.
 3. Séparation des acides nucléiques:
électrophorèse

Les  applications  de  l électrophorèse  des  acides  

nucléiques  
ü Estimation du poids moléculaire de fragments
d'ADN après une digestion par des enzymes de
restriction

ü Analyse d'ADN ou d'ARN après une amplification

par PCR

ü Séparation de fragments d ADN digérés avant

Southern blot ou d'ARN dans le cas de Northern
Blot.
 3. Séparation des acides nucléiques:
électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  d’agarose  
ü L agarose = polymère à base d'agar purifié. Différentes
puretés d'agarose sont disponibles. En général, de l'agarose
de grande pureté à solidification lente est utilisé lorsque
l'ADN doit être extrait du gel après migration.

ü L'agarose est utilisé à des concentrations de 0,5% à 2%

(poids/volume) et permet de séparer des molécules de très
grande taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN ;
 3. Séparation des acides nucléiques:
électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  d’agarose  
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  d’agarose  
Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double
brin, selon la concentration d'agarose du gel
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  d’agarose  

Le pouvoir de résolution d un gel d agarose dépend

du % d agarose. Il peut varier de 0,5 à 2%
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  d’agarose  

Le gel d agarose n est pas résolutif pour de petits

fragments d ADN (Inférieurs à 100 pb)
 Un gel d'agarose avant éclairage sous
ultraviolets

Le gel est exposé à des

rayonnements ultraviolets,
le BET colore l'ADN en une
couleur rouge-orangée

Photographie
du gel Puits :
1. Echelle de marqueur de poids
moléculaire (1kbplus) 2. vide, 3. Un
produit de PCR d'une taille
légèrement supérieure à 500 paires
de bases 4. Fragment d'environ 4.5kb
d'un Plasmide digéré par une enzyme
de restriction
 Bromure  d'éthidium  

Le   bromure   d'éthidium   (EtBr)   =   à   la   fois   un   agent   intercalant   et   un  

@luorochrome.    
Structure   aromatique   plane   à   s'intercaler   entre   les   paires   de   bases   à  
détorsion   de   la   double   hélice   et   émission   de   lumière   (@luorescence)   dans   le  
rouge-­‐orange  lorsque  le  complexe  ADN-­‐EtBr  est  excité  en  lumière  utraviolette.    

C'est l'une des principales méthodes de détection de l'ADN dans les gels
d'électrophorèse. Il peut être remplacé par l’iodure  de  propidium  
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  d’agarose  

Les  avantages  de  l'électrophorèse  en  gel  d'agarose  sont:  

ü préparation   aisée,   rapide,   et   peu   coûteuse   des   gels  

d'agarose  

ü pas  de  dénaturation  des  échantillons  

ü l'agarose  plus  ferme  et  moins  toxique  que  le  gel  de  
polyacrylamide  

ü les   échantillons   peuvent   être   récupérés   en   vue  

d'analyses  supplémentaires  
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  de  polyacrylamide  
ü L'acrylamide   est   le   nom   usuel   du   2-­‐propénamide   (amide  
acrylique)  de  formule  brute  C3H5NO.  
ü En   biologie   moléculaire,   on   utilise   l'acrylamide   polymérisé  
(polyacrylamide)  pour  réaliser  des  électrophorèses.  

ü Le   polyacrylamide   est   utilisé   à   des   concentrations   de   4%   à  

20%  (poids/volume)  et  permet  de  séparer  des  molécules  plus  
petites  d'acides  nucléiques.    
ü On  peut  aussi  faire  varier  sa  réticulation  (taux  de  rami@ication)  
lors   de   la   polymérisation   pour   moduler   les   paramètres   de  
séparation  ;  
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  de  polyacrylamide  
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  de  polyacrylamide  
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  de  polyacrylamide  
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  de  polyacrylamide  
GEL D ACRYLAMIDE NATIF (L ADN est double brin)

Efficace pour les petits fragments d ADN entre 20 &

2000 paires de bases. (cartographie)
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]èse  sur  gel  de  polyacrylamide  
GEL D ACRYLAMIDE DENATURANT
(L ADN est simple brin)
+ agent
chaotropique: l'urée

Efficace pour les très petits fragments d ADN entre 1 & 400 paires de bases.
(séquençage)
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
[Link]  facteurs  affectant  la  migration  
ü La  longueur  de  la  molécule  d'ADN  :  la  séparation  se  fait  en  fonction  
du  poids  moléculaire  et  donc  de  la  taille  de  l'ADN.    

