La réaction en chaine par polymérase

LA RÉACTION EN CHAINE PAR POLYMÉRASE (PCR)

1. Introduction
Plusieurs méthodes ont été mises au point pour amplifier de manière élective, soit une
séquence d’ADN soit une séquence d’ARN. Lorsqu’on vise à disposer d’une grande quantité de la
séquence d’intérêt, on parle de méthodes qualitatives, et lorsqu’on vise un dosage de cette technique
d’intérêt c’est les méthodes quantitatives. La quantité d’ADN récupéré lors de l’extraction à partir
d’un organisme est trop faible pour être considérée comme un échantillonnage représentatif, il
n’est pas directement analysable. Il convient donc d’isoler, de purifier la ou les séquences qui
présentent un intérêt, qu’il s’agisse de la séquence d’un gène ou de séquences non codantes. À partir
de la séquence sélectionnée qui constitue l’ADN matriciel, la PCR conduit à l'amplification in vitro de
plusieurs millions de fois de cette séquence spécifique qui peut être infiniment petite dans
l’échantillon, voire très rare (10-2 pg). 2, 12

La réaction terminée, la quantité extrêmement faible d’ADN matriciel contenue dans

l’échantillon PCR n’aura pas variée. En revanche, la quantité de la ou des séquences amplifiées (l’ADN
d’intérêt) sera très grande. La technique permet d’augmenter de manière considérable (jusqu’à 1
million de fois). Cette technique a été mise au point en 1986 par Mullis et collaborateurs (1986) ce qui
lui valut le prix Nobel de chimie en 1993.

2. Le mélange réactionnel

La réaction de polymérisation en chaîne est réalisée dans un mélange réactionnel qui comprend :

 L’extrait d’ADN (ADN matriciel).

 Quelques microlitres de la Taq polymérase (ADN polymérase), au sein d’un tampon adéquat.
 Les amorces (simple brin de 15 à 30 bases), qui sont des oligonucléotides de synthèse, les
séquences terminales 5’ des deux brins du fragment d’ADN à amplifier doivent être connues.
 Les quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP) en excès dans une solution tampon.

Les tubes contenant le mélange réactionnel sont soumis à des cycles de température répétés
plusieurs dizaines de fois dans un thermocycleur (appareil qui comporte une enceinte où l’on dépose
les tubes échantillons et dans laquelle la température peut varier, très rapidement et précisément, de
0 à 100 °C et peut varier de 1 à 2 degrés par seconde). Le thermocycleur permet la programmation de
la durée et de la succession des cycles de paliers de température. Chaque cycle comprend trois
périodes de quelques dizaines de secondes et qui sera répété n fois (n est variable selon le but
recherché, généralement entre 10 et 50). Après n cycles, la quantité de fragment obtenu est

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 La réaction en chaine par polymérase

théoriquement égale à 2 n (amplification exponentielle). Il faut compter 20 à 40 cycles pour synthétiser

une quantité analysable d’ADN (environ 0,1 microgramme). La PCR permet d’amplifier des séquences
dont la taille est inférieure à 6 kilobases. Le nombre théorique de 2 n copies ne pourra jamais être
atteint, car les fragments présents ne sont pas forcément amorcés surtout en fin de PCR, ensuite les
produits inhibiteurs comme le pyrophosphate sont formés. Dans les conditions optimales, le nombre
de copies optimal est de 1,85 n. 2

3. Les conditions réactionnelles

En fonction de la nature et de la qualité du matériel biologique de départ et également selon

la spécificité de la manipulation, il existe différentes formules de milieux réactionnels qui peuvent être
utilisés. Des formules standard qui convient à la plupart des réactions de PCR sont proposées par les
fabricants.

 Les volumes de milieu réactionnel varient entre 10 et 100 μl.

 Des solutions prêtes à l’emploi sont délivrées la Taq polymérase. Concentrée 10 fois, sa
formule est à peu près la suivante : 100 mM Tris-HCl, pH 9,0 ; 15 mM MgCl2, 500 mM KCl.
 Afin de réduire le niveau d’amplification non spécifique, il est possible de rajouter des
détergents (Tween 20, Triton X-100…) ou du glycérol pour augmenter les conditions de
stringence qui rendent plus difficile et donc plus sélective l’hybridation des amorces.
 On peut aussi réduire la concentration en KCl jusqu’à l’éliminer ou encore augmenter la
concentration en MgCl2. En effet, certains couples d’amorces fonctionnent mieux avec des
solutions enrichies en magnésium. 2

4. Principe de la PCR

 La dénaturation : la première période s’effectue à une température de 95 °C (30 à 90

secondes). À cette température, l’ADN matriciel est dénaturé : les liaisons hydrogènes ne
peuvent pas se maintenir à une température supérieure à 80 °C et les ADN double-brin se
dénaturent en ADN simple brin.
 L’hybridation : la deuxième période s’effectue à une température généralement comprise
entre 40 et 70 °C (30 à 60 secondes). La diminution de la température permet aux liaisons
hydrogène de se reformer et donc aux amorces de s’hybrider. Plus la température
d’hybridation est élevée, plus l’hybridation est sélective, plus elle est spécifique.
 L’élongation : la troisième période s’effectue à une température de 72 °C (30 à 120 secondes).
À 72° C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication
en utilisant les désoxyribonucléosides triphosphates présents dans le mélange réactionnel. Les

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régions de l’ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi sélectivement synthétisées. Au cycle
suivant, les fragments synthétisés au cycle précédent servent à leur tour de matrice pour le
cycle suivant. 12 (Figure 8).

