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Article

Développement et évaluation d'une formulation de

nanoémulsion à base d'huiles essentielles pour le traitement des
infections bactériennes buccales
Niamat Ullah1, Adnan Amin1,*, Arshad Farid2, Samy Sélim3, Cheikh Abdur Rashid4, Mohammed Imran
Aziz1, Sairah Hafeez Kamran5, Muzammil Ahmad Khan2, Nauman Rahim Khan6, Saima Mashal1,2et
Muhammad Mohtasheemul Hasan7

1 Laboratoire de recherche sur les produits naturels, Centre des sciences pharmaceutiques de Gomal, Faculté de
pharmacie, Université de Gomal, Dera Ismail Khan 29050, Pakistan
2 Centre de biochimie et de biotechnologie de Gomal (GCBB), Université de Gomal,
Dera Ismail Khan 29050, Pakistan
3 Département des sciences de laboratoire clinique, Faculté des sciences médicales appliquées, Université Jouf,
Sakaka 72388, Arabie saoudite
4 Laboratoire de recherche sur les nanotransporteurs, Centre des sciences pharmaceutiques de Gomal, Faculté de
pharmacie, Université de Gomal, Dera Ismail Khan 29050, Pakistan
5 Département de pharmacologie, Faculté des sciences paramédicales et pharmaceutiques, Université Lahore
College for Women, Lahore 05422, Pakistan
6 Département de pharmacie, Université des sciences et technologies de Kohat, KUST, Kohat 26000, Pakistan Département
7 de pharmacognosie, Faculté de pharmacie et des sciences pharmaceutiques, Université de Karachi, Karachi 75270,
Pakistan
* Correspondance : [email protected] ; Tél. : +92-966-920904

Abstrait:La prévalence des infections buccales chez les patients diabétiques est un défi de santé en raison de
l'hyperglycémie persistante. Cependant, malgré de grandes inquiétudes, les options de traitement disponibles sont
limitées. Nous avons donc cherché à développer un gel nanoémulsion (NEG) pour les infections bactériennes buccales à
base d'huiles essentielles. Des nanoémulsions à base d'huiles essentielles de clou de girofle et de cannelle ont été
Citation:Ullah, N. ; Amin, A. ; Farid, A. ;
préparées et caractérisées. Divers paramètres physicochimiques de la formulation optimisée, notamment la viscosité
Sélim, S. ; Rashid, SA ; Aziz, Michigan ;
(65311 mPa.·S), tartinabilité (36 g·cm/s) et une force mucoadhésive de 42,87 N/cm2) étaient dans les limites prescrites.
Kamran, SH; Khan, MA; Rahim Khan, N. ;
La teneur en médicament du NEG était de 94,38±1,12 % (cinnamaldéhyde) et 92,96±2,08 % (huile de clou de girofle). Une
Mashal, S. ; et coll.
Développement et évaluation d'une
concentration significative de clou de girofle (73,9 %) et d'huile essentielle de cannelle (71,2 %) a été libérée d'une

formulation de nanoémulsion à base d'huile matrice polymère du NEG jusqu'à 24 h. Le profil de perméation de la muqueuse buccale de chèvre ex vivo a révélé une

essentielle pour le traitement des infections perméation significative (52,7-54,2 %) des principaux constituants qui s'est produite après 24 h. Lorsqu'il a été soumis à
bactériennes buccales.Gels2023,9, 252. des tests antimicrobiens, une inhibition significative a été observée pour plusieurs souches cliniques, à savoir
https://doi.org/10.3390/gels9030252 Staphylococcus aureus(19 mm),Staphylococcus epidermidis(19 mm) etPseudomonas aeruginosa (4 mm), ainsi que
contreBacillus chungangensis(2 mm), alors qu'aucune inhibition n'a été détectée pour Bacillus paramycoideset

Rédacteur académique : Aris Giannakas

Paenibacillus dendritiformislorsque NEG a été utilisé. Antifongique également prometteur (Candida albicans) et des
activités de détection d'antiquorum ont été observées. Il a donc été conclu que la formulation NEG à base d'huile de
Reçu : 19 février 2023
cannelle et de clou de girofle présentait des activités antibactériennes, antifongiques et de détection d'antiquorum
Révisé : 13 mars 2023
significatives.
Accepté : 16 mars 2023
Publié : 21 mars 2023
Mots clés:huile essentielle; nanoemulgel; infection orale; Carbopol 940; détection de quorum

Droits d'auteur :© 2023 par les

auteurs. Licencié MDPI, Bâle, Suisse. 1. Introduction
Cet article est un article en libre accès Le microbiome oral est assez diversifié et comprend plus de 700 espèces microbiennes « principales » et «
distribué selon les termes et
transitoires » différentes, notamment des espèces Gram-positives, Gram-négatives et fongiques [1], qui
conditions de la licence Creative
contribuent de manière significative à la gingivite, à la parodontite, à la carie dentaire, à la stomatite et à la
Commons Attribution (CC BY) (https://
candidose [2]. Cette charge microbienne plus importante est influencée par plusieurs facteurs, notamment
creativecommons.org/licenses/by/
l'hôte, les systèmes de signalisation et les facteurs environnementaux [3]. Plusieurs bactéries,
4.0/).

Gels2023,9, 252. https://doi.org/10.3390/gels9030252 https://www.mdpi.com/journal/gels

Gels2023,9, 252 2 sur 21

les champignons, les virus ou les protozoaires sont responsables de telles infections qui deviennent plus graves en raison du
développement de biofilms [4,5].
La carie dentaire et la maladie parodontale sont des infections buccales courantes qui résultent de
l'accumulation de bactéries à la surface des dents. Parmi les espèces bactériennes les plus responsables
des caries, on trouveStreptocoques mutants, y comprisS.mutansetStreptocoque sobrinusCes bactéries
consomment les sucres présents dans l'alimentation et produisent de l'acide, ce qui abaisse le pH de la
bouche et conduit à la déminéralisation de l'émail des dents, provoquant finalement la carie dentaire [6].