ü La   conformation   de   l'ADN:   l'ADN   plasmidique,   non   digéré   par   une  

enzyme   de   restriction,   migre   à   différentes   vitesses   (du   plus   lent   au  
plus  rapide)  :  ADN  circulaire,  ADN  linéaire  et  ADN  superenroulé.  

ü La  concentration  du  gel:  l'augmentation  de  la  concentration  réduit  la  

vitesse  de  migration  et  permet  la  séparation  de  fragment  d'ADN  de  
plus  petite  taille.  

ü Le  voltage:  plus  le  voltage  est  important,  plus  la  vitesse  de  migration  
augmente.   Toutefois   le   voltage   est   limité   en   intensité   (5V/cm):   un  
fort  voltage  à  augmentation  de  température  (fondre  le  gel).    
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
ASPECT DE L'ADN GENOMIQUE SUR GEL D AGAROSE

ADN natif
non digéré
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
ASPECT DE L'ADN GENOMIQUE SUR GEL D AGAROSE
INTACT DNA SAMPLES DEGRADED DNA SAMPLES

Agarose gel electrophoresis of DNA purified Genomic DNA from 8 blood samples stored at 4°C for 1
with SpinClean™ Genomic DNA purification Kit. week. DNA was purified using the QIAamp DNA Blood
M : 1 kb ladder marker, Mini Kit. When blood is stored at 4°C the DNA is
line 1: Chicken whole blood(20ul sample volume), rapidly degraded due to apoptosis; the resulting
line 2 : Human whole blood(100ul sample volume), apoptotic banding pattern can clearly be seen in these
line 3 : [Link], line 4 : [Link], samples. M1: lambda–HindIII; M2:100 bp ladder.
line 5 : Streptomyces hygroscopicus subsp.
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse
Vérification de l’integrité de l’ADN
High Quality Genomic DNA
>95% DNA will be of high molecular
weight, migrating as intact band near the
top of the gel
Very little evidence of smaller fragments
indicated by a smear of many different
sized DNA fragments

A260 1.0 50 ug/mL

DNA
A260 / A280 1.6-1.8 High Purity
1.0
A260 40 ug/mL
(in water)
RNA
1.9-2.1
A260 / A280 High Purity
(in 10 mM Tris-Cl, pH 7.5)
3. Séparation des acides nucléiques: électrophorèse

ASPECT DES ARN SUR GEL D AGAROSE

ARN  totaux  
Marqueur  de  
non  dégradés  
PM  (1kb)  

ARN  totaux  
dégradés  
1 • Introduction à la biologie moléculaire

• Méthodes d’étude des Acides nucléiques

2
(extraction et purification)
• Séparation des acides nucléiques
3
et électrophorèse

4 • Endonucléases de restriction

5 • Vecteurs de clonage (plasmides)

6 • Marquage des acides nucléiques

7 • Amplification par PCR

 4.  Endoncléases  de  restriction  
4.1.  Généralités  

Ces   enzymes,   naturellement   présentes   chez   les   bactéries,   sont  

devenues  des  outils    important  en  génie  génétique.  
4.  Endonucléases  de  restriction  
4.1.  Généralités  
 4.  Endonucléases  de  restriction  
4.2.  Nomenclature  
 4.  Endonucléases  de  restriction  
4.2.  Nomenclature  

Sites = 4 à 6
paires de bases
à
Coupure
fréquente
~ 3kb

Sites = 8
paires de bases
à
Coupure rare
~ 100-200kb
 4.  Endonucléases  de  restriction  
4.3.  Fragment  de  restriction  

Le   nom   d'enzyme   de   restriction   provient   de   ce   mécanisme,   en  

effet   la   présence   de       ces   enzymes   dans   les   bactéries   restreint  
l'infectiosité  des  bactériophages.  
 4.  Endonucléases  de  restriction  
4.4.  Système  de  restriction-­‐modi[ication  
 4.  Endonucléases  de  restriction  
4.5.  Restriction:  La  réaction  générale  
 4.  Endonucléases  de  restriction  
4.6.  Exemples  
 4.  Endonucléases  de  restriction  
4.6.  Exemples  
 Autres  enzymes  coupant  l’ADN  
La  DNase  

La   DNase1   est   une   endonucléase   qui  

dégrade   l ADN   double   brin   ou  
simple  brin.  
L e s   c o u p u r e s   ( « n i c k s » )   s o n t  
complètement   aléatoires   sans  
spéci[icité  de  site.  
Les   produits   de   la   réaction   sont   des  
oligonucléotides   qui   possèdent   un  
groupement   phosphate   en   5 .  
L activité  dépend  des  ions  bivalents  
(Mg2+  et  Mn2+)  
 Autres  enzymes  coupant  l’ADN  
La  Nucléase  S1  

La nucléase S1 dégrade l ADN simple brin.

