COURS
DE CHROMATOGRAPHIE
- Généralités sur la chromatographie
- Historique de la chromatographie
- Principe de la chromatographie
- Différents types de chromatographie liquide
- la chromatographie liquide LC et HPLC
- La chromatographie liquide-solide (phase normale)
- La chromatographie liquide-liquide (phase normale)
- La chromatographie en couche mince
- La chromatographie ionique
- La chromatographie d'exclusion stérique
- Différents types de chromatographie en phase gazeuse
- La chromatographie gaz-liquide
- La chromatographie gaz-solide
- Autres types de chromatographie
- Théorie de la chromatographie 1
- Théorie de la chromatographie 2
- Théorie de la chromatographie 3
- La chromatographie en phase gazeuse (CPG)
- Analyse en chromatographie en phase gazeuse
- Optimisation d'une analyse
GÉNÉRALITÉS LA CHROMATOGRAPHIE
1 HISTORIQUE DE LA CHROMATOGRAPHIE
En 1906 un chimiste russe, Tswett, a séparé des pigments végétaux colorés sur une colonne
remplie de carbonate de calcium pulvérulent, les pigments étaient entraînés avec de l'éther de
pétrole (mélange pentanes et d’hexanes). Il a observé sur la colonne la formation de bandes de
couleur différente (vert, orange, jaune..). Il a donné à cette technique le nom de
chromatographie (écriture des couleurs). Il a défini également les termes : chromatogramme,
élution, rétention.
Cette technique fut quasi-abandonnée jusqu'en 1930, où Edgar Lederer a purifié par la
méthode de Tswett la lutéine du jaune d’œuf.
Vers 1940, Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la chromatographie, ils
obtiennent le prix Nobel en 1952
En 1952, mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).
En 1968, mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Performance CLHP ou HPLC
en anglais.
En 1979, première séparation chirale par HPLC.
0-2 PRINCIPES DE LA CHROMATOGRAPHIE.
La chromatographie est une méthode basée sur la différence de miscibilité d'un
soluté entre deux phases. Cette méthode s'apparente à l'extraction.
Le principe de l'extraction est simple :
Soit un soluté S réparti entre 2 phases non miscibles (1) et (2).
A l'équilibre, on a :
avec la constante d'équilibre K = [S2]/[S1] ,
K s'appelle aussi le coefficient de partition.
Application : extraction de la caféine avec du chloroforme dans une décoction de thé.
K = [caféine(CHCl3)]/[caféine(eau)] = 8,36.
En une extraction on extrait 90% de caféine du thé, après 2 extractions 99% de la caféine
sera isolée.
Comme l'extraction la chromatographie est une méthode basée sur la différence de
solvatation d'un soluté S entre deux phases.
1- une phase mobile (pm) qui est un fluide qui traverse la colonne (pour Tswett =
éther de pétrole.)
2- une phase stationnaire (ps) qui est une substance fixée sur la colonne (pour
Tswett = carbonate de calcium.)
Figure 2 : Schéma simplifié de la chromatographie
Avec l'équilibre suivant :
On a toujours [Spm]<< [Sps], d'où K >> 1suivant la valeur de K le produit sera plus
ou moins retenu sur la colonne, il sera "élué" plus ou moins rapidement.
Les répartitions différentes des solutés entre la phase mobile et la phase stationnaire
viennent d'adsorptions différentiées des produits.
A l'origine de ces phénomènes d'adsorption, il a des paramètres physiques (taille
des particules, porosité, surface spécifique...) et des paramètres chimiques
(interactions intermoléculaires comme les liaisons hydrogène, liaisons de Van der
Waals...).
3- DIFFÉRENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE
Suivant les propriétés physiques et chimiques du soluté S, plusieurs types de
chromatographies peuvent être utilisés.
3-1. Chromatographie en phase liquide (LC)
C'est la chromatographie la plus ancienne, où la phase mobile est un liquide (pm =
liquide).