La gingivite est une infection des gencives qui constitue le premier stade de la maladie parodontale. Elle
se caractérise par des saignements gingivaux et des gencives gonflées et est généralement réversible. Si elle
n'est pas traitée correctement et rapidement, elle peut entraîner une parodontite. La parodontite est une
maladie inflammatoire chronique dans laquelle les éléments de soutien des dents, tels que le ligament
parodontal et l'os alvéolaire, sont détruits. Dans la population générale, la parodontite sévère touche 10 à 15 %
de la population [7].
La structure complexe des colonies bactériennes dans la cavité buccale rend difficile le traitement des
infections bactériennes en dentisterie [8]. Les infections buccales sont généralement traitées avec des
antibiotiques, des médicaments antiamibiens et des composés d'ammonium quaternaire. Cependant,
l'utilisation de ces médicaments peut entraîner le développement de résistances et de toxicité en raison de la
pression sélective induite par leur utilisation prolongée [9]. Il existe donc un grand potentiel pour des thérapies
alternatives qui sont sûres, efficaces et faciles à utiliser, telles que les huiles essentielles.
Le potentiel de l’utilisation des huiles essentielles contre les infections microbiennes suscite de plus
en plus d’attention [10]. Les huiles essentielles les plus connues pour maintenir une bonne santé dentaire
comprennent les huiles essentielles de lavande, d'eucalyptus, de menthe poivrée, de clou de girofle et de
cannelle [11], qui sont également étayées par des preuves scientifiques [12]. L'huile de cannelle a été
étudiée pour son action antibactérienne contre les agents pathogènes Gram-positifs et Gram-négatifs.
Elle est principalement récoltée à partir deCannelle de Zeylanicum(FamilleLauracées) [13]. L'huile
essentielle de cannelle est traditionnellement utilisée dans divers remèdes à base de plantes en raison de
diverses activités biologiques, notamment des propriétés anti-inflammatoires, antidiabétiques,
carminatives, antivirales et antihypertensives [14]. Les principaux constituants de l'huile essentielle de
cannelle comprennent le cinnamaldéhyde, le linalol, le β-caryophyllène, l'eucalyptol, le camphre et
l'acétate de cinnamyle [15]. Plusieurs recherches ont montré son efficacité enversStreptococcus mutanset
Lactobacillus casei (caries dentaires),Staphylococcus aureus,C. albicans,C. glabrata,etEnterococcus
faecalis[16]. Une forte action antimicrobienne de l'huile essentielle de cannelle est due à la perturbation
de la membrane cellulaire, ce qui favorise la fuite des composants intracellulaires [17].
L'huile essentielle de clou de girofle est principalement obtenue à partir deSyzygium aromatique(familleMyrtacées
) [18] et la FDA a classé l'huile essentielle de clou de girofle comme étant « généralement considérée comme sûre
» (GRAS) et cette huile essentielle possède plusieurs propriétés telles qu'antioxydante, antioxydante, antifongique, ainsi
qu'antibactérienne [19]. De plus, il a également été prouvé que l'huile de clou de girofle inactive efficacement les
souches bactériennes telles queEscherichia coliO157:H7,Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, et
Staphylococcus aureus[19].
La nanoémulsion est un système d'administration de médicaments conçu avec une stabilité et une
solubilité améliorées [20]. La taille des globules dans la nanoémulsion est de l'ordre du nano et est stabilisée par
le mélange des tensioactifs et des co-tensioactifs [21]. Les globules de taille nanométrique dans la phase
huileuse facilitent normalement l'administration efficace de médicaments ; et par conséquent, la formulation de
nanoémulsion est une approche prometteuse contre les infections buccales [22]. Afin d'améliorer la rétention
dans la cavité buccale et même de permettre la libération prolongée d'un médicament, les gels nanoémulsion
(NEG) sont préparés en ajoutant un agent épaississant ou gélifiant (Carbopol) à une nanoémulsion [23,24]. Les
NEG sont des formulations précieuses car elles offrent une libération prolongée de médicaments et leur nature
mucoadhésive facilite un temps de contact prolongé par rapport à la nanoémulsion [21,24]. Les NEG, qui sont
des émulsions E/H ou H/E, sont combinées à une base de gel pour créer une formulation plus stable, visqueuse
et non grasse [25]. Il s'agit d'une forme posologique préférée pour les médicaments hydrophobes. Ces
formulations possèdent une biodisponibilité améliorée, car elles réduisent la tension superficielle et protègent
le médicament incorporé de la dégradation enzymatique et de l'hydrolyse [26]. De plus, une meilleure
infusibilité, une plus grande efficacité du médicament
Gels2023,9, 252 3 sur 21

La capacité de chargement et la perméabilité font des NEG le système d'administration le plus acceptable pour l'administration
de médicaments dentaires [27].
Les carbopols sont principalement constitués de polymères d'acide acrylique réticulés avec des
éthers polyalcényliques ou du divinyl glycol [28]. La nature non irritante et non toxique des carbapols les
rend largement acceptables pour les applications topiques [29]. Un poids moléculaire élevé limite leur
pénétration dans la peau, et ils sont donc considérés comme de bons substituts aux véhicules à base
d'huile [30]. Sur la base de la prévalence généralisée des infections microbiennes orales et de
l’importance des NEG, ce projet a été conçu pour développer un nanoémulgel muco-adhésif pour le
traitement des infections bactériennes orales.

2. Résultats et discussion
2.1. Valeurs HLB des différents rapports Smix
Les valeurs HLB de différents rapports Smix (tensioactif : cotensioactif) (1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 2:1, 3:1 et
4:1) ont été déterminées et il a été observé que les valeurs HLB augmentaient avec une augmentation de
la concentration du tensioactif tandis qu'une diminution significative des valeurs HLB a été constatée
avec une diminution de la concentration du cotensioactif (tableau1). Le rapport Smix 4:1 a été choisi en
raison de sa valeur HLB élevée (12,86).

Tableau 1.Effet du rapport Smix sur la valeur HLB.

Rapport de mélange Valeurs HLB

1:1 9,65
1:2 7.83
1:3 6.975
1:4 6.44
2:1 11,76
3:1 12.33
4:1 12,86

Il est avantageux que les nanoémulsions huile dans eau aient des valeurs HLB plus élevées [24]. Les
valeurs HLB et la taille des particules dans une émulsion o/w ont une relation inverse : plus la valeur HLB est
élevée, plus la taille des globules de l'émulsion est faible. De plus, les valeurs HLB plus élevées sont utiles pour
produire une nanoparticule uniforme et fine [24]. À mesure que la concentration en huile augmente, la taille des
particules de la nanoémulsion augmente et la concentration des tensioactifs est obligée de suivre la
concentration croissante des gouttelettes d'huile [30]. (Le profil GC-MS de l'huile essentielle de clou de girofle tel
qu'illustré dans la figure S1.)

2.2. Optimisation de la nanoémulsion

L'optimisation de la nanoémulsion a été réalisée en utilisant le pseudo diagramme ternaire.
Dans ce cas, le Smix (Span 80 et Tween 80) a été combiné avec de l'huile d'olive en phase dispersée
et de l'eau distillée a été utilisée comme milieu de dispersion.
La région de nanoémulsion stable d'huile dans l'eau est représentée par la zone ombrée dans la
phase pseudo-ternaire construite (Figure1). Chaque coin du diagramme de phase représente une
concentration de 100 % du constituant.
Gels2023,9, 252 4 sur 21

Figure 1.Diagramme de phase pseudo ternaire.

2.3. Taille des globules, indice de polydispersité et potentiel zêta

Quatre formulations de la nanoémulsion ont été préparées avec différentes concentrations de
phase huileuse. La concentration des tensioactifs a également été minimisée pour la nanoémulsion. La
formulation N1 a montré la plus petite taille de globule (152 nm) par rapport à toutes les formulations
(Tableau2). Étant donné sa taille minimale, la formulation N1 a été sélectionnée comme formulation
optimale.

Tableau 2.Taille des particules, potentiel zêta et indice de polydispersité des quatre formulations de nanoémulsion.

Composition (%
Code F PS (nm) PDI
m/m)
Courant de vapeur (mV)

Huile = 10%
N1 Mix = 2,5%m/m 152±3 − 19.54±2 0,309±0,023
eau = 87,5%m/m
Huile = 15%m/m
N2 Mix = 3%m/m 227±2 − 17±3 0,267±0,032
Eau = 82%m/m
Huile = 20%m/m
N3 Mix = 3,5%m/m 257,6±4 − 14±2 0,279±0,055
Eau = 76,5
Huile = 25%m/m
N4 Mix = 3,5%m/m 325±3 − 12,75±2 0,076±0,098
Eau = 71,5%m/m
PS = taille des particules, ZP = potentiel zêta, PDI = indice de polydispersité.

2.4. Stabilité cinétique

La formulation optimisée a été centrifugée pour vérifier la stabilité cinétique. La formulation est devenue
cinétiquement stable car aucune séparation de phase, aucun crémage et aucune floculation ne se sont produits
après centrifugation à 1 000, 2 000 et 3 000 tr/min.
Gels2023,9, 252 5 sur 21

2.5. Stabilité thermodynamique

Pour évaluer la stabilité thermodynamique, un cycle de chauffage-refroidissement a été effectué sur
l'échantillon d'essai. Il a été observé que le crémage de la nanoémulsion et la séparation des phases se
produisaientf Après trois cycles consécutifs de chauffage-refroidissement, ce qui était une indication claire
d'instabilité thermodynamique. Les nanoémulsions sont thermodynamiquement instables tout en étant
cinétiquement stables, et par conséquent, le crémage et la séparation de phase se produisent lors d'un
stockage à long terme. Le processus de centrifugation est généralement utilisé pour exécuter des conditions de
stress sur des nanoémulsions fraîchement formées afin de déterminer leur stabilité cinétique. Cela est dû au
fait que l'énergie libre de la dispersion colloïdale dans une nanoémulsion est plus élevée que l'énergie libre de
la phase individuelle, ce qui indique que la nanoémulsion [31].

