TP N°2 :

L’antibiogramme

Membres de groupe :

 SAIT Yasmine

 HEROUI Fahima

 BEN KAROUN Samia

 INGRACHEN Meriem
 TABLE DES MATIÈRES

Introduction …………………………………………… 3

Principe …………………………………………………..4

Objectif ……………………………………………………4

Matériels………………………………………………….5

Méthodes…………………………………………………6

Résultats………………………………………………..10

Discussion..………………………………………….…11

Conclusion……………………………………………..13
 INTRODUCTION

Un antibiogramme est un examen médical crucial permettant de déterminer la sensibilité d’une

bactérie à différents antibiotiques, guidant ainsi le choix du traitement le plus efficace. Les

organismes vivants sont exposés à de nombreux agents infectieux, dont les bactéries, et face à

l’augmentation des résistances bactériennes, cet outil s'avère indispensable pour une prescription

judicieuse. On distingue deux types de résistances aux antibiotiques : la résistance naturelle, bien

connue et prévisible, comme celle d’*Escherichia coli* à la pénicilline, et la résistance acquise, qui

peut rendre une bactérie résistante à un antibiotique auparavant efficace, tel que l’ampicilline dans

le cas d’*E. coli*. Si les résistances naturelles sont facilement anticipées par les cliniciens, les

résistances acquises posent un défi majeur. Elles introduisent une incertitude quant à l’efficacité des

traitements empiriques, pouvant parfois mener à des impasses thérapeutiques. La précision des

résultats d'un antibiogramme repose donc sur des techniques d'ensemencement rigoureuses, afin de

garantir des données fiables et interprétables pour la prise en charge optimale du patient.

Ce compte rendu détaille les étapes suivies lors de la réalisation de cet examen, en soulignant

l'importance des méthodes appliquées pour assurer des conclusions précises et pertinentes.
Principe
Le principe de l’antibiogramme par diffusion des disques sur gélose repose sur l’application de

disques imprégnés d’une quantité précise d’antibiotiques sur une gélose Mueller-Hinton (parfois

enrichie de sang), préalablement ensemencée avec la bactérie testée (10^7 ufc/ml). L’antibiotique

diffuse à partir du disque, créant un gradient de concentration dans le milieu, et inhibe la croissance

bactérienne autour de lui, si la bactérie y est sensible. La mesure du diamètre de la zone d’inhibition

permet d’estimer la concentration minimale inhibitrice (CMI) et de déterminer si la souche

bactérienne est sensible ou résistante à l’antibiotique, fournissant ainsi des informations essentielles

pour le choix du traitement.

NB: Deux notions sont à connaître avant de faire un antibiogramme :

- La CMI ou Concentration Minimale Inhibitrice. Il s’agit de la concentration de l’antibiotique

la plus faible pour laquelle la croissance bactérienne est inhibée (pas de croissance de la population

; 100% de survivants)

Objectif
- Démontrer la sensibilité des souches bactériennes à divers antibiotiques pour comprendre leur

efficacité spécifique.

- Suivre la croissance des micro-organismes en présence d’antibiotiques et observer les effets

inhibiteurs potentiels.

- Déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) pour évaluer les doses nécessaires à

l'inhibition ou à l'élimination des bactéries.

- Savoir lire et interpréter un antibiogramme afin de tirer des conclusions précises sur la résistance

ou la sensibilité des bactéries, orientant ainsi les choix thérapeutiques en conditions cliniques.
 Matériels
 Boites de pétri

 Une souche bactérienne (Escherichia coli)

 Un désinfectant

 Un bec Bunsen

 Des pinces stériles

 Pipettes Pasteur ; micropipettes

 Râteaux

 Antibiotiques à tester.

 Ecouvillons

 Cristallisoir rempli de l’eau javel

 Etuve

 Tubes à essais contenant de l’eau physiologique stérile

 Tubes à essais pour dilution

 Homogénéisateur (Vortex)

 Spectrophotomètre

 Cuvettes
Méthodes
1) Préparation de la suspension mère :

A- Prélever les colonies : À l’aide d’une pipette pasteur, prélevez 4 à 6 colonies isolées (de

taille similaire) sur une gélose fraîchement incubée (18-24 heures).

