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Gel topique à base de clou de girofle et de thym contre des isolats cutanés
cliniques génétiquement identifiés : ciblage in vivo des altérations
comportementales et de l'IGF-1/pFOXO-1/PPARγIndices

Jilan A. Nazeam1,* , Ghada M. Ragab2Amira A. El-Gazar3Shereen S. El-Mancy4, Lina Jamil5

et Sahar M. Fayez4

1 Département de pharmacognosie, Faculté de pharmacie, Université du 6 octobre, Giza 12585, Égypte Département de
2 pharmacologie et de toxicologie, Faculté de pharmacie, Université Misr, Giza 12585, Égypte ;
ghadaragab1311@[Link]
3 Département de pharmacologie et de toxicologie, Faculté de pharmacie, Université du 6 octobre, Gizeh 12585, Égypte ;
[Link]@[Link]
4 Département de pharmacie, Faculté de pharmacie, Université du 6 octobre, Gizeh 12585, Égypte ;
shereenelmancy@[Link] (SSE-M.); saharmfayez@[Link] (SMF)
5 Département de microbiologie et d'immunologie, Faculté de pharmacie, Université du 6 octobre, Gizeh 12585, Égypte ;
[Link]@[Link]
* Correspondance : Jilannazeam@[Link] ; Tél. : +20-010-0302-1798

Abstrait:La résistance aux antimicrobiens est une menace mondiale dramatique ; cependant, la lenteur des progrès
dans le développement de nouveaux antibiotiques a entravé l'identification de stratégies alternatives viables. Les
---- approches antibactériennes à base d'antioxydants naturels peuvent fournir de puissantes capacités thérapeutiques
---
pour bloquer efficacement les voies des microbes résistants. Bien que les huiles essentielles (HE) aient été signalées
Citation:Nazeam, JA; Ragab, directeur
comme agents antimicrobiens, leur application est encore limitée en raison de leur faible solubilité et de leur faible
général ; El-Gazar, AA; El-Mancy, SS; Jamil,
stabilité ; en outre, les mécanismes biomoléculaires associés ne sont pas entièrement compris. Par conséquent, l'étude
L. ; Fayez, SM Nano topique
visait à développer une préparation naturelle en nano-gel avec de multiples mécanismes moléculaires qui pourraient
Gel de clou de girofle/thym contre des isolats
combattre la résistance bactérienne de manière [Link]é vulgairemodèle. Un nano-émulsifiant d'huiles essentielles
cutanés cliniques génétiquement identifiés :
de thym/clou de girofle (NEG8) a été conçu, standardisé et son activité antimicrobienne a été testée in vitro et in vivo
ciblage in vivo des altérations

comportementales et des signaux IGF-1/

contre des isolats cliniques bactériens cutanés génétiquement identifiés (Pseudomonas stutzeri,Enterococcus faeciumet

pFOXO-1/PPAR γ. Molécules2021,26, 5608. Bacillus thuringiensis). Selon nos résultats, NEG8 a montré des activités bactériostatiques et d'inhibition puissante du
[Link] biofilm. Un modèle in vivo a également été établi en utilisant l'adapalène thérapeutique disponible dans le commerce
contre un micro-organisme génétiquement identifié. Une amélioration du comportement du rat a été signalée pour la
Rédactrice académique : Maria Atanassova première fois et NEG8 a réduit le contenu cutané/l'expression protéique de l'IGF-1, du TGF-β/collagène, du Wnt/β-
caténine, du JAK2/STAT-3, du NE, du 5-HT et des marqueurs inflammatoires ; p(Ser536) NF-κBp65, TLR-2 et IL-6. De plus,
Reçu : 30 juillet 2021 Accepté : le niveau de dopamine, de cytokine anti-inflammatoire protectrice, d'IL-10 et de protéine PPAR-γ a été amélioré, ainsi
6 septembre 2021 Publié : 15
que les structures histologiques de la peau. Ainsi, NEG8 pourrait être une future alternative clinique topique potentielle
septembre 2021
aux agents synthétiques, avec un double mécanisme de mérite en tant qu'action antibiotique bactériostatique et
inhibiteur de la voie microbienne non antibiotique.
Note de l'éditeur :Le MDPI reste neutre à

l’égard des revendications juridictionnelles

Mots clés:antibiotique; isolat bactérien clinique; clou de girofle; IGF-1; nanogel; non antibiotique; PPAR γ; thym;
dans les cartes publiées et les affiliations
infection cutanée; huile essentielle;Pseudomonas stutzeri;Enterococcus faecium;Bacillus thuringiensis
institutionnelles.

1. Introduction
Droits d'auteur :© 2021 par les
La résistance aux antimicrobiens (RAM) est l’une des dix principales menaces pour la santé mondiale auxquelles
auteurs. Licencié MDPI, Bâle, Suisse.
l’humanité est confrontée, nécessitant une action multisectorielle urgente pour atteindre les objectifs de
Cet article est un article en libre accès
distribué selon les termes et conditions développement durable [1]. L'invention de nouveaux antibiotiques et thérapies naturels est depuis longtemps

de la licence Creative Commons préconisée par les dermatologues et les microbiologistes comme une stratégie pour surmonter la production à

Attribution (CC BY) (https:// croissance lente d'agents synthétiques [2]. De plus, l'utilisation d'agents non antibiotiques est une nouvelle approche
[Link]/licenses/by/ qui s'avère nécessaire pour lutter contre la résistance microbienne en modifiant la pathogénèse ou les effets
4.0/). physiologiques des espèces microbiennes [3].

Taupe culs2021,26, 5608. [Link] [Link]

Molécules2021,26, 5608 2 sur 20

Depuis les années 1990, des incitations économiques mal alignées ont ralenti le développement de
nouveaux antibiotiques, car de moins en moins de sociétés pharmaceutiques se sont engagées dans le
processus de développement de médicaments [4]. Dans les milieux cliniques, environ 90 % des antibiotiques
proviennent de sources naturelles, qui sont composées d'un groupe privilégié de structures qui interagissent
avec un large éventail de cibles protéiques [5]. Les antioxydants naturels pourraient jouer un rôle essentiel en
tant qu'antibiotiques, où ils affectent non seulement les bactéries mais renforcent également l'immunité
humaine pendant une période de longue durée [6]. Selon Dreger et al., 2014, il existe environ 3000 huiles
essentielles (HE) actuellement identifiées, dont seulement 10 % ont une importance commerciale [7]; par
conséquent, de nouveaux domaines d'application restent encore à découvrir. Malgré le potentiel signalé des
huiles essentielles comme alternatives aux antibiotiques synthétiques, qui présentent des risques plus élevés
pour la santé humaine, l'application industrielle des huiles essentielles est limitée. Ces obstacles sont attribués à
une faible solubilité dans l'eau, à une faible stabilité, à une faible volatilité et à une perception sensorielle altérée
par la chaleur, l'oxydation ou les interactions chimiques. Néanmoins, l'approche nanotechnologique peut
représenter une approche viable pour surmonter ces défis [8], où il est considéré comme une stratégie
prometteuse pour améliorer la solubilité et la pénétration cutanée, et augmenter la sécurité et l'efficacité à long
terme [9].
L'infection cutanée est une maladie cutanée courante, largement répandue dans les communautés et les
hôpitaux. La gravité de l'infection peut aller d'une attaque superficielle à une attaque intense des tissus
profonds, augmentant potentiellement la morbidité chez les patients non traités [10]. De plus, de nombreux
facteurs tels que l'environnement et le mode de vie peuvent affecter négativement la santé de la peau, ce qui, à
son tour, pourrait entraîner la propagation de troubles cutanés transmissibles tels que l'acné, les furoncles, les
anthrax et l'impétigo [11]. On estime que l'acné vulgaire affecte 9,4 % de la population mondiale, ce qui en fait la
huitième maladie mondiale la plus répandue dans le monde [12]. De nombreuses études quantitatives et
qualitatives ont démontré l'impact de l'acné et des traitements topiques sur les mesures de la qualité de vie
liées à la santé [13]. Il est crucial de noter que les informations quantitatives sur les traitements antibiotiques
spécifiques contre l'acné sont très limitées, bien que la communauté dermatologique dispose d'une énorme
charge d'antibiotiques [14]. Des cures d'antibiotiques locaux simples et prolongées de 3 à 6 mois peuvent
potentialiser la résistance. Des rapports antérieurs ont indiqué que plus de 50 % desP. acnése sont révélés
résistants aux macrolides topiques, les rendant moins efficaces [15]. Par conséquent, dans cette étude, nous
avons utilisé l’acné comme modèle de résistance bactérienne cutanée.
L'hypothèse de recherche soutient l'utilisation des huiles essentielles comme modèle commercial
alternatif naturel qui peut imposer la fabrication durable comme norme pour l'industrie des antibiotiques
topiques [16,17]. L'étude visait à développer un nouvel agent antimicrobien à partir d'huiles essentielles en
utilisant la nanotechnologie pour améliorer les caractères physico-chimiques des huiles essentielles et
potentialiser son efficacité. De plus, les voies moléculaires sous-jacentes ont été disséquées pour étudier les
modes d'action non antibiotiques contre les maladies infectieuses cutanées résistantes comme l'acné. À cet
égard, les mécanismes antioxydants et anti-inflammatoires in vivo, les mécanismes génétiques, le
comportement animal et les indices histologiques ont été explorés. Au niveau moléculaire, le suivi de la
production d'IGF-1/pFOXO-1/PPAR γ, de TGF-β/collagène, de la Wnt/β-caténine canonique, de la signalisation
des cytokines JAK-2/STAT-3, de la dopamine, de la sérotonine, de la noradrénaline et du collagène de type 1
pour le nano-émulgel bioactif conçu a été estimé.