2.6. Optimisation du nano-émulsifiant

Les formulations de nanoémulsifiants ont été optimisées en fonction de la viscosité et de la capacité
d'étalement et il a été observé que la capacité d'étalement du nanoémulsifiant diminuait avec l'augmentation de
la concentration en polymère (tableau3, Chiffre2), alors qu'une augmentation significative de la viscosité du
nanoémulgel a été observée avec une augmentation de la concentration en polymère (tableau3, Chiffre3). La
formulation F1 était moins visqueuse (62 035±10 mPa·S) avec une valeur d'étalement élevée de 38±1, tandis que
les formulations F3 et F4 étaient toutes deux très visqueuses, avec une viscosité de 91 306±15 et 96 432±10 mPa
·S, respectivement, et une très faible aptitude à l'étalement. La formulation F2 a été considérée comme
optimisée en raison de sa viscosité optimale de 65 311±7 mPa·S et étalement de 36±0,5.

Tableau 3.Propriétés physicochimiques du nanoémulgel.

Paramètres F1 F2 F3 F4
Couleur Blanc Blanc Blanc Blanc
Cohérence Bien Bien Bien Bien
Homogénéité Excellent Excellent Excellent Excellent
pH 6.8±1 6.8±0,5 6.8±0,5 6.8±0,5
Viscosité (mPa·S) Capacité 62 035±10 65 311±7 91 306±15 96 432±10
d'étalement (g·cm/s) 38±1 36±0,5 31±2 27±2

40

35

30
Capacité d'étalement (g.cm/sec)

25

20 Capacité d'étalement

15

10

0
0 0,5 1 1,5 2 2.5
Concentration de polymère (% p/p)

Figure 2.Effet de la concentration en polymère sur l'étalement du nanoémulgel.

Les polymères (agents gélifiants) sont utilisés pour maintenir constante la consistance du nanoémulgel.
L'homogénéité physique, la consistance, les qualités bioadhésives, l'indice de gonflement, les études
rhéologiques, la cinétique de libération du médicament, l'extrudabilité et l'étalement sont parmi les paramètres
qui jouent un rôle important dans la détermination de la consistance des formulations de nanoémulgel.
.S)
 Capacité d'étalement (g.cm/sec)
Gels2023,9, 252 6 sur 21

les agents gélifiants étant un facteur clé pour atteindre ces paramètres [32]. La viscosité élevée (30 000 à
50 000 centipoises) du polymère synthétique Carbopol 940 est généralement utilisée pour les
formulations topiques ou transdermiques car elle forme un gel transparent avec de l'eau ou des
structures hydroalcooliques. De même, l'étalement est un aspect crucial pour les préparations destinées
au traitement topique [33]. Nos résultats ont démontré que la formulation améliorée est adaptée à une
application topique et présente des propriétés d'étalement acceptables. Une augmentation de la
concentration de l'agent gélifiant (Carbopol 940) a montré un effet positif sur la viscosité de la
formulation de nanoémulsifiant ; par conséquent, l'étalement de la formulation de nanoémulsifiant a
diminué, car il existe une relation inverse entre la viscosité et l'étalement de la formulation (Figures2et3) [
34].

120000

100000

80000
Viscosité (mPa.S)

60000

Viscosité
40000

20000

0
0 0,5 1 1,5 2 2.5
Concentration de polymère (% p/p)

Figure 3.Effet de la concentration en polymère sur la viscosité du nanoémulgel.

2.7. FTIR
L'analyse FTIR est utilisée pour déterminer la compatibilité médicament-excipient dans les formulations
de nanoémulsifiants. Les pics caractéristiques des huiles essentielles et d'autres excipients, seuls et dans la
formulation optimisée de nanoémulsifiants, se sont avérés correspondre aux groupes fonctionnels
précédemment rapportés de ces constituants. Par exemple, dans le spectre FTIR de l'huile d'olive, les pics se
situent à 2923 cm−1et 2845 cm−1correspondent à l'étirement des OH et des acides gras, tandis qu'un pic à 1744
cm−1représente le groupe ester C=O (Figure4). Dans l'huile de girofle, un pic à 3452 cm−1
représente l'étirement OH et culmine à 1512 cm−1, 1425 cm−1, et 1266 cm−1correspondent au
groupe aromatique C=C et phénolique. Dans l'huile de cannelle, un pic à 3452 cm−1 représente
l'étirement OH, un pic à 1670 cm−1 correspond au groupe C=O, un pic à 1624 cm−1
représente le groupe C=C, un pic à 745 cm−1 correspond au groupe aromatique CH, et un pic à 970
cm−1indique une courbure CH. Dans le spectre FTIR du Carbopol 940, le pic à 2927 cm−1représente
l'étirement du CH2, un 1767 cm−1le pic est associé au groupe COOH, tandis que 1451 cm−1et 1246
cm−1les pics montrent la présence du squelette acrylate (Figure4). Sur la base des données
spectrales FTIR des huiles essentielles ainsi que des excipients, il est confirmé que les pics
caractéristiques des huiles essentielles sont préservés dans les formulations de nanoémulsifiants,
démontrant l'absence de tout type d'interaction entre les constituants de la formulation.
Gels2023,9, 252 7 sur 21

Figure 4.Analyse FTIR des ingrédients actifs, des excipients, du nanoémulgel vierge et de la formulation de
nanoémulgel chargée d'huile essentielle.

2.8. Analyse du contenu des médicaments

Des études d'analyse du contenu en médicaments ont révélé que la teneur en huile essentielle de la formulation
optimisée de nanoémulsifiant pour l'huile de cannelle et l'huile de clou de girofle était de 94,38±1,12% et 92,96±2,08 %,
respectivement.

2.9. Efficacité de piégeage de la nanoémulsion et du nanoémulgel

L'efficacité moyenne de piégeage du cinnamaldéhyde dans le nanoémulgel était
95,78 %, alors que dans le cas de l’huile de clou de girofle, ce chiffre était de 96,45 %.

L'efficacité de l'encapsulation et l'homogénéité du système sont influencées par la solubilité du

médicament dans la phase huileuse requise, ainsi que par sa compatibilité avec d'autres ingrédients. Un
élément important qui affecte grandement l'encapsulation du médicament est l'insolubilité des composés
chimiques étudiés, qui peuvent être stabilisés en utilisant des tensioactifs et des co-tensioactifs. Cela pourrait
être dû à une teneur plus élevée en tensioactifs dans la nanoémulsion et le nanoémulgel, ce qui peut conduire à
une taille de particules plus petite et à une réduction de l'encapsulation du médicament [35]. De plus, dans notre
cas, la répartition des médicaments a amélioré la solubilité des principes actifs de la phase huileuse à la phase
aqueuse, ce qui a réduit la viscosité de la formulation et amélioré la phase de diffusion lors de l'auto-
assemblage. Cela a fourni une explication claire du record antérieur de la formulation d'efficacité de piégeage
des principes actifs plus faible [36].