B- Préparer la suspension dans la solution physiologique : Ajoutez les colonies prélevées

dans un tube contenant environ 5 ml de solution physiologique stérile. Bien refermer le tube

pour éviter toute contamination.

Secouez doucement le tube pour dissoudre complètement les colonies.

Vérifiez visuellement l’absence de grumeaux ou de particules visibles, puis homogénéisez

avec un vortex en prenant soin de ne pas endommager les bactéries.

2) Mesure de la densité optique (DO) :

A. Réglage du spectrophotomètre :

1. Allumez le spectrophotomètre et laissez-le chauffer

2. Réglez la longueur d’onde sur 625 nm (utilisée pour la mesure de la turbidité bactérienne

3. Remplissez une cuve avec de la solution physiologique stérile.

4. Placez la cuve dans le spectrophotomètre pour effectuer le blanc (calibrage à zéro).

B. Lecture de la DO :

1. Remplissez une autre cuve avec la suspension bactérienne préparée.

2. Essuyez la cuve avec un papier doux pour éliminer les traces de doigts ou d'humidité.

3. Placez la cuve dans le spectrophotomètre et lisez la DO.

 C. Ajustement de la densité optique :

 Si la DO est trop faible (inférieure à 0,08-0,1) : Ajoutez quelques colonies supplémentaires à la

suspension et homogénéisez.

 Si la DO est trop élevée (supérieure à 0,1) : Diluez avec de la solution physiologique stérile en

ajoutant progressivement et en homogénéisant.

3) Préparation de la dilution 10"7 :

Prenez 1 ml de la suspension initiale (10"8 UFC/ml) à l'aide d'une pipette ou d'une

micropipette stérile. Ajoutez-le dans 9 ml de solution saline stérile puis mélangez

soigneusement pour homogénéiser la suspension.

4) Ensemencement :

L'ensemencement est réalisé à l'aide d'un écouvillon stérile préalablement imprégné de la

suspension bactérienne.

Après avoir été essoré délicatement contre la paroi du tube, des stries serrées sont appliquées de

haut en bas sur toute la surface de la gélose Muller Hilton, en tournant la boîte de Pétri de 60

degrés à chaque série de stries pour assurer une répartition uniforme des bactéries. Cette

opération est répétée trois fois.

Pour finaliser l'ensemencement, l'écouvillon est glissé le long de la périphérie de la gélose.

Cette procédure doit être réalisée dans les 15 minutes suivant la préparation de la suspension

pour garantir l'efficacité de l'ensemencement bactérien.

 5) Dépôt des disques d'antibiotique :

A l'aide d'une pince stérile, les disques d'antibiotiques sont déposés avec précaution à la surface

de la gélose préalablement ensemencée.

Après le dépôt, chaque disque est légèrement pressé sur la gélose pour assurer un bon contact.

Les disques sont espacés d'environ 3 cm afin d'éviter toute interférence entre les zones

d'inhibition des différents antibiotiques.

Les boîtes sont ensuite laissées à température ambiante pour permettre aux antibiotiques de

diffuser dans le milieu avant le début de la croissance bactérienne, facilitant ainsi l'observation

des zones d'inhibition et l'interprétation des résultats d'antibiogramme.

6) Incubation :

Après la pré-diffusion des antibiotiques sur la gélose, les boîtes sont incubées à 37°C pendant 18

à 24 heures.

7) Lecture :

Les zones d'inhibition sont mesurées avec précision à l'aide d'un pied à coulisse ou d'une règle

calibrée. Ces mesures sont cruciales pour interpréter les résultats en fonction des diamètres critiques

établis par les recommandations du CASFM (Comité de l'antibiogramme de la Société Française

de Microbiologie) 2024.

Les résultats sont ensuite classés en trois catégories : sensible, résistant ou intermédiaire.

Pour interpréter correctement les résultats obtenus lors de notre expérimentation, une souche de

référence spécifique, Escherichia coli ATCC 25922, (selon les normes du CASFM 2024) est utilisée.

Les diamètres des zones d'inhibition mesurées sont comparés aux valeurs de référence pour assurer

la validité de la technique et la fiabilité des résultats ainsi que l'efficacité des disques d'antibiotiques
 . .