2. Matériel et méthodes
2.1. Étude des échantillons d'huiles essentielles (HE)

Cannelle (Cannelle zelylanicum),cumin (Cuminum cyminum), clou de girofle (Syzygium aromatique),

eucalyptus (Eucalyptus globulus), ail (Allium sativum), thym (Thymus vulgaire), menthe poivrée (Menthe
poivrée), lavande (Lavande à feuilles étroites), le géranium (Pelargonium graveolens) et la citronnelle (
Cymbopogon citratus) ont été obtenus auprès du Centre national de recherche, Dokki, Le Caire. Les
huiles ont été préparées par distillation à la vapeur et utilisées comme échantillon d'huiles essentielles de
qualité pharmaceutique. Les normes de performance pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens
étaient conformes au document M100-S20 (ISBN 1-56238-716-2) du Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI), 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2010 : vingtième
supplément d'information.
Molécules2021,26, 5608 3 sur 20

2.2. Authentification des EO commerciaux

Les échantillons d'huiles essentielles ont été authentifiés et standardisés par chromatographie en phase gazeuse-
spectrométrie de masse (GC-MS) à l'aide de chromatographes en phase gazeuse TRACE GC Ultra (THERMO Scientific
Corp., Waltham, MA, États-Unis), couplés à un détecteur spectromètre de masse THERMO (spectromètre de masse à
quadripôle unique ISQ). Les pourcentages relatifs des constituants des huiles essentielles ont été évalués à partir des
surfaces totales des pics et identifiés en comparant leurs spectres de masse avec des produits chimiques authentiques
(bibliothèque NSIT, collection de la bibliothèque spectrale Wiley).

2.3. Détermination des antioxydants à l'aide d'analyses du pouvoir antioxydant réducteur ferrique
(FRAP) et du 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
L'activité antioxydante des huiles essentielles a été mesurée à l'aide du test de piégeage
des radicaux libres 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl (DPPH) et comparée à celle de l'acide
ascorbique (vitamine C) [18]. Le test FRAP a été réalisé selon Olszowy et al. [19].

2.4. Développement de nano-émulsifiants (NEG)

Neuf systèmes de nano-émulsion (NEG) ont été préparés en mélangeant des teneurs variables en
myristate d'isopropyle (IPM) en tant que phase huileuse IPM, de l'eau et une concentration fixe de mélange de
tensioactifs (60 %m/m) de Tween 80 et de Cremophor RH-40 dans différents rapports (1:1, 2:1 et 3:1) comme
indiqué dans (Tableau1). Les systèmes ont été chargés avec un mélange d'huiles antioxydantes les plus
bioactives (30 mg/mL) et ont ensuite été évalués par inspection visuelle pour la clarté optique, l'homogénéité, la
séparation de phase et la cohérence. Le système a montré des gels nano-émulsion (NEG) clairs, qui ont ensuite
été soumis à une caractérisation plus poussée.

Tableau [Link] des systèmes de nano-émulsion préparés (chaque formule a été chargée avec 30 mg/mL de mélange 1:1 clou de girofle/
thym) et observations de l'inspection visuelle.

Tensioactifs
Rapport surfacique Code de formule Huile Eau Aspect visuel
Préadolescent 80 Crémophor RH40
NEG1 10 30 30 30 trouble

(1:1) NEG2 20 30 30 20 gel

NEG3 30 30 30 10 fluide

NEG4 10 40 20 30 trouble

(2:1) NEG5 20 40 20 20 gel

NEG6 30 40 20 10 fluide

NEG7 10 45 15 30 trouble

(3:1) NEG8 20 45 15 20 gel

NEG9 30 45 15 10 fluide

Caractérisation des NEG et formule sélectionnée

La taille des particules (PS), l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta (ZP) des NEG ont été
évalués par Zetasizer (ZS, Malvern Instruments Ltd., Malvern, Royaume-Uni) après une dilution
appropriée du NEG, les mesures ont été effectuées en triple à température ambiante (25±2◦C). Un test de
capacité d'étalement a également été effectué en pressant 0,5 g de chaque formule NEG entre deux
lames de verre et en attendant 5 min jusqu'à ce qu'aucun étalement ne soit attendu, puis les cercles
formés ont été mesurés. Ensuite, les valeurs de pH des gels ont été mesurées à l'aide d'un pH-mètre
étalonné. La formule présentant les caractéristiques les plus optimisées a été analysée
morphologiquement à l'aide d'un microscope électronique à transmission (MET). Le NEG sélectionné a
été étudié pour sa stabilité intrinsèque et stocké dans un flacon en verre propre scellé à des conditions
ambiantes pendant 6 mois. Il a été inspecté visuellement et analysé pour PS, PDI et ZP [20].
Molécules2021,26, 5608 4 sur 20

2.5. Bio-essais antibactériens

2.5.1. Culture et identification bactériennes
L'activité antibactérienne du NEG8 sélectionné avec des huiles essentielles de thymol et de clou de girofle
possédant l'activité antioxydante la plus élevée a été testée contre des bactéries cliniquement isolées [21]. Le
test de coloration de Gram a été utilisé pour identifier les trois bactéries isolées suivantes à partir d'une
situation clinique d'infection cutanée ; B1, bâtonnets Gram-négatifs ; B2, cocci Gram-positifs ; et B3, bacilles
Gram-positifs dans des cultures pures selon Gehardt et al. [22].

2.5.2. Identification biochimique des isolats bactériens à l'aide du système compact Vitek2
L'identification par le système compact Vitek2 a été établie conformément aux instructions du
fabricant (manuel Biomeriux VITEK-2 Compact réf. - Réf. 414532). Un système optique de transmission
permet l'interprétation des réactions de test en utilisant différentes longueurs d'onde dans le spectre
visible. Pendant l'incubation, chaque réaction de test a été lue toutes les 15 minutes pour mesurer soit la
turbidité, soit les produits colorés du métabolisme du substrat. De plus, un algorithme spécial a été
utilisé pour éliminer les fausses lectures dues aux petites bulles qui peuvent être présentes.

