ARTICLES SCIENTIFIQUES
REVUE DE SYNTHESE
La validation analytique concepts généraux et pratique
quotidienne
Analytical validation global concepts and daily practice
Y. Khabbal*1, I. Arous1, A. El Attari1, Y. Cherrah2, A. Amarti1
1
Laboratoire central des analyses médicales, CHU Hassan II, Fès
2
Laboratoire de pharmacologie-toxicologie, faculté de médecine et de pharmacie, Rabat
Résumé Abstract
La validation analytique et bio-analytique est Bioanalytical and analytical validation is now
aujourd’hui un concept qui devient obligatoire à a concept which becomes mandatory analysis
toute procédure d’analyse, son exigence est non process, the requirement is not only scientific but
seulement scientifique mais aussi réglementaire. also regulatory.
L’objectif principal de la validation analytique est The main intention is to demonstrate that each
de démontrer que chaque mesure réalisée est une measurement is made adequately close to the
mesure suffisamment proche de la vraie valeur true value or within acceptable limits as required
ou dans les limites acceptables selon le besoin analysis, she focuses on the following features :
de l’analyse; Elle porte sur les caractéristiques specificity, selectivity, fidelity, linearity, accuracy,
suivantes : spécificité, sélectivité, fidélité, linéarité, limit of detection (LOD), limit of quantification
exactitude, limite de détection, limite de quan- (LOQ), robustness, stability, correlation method,
tification, robustesse, stabilité, corrélation de contamination between sample matrix effect and
méthode, contamination entre échantillons, effet extraction.
matrice et rendement d’extraction. Validation of analytical methods has as principal
La validation des méthodes analytiques a pour objective to ensure that data analytical method will
principal objectif de s’assurer qu’une méthode give results sufficiently reliable and reproducible.
analytique donnée donnera des résultats suffi- These principles apply to all quantitative methods
samment fiables et reproductibles. Ces principes used in biology but also in biochemistry and
s’appliquent à toutes les méthodes quantitatives pharmacology.
utilisées en biologie, mais surtout en biochimie
et en pharmaco-toxicologie. Keys words : Analytical validation, pharmacology,
therapeutic drug monitoring
Mots clés : Validation analytique, pharmacologie,
dosages des médicaments
*Auteur correspondant
Youssef KHABBAL
Faculté de médecine et de pharmacie de Fès, B.P. 1893;
Km 2. 200 Route de sidi Harazem - Fès
E-mail : youssefkhabbal@[Link]
Tél : +212 06 63 71 00 93
Journal de Biologie Médicale / Volume 2-Numéro 6 / Juil-Sept 2013 143
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Introduction
La validation analytique et bio-analytique est aujourd’hui analytiques et l'autre pour la validation des méthodes
un concept qui devient obligatoire à toute procédure bio-analytiques [8].
d’analyse. Dans ce sens, tout laboratoire en France et dans En 2005, "AOAC" International a publié un document
de nombreux laboratoires en Europe, et bientôt au Maroc, technique pour la vérification des méthodes d'analyse
qui veut être accrédité doit respecter les exigences pour l'accréditation ISO 17025 [9].
de la norme ISO 15189 [1], exigence non seulement
réglementaire mais aussi scientifique. Ce concept est
fondé sur une analyse statistique, basée sur un certain
nombre de critères. Il abouti à des méthodes analytiques Objectif de la validation analytique
permettant de donner des résultats fiables.
Dans cet article, notre objectif principal est d’aider L’objectif principal de la validation analytique est de
les biochimistes, les biologistes et les pharmacologues démontrer que chaque mesure réalisée est une mesure
à valider leurs procédures d’analyse. Ce protocole est suffisamment proche de la vraie valeur ou dans les limites
aussi valable pour les industriels du médicament. acceptables selon le besoin de l’analyse. Ces exigences
sont sous forme de critères qui sont fixés en fonction de
la finalité de la procédure analytique.
Généralités En effet, et selon la méthodologie commune inspirée
de la stratégie des guidelines ICH [5, 6] et celles de la
Les premières publications sur la validation analytique SFSTP [3, 4], la validation porte sur les caractéristiques
remontent à 1985, à la suite des rencontres de suivantes : Spécificité, sélectivité, fidélité, linéarité,
l’industrie pharmaceutique américaine. Dès 1986, exactitude, limite de détection (LDD), limite de
un premier texte officiel a été publié dans le quantification (LDQ), robustesse, stabilité, corrélation
pharmacopoeial forum intitulé :" Current concept for
de méthode, contamination entre échantillons, effet
the validation of compendial assays ". En 1989, l’ United
matrice et rendement d’extraction.