Nettoie les extrémités simples brins.

Coupe un misappariement

Sans activité sur le double brin «parfait »

Sans activité sur les hybrides ADN/ARN

Cette enzyme est extraite d un champignon

 Autres  enzymes  coupant  l’ADN  
L’Exonucléase  III  

Cette enzyme catalyse l hydrolyse séquentielle des nucléotides d un ADN

3 à5 à partir d une extrémités 3 OH libre. Elle possède en plus une activité
3 phosphatase.

Ces trois types d enzyme ne font pas partie

des endonucléases de restriction.

1 • Introduction à la biologie moléculaire

• Méthodes d’étude des Acides nucléiques

2
(extraction et purification)
• Séparation des acides nucléiques
3
et électrophorèse

4 • Endonucléases de restriction

5 • Vecteurs de clonage (plasmides)

6 • Marquage des acides nucléiques

7 • Amplification par PCR

 5.  Vecteurs  de  clonage  
5.1.  Dé[inition  
  Un   vecteur   est   un   transporteur   capable   de   conduire  
une  molécule  à  pénétrer  dans  une  cellule  alors  qu’elle  
n’est  pas  captée  spontanément  par  cette  cellule.    
 
  Les   vecteurs   sont   principalement   étudiés   pour  
transporter   des   médicaments   dans   un   type   déterminé  
de  cellules  de  l’organisme  d’un  malade,  tout  en  mettant  
ce   médicament   à   l’abri   des   enzymes   de   détoxi@ication  
du  sujet.    
 5.  Vecteurs  de  clonage  
5.2.  Propriétés  
  En   biologie   moléculaire,   certains   vecteurs   sont  
étudiés   pour   faire   entrer   un   acide   nucléique   dans   une  
cellule   et   permettre   la   réplication   ou   l’expression   de  
cet  acide  nucléique  dans  la  cellule  qui  le  reçoit.    
 
       Un  vecteur  de  clonage:  
•est  capable  de  réplication  autonome  dans  une  cellule  
hôte   donnée   (origine   de   réplication   de   type  
procaryotique  et/  ou  eucaryotique)  
•possède  un  polylinker  ou  site  multiple  de  clonage  
•supporte   l’insertion   d’un   fragment   d’ADN   plus   ou  
moins  grand  
 5.  Vecteurs  de  clonage  
5.3.  Types  de  vecteurs  
Les   plasmides   bactériens,   les   bactériophages   et   de  
nombreux  virus  sont  des  vecteurs  naturels  permettant  
la  transfection  de  différents  types  de  cellules-­‐hôtes.  
   
D’autres   vecteurs   encore   plus   performants   ont   été  
obtenus  arti@iciellement  à  partir  de  ceux-­‐là  grâce  à  des  
manipulations  génétiques  (BAC/YAC).    
 5.  Vecteurs  de  clonage  
5.4.  Les  plasmides:  vecteurs  de  clonage  

ü Molécule  d’ADN  de  taille  réduite,  d'origine  bactérienne  

ü Molécule  d’ADN  circulaire  
ü Peut  être  considérée  comme  un  minichromosome  
capable  de  réplication  autonome  
ü Confère  la  résistance  à  un  ou  plusieurs  antibiotiques  
 5.  Vecteurs  de  clonage  
5.4.  Les  plasmides:  vecteurs  de  clonage  
 5.  Vecteurs  de  clonage  
5.5.  Les  cellules  hôtes  
  Les   cellules   qui   sont   habituellement   transfectées   par   des  
vecteurs   contenant   des   fragments   d’ADN,   sont   destinées   à  
permettre   d’ampli@ier   ce   vecteur   en   même   temps   que   leur  
croissance.    
 