2.5.3. Identification moléculaire des bactéries cliniquement isolées

Extraction d'ADN
Des échantillons d'extraction d'ADN de B1 et B2 ont été réalisés à l'aide du kit d'extraction d'ADN
GeneJet (Thermo Fisher Scientific, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, CA, USA). L'acide nucléique a ensuite été
élué dans 100µL de tampon d'élution [23].

Analyse des produits obtenus par réaction en chaîne par polymérase (PCR)

Les produits de PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5 % (Applichem,
GmbH, Darmstadt, Allemagne). Les tailles des fragments ont été étalonnées à l'aide d'un GelPilot 100
paires de bases (pb) plus échelle). Les gels ont été photographiés à l'aide d'un système de
documentation de gel (Alpha Innotech, Biometra, Allemagne) et les données ont été analysées à l'aide
d'un logiciel informatique.

Séquençage microbien
Les produits PCR ont été purifiés à l'aide du kit d'extraction de produits PCR QIAquick (Qiagen, Valence,
Espagne). Un kit de séquençage cyclique Bigdye Terminator V3.1 (Perkinelmer, Foster City, CA, États-Unis) a été
utilisé pour effectuer les réactions de séquençage, qui ont été purifiées à l'aide de la colonne de centrifugation
Centrisep. Les séquences d'ADN ont été obtenues par l'analyseur génétique Applied Biosystems 3130 (HITACHI,
Tokyo, Japon). Analyse BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool) [24] a été initialement réalisée pour établir
l'identité de la séquence avec les accessions GenBank [25]. L'alignement de la base de données à l'aide de NCBI-
BLAST a été analysé par ordinateur pour générer un arbre phylogénétique. Les amorces oligonucléotidiques
pour les bactéries ont été fournies par Metabion (Planegg, Allemagne) [Matériel supplémentaire].

2.5.4. Dosage de la bioactivité par la méthode de diffusion en gélose en coupe

Un test de sensibilité a été établi en utilisant la méthode de diffusion en cupule d'agar [26]. Les
cultures bactériennes ont été diluées à 1:100 (≈106unités formant colonie (UFC)/mL), les plaques d'agar
d'infusion cœur-cerveau (BHA) ont été inoculées avec 100µL de chaque isolat bactérien et des pores de 5
mm remplis de 100 mL de NEG8 sélectionné à 10 mg/mL. Les plaques ont été incubées pendant 24 h à
37◦C; ensuite, les zones d'inhibition ont été mesurées (mm).

2.5.5. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) et de la concentration

minimale bactéricide (CMB)
La CMI de NEG8 a été évaluée à l'aide de la méthode de dilution en série selon le CLSI. Une série de tubes a été préparée
avec un milieu de bouillon auquel diverses concentrations de NEG8 ont été ajoutées. Les tubes ont ensuite été inoculés avec 0,5
ml de standard McFarland des suspensions bactériennes isolées. Les suspensions bactériennes ont été utilisées comme contrôle
négatif, tandis que le bouillon contenant NEG8 a été utilisé comme contrôle positif. Après incubation à 35 °C, les suspensions
bactériennes ont été inoculées avec 0,5 ml de standard McFarland des suspensions bactériennes isolées.±2◦C,
Molécules2021,26, 5608 5 sur 20

les tests ont été examinés et la CMI a été déterminée. Ensuite, des aliquotes de 0,5µLes L de tous les tubes qui
ne présentaient aucune croissance bactérienne visible ont été ensemencés sur des plaques d'agar BHA et
incubés pendant 24 h à 37◦C. Le MBC a été défini comme la plus faible concentration de NEG8 capable
d'empêcher la croissance microbienne dans un milieu de culture [27].

2.5.6. Dosage de l'inhibition du biofilm, quantification et pourcentage d'inhibition

Les biofilms ont été analysés et évalués selon Stepanovic et al., 2007 [28]. La capacité du
NEG8 optimisé à inhiber le biofilm de bactéries isolées (B1, B2, B3) a été évaluée selon la
méthode modifiée d'O'Toole, GA [29]. L'analyse quantitative de la production de biofilm a été
réalisée en ajoutant 125µL d'acide acétique à 30 % pour décolorer les échantillons. Ensuite, la
densité optique (DO) à 620 nm a été évaluée à l'aide d'un lecteur ELIZA pour microplaques
(FLUOstar Omega, BMG, Labtech, Ortenberg, Allemagne). Le pourcentage d'inhibition du
biofilm a été déterminé par la formule :

Contrôle OD−Échantillon OD
%Inhibition = ×100
Contrôle OD

2.6. Potentiel anti-infectieux cutané in vivo du NEG sélectionné optimisé

Les études sur les animaux ont été approuvées et ont suivi les directives du guide d'éthique des animaux
de laboratoire pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire approuvé par les National Institutes of
Health (publication NIH, 1996). L'activité antibactérienne in vivo du nanogel NEG le plus optimisé a été évaluée à
l'aide de rats albinos. Les sites d'injection ont été rasés et l'oreille gauche a été préfixée à l'étagère à l'aide de
ruban adhésif double face. Cette étape a été suivie d'une injection intradermique (id) de 10µL des cultures
bactériennes (B1, B2, B3) au site dorsal de l'oreille. De même, 10µDes litres de solution saline tamponnée au
phosphate (PBS) ont été injectés dans l'oreille droite du même rat et considérés comme un groupe témoin
négatif [30]. Ensuite, 24 h plus tard, la préparation de nanogel optimisée (NEG8) et le gel d'adapalène standard
disponible dans le commerce (ADA) (250 mg/kg) [31] ont été appliqués localement à leurs groupes d’animaux
une fois par jour pendant quatre jours consécutifs ; son potentiel antibactérien a ensuite été évalué.

Conception expérimentale : les rats ont été divisés en 10 groupes suivants (n=10).
(1) GI, groupe témoin négatif ; (2) [Link], traité avec B1 ; (3) [Link], traité avec B1 + NEG8 ;
(4) [Link], traité avec B1 + ADA ; (5) [Link], traité avec B2 ; (6) [Link], traité avec B2 + NEG8 ;
(7) [Link], traité avec B2 + ADA ; (8) [Link], traité avec (B3) ; (9) [Link], traité avec B3 + NEG8 ;
et (10) [Link], traité avec B3 + ADA.

2.6.1. Tests comportementaux en champ libre

Les tests ont commencé 24 h après la fin de l'expérience. Dix rats (premier groupe) ont été soumis
au test du champ ouvert, qui mesurait le temps de latence (temps écoulé entre le moment où l'animal
est placé au milieu du dispositif et son premier mouvement), la fréquence de déambulation (nombre de
cases traversées par l'animal en 3 min) et la fréquence de redressement (nombre de fois où l'animal s'est
tenu debout et étendu sur les membres postérieurs sans support des membres antérieurs) [32].

2.6.2. Western blot

La technique de Western blot a été réalisée comme décrit précédemment [33]. La densité optique (DO)
des résultats mentionnés ultérieurement a été normalisée en fonction de la β-actine et des protéines totales.

2.6.3. Paramètres ELISA

Les kits ELISA ont été utilisés pour mesurer les niveaux d'homogénat du facteur de croissance analogue à
l'insuline-1 (IGF-I), de la protéine p(Ser256) Forkhead box O-1 (p(Ser256)FOXO-1), de l'IL-6, de l'IL-10, de la
dopamine, de la sérotonine, de la noradrénaline, du collagène de type 1 et des niveaux de facteur de croissance
transformant β-1 (TGFβ-1) selon les instructions du fabricant.
Molécules2021,26, 5608 6 sur 20

2.6.4. Analyse RT-PCR

Des échantillons de tissus ont été générés comme décrit précédemment par Je et al., 2020 [33]. Des listes
quantitatives de transcriptase inverse (qRT) sont fournies dans les documents supplémentaires. Les niveaux
d'expression ont été analysés par Real-Time StatMiner (Integromics, Madrid, Espagne). Les niveaux de β-actine
ont été utilisés comme contrôle interne et les changements de repli ont été calculés par quantification relative.