2.10. Profil de libération du médicament de Nanoemulgel

Le profil de libération in vitro du médicament du nanoemulgel a été réalisé à l'aide d'une cellule de diffusion
Franz. La libération du médicament en pourcentage a été tracée en fonction du temps expérimental (Figure5). Le
nanoémulsifiant chargé d'huile essentielle a présenté une libération prolongée du médicament puisque l'huile
essentielle était encapsulée dans la partie lipidique du nanoémulsifiant. La formulation à base d'huile essentielle de clou
de girofle a présenté une libération significative (73,9 %) dans les 24 heures, tandis qu'un profil de libération presque
similaire a été enregistré dans le cas de la formulation à base d'huile de cannelle (71,2 %) (Figure5). Dans le cas des
huiles essentielles pures à 100%, la libération a été observée dans les 2 h.
L'efficacité thérapeutique de tout médicament dépend de la libération du médicament à partir de la
formulation pharmaceutique [37]. La libération du médicament à partir de la formulation pharmaceutique
topique dépend de nombreux facteurs tels que la viscosité, la concentration en tensioactifs, le polymère et la
concentration en médicament [38]. Une libération retardée de l'huile essentielle de la formulation optimisée de
nanoémulsifiant pourrait éventuellement être due au fait qu'un polymère a été incorporé
Gels2023,9, 252 8 sur 21

dans la nanoémulsion déjà préparée. Cela augmente la viscosité et la structure devient plus complexe. Le
poids moléculaire élevé du polymère synthétique Carbopol 940 entraîne la formation d'une formulation
visqueuse, provoquant un retard dans le profil de libération des médicaments à partir de préparations
topiques telles que le nanoemulgel [32]. De plus, il a été rapporté précédemment qu'Emulgel agit comme
un réservoir pour le médicament, qui libère le médicament initialement de la phase interne vers la phase
externe, puis dans le site de la peau [39]. Dans le nanoemulgel, les gouttelettes d'huile sont initialement
libérées dans la matrice de gel puis pénètrent directement dans la couche sous-cutanée de la peau,
évitant ainsi la nécessité de passer par un transfert de phase hydrophile dans la nanoémulsion [40].

100

90

80

70
% cumulé de libération de médicament

60

50 Huile de clou de girofle (NEG)

40 Huile de cannelle
(NÉG)
30 Huile de clou de girofle pure

20 Cannelle pure
huile

10

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Durée (h)

5 libération d'huile essentielle de cinnamaldéhyde et d'huile essentielle de clou de girofle à partir du

Chiffre .La
Formulation de nanoémulsifiant.

2.11. Mécanisme de libération du médicament à partir du nano-émulsion chargé d'huile essentielle

Différents modèles cinétiques, tels que les modèles d'ordre zéro, de premier ordre, de Higuchi, de Hixson-
Crowell et de Korsmeyer-Peppas ont été utilisés pour établir le mécanisme de libération du médicament à partir
du nanoémulgel. Il a été observé que notre formulation suivait le modèle de Korsmeyer-Peppas avec un R2
valeur de 0,99. Il a été conclu que la libération du médicament à partir de la formulation produite était contrôlée
par diffusion (tableau4).

Tableau 4.Modèles cinétiques utilisés pour les études mécanistiques du nanoémulgel.

Korsmeyer-Peppas
Ordre zéro Premier ordre Modèle Higuchi
Formulation Actif Modèle N Modèle le mieux adapté

R2 R2 R2 R2
Cinnamon 0,9539 0,9641 0,9709 0,9904 0,507
Nanoémulsifiant Modèles Korsmeyer-Peppas
Eugène 0,9515 0,9719 0,9701 0,9905 0,522

Cinn = aldéhyde benzoïque, Eug = eugénol.

2.12. Perméation de la muqueuse buccale du nanoémulgel préparé

Une perméation modérée de l'huile essentielle de cannelle (54,21 %) et de clou de girofle (52,75 %) a été
observée dans le cas de la nanoémulsion. Dans l'ensemble, une perméation retardée a été observée pour
l'huile essentielle dans le nanoemulgel, qui était contraire à la nanoémulsion. Médicament pur (100%)
la perméation a été obtenue en 4 h (Figure6).
Gels2023,9, 252 9 sur 21

100
90
80
70

% de pénétration du médicament
60
50
40 Huile de clou de girofle (NEG)

30 Huile de cannelle (NEG)

20 Huile de clou de girofle pure

10 Huile de cannelle pure

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Durée (h)

Figure 6.Perméation de la muqueuse buccale de chèvre de l'huile essentielle issue d'une formulation nanoémulgel optimisée.

2.13. Test mucoadhésif

Le polymère hydrophile Carbopol 940 (utilisé comme agent gélifiant) possède également des propriétés
Force mucoadhésive. La force mucoadhésive du nanoémulgel a été calculée en utilisant une
méthode d'équilibre modifiée. Il a été observé que la formulation de nanoémulgel préparée a
une très bonne force mucoadhésive de 42,87 N/cm2.
La mucoadhésion est essentielle pour délivrer la concentration de médicament requise à la
muqueuse malade, car la formulation préparée reste intacte sur la zone affectée pendant plus longtemps
en raison de ses propriétés adhésives. Cela permet donc un temps de contact maximal pour que la
formulation libère le médicament. Les polymères hydrophiles possèdent de fortes caractéristiques de
mucoadhésion en raison du fait qu'ils peuvent former une interaction de liaison hydrogène avec la
mucine [41]. La mucoadhésion est une propriété clé des polymères hydrophiles [42].

2.14. Test d'irritation cutanée

Une formulation de nano-émulsion chargée d'huile essentielle et de formol (témoin positif) ont été appliquées sur
des rats. Les rats ont été observés pour détecter tout signe d'irritation cutanée tel qu'un érythème cutané et la
formation d'œdème. Le système de notation de l'irritation cutanée de Draize a été utilisé pour évaluer l'irritation
cutanée et, comme indiqué précédemment, si le score était de un ou inférieur à un, alors aucun signe d'irritation n'a été
démontré ou que des signes négligeables d'irritation cutanée ont été observés. Le score d'irritation cutanée du nano-
émulsion chargé d'huile essentielle était < 1 et il n'y avait aucun signe significatif d'irritation cutanée. L'absence
d'irritation dans la formulation testée peut être attribuée au fait que les huiles essentielles étaient encapsulées dans de
l'huile d'olive et du polymère non irritant Carbopol 940 [43]. De même, la formulation de nanoemulgel préparée a
également été appliquée sur la muqueuse buccale de la chèvre et aucun signe d'irritation de la muqueuse n'a été
observé (tableau5).

Tableau 5.Il en résulte une irritation de la muqueuse buccale et de la peau des chèvres.

Érythème Œdème
Formulation
0h 24 h 48 h 0h 24 h 48 h
Contrôle positif 0,00 3.7 2,80 0,00 1,69 2.13
NÉG 0,00 0,30 0,00 0,00 0,00 0,00
Contrôle négatif 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
NEG = Nanoemulgel, contrôle positif = formol, contrôle négatif = formulation vierge.
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2.15. Évaluation biologique du nanoémulgel

2.15.1. Activité antimicrobienne
La formulation optimisée de nano-émulsion (chargée de 3 % et 1,5 % d'huile essentielle) a été testée pour
son efficacité antibactérienne contre des souches bactériennes orales isolées. La formulation de nano-émulsion
chargée d'huile essentielle s'est avérée avoir une zone d'inhibition très distincte lorsqu'elle était utilisée contre
les souches bactériennes isolées (tableau6). L'activité antibactérienne du NEG chargé d'huile essentielle a
également été vérifiée par rapport à d'autres souches bactériennesP. aeruginosa(4±1 mm) et Bacillus
chungangensis(2±1 mm), alors qu'aucune activité n'a été observée contreBacillus paramycoides etPaenibacillus
dendritiformis. De plus, il a été constaté que l'activité antibactérienne du nano-émulsifiant chargé d'huile
essentielle contre les souches bactériennes orales augmentait à mesure que la concentration de l'huile
essentielle augmentait de 1,5 à 3 %.m/m, et la zone d'inhibition a augmenté de 6 à 19 mm dans les deux
souches bactériennes orales (informations supplémentaires (figures S2 et S3). De même, une inhibition
significative deStaphylococcus aureusetS. épidermidisa également été enregistré (tableau6). Les huiles
essentielles de cannelle et de clou de girofle étaient autrefois utilisées contreEscherichia colietK. pneumoniae
avec différentes concentrations. Il a été constaté que ces huiles essentielles étaient potentiellement actives et
que la zone d'inhibition augmentait avec l'augmentation de la concentration en huile essentielle [44]. Le
nanoémulgel chargé d'huile essentielle a également inhibéCandida albicans(6±1 mm). Il a été rapporté
précédemment que la nature hydrophobe des huiles essentielles peut conduire à la détérioration de la
membrane et augmenter la perméabilité de la membrane chez les bactéries [45].