  Des   bactéries   comme   Escherichia   coli   sont   utilisées   pour  
recevoir   des   plasmides.   Certaines   souches   de   cette   espèce   sont  
plus   particulièrement   développées   pour   permettre   la  
transfection  de  certain  vecteurs  :    
ü souche  DH5α  pour  les  plasmides  pUC18  ou  pUC19  
ü souche  HB  101  pour  le  plasmide  pBR322,    
ü souche   JM   109   dépourvue   d’opéron   lactose   pour   les  
vecteurs  à  β-­‐galactosidase.    
1 • Introduction à la biologie moléculaire

• Méthodes d’étude des Acides nucléiques

2
(extraction et purification)
• Séparation des acides nucléiques
3
et électrophorèse

4 • Endonucléases de restriction

5 • Vecteurs de clonage (plasmides)

6 • Marquage des acides nucléiques

7 • Amplification par PCR

 6.  Marquage  des  acides  nucléiques  
6.1.  Les  sondes  d'acides  nucléiques  

 Une  sonde  est  un  marqueur  qu’on  introduit  dans  un  

milieu  biologique  pour  que  ses  propriétés  vis-­‐à-­‐vis  des  
constituants  de  ce  milieu  soient  révélées  par  l’émission  
d’un  signal  détectable  par  nos  instruments  de  mesure.  
 
  Les   oligonucléotides   sont   employés   comme   sondes  
parce   qu’ils   peuvent   s’hybrider   spéci@iquement   avec  
une   séquence   d’un   acide   nucléique   dans   un   milieu  
biologique.   Lorsqu’elles   sont   marquées   (atomes  
radioactifs,  biotine,  @luorochromes)  leur  présence  dans  
le  milieu  peut  être  suivie.  
 6.  Marquage  des  acides  nucléiques  
6.1.  Les  sondes  d'acides  nucléiques  

Donc  par  dé@inition:  

Une   sonde   nucléique   =   Séquence   d'ADN   ou   d'ARN  

marquée   (par   un   composé   @luorescent,   un   radioisotope,  
ou   une   enzyme)   que   l'on   utilise   pour   détecter   des  
séquences   homologues   (complémentaires)   par  
hybridation  in  situ  ou  in  vitro.  
 6.  Marquage  des  acides  nucléiques  
6.1.  Les  sondes  d'acides  nucléiques  
Fragment  d'ADN  ou  ARN  marqué:  
 
ü sonde  radioactive  (incorporation  de  nucléotides  
radioactifs)  
ü sonde  froide  
 
générée  in  vitro  avec  une  séquence  complémentaire  
de  la  séquence  recherchée:  
 
ü fragment  de  restriction  
ü produit  PCR  
ü synthèse  "commerciale"  
 6.  Marquage  des  acides  nucléiques  
6.2.  Les  sondes  radioactives  (chaudes)  
• sondes  mono  ou  double  brins  
• Phosphate32  (radio-­‐isotope  le  +  utilisé),  Soufre35,  H3  (tritium)  
• Incorporé  dans  la  sonde  enzymatiquement  au  moyen  d'un  ou  
plusieurs  nucléotides  triP  radiomarqués  
marquage  en  5':  T4  polynucléotide  kinase  ajoute  un  P32  
en  5'  (sonde  peu  radioactive)  
marquage  en  3'  :  
ü avec  une  ADN  polymérase:  ADN  pol  I  ou  T4,  Taq  pol  
(PCR)  (sondes  très  radioactives)  
ü avec  une  exonucléase  
ü avec  une  terminal  transférase  
 6.  Marquage  des  acides  nucléiques  
6.3.  Les  sondes  froides  

ü Marquage  par  la  Digoxygenine:  

ü Marquage  par  la  biotine-­‐streptavidine:  

1 • Introduction à la biologie moléculaire

• Méthodes d’étude des Acides nucléiques

2
(extraction et purification)
• Séparation des acides nucléiques
3
et électrophorèse

4 • Endonucléases de restriction

5 • Vecteurs de clonage (plasmides)

6 • Marquage des acides nucléiques

7 • Amplification par PCR

7.  L’  ampli[ication  d’un  Fragment  d’ADN  par  PCR    
(Polymerase  Chain  Reaction)  
7.1.  Historique  
ü Procédure rapide pour l’amplification enzymatique
in vitro d’un segment d’ ADN spécifique
ü D é v e l o p p é e p a r K a r y M u l l i s e n 1 9 8 5
(Nobel prize in 1993)

ü Les bases théoriques ont été décrites par Kleppe K.

en 1971
 7.  La  PCR:  Polymerase  Chain  Reaction  
[Link] de la PCR
But?  
àmultiplier  une  séquence  d  ’ADN  à  des  millions  d’exemplaires  
en  quelques  heures.  
L’enzyme  clé  =  Taq  Polymérase  

Taq  
T   A   A   T   G   C   C   G   C   C   T   A   T   T  
A   T   T   A   C   G   G   C   G   G   A   T   A   A   T   T   T   G   G   C  
………   ………

L’ADN  polymérase  synthétise  l’ADN  double  brin  en  présence  de  matrice  et  d’amorce.  
àAugmentation  de  la  production  de  l’ADN  double  brin  au  cours  des  cycles.  