2.6.5. Examens histopathologiques

Des échantillons de peau ont été prélevés sur trois rats par groupe, qui ont été inclus dans de la cire de
paraffine pour être sectionnés et colorés à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) à l'aide du module d'application
Leica pour l'analyse des coupes de tissus (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Allemagne).

2.7. Analyse statistique

Les données ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance (ANOVA), suivie du test post-hoc de
Tukey. Toutes les valeurs ont été exprimées sous forme de moyenne±SD L'inhibition des biofilms bactériens à
différentes concentrations de NEG optimisé a été comparée par ANOVA à deux facteurs (tests post-hoc de
Bonferroni). Le logiciel GraphPad Prism (version 5.0d ; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) a été utilisé
pour toutes les analyses statistiques,p<La valeur de 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

3. Résultats et discussion
3.1. Analyses chromatographiques GC-MS
L'authentification et la normalisation des échantillons d'EO ont été établies en comparant le temps de rétention
et les spectres de masse des composants avec les données publiées (tableau2). L'analyse quantitative de l'huile de thym
et de clou de girofle a montré que le thymol (65,6 %) et l'eugénol (94,3 %) étaient respectivement les principaux
principes de l'huile de thym et de clou de girofle.

Tableau [Link] et authentification GC/MS d'échantillons d'huiles essentielles.

Huile testée % de la zone principale Rt Poids maximal Formule moléculaire Composé Modèle de fragmentation

Ail 40,87 12.17 178 C6H10S3 Trisulfure d'allyle 39, 41, 73, 113, 178
Eucalyptus 48,88 8,65 152 C10H16O 2-Bornanone 41, 55, 69, 81, 95, 108, 152
Lavande 39,39 7.41 154 C10H18O L-Linalol 55, 69, 71, 80, 93, 121, 136
Cannelle 60,97 11.73 132 C9H8O Cinnamaldéhyde 51, 77, 78, 103, 131, 132
Thym 56,62 * 11,85 150 C10H14O Thymol 77, 91, 115, 117, 135, 150
Citronnelle 52,46 5.86 136 C10H16 D-Limonène 41, 53, 67, 93, 107, 121, 136
Cumin 34,77 6.47 136 C10H16 Terpinène 41, 77, 79, 91, 93, 105, 121, 136
Géranium 36.27 10.3 156 C10H20O Citronellol 41, 55, 69, 82, 95, 109, 123, 138, 156
Clou de girofle 94,13 * 13.25 164 C10H12O2 Eugénol 55, 77, 91, 103, 121, 131, 149, 164
Menthe poivrée 23,90 9.26 156 C10H20O Menthanol 41, 43, 55, 71, 81, 95, 123, 138, 156

* Fait référence à la concentration en phénol (thymol et eugénol) dans NEG8.

3.2. Activité antioxydante des huiles essentielles

Grâce à l'amélioration des connaissances, les consommateurs se tournent progressivement vers les
antioxydants naturels sans ingrédients synthétiques. En plus des activités cosmétiques et conservatrices des
huiles essentielles, ses petites molécules lipophiles et non polaires sont considérées comme des activateurs
naturels de pénétration cutanée, ce qui soutient l'intérêt croissant pour la recherche sur les huiles naturelles [34
]. L'activité antioxydante des huiles essentielles testées a été évaluée à l'aide de tests de piégeage des radicaux
libres DPPH et FRAP.
Les résultats (chiffres1et2) ont montré que les huiles de thym et de clou de girofle possédaient les activités
antioxydantes les plus élevées [35,36]. Le clou de girofle et la vitamine C exerçaient le même pourcentage d'activité
antioxydante et étaient insignifiants à une concentration de 40µg/mL. Cependant, toutes les huiles testées ont montré
une différence significative par rapport à l'acide ascorbique à une concentration de 80, 100, 120µg/ml (p<0,05). De plus,
l'ion réducteur Fe à activité la plus forte3+à Fe2+était connu pour ses huiles essentielles de thym et de clou de girofle. Les
deux huiles essentielles les plus bioactives étaient auparavant caractérisées par une
Molécules2021,26, 5608 7 sur 20

pourcentage élevé de composés phénoliques, qui contribuent potentiellement à une double activité anti-radicalaire et
antimicrobienne [37]. Par conséquent, les huiles de clou de girofle et de thym ont été utilisées pour préparer des nano-
émulsifiants fonctionnels (NEG), afin d'améliorer les caractères physico-chimiques des huiles
isolats bactériens.

Figure [Link] FRAP de différents échantillons d'huiles essentielles. Les lettres indiquent les différences statistiques
d'activité antioxydante entre différentes huiles (test de Tukey,p<0,05).

Figure [Link] DPPH de différents échantillons d'huiles essentielles.

3.3. Caractérisation des NEG préparés

L'inspection visuelle a révélé que les formules NEG1, NEG4 et NEG7 (teneur en eau la plus élevée et
teneur en huile la plus faible) étaient troubles, tandis que NEG3, NEG6 et NEG9 (teneur en eau la plus
faible et teneur en huile la plus élevée) étaient des fluides jaunes transparents, ils ont donc été exclus.
Les formules NEG2, NEG5 et NEG8, qui ont été préparées en utilisant des quantités égales d'huile et
d'eau, se sont avérées avoir une consistance gélatineuse jaune transparente appropriée ; par
conséquent, ces formules ont été sélectionnées pour une caractérisation plus approfondie. Les valeurs
de pH des formules sélectionnées allaient de 5 à 5,96, ce qui est compatible avec le pH de la peau et
convient à une application topique. Un test d'étalement, essentiel à l'observance du traitement par le
patient, a été effectué. Une bonne étalement facilite l'application facile et uniforme de la préparation
cutanée topique [38]. Les valeurs d'étalement pour les NEG sélectionnés variaient entre 6,89±0,12 et 7,4±
0,26 cm, indiquant des propriétés d'étalement pratiques. Les analyses PS ont révélé que NEG8 avait la
plus petite taille (33,46±1,315 nm) (Tableau3). En termes de PDI, le ratio de
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L'écart type par rapport à la moyenne PS était de 0,315±0,05. Une faible valeur PDI indique une bonne
uniformité du PS dans la formule [39]. Les données ZP pour NEG8 reflètent une bonne stabilité (−14.2±2,316
mV) et le TEM ont confirmé que les particules NEG8 étaient de taille nanométrique (30 nm), de forme sphérique
uniforme sans agrégation (Figure3). Sur la base de ces données, NEG8 a été sélectionné pour d'autres études in
vitro et in vivo. La stabilité de NEG8 a été testée en le stockant pendant 6 mois dans des conditions ambiantes.
Des inspections visuelles fréquentes n'ont révélé aucun changement d'apparence et aucune séparation de
phase n'a été notée. Aucune différence significative n'a été enregistrée pour PS, PDI ou ZP (p<0,01); les valeurs
mesurées étaient de 29,49±2,5 nm, 0,42±0,06 et−19.43±2,1 mV pour PS, PDI et ZP, respectivement. Ces
résultats indiquent la stabilité de la préparation optimisée sélectionnée : NEG8.

Tableau [Link]éristiques des gels nano-émulsion préparés.

Code de formule PS (nm) PDI Courant de vapeur (mV)

NEG2 52,44±3.22 0,413±0,00 − 12h40±0,70

NEG5 36,43±1,63un 0,260±0,06un − 12,50±2.26
NEG8 33,46±1.31un 0,315±0,05 − 14.2±2.31
NEG8
29,49±2.51a, b 0,42±0,06b − 19.43±2.10abc
(6 mois de stockage)
Toutes les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ((n=3),±SD); la différence est significative àp≤0,05 de : NEG2un, NEG5b, NEG8c.

Figure [Link] électronique à transmission du NEG8 sélectionné.