Figure 8 : Principe de la PCR (polymerase Chain Reaction). 12

5. Détection et analyse des produits PCR

Le produit d’une PCR est constitué d’un ou de plusieurs fragments d’ADN (la ou les séquences
d’intérêt). La détection et l’analyse des produits peuvent être réalisées par électrophorèse sur gel
d’agarose (ou d’acrylamide). Pour contrôler la réalité et/ou la conformité des amplifications, il s’agit
aussi de contrôler l’absence d’amplifications ou de contaminations, dans le puits ou on a déposé une
partie du « Blancs » (contrôle négatif) tube de PCR ou avait été déposé la totalité du mélange
réactionnel sauf l’ADN. Le contenu du « blancs » après PCR ne doit donner aucune bande visible sur

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 La réaction en chaine par polymérase

gel de contrôles (si le travail est exempt de contamination). Le gel de contrôle est aussi l’étape
d’analyse quand il s’agit de vérifier la taille du fragment d’intérêt qui a été amplifié (recherche des
mutations). L’ADN est révélé par une coloration au bromure d’éthidium. Ainsi, les produits sont-ils
visibles directement par transillumination aux ultraviolets (280 - 320 nm). Selon les conditions
réactionnelles, il arrive que des fragments non spécifiques d’ADN soient amplifiés en quantité plus ou
moins abondante, formant des bandes nettes ou des « traînées » (smear). 12

6. Amplification de l’ARN sous forme d’ADNc par RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

Cette technique est utilisée pour la mise en évidence et la caractérisation d’ARN en très faible
quantité, ou bien lorsque la source d’ARN est très limitée. La RT-PCR est une technique qui permet
d’amplifier de manière élective (et sous forme d’un fragment ADNc double brin) une séquence d’ARN
spécifique présente dans un mélange d’ARN-polyA, ou d’ARN totaux, issus d’un tissu supposé exprimer
le gène d’intérêt. Cette réaction est catalysée par la transcriptase inverse des rétrovirus (reverse
transcriptase) qui synthétise une chaîne d’ADN à partir d’une matrice d’ARN. Plusieurs stratégies sont
possibles : utilisation d’un oligo (dT) ou un mélange d’hexanucléotides. 11

 Après extraction des ARN totaux, les ARNm sont isolés par chromatographie d’affinité grâce à
des oligodT (oligonucléotide polyT), ils se caractérisent par une séquence polyA en 3’.
 Les ARNm sont soumis ensuite à la transcriptase inverse qui va générer une copie d’ADN
(ADNc) de chaque ARNm.
 À l’issue de la transcription inverse, les ARNm sont hydrolysés (traitement alcalin, RNase ou
température).
 Les étapes suivantes sont réalisées dans l’enceinte du thermocycleur. Les ADNc
monocaténaires sont alors répliqués par l’ADN polymérase.

Cette technique permet d’étudier les variations et les influences d’expression de gènes dans un
contexte physiologique ou pathologique.

7. La PCR quantitative

C’est une variante de la technique de PCR. La PCR quantitative permet de déterminer le taux
d’ADN ou d’ARN spécifique dans un échantillon biologique. Il s’agit de doser la quantité d’une
séquence d’intérêt contenue dans un volume de matériels biologique (exemple : le nombre de copie
d’un gène). Le dosage revient à estimer le nombre de copies de la séquence d’intérêt contenus dans
le tube de départ, une simple règle de trois suffira ensuite pour estimer à partir du volume testé par
PCR, la quantité totale de la séquence d’intérêt présente dans le matériel biologique de départ. La
technique permet également de connaître la quantité de l’ARN, puisqu’il est possible de conduire une

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RT-PCR quantitative avec le même appareillage, avec les mêmes étapes sauf que le matériel biologique
de départ est constitué de l’ARN. 12

8. La PCR quantitative en temps réel

Des appareils analysent en temps réel l’amplification au cours des différents cycles de PCR (real-
time PCR), permettant le calcul de la quantité de la cible dans la portion de la courbe d’amplification
ou le nombre de copies amplifiées est proportionnel au nombre de copies de la cible. La méthode de
la PCR quantitative en temps réel est basée sur la détection d’un signal fluorescent qui est produit de
façon proportionnelle à l’amplification du produit PCR, cycle après cycle. Elle nécessite un
thermocycleur couplé à un système de lecture optique qui mesure une émission de fluorescence.

 Une sonde nucléotidique est synthétisée de telle sorte qu’elle puisse s’hybrider sélectivement
à l’ADN d’intérêt, entre les séquences où les amorces s’hybrident.
 La sonde est marquée sur l’extrémité 5’ par un fluorochrome signal (exemple, la 6-
carboxyfluoresceine), et sur l’extrémité 3’ par un fluorochrome extincteur (quencher)
(exemple, la 6-carboxy-tétraméthyl-rhodamine).
 Durant la phase d’élongation, la Taq polymérase, qui possède une activité nucléase 5’-3’
intrinsèque, dégrade la sonde et donc libère le fluorochrome signal. Le taux de fluorescence
alors libéré est proportionnel à la quantité de produits PCR générés à chaque cycle. 12