Tableau 6.Propriétés antimicrobiennes du nanoémulgel chargé d'huile essentielle.

Code F Concentration (%) Souche Zone d'inhibition (mm)

1ÉNERGIE 3 S. épidermidis 19±1
ÉNERGIE 3 Staphylococcus aureus 19±0,5
ÉNERGIE 1,5 S. épidermidis 6±1
ÉNERGIE 1,5 Staphylococcus aureus 6±1
ÉNERGIE 3 Pseudomonas aeruginosa 4±1
ÉNERGIE 3 Bacillus chungangensis 0
ÉNERGIE 3 Bacillus paramycoides 0
ÉNERGIE 3 Bacillus chungangensis 2±1
ÉNERGIE 3 Paenibacillus dendritiformis 0
ÉNERGIE 3 Candida albicans 6±1
1Nanoémulsifiant d'huile essentielle.

2.15.2. Activité de détection d'Antiquorum

La détection d'antiquorum du nanoémulgel préparé a été réalisée contre
Chromobacterium voilaceum(souche biomarqueur) et des résultats significatifs ont été
enregistrés (20±1 mm) (Table7, Matériel supplémentaire (Figure S5).

Tableau 7.Activité de détection d'antiquorum d'émulsion chargée d'huile essentielle et d'émulgel.

Formulation Souche Zone d'inhibition (mm)

1ÉNERGIE 3CV 20±1
2NÉG CV 0
1Nanoémulsion d'huile essentielle,2Nanoémulsifiant,3Chromobacterium violaceum.

2.16. Microscopie électronique à balayage du nano-émulgel chargé en éléments essentiels

L'analyse au microscope électronique à balayage fournit des informations morphologiques sur la

formulation. Les images SEM ont confirmé que les globules des nanoémulsions sont répartis
uniformément dans la base de gel polymère de l'émulgel et présentent une forme sphérique bien
définie. De plus, la nature poreuse du gel Carbopol a intégré les globules de nanoémulsion formant une
barrière de couche de gel qui facilite une libération retardée du médicament. La forme sphérique des
globules est bénéfique en raison de leur capacité à se comprimer facilement pour pénétrer à travers les
pores microscopiques de la peau (Figure7).
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Figure 7.SEM du nanoemulgel chargé d'huile essentielle (EHT = 20,00 Kv, Signal A C2DX, WD 7,5 à 9 mm,
résolution (UN) = 2,01 kx, (B) = 5,03 KX, (C) = 249 KX, (D) = 25 KX).

2.17. Stabilité cinétique et thermodynamique du nanoémulgel

La formulation optimisée de nanoémulsifiant a été caractérisée pour déterminer son pH, son
homogénéité et sa couleur. Aucun changement significatif n'a été observé dans les propriétés
organoleptiques de la formulation optimisée de nanoémulsifiant, et elle est restée homogène pendant 3
mois à 25◦C comme indiqué dans le tableau8. De plus, à une température de 8◦C et 25◦C, aucun
changement de couleur de la formulation n'a été constaté (tableaux8et9). De même, aucun changement
dans le pH de la formulation optimisée stockée à diverses températures n'a été enregistré. La
formulation nanoemulgel est restée homogène à 8◦C, et un léger changement dans la capacité
d'étalement et la viscosité de la formulation a été enregistré. La formulation de nanoémulgel était
cinétiquement stable (tableau9) m et est resté stable à 48◦C; cependant, la capacité d'étalement du
nanoémulgel a augmenté et la viscosité a diminué, suivie d'un changement de couleur de la formulation
(du blanc au brun foncé) (Tableau10).

Tableau 8.Stabilité du nanoemulgel à température ambiante (25◦C).

Faible Homogénéité pH Capacité d'étalement Viscosité (mPa·S) Centrifugation Couleur

0 Homogène 6.8±0,1 37±0,5 65311±5 Écurie Blanc

3ème Homogène 6.8±0,1 37±0,3 65612±8 Écurie Blanc
6ème Homogène 6.8±0,1 37±0,5 65730±10 Écurie Blanc
9ème Homogène 6.8±0,1 37±0,1 65921±5 Écurie Blanc
12ème Homogène 6.8±0,1 37±0,1 65992±8 Écurie Blanc

Tableau 9.Stabilité du nanoemulgel à 8◦C.

Faible Homogénéité pH Capacité d'étalement Viscosité (mPa·S) Centrifugation Couleur

0 Homogène 6.8±0,1 37±0,5 65 311±10 Écurie Blanc

3ème Homogène 6.8±0,1 37±0,1 66 943±6 Écurie Blanc
6ème Homogène 6.8±0,1 36±0,2 69 211±7 Écurie Blanc
9ème Homogène 6.8±0,1 33±0,3 71 388±9 Écurie Blanc
12ème Homogène 6.8±0,1 30±0,5 75 218±5 Écurie Blanc
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Tableau 10.Stabilité du nanoemulgel à 48◦C.

Viscosité
Faible Homogénéité pH Capacité d'étalement Centrifugation Couleur
(mPa·S)

0 Homogène 6.8±0,1 37±0,5 65 311±11 Écurie Blanc

3ème Homogène 6.8±0,1 37±0,8 62 230±8 Écurie Blanc cassé
6ème Hétérogène 6.8±0,1 38±1 58 963±9 Instable Brun foncé
9ème Hétérogène 6.8±0,1 40±0,5 55 871±5 Instable Brun foncé
12ème Hétérogène 6.8±0,1 41±0,9 48 222±9 Instable Brun foncé

La viscosité des formulations pharmaceutiques est un facteur crucial car la libération des
médicaments et la consistance des formes posologiques semi-solides en dépendent [46]. Nous avons
observé que la viscosité du nanoémulgel diminuait avec l'augmentation de la température de 8◦C à 48◦C.
De plus, une augmentation de la température a conduit à une augmentation de la capacité d'étalement
de la formulation, à mesure que la viscosité diminuait. Cela est dû à la relation inverse entre la viscosité
et la capacité d'étalement du nanoémulgel. La viscosité de la formulation semi-solide a diminué avec
l'augmentation de la température [47]. Ainsi, la température ambiante (25◦C) a été considéré comme le
stockage le plus approprié du gel nanoémulsion. L'augmentation de la température s'est avérée
augmenter la capacité d'étalement de la formulation préparée, ce qui pourrait être avantageux pour le
patient, en particulier dans la cavité buccale où la température est supérieure à la température
ambiante. Cette amélioration de la capacité d'étalement peut faciliter l'application de la formulation. En
ce qui concerne la stabilité physique, la stabilité de la formulation dure 3 mois et aucune séparation de
phase ne s'est produite après centrifugation à 1000 tr/min, 2500 tr/min et 3000 tr/min pendant 15
(tableaux8–10).

3. Conclusions
Ces dernières années, l'intérêt pour le développement de méthodes efficaces d'administration d'huiles
essentielles avant leur incorporation dans différentes formes de médicaments s'est accru. En particulier,
l'utilisation d'huiles essentielles comme sources potentielles d'agents antimicrobiens pour des applications dans
les traitements, la conservation des aliments et l'emballage a suscité une attention considérable. Les
applications commerciales des huiles essentielles étaient limitées en raison de problèmes tels qu'une faible
solubilité, la toxicité des solvants, la volatilité et un goût organoleptique prononcé. Pour le développement de
nanosystèmes antimicrobiens à base d'huiles essentielles, les nanoémulsions sont une bonne option en raison
de leur biocompatibilité, de leur biodégradabilité, de leur non-toxicité et de leur sélectivité de cible. Grâce à
l'encapsulation et à la libération retardée de la formulation optimisée de nanoémulsion huile dans eau, les
produits à base d'huile essentielle de cannelle et de clou de girofle ont démontré des activités antibactériennes
et de détection d'antiquorum prometteuses. En raison de ses propriétés mucoadhésives et de son profil de
libération retardée, il a été conclu que la conversion de la nanoémulsion en nanoémulsion serait plus
avantageuse en raison d'une libération prolongée et d'un temps de contact amélioré en raison de la nature
mucoadhésive.