3.4. Activité antibactérienne in vitro de NEG8

3.4.1. Identification des bactéries cliniquement isolées
Vitek Identification des isolats de bactéries
L'isolat B3 a été identifié commeBacillus thuringiensisen utilisant le système Vitek 2 (Tableau4). Par conséquent,
B3 était une sporulation avec une forme de bâtonnet unique, et elle était facilement identifiable comme une Bacilleen
utilisant la méthode Vitek. Cependant, les formes B1 et B2 sont courantes pour de nombreux organismes et ne peuvent
pas être facilement identifiées, donc une méthode plus avancée comme le test d'identification moléculaire a été
appliquée.
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Tableau 4.Détails biochimiques du B3 identifié (Bacillus thuringiensi)par système compact Vitek2.

1 BXYLE - 3 LysA - 4 AspA - 5 LeuA + 7 PheA + 8 ProA -

9 BGAL - 10 PyrA + 11 AGAL - 12 AlaA - 13 TyrA - 14 BNAG +
15 APPA + 18 CDEX - 19 dGAL - 21 GLYG - 22 INO - 24 MdG -
25 ELLM - 26 MdX - 27 UN MÈRE - 29 MTTE - 30 GlyA - 31 dMAN -
32 dMNE - 34 dMLZ- 36 HARCELER + 37 PLÉ - 39 IRHA - 41 BGLU +
43 BMAN - 44 SCP - 45 PVATE + 46 AGLU - 47 dTAG - 48 dTRE +
50 INU - 53 dGLU+ 54 dRIB + 56 PSCNa - 58 NaCl + 59 CAN -
60 VIEUX - 61 Échap + 62 TIZ - 63 POLYB + 1

Identification moléculaire des isolats bactériens

Les résultats de l'électrophorèse n'ont montré aucune contamination ni dégradation des
échantillons isolés. Le premier puits contenait l'échelle d'ADN kb négative (M) et le deuxième puits
contenait le contrôle négatif pour détecter toute contamination (N). Figure4démontre les résultats
de la PCR pour B1 et B2. Les données de séquence d'ADNr 16S ont indiqué que B1 était par
exemple étroitement apparenté (100 %) à la souchePseudomonas stutzeriet le B2 isolé est
Enterococcus faecium(99,18 %). Ces résultats ont été observés dans les modèles d'arbres de
voisinage (Figure S1) [fichier supplémentaire].

Figure [Link] du produit PCR (résultats PCR utilisant l'amorce 16 s).

3.4.2. Test de sensibilité, dosages MIC et MBC de NEG8 contre des isolats bactériens
Nos recherches ont montré des activités antibactériennes du NEG8 testé contre les isolats
cliniques (B1, B2 et B3), mais leur activité était assez diverse.
La tendance suivante de sensibilité microbienne au NEG8 a été observée :Enterococcus
faecium(B2) >Bacillus thuringiensis(B3) >Pseudomonas stutzeri(B1) (Table4). Les résultats ont
indiqué que la CMI de B1 et B3 était de 1,25 mg/mL, tandis que la CMI de B2 était de 0,625 mg/mL.
La CMB de B1 et B3 était de 5 mg/mL, et de 2,5 mg/mL pour B2 (tableau5).

Tableau [Link] de sensibilité (mm), CMI, MBC (mg/mL) de NEG8 contre des isolats bactériens identifiés.

Nom bactérien Zone d'inhibition Micro MBC

Pseudomonas stutzeri(B1) 19 1,25 5.0
Enterococcus faecium(B2) 25 0,62 2.5
Bacillus thuringiensis(B3) 23 1,25 5.0

Ces résultats sont conformes aux publications précédentes qui ont rapporté l’effet inhibiteur de
l’huile de clou de girofle contreEntérocoqueetPseudomonasespèces [40]. De plus, Nzeako et al.
Molécules2021,26, 5608 10 sur 20

ont montré que les huiles de thym et de clou de girofle possédaient une activité antimicrobienne remarquable
contre Pseudomonasespèces bactériennes [41]. La teneur élevée en phénol du thymol (56 %) et de l'eugénol (94
%) (tableau2) peut être attribuée à la puissante activité antimicrobienne du NEG8 [42].

3.4.3. Formation de biofilm, quantification et pourcentage d'inhibition par NEG8

Les biofilms microbiens sont construits par des communautés bactériennes pour former des structures
complexes qui facilitent leur adhérence à la surface, permettent la propagation des agents pathogènes et
empêchent la diffusion des antibiotiques vers la paroi cellulaire bactérienne. Par conséquent, il s'agit d'un
contributeur potentiel à la résistance des agents pathogènes aux antibiotiques [43]. L'avènement de nouvelles
stratégies pour développer un inhibiteur de biofilm efficace plutôt que des traitements conventionnels a suscité
beaucoup d'attention. Les isolats B1, B2 et B3 ont été évalués pour la formation de biofilm à l'aide d'une
méthode de microplaque. Selon nos résultats, B2 et B3 ont montré une forte formation de biofilm, tandis que
B1 possédait un comportement de formation de biofilm modéré. Nous avons observé une différence
significative entre le groupe témoin et tous les isolats ; de plus, le résultat a indiqué qu'il existe une différence
statistiquement mesurable entre B1 et B2 et entre B1 et B3 àp<0,05 (chiffre5a). Le pourcentage d'inhibition du
biofilm des bactéries isolées (B1, B2 et B3) par le NEG8 a été déterminé à 1/2, 1/4, 1/8 CMI pour chaque isolat, et
le NEG8 a montré une activité antibiofilm contre tous les isolats. B1 a été inhibé de 92,70 %, 83,63 % et 63,47 % ;
B2 de 64,86 %, 56,99 % et 50,46 % ; et B3 de 78,7 %, 70,3 % et 62,6 % à 1/2, 1/4 et 1/8 CMI respectivement
(Figure5b). Ces données concordent avec celles de Sharma et al., 2020, qui ont indiqué que l'huile de thym et de
clou de girofle inhibait les bactéries Gram-négatives
Escherichia coliformation de biofilm de 93,43 % [44].

Figure 5.(un) Types de formation de biofilm de bactéries isolées. Négatif (OD≤ODc), faible (ODc≤OD≤2ODc), modéré
(2ODc < OD≤4ODc) et une forte production de biofilm (4ODc < OD) OD = densité optique (a : significatif par rapport au
témoin àp<0,05, b : significatif par rapport à B1 à (p<0,05), c : significatif par rapport à B2 àp<0,05). (b) Le pourcentage
d’inhibition du biofilm.

3.5. Potentiel antimicrobien in vivo de NEG8

3.5.1. Altérations du comportement des rats lors d'un test en plein champ

Les résultats du test en champ ouvert indiquent un désordre lié à l'infection cutanée dans les
activités locomotrices et exploratoires spontanées, comme le montre la figure6Panneau I (A). Tous les
groupes traités avec les bactéries (B1, B2 et B3) ont un temps de latence prolongé (6,3, 7,5 et 9 s,
respectivement). De plus, les animaux ont également montré une diminution significative du nombre de
carrés traversés/3 min (B) et du nombre de carrés traversés/3 min par rapport au groupe témoin sain.
Cependant, l'application épicutanée du NEG8 pendant 4 jours a amélioré les résultats comportementaux,
a empêché l'effet dépressif des bactéries en diminuant le temps de latence et en augmentant les
fréquences de déplacement et de cabrage. Il convient de noter que le NEG8 a une activité de
modification comportementale significative par rapport à la norme ADA et précède même celle du
contrôle en ce qui concerne le nombre de carrés traversés/3 min qui reflète l'amélioration des résultats
comportementaux des rats. De plus, à la connaissance des auteurs, cette étude est le premier modèle
animal expérimental évaluant les résultats comportementaux.
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Figure [Link] changements de comportement dans un test en champ ouvert sur (UN) temps de latence, (B) fréquence d'élevage, et (C) nombre de cases traversées/3 min (panneauje). Contenu de (UN) IGF-1, (B) FOXO-1 et (C
) expression protéique de PPAR-γ (panneauII). Contenu de (UN) TGFβ-1 et (B) collagène (panneauIII). Expression protéique de (UN) Wnt-1 et (B) Voie de la β-caténine (panneauIV). Les valeurs sont présentées sous forme de
moyenne (n=10)±L'écart-type et l'analyse statistique ont été réalisés à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie d'un test de comparaison multiple post hoc de Tukey. Par rapport au groupe témoin (*), les groupes traités B1 (†),
B1 + F (&), B2 (‡), B2 + F (#), B3 ($) et B3 + F (%) ;p<0,05. B1 :Pseudomonas stutzeri, B2:Enterococcus faecium, B3:Bacillus thuringiensis, F : NEG8, ST : gel d'Adapalène standard.
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3.5.2. Expression de l'IGF-1/FOXO-1 et du PPAR-γ