State pharmacopoeial Convention (USP Convention )
publie dans son 9 ème supplément, un texte officialisé
dans cette même pharmacopée le 1 er janvier 1990 [2].
En France, ce n’est qu’en 1992, que la société française des Les critères de la validation :
sciences et techniques pharmaceutiques (SFSTP) a publié concepts généraux et pratique
dans STP Pharma, un guide pour la validation analytique.
Cette proposition a connu un succès beaucoup plus vaste quotidienne
puisqu’il présente les recommandations réglementaires
communément admises et appliquées dans l’industrie a- Spécificité
pharmaceutique nationale [3, 4].
C’est la propriété qui fait qu’une méthode d’analyse rend
Le sujet est ensuite repris par L’ International Conference
compte sans ambiguïté de la substance analysée en
on Harmonisation (ICH) qui publie en 1994 un premier
présence d’autres composantes normalement présentes.
document sur les définitions [5]. Cette publication est
Ces dernières peuvent inclure des impuretés, ou des
complétée en 1996 par une seconde publication expliquant
produits de dégradation, ou des éléments de la matrice [5].
comment on peut conduire une validation analytique [6].
En 1996, Le laboratoire national de chimie ( laboratory En pratique : On fait une identification du spectre
of the Government Chemist " LGC") a élaboré un guide d’absorption et du temps de rétention des analytes,
pour la méthode interne de la validation qui comprend Les spectres UV des molécules à une bibliothèque
une discussion sur les exigences liées à l'accréditation spectrale sont comparés [10].
des laboratoires [7]. Remarque : Dans le cas d’une détection par barrette
En 2000, l’agence fédérale américaine des produits de diodes ou par spectrométrie de masse, il n’est pas
alimentaires et médicamenteux ( Food and Drug nécessaire de démontrer la spécificité, le spectre
Administration "FDA") a développé deux lignes directrices d’absorption et le temps de rétention étant spécifiques
de l'industrie : Une pour la validation des méthodes de chaque molécule [11].
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b- Sélectivité
C’est l’aptitude d’une méthode à quantifier un analyte
sans équivoque et à le séparer des produits de dégradation,
des métabolites et des composés co-administrés [12].
En pratique : Ce critère est fondé sur une démonstration,
dans un blanc matrice (plasma, urine), de l’absence
de réponse au temps de rétention de l’analyte par
comparaison avec une solution pure de l’analyte [13]. 2- Comparaison des résultats obtenus de la méthode
à valider avec ceux obtenus par une méthode bien
c- Fidélité (Figure 1) caractérisée
3- Déduction de l’exactitude après avoir établi la
C’est l’étroitesse de l’accord entre une série de mesures
précision, la linéarité et la spécificité de la méthode
provenant de multiples prises d’un même échantillon.
en question [6].
Elle fournit des indications sur les erreurs liées au hasard.
Elle peut être évaluée à 3 niveaux :
1- Répétabilité : l’analyse d’un même échantillon dans
des conditions identiques : même laboratoire, même
opérateur, même lots de réactifs, même équipement
et pendant un court intervalle de temps [5].
En pratique : On prépare au moins trois niveaux de
concentrations, répétés 6 fois, à partir de la même solution
mère, et on calcule la moyenne, l'écart type et le coefficient
de la variation (CV) de la série de mesures. La répétabilité
est exprimée par le CV. Elle est acceptable si le CV est
inférieur à la limite fixée (souvent 20 %) [4].
2- Fidélité intermédiaire "intra-laboratoire" : concerne les
mesures effectuées à l’intérieur d’un même laboratoire,
quand un ou plusieurs facteurs sont changés (jour,
Figure 1: Notions de justesse et de fidélité
opérateur, équipement…) pendant un intervalle de
temps donné [5].
e- Linéarité
En pratique : On la pratique pendant trois jours différents
dont le premier jour correspond à la détermination de la C’est la capacité, à l’intérieur de l’intervalle de dosage,
répétabilité. On aura, au total, 18 essais. La moyenne, à produire des résultats, directement, proportionnels
l’écart -type et le coefficient de la variation sont calculés. à la concentration de substance analysée dans un
Le CV représentera la fidélité intermédiaire de la échantillon. Il s’agit le plus généralement d’une droite [5].