4. Matériel et méthodes
4.1. Produits chimiques et souches bactériennes

La cannelle et le clou de girofle ont été achetés sur un marché local et authentifiés par un taxonomiste
nommé DI Khan à l'Institut des sciences biologiques (IBS) de l'université de Gomal. L'isolement de l'huile
essentielle a été réalisé à l'aide d'un appareil Clevenger. L'huile d'olive, le Carbopol 940 et la triéthanolamine ont
été achetés auprès de Sigma Aldrich, St. Louis, MI, États-Unis. Les milieux de croissance bactérienne utilisés
comprenaient du bouillon tryptique de soja (Hi Media, Mumbai, Inde), de la gélose nutritive (Oxoid, Hampshire,
Royaume-Uni) et du bouillon Luria-Bertani (LB) (Oxoid, Hampshire, Royaume-Uni). Les souches bactériennes ont
été isolées à partir de plaques dentaires de patientes diabétiques avec leur consentement éclairé. L'approbation
éthique de l'étude a été obtenue auprès du comité d'éthique de l'université de Gomal, au Pakistan (approbation
n° 335/ERB/GU) conformément à la déclaration de la WMA d'Helsinki et aux directives ARRIVE pour les animaux.
Les souches bactériennes ont été isolées à partir de plaques dentaires de patientes diabétiques avec leur
consentement éclairé et des méthodes microbiologiques standard ont été utilisées pour isoler et purifier les
bactéries. La méthode de l'agar rouge Congo a été utilisée pour vérifier l'existence d'une production de biofilm.
Extraction d'ADN génomique à partir de bactéries, gel d'agarose
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L'électrophorèse et la PCR ont été réalisées, suivies du séquençage du gène de l'ARNr 16S, qui a été
réalisé dans la National Culture Collection of Pakistan (NCCP). L'alignement des gènes a été réalisé pour
une correspondance exacte avec la base de données nucléotidique NCBI à l'aide de nBLAST. Les souches
ont été identifiées commeStaphylococcus epidermidis,Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,
Bacillus chungangensis,Bacillus paramycoidesetPaenibacillus dendritiformis(Spécimen déposé dans la
banque de culture du Pakistan).Chromobacterium violaceum(Le DSM 30191 a été acheté auprès de
DSMZ, Braunschweig, Allemagne.

4.2. Extraction d'huiles essentielles

Les huiles essentielles (cannelle et clou de girofle) ont été extraites en laboratoire par une méthode d'hydrodistillation. Des
informations détaillées sur l'analyse des composants ont été enregistrées (documents supplémentaires).

4.3. Détermination des valeurs HLB

L'équilibre hydrophile-lipophile (HLB) a été utilisé pour calculer la quantité de tensioactifs
nécessaire pour qu'une huile reste en solution. La valeur HLB indique le rapport optimal de tensioactifs
nécessaire pour former une émulsion stable, qu'il s'agisse d'une émulsion de type huile dans eau (o/w)
ou eau dans huile (e/h). L'équilibre hydrophile-lipophile requis pour une émulsion stable peut être calculé
à l'aide de l'équation [48], comme indiqué dans le tableau11.

HLB = (Wa×HLBa) + (Wb×HLBb)/Wa + Wb (1)

où, Wa représente la quantité (poids) du premier émulsifiant, Wb montre la quantité (poids)

du 2ème émulsifiant, et HLBa et HLBb représentent l'équilibre lipophile hydrophile des
émulsifiants a et b, respectivement.

Tableau 11.L'application des tensioactifs dépend de la valeur HLB.

HLB Application
4–6 sans émulsifiant
7–9 Agents mouillants
8–18 o/w émulsifiant
13–15 Détergent
10–18 Solubilise

4.4. Diagramme de phase pseudo-ternaire

En utilisant un protocole standard [49], un diagramme de phase pseudo-ternaire a été construit pour
analyser le comportement de phase des différents composants de la formulation. En bref, 100 ml d'un mélange
4:1 de tensioactif (Tween 80) et de co-tensioactif (Span 80) (Smix) ont été préparés, et 16 combinaisons
différentes d'huile (huile d'olive) et de Smix ont été réalisées dans des rapports volumiques uniques allant de 1:9
à 9:1 (1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1). Le mélange de Smix et d'huile
d'olive a été titré par rapport à de l'eau distillée. Une inspection visuelle a été réalisée après chaque ajout de 5 %
de phase aqueuse au mélange d'huile et de Smix, et les résultats ont été enregistrés. Enfin, les données ont été
enregistrées après que les fractions d'eau, d'huile et de Smix ont été sélectionnées et conçues sur un
diagramme de phase avec un axe caractérisant la phase aqueuse, l'autre représentant la phase huileuse et le
troisième représentant le Smix. Sur la base des points successifs, des formulations distinctes ont été
sélectionnées à partir de chaque diagramme de phase produit pour différents rapports Smix. La phase huileuse
a été sélectionnée dans une concentration telle qu'elle dissout facilement les 3 % d'huile essentielle qui ont été
utilisés comme ingrédient actif. La concentration d'huile du diagramme de phase a été choisie comme le
nombre de cinq (5 %, 10 %, 15 % et 20 %) et la concentration la plus faible de tensioactif a été prise pour la
préparation de la nanoémulsion.

4.5. Préparation de la nanoémulsion

La préparation des nanoémulsions chargées d'huiles essentielles impliquait le mélange de 3 % p/p d'huile
essentielle avec 5 %, 10 %, 15 % et 20 % d'huile d'olive à l'aide d'un mélangeur vortex et des rapports Smix
appropriés. De l'eau a ensuite été ajoutée et mélangée jusqu'à l'obtention d'une émulsion stable [50].
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4.6. Taille des globules

Le Zetasizer 1000 HS (Malvern instrument, Worcestershire, Royaume-Uni) a été utilisé pour déterminer la
taille des globules de la formulation de nanoémulsion préparée [51]. La diffusion de la lumière a été observée à
25◦C à un angle de diffusion de 90◦.

4.7. Stabilité de la nanoémulsion

4.7.1. Stabilité cinétique
La stabilité cinétique de la formulation a été déterminée à l'aide de la méthode de centrifugation [
52]. La centrifugation des échantillons a été réalisée à 1000, 2000 et 3000 tr/min pendant 15 min à
température ambiante (25◦C). L'apparence de l'émulsion et la séparation de phase avant et après le cycle
de centrifugation ont été enregistrées pour mesurer la stabilité cinétique de la formulation.

4.7.2. Stabilité thermodynamique

La stabilité thermodynamique de la nanoémulsion a été déterminée en utilisant un cycle de refroidissement/
chauffage [53]. Brièvement, les échantillons ont été conservés à 4◦C pendant 48 h puis transféré à 48◦C pendant 48 h. La
nanoémulsion a ensuite été examinée pour détecter d'éventuels changements, tels qu'une séparation de phase.

4.8. Préparation du nanoémulsifiant

Les principales étapes suivantes ont été utilisées lors de la préparation du nanoémulgel [29].

4.8.1. Préparation du gel

Pour créer la base du gel, différentes concentrations (0,5 %, 1 %, 1,5 % et 2 %) de l'agent gélifiant
Carbopol 940 ont été mélangées à de l'eau distillée et agitées en continu jusqu'à ce que l'agent gélifiant
soit complètement dissous à température ambiante (25◦C). L'utilisation de différentes concentrations
d'agent gélifiant a été explorée pour étudier leur influence sur la viscosité et l'étalement.

4.8.2. Incorporation du gel préparé dans une nanoémulsion déjà préparée

La nanoémulsion préparée a été ajoutée goutte à goutte dans le gel préparé et agitée
pendant environ 20 minutes à température ambiante (25◦C) pour le transformer en émulgel. Enfin,
le pH de l'émulgel a été ajusté en fonction du pH de la cavité buccale.