Le facteur de croissance analogue à l'insuline-1 (IGF-1) et sa principale protéine en aval, la protéine
Forkhead box O-1 (FOXO-1), sont impliqués dans la pathogenèse et le développement des infections cutanées [
45,46]. PPAR- γest l'une des principales isoformes fonctionnelles des membres de la famille PPAR et est
exprimée dans les glandes sébacées normales qui régulent la production de sébum humain et jouent un rôle
essentiel dans le développement de l'acné [47]. Comme indiqué (Figure6, panneau II), tous les rats injectés par
différents isolats bactériens ont acquis une augmentation immense du niveau (A) IGF-1, puis l'activité nucléaire
de FOXO-1 a diminué ; en induisant la phosphorylation au site Ser256 et en régulant à la baisse l'expression de
PPAR-γ.
Au contraire, le niveau d'IGF-1 a diminué et l'expression de PPAR-γ a augmenté après
l'application de NEG8. Cela a diminué la phosphorylation de FOXO-1, augmentant ainsi sa
translocation nucléaire et son activité. En termes d'axe IGF-1/PPAR-γ/FOXO-1, il a été suggéré
précédemment que PPAR-γ pourrait réguler FOXO-1 en modulant PI3k-AKT [48]; en conséquence,
NEG8 a augmenté l'expression de PPAR-γ et diminué les niveaux d'IGF-1, entravant ainsi l'activité
d'AKT et augmentant indirectement l'activité de FOXO [49].

3.5.3. TGFβ-1 et collagène

Le TGFβ-1 est une cytokine pro-inflammatoire importante [50]. Chiffre6le panneau (III) montre que
toutes les bactéries cliniquement isolées ont montré une augmentation du facteur de croissance
transformant β-1 (TGFβ-1) qui a augmenté séquentiellement la production de collagène [51]. Cependant,
l'application de NEG8 sur les zones infectées a empêché la production de collagène et amélioré les
résultats comportementaux des rats (en inhibant leur activateur influent, TGFβ-1) plus que la norme ADA.
Cet effet peut être attribué à la capacité de la formule à diminuer l'IGF-1 et à augmenter le PPAR-γ.

3.5.4. Expression de Wnt-1/β-caténine

La Wnt/β-caténine joue un rôle crucial dans diverses fonctions cellulaires [52]. Tous les groupes
témoins positifs ont activé cette signalisation (Figure6panneau IV), comme le montre la forte
augmentation de l'expression de la protéine (A) Wnt-1, qui était environ 4,5 fois plus élevée que dans le
groupe témoin. Cette augmentation était associée à une augmentation de 6,4 fois de l'expression de la
β-caténine libre (B). L'activation de ce signal par toutes les bactéries injectées peut être due à une
augmentation du TGFβ-1, alors qu'une étude précédente avait rapporté que le TGF-β1 et la signalisation
canonique Wnt/β-caténine se stimulaient mutuellement via l'axe PI3K/Akt [53]. L'effet bénéfique de NEG8
s'est traduit par la désactivation de cette voie ; il a stoppé les effets bactériens, diminué l'expression de
Wnt et par la suite de la β-caténine. Cet effet peut avoir été médié par la modulation de PPAR-γ, les
agonistes PPAR-γ se sont avérés diminuer les niveaux de β-caténine libre et inhiber sa translocation
nucléaire par l'activation des inhibiteurs de signal Wnt [53]. L'application de NEG8 a exercé une
protection anti-inflammatoire plus élevée en diminuant l'expression protéique de Wnt dans les groupes
traités par B1 et B3 plus que dans le groupe traité de manière similaire par la norme ADA.

3.5.5. Voie de signalisation IL-6, IL-10 et p(Tyr (1007/1008))JAK-2/p(Tyr705)STAT-3

L'axe JAK-2/STAT-3 est soupçonné de jouer un rôle central dans la progression de l'acné. Les
données de la figure7Le panneau (I) illustre la stimulation progressive de ce signal initié par
l'augmentation de l'IL6 (A). La régulation positive de l'IL6 est entraînée par l'augmentation de
l'expression protéique de (B) JAK-2, de la molécule en aval (C) STAT-3 et par la diminution du contenu de
la cytokine de survie (D) IL-10 (les actions intervenues par tous les isolats bactériens). La signalisation
JAK-2/STAT-3 est normalement déclenchée par l'activation des ligands des récepteurs des cytokines (IL-6
et IL-10) [54]. Dans la présente étude, cette voie était un signal de signalisation dangereux, dans lequel
dans le groupe traité par les bactéries, l'IL-6 a augmenté avec les molécules JAK-2/STAT-3, ce qui a à son
tour diminué le contenu de la cytokine anti-inflammatoire de survie IL-10. Cependant, NEG8 a exercé des
mesures de protection en inversant ces effets et en augmentant le niveau de la cytokine de défense
IL-10. Cette voie d'action de NEG8 remplace l'effet du médicament ADA à différents points de cette
trajectoire.
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Figure [Link] du contenu et de l'expression des protéines de (UN) IL-6, (B)p(Tyr (1007/1008))JAK-2 (C)p(tyr705)STAT3 et (D) IL-10 (panneauje). Expression protéique de (UN) TLR-2 et (B) NF-κB (panneauII).
Changements dans le contenu de (UN) NE, (B) 5HT, et (C) DA (panneauIII). Les valeurs sont présentées sous forme de moyenne (n=10)±SD. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie d'un
test de comparaison multiple post hoc de Tukey. Par rapport au groupe témoin (*), les groupes traités B1 (†), B1 + F (&), B2 (‡), B2 + F (#), B3 ($) et B3 + F (%) ;p<0,05. B1 :Pseudomonas stutzeri, B2: Enterococcus faecium, B3:
Bacillus thuringiensis, F : NEG8, ST : gel d'Adapalène standard.
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3.5.6. Expression de TLR-2 et de p(Ser536) NF-κBp65

Outre ces mécanismes, des cascades inflammatoires exagérées sont impliquées dans la
physiopathologie de l'acné [55,56]. Comme le montre la figure7panneau II, différentes injections
microbiennes ont entraîné une myriade d'effets déclenchés par (A) TLR-2 et ont abouti à une
augmentation de l'expression protéique du facteur de transcription inflammatoire parent (B) NF-κBp65
ainsi que de l'IL-6. Cependant, les niveaux d'IL-10 ont diminué par rapport au groupe d'animaux témoins
normaux. Ces observations concordent avec les données d'une étude précédente montrant que les
agents microbiens déclenchaient des réponses cytokines et l'expression de NF-κB via des récepteurs de
type Toll (TLR-2) [57].
De plus, le facteur de transcription amélioré NF-κB qui est responsable de la formation d'autres
marqueurs pro-inflammatoires peut également réactiver NF-κB pour provoquer une poussée de
chimiokines ainsi qu'une réduction de l'expression protectrice anti-inflammatoire de l'IL-10 [58,59]. Après
l'application de NEG8, les résultats ont fait référence à la diminution des résultats de TLR-2 et de NF-
κBp65 par rapport aux groupes traités par des bactéries individuelles. Néanmoins, NEG8 a également
montré des aptitudes anti-inflammatoires supérieures à celles du médicament standard. Notamment,
quatre actions mécanistes pourraient expliquer les effets anti-inflammatoires de NEG8 : (i) l'élévation des
niveaux d'IGF-1 et de pFOXO-1, (ii) l'inhibition de l'activité de NF-κB, (iii) la stimulation des gènes cibles de
la β-caténine, (iv) la trajectoire JAK/STAT intervient pour médier l'effet anti-inflammatoire. De plus, il a été
suggéré auparavant que l'activation des médiateurs inflammatoires par l'agoniste de TLR-2, comme
l'IL-6, dépend des voies de signalisation NF-kB et JAK-STAT.