méthode, exprimé en % [4]. En pratique : Utiliser au moins cinq niveaux de concen-
trations, répéter trois fois à partir d’une même solution
3- Reproductibilité "inter-laboratoire" : individus
mère et analyser le même jour afin de déterminer l’exac-
d'essai identiques, laboratoires différents, opérateurs
titude des valeurs obtenues. La pente, l’ordonné à l’origine
différents, équipements différents ou à des époques
et le coefficient de corrélation doivent être calculés pour
différentes [4].
chaque courbe. La moyenne de coefficient de corrélation
doit être comparée à 1 par un test t de student (95 %).
d- Exactitude (Figure 1) Le modèle mathématique doit être vérifié à l’aide
L' exactitude ou la justesse correspond au degré de d’une analyse de variance de type ANOVA afin de
concordance entre la valeur de la méthode obtenue et démontrer que la droite décrit bien la variation totale [4].
la valeur de référence ou la valeur considérée comme
véritable par convention [5]. f- Limite de détection "LDD"
En pratique : L’exactitude peut être évaluée par Il s’agit de la plus faible quantité de la substance
diverses méthodes : analysée que la méthode permet de détecter, sans
1- Application de la méthode à une substance de nécessairement fournir la valeur exacte [5].
référence [14].
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En pratique : L'estimation de la LDD s'effectue selon procédure. Elle donne une idée de la fiabilité de la
l’une des méthodes suivantes : méthode aux conditions normales d’utilisation [4, 5].
1- Pour une méthode chromatographique, on choisit
n’importe quel point de gamme et on mesure le bruit de fond i- Stabilité
(hauteur) dans une zone sans pic du chromatogramme, Pour chaque analyte, on doit déterminer a priori le délai
on multiplie le résultat par 3, ensuite on mesure la de péremption des solutions d’analyte, en fonction des
hauteur de pic de l’analyte sur le même chromatogramme spécifications du fabriquant ou de la connaissance
puis onfait un produit en croix avec la concentration de la molécule de référence [10].
du point de gamme choisi.
Exemple : On a le point X mg/l, notre bruit de fond j- Contamination entre échantillons
mesure Y mAU et le pic de notre molécule mesure
Il est nécessaire d’étudier la contamination inter-
Z mAU. La LDD est donc égale à (Y x X)/Z= LLD en mg/l [11].
échantillon. Pour cela, un échantillon de faible
2- Elle peut être calculée en effectuant n mesures concentration est injecté à la suite d’un échantillon
répétées du blanc,(B) dans une même série, et on calcule de forte concentration afin de mettre en évidence
l’écart type S, exprimé en concentration [4]. La LDD un éventuel "relargage" de l’analyte par la colonne
est donc calculée comme suite : LDD = 3 x S B chromatographique [11].
3- Elle peut être estimée en tenant compte de la droite
En pratique : Après rinçage de l’appareil, on analyse,
de régression y= ax+b [12] : trois fois, un échantillon de forte concentration en
analyte (H1, H2, H3) et un échantillon de faible
concentration (B1, B2, B3). Et on calcule la contamination
en % [10] :
g- Limite de quantification "LDQ"
C’est la plus petite concentration pouvant être mesurée
avec un degré acceptable de la fidélité et d’exactitude Avec H correspond à la moyenne des trois analyses de l’échantillon
(justesse > 80 % ou biais < 20 %). C’est un paramètre des de forte concentration.
analyses quantitatives des composés présents en faibles
quantités dans les matrices d’échantillon, elle est plus k- Rendement d’extraction
particulièrement utilisée dans le dosage des impuretés
et (ou) des produits de dégradation [5]. Il est mesuré par le pourcentage de l’analyte retrouvé
après prétraitement de la matrice par comparaison
En pratique : Elle est déterminée soit par essais à la même concentration en solution pure [13].
de répétabilité et de la fidélité intermédiaire sur des
concentrations de plus en plus faible [4], Soit obtenue En pratique : Le rendement de l'extraction doit être
à partir de l'estimation de l'écart-type du blanc : étudié à trois niveaux de concentrations. Chaque
LDQ=10xS B . Elle peut également être déterminée à concentration est analysée au moins 3 fois. Le
partir de la droite de régression [12] : rendement doit être indépendant de la concentration
étudiée, il est calculé comme suit [13] :
h- Robustesse
C’est la capacité à rendre des résultats exacts en présence
de faibles changements de conditions expérimentales Le rendement d’extraction est acceptable s’il est supérieur
susceptibles de se produire dans l'utilisation de la à 85 %.