Figure 4 Schéma simplifié d'une chromatographie liquide
Figure 3 : Schéma simplifié d'un chromatographe HPLC
La Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP ou HPLC en anglais) est
une amélioration de la chromatographie en phase liquide, dans laquelle la phase
mobile est utilisée sous haute pression. L'utilisation de la haute pression améliore
l'efficacité des séparations et réduit fortement les temps d'analyse.
0-3-2 Chromatographie liquide-solide (phase normale )
pm = solvant peu polaire ( pentane, acétate d'éthyle, éther,
dichlorométhane...méthanol)
ps = gel de silice ou d'alumine
Les interactions sont des interactions électrostatiques du type dipôle-dipôle ou
dipôle-dipôle induit (Si-O-Si-O-H ----- X )
Les solutés sont élués dans l'ordre de polarité croissante (par exemple carbure, puis
cétone enfin alcool)
Figure 4 : HPLC liquide-solide (phase normale)
Séparation des vitamines lipidiques
Conditions
Column: SUPELCOSIL LC-Si, 15cm x 4.6mm ID, 5µm particles
Phase mobile : hexane/ alcool amylique (99.65:0.35)
débit: 2mL/min
Det.: UV, 280nm
Inj.: 20µL
Résultats 1.-Tocopherol, 2. –Tocopherol, 3.-Tocopherol, 4-Tocopherol, 5. Ergocalciferol,
6. Retinol
3-3. Chromatographie liquide-liquide (phase inverse)
pm = solvants polaires (eau- méthanol - acétonitrile)
ps = liquide greffé sur un gel de silice, on peut greffer de longues chaînes
aliphatiques pour obtenir par exemple le motif Si-O-Si-O-C17H34-CH3, (ps C18)
ou des chaînes avec des substituants aromatiques . La phase stationnaire est dans ce cas
assimilée à un liquide immobilisé sur la colonne.
Les interactions sont des interactions du type lipidique (interactions avec de
longues chaines hydrocarbonées)
Les solutés sont élués dans l'ordre de polarité décroissante (par exemple alcool, puis
cétone enfin carbure), à l'inverse de la chromatographie solide-liquide
Figure 5: HPLC liquide-liquide (phase inverse).
Dosage des acides organiques dans le jus d'orange.
Conditions
SUPELCOSIL 15cm x 4.6mm, particules de 5µm (avec filtre de 0,5µm avant la colonne)
Phase Mobile: eau à pH 2.0
Débit: 2mL/min
Det.: UV, 210nm
Inj.: 5µL jus d’orange
Résultats
- Acide fumarique
HO-CO-CH=CH-COOH (E)
- Acide citrique
HO-CO-CH(OH)(CH2-COOH)2
- Acide ascorbique
3-4. Chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais)
ps = gel de silice ou d'alumine, réparti en couche mince (0,2mm) sur une plaque.
pm= mêmes solvants qu'en phase inverse ou normale, même principe que précédemment
mais pour des quantités faibles de produit. Chaque produit est caractérisé par la constante Rf
(Retardation factor) : Rf = Hp/Hs, où Hp =hauteur d'élution du produit et Hs = hauteur
d'élution du solvant
3-5. Chromatographie ionique (IEC en anglais)
pm = solution tampon aqueuse.
ps = résine échangeuse d'ion, donc un solide comportant des sites ioniques.
La séparation est basée sur des interactions ioniques et s'applique à des solutés eux
même ionisés (sels…)
Applications :Dosage des anions et cations dans une eau
Figure 6. Chromatographie par échange d’ions.
Dosage du sodium dans des produits alimentaires (maïs et soupes en boite)
Conditions
SUPELCOSIL LC-SCX, 25cm x 4,6mm ; particules de 5µm
Température: 35°C
Phase mobile: eau avec 0,05M acide citrique, pH 2,4
Débit: 2,0mL/min
Detecteur: conductivité
Injecteur: échantillons de maïs et soupes en boite dilués (1:1) avec la phase mobile
3-6. Chromatographie d'exclusion stérique (SEC en anglais)
Cette chromatographie est appelée aussi chromatographie par perméation sur gel (GPC)
pm = solvant organique (en général tetrahydrofuranne, ou toluène)
ps = solide poreux. Il y a une relation entre la taille des pores et la taille des molécules.