4.9. Optimisation de la formulation du nano-émulsifiant

La formulation du Nanoemulgel a été optimisée en fonction de la viscosité, de la capacité d'étalement et
de la concentration de l'agent gélifiant. Afin d'optimiser la formulation, quatre formulations différentes ont été
préparées avec différentes concentrations d'agent gélifiant (0,5, 1, 1,5 et 2 %) (tableau12).

Tableau 12.Composition des quatre formulations de nanoemulgel.

Ingrédients (%m/m) F1 F2 F3 F4
Huile essentielle (%m/m) 1,5 1,5 1,5 1,5
Carbopol 940 (%m/m) 0,5 1 1,5 2
Méthyl parabène 0,01 0,01 0,01 0,01
Propyl paraben 0,05 0,05 0,05 0,05
Triéthanolamine qs qs qs qs
Eau distillée qs qs qs qs

4.10. Caractérisation du nanoémulgel

4.10.1. Analyse FTIR
Une analyse FTIR a été réalisée dans le but de voir toute incompatibilité entre les excipients et les
composants actifs de la formulation comme décrit précédemment [30]. L'analyse FTIR de l'huile d'olive,
de l'huile essentielle de cannelle et du Carbopol 940 a été réalisée dans des formulations chargées et non
chargées de nanoémulgel.
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4.10.2. Viscosité
La viscosité de toutes les formulations a été déterminée à l'aide de la procédure standard [53
]. Le viscosimètre Brookfield n° 4 a été utilisé pour déterminer la viscosité du nanoemulgel à 25±2◦
C et 6 tours (numérique, Labtronics, Panchkula, Inde).

4.10.3. Apparence physique

Toutes les formulations de nanoémulsifiants préparées ont été observées visuellement pour leur couleur, leur
homogénéité, leur consistance et leur séparation de phase [54]

4.10.4. Détermination du pH
Le pH des formulations de nanoémulsifiants a été déterminé à l'aide de la méthode décrite
précédemment [54]. Le pH a été déterminé à l'aide d'un pH-mètre en plaçant la pointe de l'électrode
dans l'émulgel sans dilution jusqu'à 2 minutes et le résultat a été enregistré.

4.10.5. Étalement
Une méthode modifiée a été adoptée pour déterminer l'étalement des formulations [55]. En bref,
deux lames de verre (7,5 cm de longueur et 2,5 cm de largeur) ont été utilisées, l'une était fixée à la
planche de bois et l'autre était mobile, avec un fil passant dans une poulie et tenant un poids. Ensuite, la
formulation a été prise en sandwich entre les deux plaques. Un poids de 100 g a été placé sur la lame
supérieure pendant 1 à 2 minutes pour libérer l'air emprisonné entre les lames et créer une couche
homogène de la formulation. Plus tard, le poids (100 g) a été retiré et un poids de 30 g a été placé sur la
poulie pour appliquer une traction sur la lame supérieure. Les résultats ont été enregistrés en secondes
et exprimés comme le temps qu'il fallait à une lame mobile pour se déplacer sur une distance
prédéterminée (6,5 cm). La capacité d'étalement a été calculée à l'aide de la formule suivante :

S = M×L/T (2)

où M est le poids attaché à la lame supérieure, L est la longueur des lames de verre et T est le
temps nécessaire pour séparer les lames.

4.10.6. Microscopie électronique à balayage du nanoémulsifiant

La taille et la morphologie de surface de la phase huileuse interne du nanoémulgel ont été déterminées à
l'aide d'un microscope électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM LEO 1525 ZEISS) avec des tensions
électroniques élevées de 5 et 15 kV. Pour capturer les images, le matériau a été placé sur des plots avec du
ruban adhésif double face en carbone et recouvert d'une couche de chrome de 8 nm. Les images SEM ont été
prises à des grossissements de 1,00 KX à l'aide de détecteurs d'électrons secondaires (SE) et de détecteurs
intégrés à la lentille. Le logiciel Image J a été utilisé pour calculer la distribution de taille moyenne des
gouttelettes sur la base des images SEM. [56].

4.10.7. Test de muco-adhérence

Les propriétés mucoadhésives du nanoemulgel ont été déterminées selon une méthode
précédemment décrite [57]. En bref, la muqueuse buccale de chèvre a été obtenue à l'abattoir
local, placée dans un tampon phosphate (pH 6,8) et immédiatement transférée au laboratoire.
Après cela, un plateau de la balance a été retiré et un flacon a été fixé de manière à ce qu'un
morceau de la muqueuse buccale soit fixé sur le flacon, tandis que l'autre morceau de la muqueuse
buccale était fixé à un autre flacon fixé sur la surface de la table. Le nanoémulgel a été pris en
sandwich entre les deux flacons et pressé pour éliminer tout air entre les flacons. Ensuite, un poids
a été ajouté à l'autre plateau de la balance jusqu'à ce que les deux flacons se détachent l'un de
l'autre. Le poids sur lequel le détachement des flacons s'est produit a été enregistré et la force
muco-adhésive du nanoémulgel a été déterminée par la formule suivante [58].
()
poids (grammes)×Accélération gravitationnellem
m2
Force mucoadhésive = (3)
Surface de l'ouverture du flacon (cm2)
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Le poids a été appliqué sur la casserole pour détacher la casserole ; l'accélération gravitationnelle est de 9,8 m/s2.

4.10.8. Analyse du contenu des médicaments

Une approche spectrophotométrique (UV-Vis) [55] a été utilisé pour calculer les teneurs en huile
essentielle. Après dilution avec de l'éthanol (1:1000), homogénéisation dans un bain à ultrasons et mesure à 230
nm pour l'huile essentielle de clou de girofle (eugénol) [59] et 290 nm pour l'huile essentielle de cannelle, des
formulations de nanoémulsifiants ont été utilisées (cinnamaldéhyde) [60]. À partir de la courbe standard, la
teneur en huile essentielle a été calculée.

4.10.9. Efficacité d'encapsulation de la nanoémulsion

L'efficacité de l'encapsulation du nanoémulgel a été évaluée à l'aide de l'approche
précédemment rapportée avec une modification mineure [61]. Elle a été calculée en
comparant l'huile essentielle libre quantifiable à la quantité initiale d'huile ajoutée à la
formulation. L'efficacité d'encapsulation a été calculée à l'aide des éléments suivants :

EE(%) = [(conc. initiale d'EO−EO libre)/conc. initiale en EO]×100 (4)

où EE = efficacité d'encapsulation, EO = huile essentielle.

4.10.10. Profil de libération du médicament

Le profil de libération a été déterminé à l'aide d'une cellule de diffusion Franz (Permegear, modèle
4G01-00-05-05) [62] équipé d'un compartiment accepteur d'une capacité de 7 mL et d'une surface de diffusion
de 0,2 cm2a été utilisé pour l'enquête sur la libération. Au départ, des membranes de cellulose (14 kDa,
membrane de cellulose pour tube de dialyse (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, États-Unis) ont été trempées dans du
liquide récepteur pendant 24 h à 37±1◦C, suivi d'un placement dans les compartiments donneur et récepteur.
Pour imiter les conditions physiologiques, une solution tampon de phosphate (pH 6,8) a été utilisée et des
échantillons ont été obtenus à intervalles réguliers (0,5, 1, 1,5, 2, 4, 8, 12, 16 et 24 h). Les échantillons collectés
ont été analysés pour le cinnamaldéhyde à l'aide d'un spectroscope UV réglé à 230 nm pour l'eugénol [59] et 290
nm pour le cinnamaldéhyde [60]. La quantité cumulée d'huile essentielle libérée en fonction du temps a été
tracée pour quantifier la libération d'huile de clou de girofle et d'huile de cannelle à travers la membrane. Une
procédure similaire a été répétée avec des huiles essentielles pures.