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l- Corrélation de méthode Références
Elle doit être vérifiée lorsque l’analyse est réalisée sur 1- AFNOR, Norme NF EN ISO 15 189, Laboratoires d’analyses de
des instruments différents ou par des méthodes biologie médicale Exigences particulières concernant la qualité et
différentes [11]. la compétence, Aout 2007.
2- <1225> VALIDATION OF COMPENDIAL METHODS PF 33(1) Pg. 96.
En pratique : On analyse trois fois (p), cinq échantillons 3- Commission SFSTP. Guide de validation analytique. STP Pharma
(n). Ensuite, on teste l’égalité des variances par test Prat. 1992;2:205-26.
Fischer ‘’p (n-1) ddl’’, puis on calcule les différences pour 4- Commission SFSTP. Guide de validation des méthodes de dosage
chaque étalon, la moyenne et la variance de ces biologique. STP Pharma Prat. 2002;12(6):317-36.
différences, ensuite on teste l’égalité de cette 5- International conference on harmonisation of technical
différence moyenne à zéro par un test t de student requirements for registration of pharmaceuticals for human use;
Validation of analytical procedure : Terminology and definitions
(p-1) ddl [11]. (Q2A) 27 octobre 1994.
6- ICH harmonised tripartite guideline. Validation of analytical
m- Effet matrice procedures : methodology Q2B. International conference on
harmonisation of technical requirements for registration of
Il est nécessaire, en détection par spectrométrie de masse, pharmaceuticals for human use; 6 novembre 1996.
de vérifier l’absence d’influence de la matrice sur
7- Eurachem Guide : The fitness for purpose of analytical methods.
la concentration en analyte dans l’échantillon [13]. A laboratory guide to method validation and related topics, LGC,
Pour cela, il faut comparer les résultats obtenus par Teddington, Middlesex, UK, 1998 ([Link]
l’analyse des solutions suivantes [11] : 8- FDA Guidance for Industry --Analytical Procedures and
1- Blanc matrice extrait puis surchargé en analyte à la Methods Validation --Chemistry, Manufacturing, and Controls
concentration C. Documentation" (Draft, August 2000). ([Link]
Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/
2- Blanc matrice surchargé à la concentration C puis [Link]).
extrait. 9- AOAC INTERNATIONAL Guidelines for Laboratories
Performing Microbiological and Chemical Analyses of Food and
Pharmaceuticals - Revised 2010 Edition - An Aid to Interpretation of
Critères d’acceptation de la ISO/IEC 17025:2005. ISBN-10: 0935584811 / ISBN-13: 978-0935584813.
10- Dingeon B, Dreyfuss MF, Gaillard Y, Le Bouil A, Lhermitte M,
validation Mazzega S et al. Aide à la validation des méthodes en toxicologie et
suivi thérapeutique. Ann Toxicol Anal. 2005;17(3/supplément 1):1-20.
Les limites d’acceptation de la validation doivent être 11- Procédure générale de validation d’une méthode quantitative
en toxicologie et suivi thérapeutique et pharmacologique. CHU
pertinentes quant à l’interprétation biologique de l’analyse. AMIENS Picardie.
Elles doivent être fixées avant de commencer la validation. 12- M. Feinberg. La Validation des Méthodes d’Analyse. Une
Le plus souvent, en pharmacologie et toxicologie, la Approche Chimiométrique de l’Assurance Qualité au Laboratoire.
limite d’acceptation pour le coefficient de variation est Masson, Paris, France, 1996.
≤ 20 %, celle de la justesse ≥ 80 %, celle du biais ≤ 20% 13- Nicolas O, Farenc C, Bressolle F. Stratégie de validation de méthodes
et celle du rendement d’extraction ≥ 85 %. de dosage en bioanalyse en vue d'études pharmacocinétiques
et toxicologiques. Ann Toxicol Anal. 2004;16(2):118-27.
14- Centre d’expertise en analyse environnementale du Québec.
Protocole pour la validation d’une méthode d’analyse en
Conclusion chimie, DR-12-VMC, Ministère du Développement durable,
de l’Environnement et des Parcs du Québec, Édition courante.
La validation des méthodes analytiques a pour principal [[Link]
protocole_val_chimie.pdf].
objectif de s’assurer qu’une méthode analytique donnée,
donnera des résultats suffisamment fiables et
reproductibles, compte tenu du but de l’analyse. Il
faut donc définir correctement, à la fois les conditions
dans lesquelles la méthode sera utilisée et le but pour
lequel elle sera employée. Ces principes s’appliquent
à toutes les méthodes quantitatives utilisées en
biologie, et particulièrement en biochimie et en
pharmaco-toxicologie.
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