3.5.7. Modifications des taux de noradrénaline (NE), de sérotonine (5-HT) et de dopamine (DA)
Dans la présente étude, tous les rats infectés ont montré une perturbation des monoamines (Figure7
panneau III) comme le montrent les niveaux élevés de (A) NE et (B) 5-HT. Cet effet s'est reflété dans les niveaux
de (C) DA qui ont diminué par rapport au groupe témoin. Le rôle direct de ces monoamines dans le
déclenchement ou l'aggravation des infections cutanées reste flou. Il a été précédemment démontré que divers
types de stress physiques augmentent la NE centrale [60] et 5-HT [61] niveaux. De plus, le stress et la
dépression ont favorisé des réponses inflammatoires qui interagissent avec de nombreux domaines
physiopathologiques, en particulier les fonctions neuroendocrines et les résultats comportementaux [62].
D'après nos observations, NEG8 a non seulement neutralisé cette menace mais a également rétabli des valeurs
normales, en particulier contre le B1 (P. stutzeri) groupe traité. Le NEG8 a exercé un effet plus significatif que le
médicament standard ADA sur les niveaux de DA et NE. Ces données suggèrent que la restauration de niveaux
de monoamines proches de la normale par le NEG8 était un facteur clé à l'origine de la réduction des niveaux
de marqueurs inflammatoires et de l'amélioration des séquelles comportementales.

3.5.8. L'effet de NEG8 sur l'histopathologie

L'impact des différentes bactéries sur l'histopathologie de l'oreille gauche et des zones
environnantes a été étudié. D'après nos données (Figure8, panneau I) il a été révélé de larges zones
diffuses d'infiltration de cellules inflammatoires dans le tissu sous-cutané (symbole étoile dans le
panneau) accompagnées d'infiltrations modérées dans la couche dermique et de vaisseaux sanguins
modérément congestionnés (flèche rouge) par rapport aux oreilles injectées de PBS (témoin négatif).
Cependant, l'application épicutanée de NEG8 pendant 4 jours a montré des effets antimicrobiens et anti-
inflammatoires contre B1 (P. stutzeri) et B2 (Escherichia coli) groupes.
Cette application a amélioré l'apparence de la peau (panneau II). Dans le GIIa (P. stutzeri+Dans le groupe
NEG8, une réduction modérée des infiltrats de cellules inflammatoires a été observée mais avec une persistance
de vaisseaux sanguins congestionnés (flèche rouge). Cependant, dans le groupe traité par ADA, GIIb (P. stutzeri
+L'ADA a montré la persistance des mêmes enregistrements que le GII (Pseudomonas stutzeri : B1) groupe.
NEG8 a exercé son effet protecteur dans GIIIa (B2 ;Escherichia coli+NEG8), comme en témoignent les structures
morphologiques bien organisées dans les différentes couches cutanées, avec des infiltrats cellulaires
inflammatoires minimes et un œdème sous-cutané modéré (flèche rouge). De plus, GIIIb (B2 ;Escherichia coli+
L'ADA a montré une amélioration significative avec des infiltrations de cellules inflammatoires minimales ainsi
que peu de vaisseaux sanguins congestionnés (flèche rouge) par rapport au GIII (B2 ;Escherichia coli) groupe
d'animaux. Néanmoins, NEG8 et même l'ADA
Molécules2021,26, 5608 15 sur 20

le groupe traité n’a pas conservé la morphologie cutanée de son groupe témoin positif correspondant
(B3 ;B. thuringiensis), où les deux ont montré la persistance des mêmes enregistrements (Figure8,
panneau I, II).

Figure [Link] représentatives d'altérations de photomicrographies histopathologiques (panneauje) et le potentiel d'irritation cutanée du NEG8
contre les bactéries cliniquement isolées (panelII). Panneau I : comparé au (UN,un) sections de peau normale intacte de l'oreille gauche et de la (B,
b) sections de l'oreille droite injectées de PBS, (C,c) les coupes ont montré une morphologie cutanée perturbée après injection de B1. Dans le
même schéma, des photomicrographies de B2, inoculation (F,f) et l'inoculation B3 (je,je) ont montré des résultats similaires à ceux de B1.
Cependant, des sections de l'oreille gauche des animaux ont reçu F pendant quatre jours ; (D,d; B1 + F) et (G,g; B2 + F) ont amélioré la morphologie
de la peau encore mieux que les sections standard de (E,et; B1 + ST) et (H,h; B2; + ADA). Cependant, les sections traitées par F (J,j; B3 + F) et la
norme (K,k; B3 F + ST) n'a pas sauvegardé la morphologie de la peau car les deux ont montré la persistance des mêmes enregistrements que leur
groupe témoin positif correspondant B3 (H,E; 50µm et 200µm). B1:Pseudomonas stutzeri, B2:Enterococcus faecium, B3: Bacillus thuringiensis, F :
NEG8, ST : gel d'adapalène standard (ADA).

Nous avons également observé queP. stutzeria augmenté l'IGF-1 et a induit un niveau plus élevé
d'infection cutanée queEscherichia colietB. thuringiensis,alors queB. thuringiensisa déclenché des
troubles du comportement plus queP. stutzerietEscherichia coliisole. De l'autre côté, le
Escherichia coliles marqueurs inflammatoires tgfb, TLR et NF-kB ont été potentialisés plus queP. stutzeri
etB. thuringiensis. En revanche,P. stutzeria augmenté la voie inflammatoire JAK plus que les deux autres
bactéries. Toutes les bactéries isolées ont exercé les mêmes effets significatifs sur PPAR-γ et Wnt par
rapport aux témoins. Après traitement avec NEG8, aucune différence dans le temps de latence n'a été
observée entre les groupes d'animaux. De plus, NEG8 était plus efficace contreP. stutzeriqueEscherichia
colietB. thuringiensisen ce qui concerne les paramètres monoamines, TGFB-1 et Wnt, indiquant que
NEG8 peut modifier la progression de l'inflammation et l'état de perturbation comportementale de
l'infection. Un diagramme schématique décrivant les mécanismes thérapeutiques possibles de la voie de
signalisation in vivo est présenté dans la Figure9À notre connaissance, il s’agit du premier rapport qui
met en lumière l’effet de types spécifiques de bactéries sur les signaux moléculaires biologiques.
Molécules2021,26, 5608 16 sur 20

Figure [Link]éma révélant les changements possibles in vivo, les différentes voies de signalisation impliquées dans l'infection cutanée et l'effet
protecteur du NEG8 (thymol/clou de girofle).