4.10.11. Perméation ex vivo

Une étude de perméation ex vivo a été réalisée en utilisant la muqueuse buccale de chèvre [63]. La
muqueuse buccale a été obtenue à partir d'une chèvre et placée dans un tampon phosphate à pH 6,8. La
membrane muqueuse buccale a été séparée des tissus sous-jacents à l'aide de lames chirurgicales
tranchantes par un médecin vétérinaire agréé. La membrane buccale a été placée entre les
compartiments donneur et accepteur de la cellule de diffusion de Franz. Un total de 0,5 g d'émulgel a été
placé dans le compartiment donneur et la cellule de diffusion de Franz a été maintenue à 37±1◦C. Le
compartiment accepteur a été rempli de tampon phosphate pH 6,8 et l'échantillonnage a été effectué à
différents intervalles de temps (0,5, 1, 1,5, 2, 4, 8, 12, 16 et 24 h). La concentration d'huile essentielle
perméable a été analysée à l'aide d'un spectrophotomètre à 290 nm pour la cannelle et à 230 nm pour
l'huile de clou de girofle.

4.10.12. Test d'irritation des muqueuses et de la peau

Un test d'irritation cutanée a été réalisé en utilisant le protocole décrit précédemment [64]. En bref, les
rats Wister (200–250 g) ont été divisés en trois groupes. A 0,8%v/vUne solution aqueuse de formol a été utilisée
comme témoin positif, tandis qu'une formulation de nanoémulsifiant vierge a été utilisée comme témoin
négatif. Le groupe 1 était le témoin positif (groupe formol), le groupe 2 était le témoin négatif (groupe de
formulation de nanoémulsifiant vierge), tandis que le groupe 3 était le groupe test (groupe de formulation de
nanoémulsifiant chargé d'huile essentielle). Les rats Wister ont été soumis à un test d'irritation cutanée en
utilisant la méthode de notation de Draize (tableau13) [65,66]. De plus, la formulation de nano-émulsion
chargée d'huile essentielle a été appliquée sur la muqueuse buccale de chèvre pour vérifier l'irritation de la
muqueuse. Les animaux ont été contrôlés pour détecter tout signe d'érythème et d'œdème après le retrait de
l'irritant standard et des formulations d'essai, et les réponses ont été notées à 0 h,
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24 h et 48 h. Le test mentionné ci-dessus a été réalisé pour vérifier tout type d'irritation sur la peau
en général si la même formulation s'appliquait aux infections de la peau et des tissus mous.

Tableau 13.Draize notation pour irritation cutanée.

Évaluation de la réaction cutanée

Valeur Érythème Valeur Formation d'œdème

0 Pas d'érythème 0 Pas d'œdème

1 Érythème très léger 1 Œdème très léger
2 Léger érythème 2 Léger œdème
3 Érythème modéré à sévère 3 Œdème modéré à sévère
4 Érythème sévère 4 Œdème sévère

4.10.13. Études de stabilité

La stabilité de la préparation semi-solide de nanoémulgel a été déterminée [67] pendant 3 mois et
la formulation optimisée a été conservée à différentes températures : 8◦C, 48◦C + 75 % d'humidité relative
(HR) et à température ambiante (TA). Les échantillons ont été caractérisés pour les changements
organoleptiques, la stabilité physique, la viscosité et la tartinabilité après chaque 15e jour.

4.11. Évaluation biologique du nano-émulsifiant

4.11.1. Propriété antimicrobienne
Une méthode de diffusion sur disque modifiée [68] a été utilisé pour déterminer le diamètre de la
zone d'inhibition sur des boîtes de Petri (90 mm) en utilisant des milieux de gélose Mueller-Hinton et
Sabouraud. Après une certaine période de mort, la souche bactérienne fongique âgée de 24 h a été
étalée sur le milieu. Après cela, des disques de papier filtre d'un diamètre de 6 mm ont été coupés et
stérilisés avant d'être soigneusement déposés au centre. Ensuite, 12µDes litres d'huile essentielle pour
les tests antibactériens ont été déposés sur ces disques et laissés pendant 30 minutes. Ensuite, les
plaques ont été incubées dans un four à 37◦C pendant 24 h à 48 h. Ensuite, les diamètres d'inhibition ont
été mesurés autour du disque et les résultats ont été enregistrés.

4.11.2. Activité de détection d'Antiquorum

Une méthode standard [69] a été utilisé pour évaluer la capacité de médicaments isolés à perturber
la détection du quorum. Dans des boîtes de Petri, une souche de 24 h deC. violaceum(1/100) a été étalé
sur la gélose LB. Après cela, des disques de papier filtre de 6 mm ont été placés au centre des boîtes de
Petri qui étaient déjà striées avecC. violaceum. Ensuite, 15 microlitres de l'échantillon d'essai ont été
appliqués sur les disques de papier filtre et ont été conservés à sécher pendant une demi-heure. Enfin,
les plaques ont été placées dans l'incubateur pour incuber pendant 24 h à 30◦C. Après 24 h, la zone
d’inhibition a été mesurée et les résultats ont été enregistrés.

4.12. Analyse des données

La moyenne±SD a été utilisé pour produire toutes les données. Les analyses statistiques ont
été réalisées à l'aide d'une ANOVA à un facteur avec Microsoft EXCEL.

Matériel supplémentaire :Les informations complémentaires suivantes peuvent être téléchargées à l'adresse
suivante :https://www.mdpi.com/article/10.3390/gels9030252/s1Figure S1 : Profil GC-MS de l'huile essentielle de clou de
girofle (A) et vue agrandie des pics plus petits (B) de RT 13,53-16,91 [69]; Figure S2 : (A,B) activité du nanoémulgel chargé
à 3 % d'huile essentielle contreS. épidermidisetStaphylococcus aureusrespectivement ; Figure S3 : (A, B) activité du
nanoémulgel chargé à 1,5 % d'huile essentielle contreS. épidermidisetS.aureusrespectivement; Figure S4 : (A, B) est
l'activité du nanoemulgel contrePseudomonas aeruginosaetBacillus chungangensis respectivement ; Figure S5 : (A, B)
Activité de détection d'Antiquorum du nanoémulgel chargé et non chargé d'huile essentielle respectivement contre
Chromobacterium voilaceum; Tableau S1 : Analyse GC-MS de l'huile essentielle de clou de girofle [69]; Tableau S2 :
Analyse des composants GCMS de l'huile essentielle de cannelle [17].
Gels2023,9, 252 18 sur 21

Contributions des auteurs :Le projet a été conçu par AA et NU tandis que la méthodologie,
l'analyse logicielle et l'analyse formelle ont été réalisées par NU, MIA, SHK, SM et MAK. La validation
et la durée des données ont été réalisées par AF et SS et la préparation du projet original a été
réalisée par SAR et MMH. L'examen et l'édition du projet final ont été réalisés par NRK et AA. La
supervision du projet était la responsabilité d'AA et MAK. Tous les auteurs ont lu et accepté la
version publiée du manuscrit.

Financement:Cette recherche n'a reçu aucun financement externe.

Déclaration du comité d’examen institutionnel :Avant le début de l'étude, le comité d'éthique de la recherche
scientifique du comité d'éthique de l'université DI Khan de Gomal a donné son accord pour les aspects éthiques
et de consentement de la recherche (numéro d'approbation éthique : 335/QEC/GU). Les auteurs confirment que
l'étude a été menée conformément aux directives ARRIVE et à la déclaration d'Helsinki. Les souches cliniques
utilisées dans l'étude proviennent d'échantillons cliniques de patients.

Déclaration de consentement éclairé :Avant la collecte des souches, des consentements éclairés ont été rédigés avec
les patients après avoir clairement expliqué la nature et le but de l'étude. Dans le cadre du processus de consentement
éclairé, un temps suffisant est accordé aux questions et aux réponses.

Déclaration de disponibilité des données :Sans objet.

Conflits d’intérêts :L'auteur ne déclare aucun conflit d'intérêt dans ce travail.

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