Comment?  
115  
 7.  La  PCR:  Polymerase  Chain  Reaction  
[Link] de la PCR
L  ’hybridation  de  séquences  complémentaires  
T°  (94°C):  dénaturation  
………   ………  
T   A   A   T   G   C   C   G   C   C   T   A   T   T   A   A   A   C   C   G  

A   T   T   A   C   G   G   C   G   G   A   T   A   A   T   T   T   G   G   C  
………   ………  

T°  :  hybridation  des  brins  complémentaires  

………   ………  
T   A   A   T   G   C   C   G   C   C   T   A   T   T   A   A   A   C   C   G  
A   T   T   A   C   G   G   C   G   G   A   T   A   A   T   T   T   G   G   C  
………   ………  

ü l’ADN  double  brin  (ds)  se  dénature  à  haute  température.  

ü L’ADN  simple  brin  est  capable  de  s’hybrider  avec  un  autre  
brin  complémentaire  à  température  adéquate.  
116  
 7.  La  PCR:  Polymerase  Chain  Reaction  
[Link] de la PCR
Les  réactifs:   Taq
T A A T G C C G C C T A T T
A T T A C G G C G G A T A A T T T G G C
……… ………

Enzyme  Taq  polymérase  extraite  de  la  bactérie  Thermus  aquaticus.  

Température  d  ’activité:  72°C.  Thermostable  à  95°C.    

ADN  cible  
Séquence à amplifier

2  Amorces  oligonucléotidiques  (=  Primers)  :  courtes  

séquences  d  ’ADN  (20-­‐30  bases)  complémentaires  de  
séquences  encadrant  le  fragment  à  ampli@ier  
Séquence à amplifier
G T
A
C A T G Des  nucléotides=  dNTP(dATP,  dCTP,  dGTP,  dTTP)  =  déoxynucléotides-­‐  
C G A G
T C triphosphates  

Tampon:  solution  de  composition  adéquate  pour  le  bon  fonctionnement  de  
l’enzyme  (Tris-­‐HCl  10mM,  MgCl2  1.5mM,  KCl  50mM,  pH  8.3).  
 7.  La  PCR:  Polymerase  Chain  Reaction  
[Link] de la PCR
Le  matériel:  

ü Thermocycleur:
Machine automatisée qui
contrôle les changements
des températures
indispensables pour
chaque étape de la PCR:
• Température de Dénaturation
• Température d’Hybridation
• Température d’Elongation

118  
 7.  La  PCR:  Polymerase  Chain  Reaction  
[Link] de la PCR

Le  sénario:  
A  
dNTPs   C   T  
G  
A   T   C  
Amorce   G  
T   A   A   T   A   A  
G   C  
5’   T-­‐G-­‐C-­‐A-­‐T-­‐G-­‐A-­‐C-­‐C-­‐G-­‐T-­‐G-­‐G-­‐A-­‐C-­‐T-­‐T-­‐A-­‐A-­‐A   C   G  
3’   A-­‐C-­‐G-­‐T-­‐A-­‐C-­‐T-­‐G-­‐G-­‐C-­‐A-­‐C-­‐C-­‐T-­‐G-­‐A-­‐A-­‐T-­‐T-­‐T-­‐G-­‐C-­‐A-­‐T-­‐T-­‐G-­‐C-­‐A   5’  
ADN  polymérase  

Extension  

119  
7.  La  PCR:  Polymerase  Chain  Reaction  
[Link] de la PCR
 7.  La  PCR:  Polymerase  Chain  Reaction  
[Link] de la PCR

1:  94°C:  dénaturation          2:  55°C:  hybridation            3:  72°C:  polymérisation  

7.  La  PCR:  Polymerase  Chain  Reaction  
[Link] de la PCR

122  
LE  PRINCIPE  ET  LES  ETAPES  DE  LA  PCR    EN  DETAIL     1/10  
(Planches  complémentaires)  
2/10  
3/10  
4/10  
5/10  
6/10  
7/10  
8/10  
9/10  
10/10