Préparation de la suspension mère Homogénéisation

Souche bactérienne E. coli

Mesure de la densité optique (DO) Lecture de la DO sur le spectrophotomètre

Préparation de la dilution Préparation de l’inoculum Ensemencement par écouvillonnage

10"7

Dépôts des disques d’antibiotiques Incubation des boites

Schéma recapelatif des méthodes utilisées pour réaliser un antibiogramme

Résultats
NB : par erreur on a déposé un disque d'antibiotique en 3 fois par boîte de Petri (3 fois la gentamicine
et 3 fois la kanamycine) pour cela on a pris les boîtes de nos camarades qui ont travaillé sur la même
souche d'Escherichia coli .

Photos représentatives les résultats de notre groupe

Diamètres des zones d'inhibition de chaque disque : Diamètres des zones d'inhibition de chaque disque :

-K 30 (kanamycine 30µg) = 23 mm - CN 10(gentamicine 10 µg) = 20mm

Photos représentatives les résultats de 2 -ème groupe de même paillasse

Diamètres des zones d'inhibition de chaque disque :

Diamètres des zones d'inhibition de chaque disque :
- COT 25(co-trimoxazole 25µg) =33mm
-AMP 10 (ampicilline 10µg) =19mm
- CN 10 « avec trait au-dessous » (gentamicine 10 µg)
- AMP 10 « sans trait au-dessous » (ampicilline 10 µg)
= 20mm
= pas de zone d'inhibition
-FOX 30 "avec trait au-dessous" (cefoxitine 30 µg) =
-K 30 (kanamycine 30µg) = 23 mm
28 mm
Discussion
Pour interpréter les résultats de l'antibiogramme, il est nécessaire de comparer les diamètres observés

aux seuils de sensibilité fournis par le CASFM (Comité de l'antibiogramme de la Société Française

de Microbiologie) 2024. Voici une interprétation des résultats :

Antibiotiques et diamètres observés :

Ampicilline (AMP 10 µg) :

Le diamètre mesuré pour la souche testée (19 mm) tombe dans les limites acceptables (15-22 mm),

indiquant que la souche est sensible à l'ampicilline.

Kanamycine (K 30 µg) :

Le diamètre de 23 mm se situe dans la plage acceptable (17-25 mm), donc la souche est sensible à la

kanamycine.

Gentamicine (CN 10 µg) :

Le diamètre de 20 mm est également dans les limites acceptables (19-26 mm), indiquant une sensibilité

à la gentamicine.

Céfoxitine (FOX 30 µg) :

Le diamètre de 28 mm se situe dans les limites acceptables (23-29 mm), montrant que la souche est

sensible à la céfoxitine.

Cotrimoxazole (COT 25 µg) :

Bien que les limites de référence ne soient pas indiquées, un diamètre d'inhibition de 33 mm est

relativement élevé, suggérant que la souche est probablement sensible au co-trimoxazole.

NB : Pour le disque d'antibiotique de l'ampicilline à 10 microgrammes il n’y a pas de zone d'inhibition

car soit le disque est déchargé de son antibiotique soit l'antibiotique est périmé

Conclusion

Tous les antibiotiques testés montrent des diamètres de zone qui indiquent que la souche testée est

sensible à chacun d'eux, selon les critères du CASFM 2024. Ces résultats suggèrent que la souche

d'Escherichia coli étudiée ne présente pas de résistance aux antibiotiques testés.

 Conclusion :
Ce TP a permis de mettre en pratique les étapes essentielles de la réalisation d’un antibiogramme, une

technique indispensable pour évaluer la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. Les résultats obtenus

montrent que la souche d’*Escherichia coli* testée est sensible à tous les antibiotiques étudiés, selon les

critères définis par le CASFM 2024, et ne présente donc pas de résistance détectable. Cette observation

souligne l’importance des antibiogrammes dans la lutte contre les résistances bactériennes, permettant

d’adapter les traitements de manière précise et efficace. Enfin, la réussite de cet exercice repose sur la

rigueur des techniques d’ensemencement et la précision des mesures, éléments clés pour garantir des

résultats fiables et interprétables en contexte clinique.