Par exemple des molécules entre 1000 et 8000 Daltons sont retenues par des pores 4 nm, des
molécules entre 200000 et 150000 Daltons sont retenues par des pores 250 nm.
Les molécules plus grosses que la taille des pores sont éluées les plus rapidement.
Applications :Séparation et dosage des polymères.
Figure 7 : HPLC par exclusion stérique d'un mélange de polystyrènes
Conditions
2 colonnes en série : SUPELCOSIL LC-1, 25cm x 6.2mm ID, particules de 5µm
puis SUPELCOSIL LC-301, 25cm x 6.2mm ID, particules de 5µm, pores de 300Å
Phase mobile : tetrahydrofuranne
Débit: 1mL/min
Temp.: 45°C
Det.: UV, 254nm
Inj.: 10µL de polymères
Résultats
1. Polystyrène (M. 1 800 000) 3.3µg
2. Polystyrène (M. 300 000) 3.3µg
3. Polystyrène (M. 100 000) 3.3µg
4. Polystyrène (M. 35 000) 5.0µg
5. Polystyrène (M. 17 500) 6.7µg
6. Polystyrène (M. 9 000) 6.7µg
7. Polystyrène (M. 2 000) 10.0µg
8. Toluène 1.7µg
4- DIFFÉRENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
Cette chromatographie (CPG ou GC en anglais), qui est la plus performante au point de vue
de la séparation, est réservée aux produits volatils et thermostables. (Masse moléculaire <
500 Daltons)
Figure 8. Schéma simplifié d'un chromatographe en phase gazeuse
4-1. Chromatographie gaz-liquide
pm = gaz (He, H2, N2...)
ps = liquide greffé sur des particules (colonnes remplies)
ps = liquide greffé sur la paroi interne de la colonne (colonnes capillaires)
La substance greffée sur la colonne est en général un polymère siliconé, inerte chimiquement
et tenant bien la température. Cette chromatographie est la plus répandue et est utilisée dans
de nombreux domaines (Cf. Analyse en CPG)
Figure 9: Chromatogramme de l'essence de géranium
Conditions
Colonne: SUPELCOWAX 10, 30m x 0.25mm ID,
film de 0.25µm
Four: 50°C (2 min) to 280°C at 2°C/min, puis 20 min
Phase mobile : helium, 25cm/sec
Det.: FID
Inj.: 0.2µL, split (100:1)
Figure 10 : Chromatographie gaz-solide : Séparation de produits gazeux.
Conditions
Colonne: Supel-Q PLOT, 30m x 0.53mm ID
Four: 35°C (3 min) to 250°C at 16°C/min
Phase mobile: helium, 3mL/min
Det.: TCD, 250°C
Inj.: 0,1µL
Résultats
1. Azote (excés)
2. Methane
3. Carbon dioxide
4. Acetylene/Ethylene
5. Ethane
6. Eau
7. Propyne
8. Propylene
9. Propane
10. n-Butane
4-2. Chromatographie gaz-solide
pm = gaz (He, H2, N2...)
ps = solide adsorbant
Ce type de chromatographie s'applique aux molécules très volatiles (gaz, hydrocarbures
légers...)
5- AUTRES TYPES DE CHROMATOGRAPHIE
Il existe d'autres types de chromatographie, parmi elles :
La chromatographie supercritique
pm = gaz à l'état supercritique (en général CO2 à 50° et 150 bars)
ps = solide ou liquide greffé sur solide.
Cette chromatographie combine les bons résultats de la CPG au point de vue séparation et le
domaine d'utilisation de la LC.
L'électrophorèse
pm = solution tampon.
ps = gel disposé sur une plaque ou dans un tube capillaire
Un champ électrique est appliqué aux deux extrémités de la plaque (ou du tube). Cette
chromatographie est basée sur les différences de mobilité des ions dans un champ électrique.
Cette mobilité varie en fonction de la charge de la taille et de la géométrie des molécules.
Les ions positifs vont vers l'électrode négative et vice versa. Pour des raisons de sécurité, une
électrode est mise à la masse et l'autre est mise à une haute tension positive ou négative