Nos résultats sont conformes aux études précédentes qui ont attribué l'utilisation des huiles essentielles
comme un agent antimicrobien prometteur contre les agents pathogènes résistants aux médicaments [63].
Pectis substriataL'EO a exercé une activité potentielle contre les bactéries résistantessouches de
staphylocoques[64]. L'action antibiotique des huiles essentielles est attribuée à l'inhibition du biofilm [65],
mécanisme d'action de rupture de membrane et de suppression d'efflux [66]. De plus, l'inhibition des cytokines
inflammatoires et la suppression de la production de superoxyde ont été signalées comme le mode d'action
antimicrobienne de l'huile d'arbre à thé terpinen-4-ol [67]. De plus, l'huile essentielle de citron a montré une
activité bactéricide d'origine alimentaire par la lyse de la paroi cellulaire bactérienne, l'inhibition du taux de
croissance des microbes et la fuite de l'ingrédient intracellulaire du microbe [68].
Récemment, la préparation de nanomatériaux (NM) représente une stratégie efficace qui met en
œuvre une activité bactéricide unique qui contrecarre la résistance microbienne. NM libérant de l'oxyde
nitrique, NM à base de chitosane, NM métalliques et NM à chargement multiple d'antibiotiquesS
sont différentes nano-formes qui jouent un rôle essentiel dans l'interaction avec le système cellulaire bactérien.
Molécules2021,26, 5608 17 sur 20

tem et servir d'alternative aux antibiotiques [69]. Actuellement, il existe peu d'études utilisant des nano-huiles
essentielles pour lutter contre la résistance bactérienne [70]. Cependant, la nano-émulsion d'huile d'origan a montré
une cicatrisation de l'acné et une activité antimicrobienne in vitro [71]. En outre, la nano-encapsulation de
cardamomechitosane a enregistré une efficacité puissante contre les agents pathogènes bactériens résistants aux
antibiotiques (producteurs de β-lactamaseEscherichia coliet résistant à la méthicillineStaphylococcus aureus) [72]. À la
connaissance des auteurs, la plupart des études antimicrobiennes sur les huiles essentielles et les nano-huiles
essentielles n'ont pas permis de fournir d'informations précises sur leurs mécanismes d'action au niveau moléculaire [
73]. Cependant, pour la première fois, nos recherches ont exploré les perspectives antibiotiques et non antibiotiques
des huiles essentielles de nano-thym/girofle (NEG8) contre les microbes résistants aux médicaments contre l'acné.
En résumé, NEG8 a montré une activité bactériostatique et inhibitrice du biofilm. L'application de NEG8 a
amélioré les résultats comportementaux des rats, qui ont été reflétés par les niveaux de monoamines. Il a
également eu un impact sur les événements de signalisation importants induits par des bactéries isolées lors
d'une infection cutanée en modulant l'expression de l'IGF-1, du TGF-β/collagène, de la Wnt/β-caténine et de
JAK2/STAT-3. De plus, NEG8 a régulé à la hausse les récepteurs PPAR-γ qui jouent un rôle essentiel dans le
développement de l'acné/des infections cutanées et régulent la production de sébum. Les activités anti-
inflammatoires de NEG8 ont été confirmées par la diminution des niveaux de p(Ser536) NF-κBp65, TLR-2 et IL-6
et par l'augmentation du seuil de la cytokine anti-inflammatoire protectrice IL-10. Ces résultats se sont reflétés
par des améliorations des structures histologiques et de la morphologie de la peau. Par conséquent, NEG8 est
considéré comme un nouvel agent thérapeutique non antibiotique avec de multiples mécanismes qui peuvent
potentiellement ralentir la vitesse à laquelle la résistance se développe.

4. Conclusions
La présente étude a montré que le NEG8 (NEG clou de girofle/thym) présentait un double mécanisme
antibiotique non antibiotique et bactériostatique. Les effets non antibiotiques ont été attribués au potentiel du
NEG8 à inhiber la pathogénèse neuro-motrice et les voies comportementales/inflammatoires bactériennes. Sur
la base de ces résultats, nous proposons le NEG8 comme un agent antimicrobien cosmo-naturel potentiel qui
améliore la morphologie de la peau et réduit l'acné comédonienne. À la connaissance des auteurs, aucune
étude n'a décrit de manière exhaustive les effets des huiles essentielles sur les voies mesurées impliquées dans
le traitement de l'acné. Des recherches cliniques supplémentaires sont nécessaires pour explorer l'application
du NEG8 en milieu clinique. Dans l'ensemble, l'étude a révélé la possibilité de développer différents émulgels
d'huiles essentielles nano avec une stratégie de lutte contre la résistance microbienne à mécanismes multiples.

Matériel supplémentaire :Les éléments suivants sont disponibles en ligne, Figure S1 : Arbre phylogénétique de
Pseudomonas stutzeri(un),Enterococcus faecium(b).

Contributions des auteurs :Conceptualisation, JAN et SMF ; méthodologie, analyses GC-MS et dosage
des antioxydants, JAN ; formulation, SMF et SSE-M ; dosage in vitro, LJ ; dosage in vivo : AAE-G. et GMR ;
rédaction – préparation du projet original, JAN, AAE-G., SMF et LJ ; rédaction, révision et édition, JAN, SSE-
M. et LJ ; analyse formelle, AAE-G. et LJ ; visualisation, SMF ; supervision, JAN ; acquisition de financement,
tous les auteurs. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit et acceptent d'être
responsables de tous les aspects du travail en garantissant l'intégrité et l'exactitude.

Financement:Cette recherche n'a reçu aucun financement externe.

Déclaration du comité d’examen institutionnel :L’étude a été menée conformément aux directives de
la Déclaration d’Helsinki et approuvée par les National Institutes of Health (publication NIH, 1996).

Déclaration de consentement éclairé :Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets impliqués dans l’étude.

Déclaration de disponibilité des données :Les données présentées dans cette étude sont disponibles sur demande auprès de
l’auteur correspondant.

Conflits d’intérêts :Nous tenons à confirmer qu’il n’existe aucun conflit d’intérêt connu associé à cette
publication et qu’aucun soutien financier significatif n’a été apporté à ce travail qui aurait pu influencer
son résultat.

Disponibilité des échantillons :Des échantillons du NEG8 sont disponibles auprès des auteurs.
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Abréviations
5-HT : sérotonine ; AMR, résistance aux antimicrobiens ; B1 :Pseudomonas stutzeri; B2:Enterococcus
faecium; B3:Bacillus thuringiensis; ADA : étalon d'adapalène ; BHA, gélose d'infusion cœur-cervelle ; UFC, unité
formant colonie ; DA, dopamine ; DPPH, 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl ; EO, huiles essentielles, ELISA, dosage
immuno-enzymatique ; FOXO-1, protéine Forkhead box O-1 ; FRAP, pouvoir antioxydant réducteur ferrique ; GC-
MS, chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse ; IGF-1, facteur de croissance
analogue à l'insuline 1 ; IL-10, interleukine-10 ; IL-6, interleukine-6 ; IPM, myristate d'isopropyle ; JAK/STAT,
Janus Kinase/transducteur de signal et activateur de la transcription ; JAK2, Janus Kinase 2 ; MBC, concentration
bactéricide minimale ; MIC, concentration minimale inhibitrice ; NEG, préparations de gels nano-émulsionnés ;
NEG8, formule optimisée nano-émulgel ; OD, densité optique ; NE, norépinéphrine ; NF-κB, activateur de chaîne
légère kappa du facteur nucléaire ; P-FOXO1(ser256), Phospho-FoxO1 (Ser256) ;P. acné,Propionibacterium acnes
; PBS, tampon phosphate salin ; PCR, réaction en chaîne par polymérase ; PDI, indice de polydispersité ; PPAR,
récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes ; PPAR, récepteurs activés par les proliférateurs de
peroxysomes ; p(Tyr(1007/1008)) JAK2 : kinase activatrice Janus-2 phosphorylée sur la tyrosine-(1007/1008)) ;
p(tyr705)STAT3 : facteur activateur du transducteur de signal phosphorylé sur la tyrosine 705 ; TLR-2 : récepteur
de type Toll-2 ; RIPA, tampon d'essai de radioimmunoprécipitation ; STAT3, transducteur de signal et activateur
de la transcription 3 ; TEM, microscope électronique à transmission ; TGF-β, facteur de croissance transformant
bêta ; TGF-β1, facteur de croissance transformant bêta 1 ; TLR, récepteurs de type Toll ; Voie Wnt/β-caténine,
voie Wnt canonique ; ZP, potentiel zêta.

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