République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère L’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE MENTOURI CONSTANTINE

FACULTE DES SCIENCES EXACTES DEPARTEMENT DE CHIMIE

N° d’ordre ……..
N° de Série ……..
MEMOIRE
Présenté en vue de l‘obtention du grade de
Magister en Sciences
En chimie organique
Option : Phytochimie

ETUDE PHYTOCHIMIQUE DE l’EXTRAIT

BUTANOLIQUE DE L’ESPECE
Centaurea Maroccana
Sous la direction du professeur : Présenté Par :
Mr Belattar Abdelhamid Mr Bensouici Chawki

Devant le jury :

Président Pr. Teniou Abderrahmane Univ. Constantine

Rapporteur Pr. Belattar Abdelhamid Univ. Constantine

Examinateur Dr. Bentamene Ali Univ. Constantine

Examinateur Dr. Mekkiou Ratiba Univ. Constantine

DEDICACE
REMERCEIMENT
 SOMMAIRE

Nomenclature................................................................................................................5
Introduction et étude bibliographique
introduction ...............................................................................................................
 SOMMAIRE

INTRODUCTION

CHAPITRE I :LES COMPOSES FLAVONIQUE

І-les composées flavoniques..................................................................... 1

І-1- Introduction.......................................................................................... 1
І-2- Biosynthèse.......................................................................................... 8
І-2-1- Biosynthèse du squelette C6-C3-C6................................................... 8
І-2-2- Biosynthèse des différent squelette flavonique.................................... 10
І-3- Substitution du squelette flavonique..................................................... 12
І-3-1- L’hydroxylation.................................................................................. 13
І-3-2- La méthoxylation............................................................................... 14
І-3-3- La glycosylation................................................................................. 16
І-3-3-1- La C-glycosylation........................................................................... 17
І-3-3-2- La O-Glycosylation.......................................................................... 18
І-4- L’intérêt des flavonoides........................................................................ 20
І-4-1- Le rôle biologique et physiologique..................................................... 20
І-4-2- Le rôle thérapeutique......................................................................... 23
І-4-2-a- Effets antiallergiques...................................................................... 23
І-4-2-b- Effets anticancéreux....................................................................... 24
І-4-2-c- Effets anti-inflamatoires.................................................................. 25
І-4-2-d- Effets anti-ulcereux........................................................................ 25
І-4-2-e- D’autres effets biologiques............................................................... 26
Références bibliographiques

CHAPITRE II : ANALYSE STRUCUTURALE DES FLAVONOIDES

ІІ- L’étude structurale des composés flavoniques…………………………………. 28

ІІ-1- Propriétés chromatographiques………………………………………………… 28
ІІ-1-1- Fluorescence sous lumière de Wood………………………………………… 28
ІІ-1-2- Facteur de retardement Rf…………………………………………………….. 30
ІІ-2- La spectrophotométrie UV……………………………………………………….. 31
Spectre d’absorption en milieu méthanolique……………………………………… 31
Spectre d’absorption en présence de NaoH ou NaoMe…………………………… 34
Spectre d’absorption en présence de NaoAC……………………………………….. 34
Spectre d’absorption en présence de H3Bo3 + NaoAc……………………………. 34
Spectre d’absorption en présence de Alcl3 et Alcl3+Hcl…………………………. 35
ІІ-3- La résonance magnétique nucléaire…………………………………………… 39
ІІ-3-1- La RMN du proton (RMN-H¹)………………………………………………….. 39
Les protons du cycle (C)…………………………………………………………………. 42
Les protons des substituant méthoxyles……………………………………………. 42
Les protons des sucres………………………………………………………………….. 42
ІІ-3-2- La RMN du carbone ( RMN-C¹³)……………………………………………… 43
ІІ-4- La spectrométrie de masse………………………………………………………. 44
- Spectrométrie de masse à impact électronique………………………………….. 45
- Spectrométrie de masse à bombardement atomique rapide (FAB)………….. 45
- Spectrométrie de masse electrospray (ES)………………………………………… 45
ІІ-5- L’hydrolyse acide des hétérosides………………………………………………. 48
Références bibliographiques

CHAPITRE III :PARTIE EXPERIMENTALE

III-Plante végétal,méthodes d’extraction, séparation et purification………….. 49

III-1- Principes générales d’extraction, séparation et purification…………….. 49
III-1-1- Extraction………………………………………………………………………… 49
III-1-2- Séparation et purification…………………………………………………….. 50
III-1-2-1- Chromatographie sur couche mince…………………………………….. 50
III-1-2-2- Chromatographie sur papier………………………………………………. 53
III-1-2-3- Chromatographie sur colonne……………………………………………. 54
III-2- Etude chimique de l’espèce……………………………………………………… 56
III-2-1- Caractéristiques communes…………………………………………………. 56
III-2-2- Les flavonoides isolées de la famille centaurea………………………….. 59
III-3- Matériel végétal……………………………………………………………………. 64
III-3-1- Choix du matériel végétal…………………………………………………….. 64
III-3-2- Description botanique…………………………………………………………. 64
III-3-3- Place dans la systématique…………………………………………………… 64
III-3-4- Répartition géographique……………………………………………………… 65
III-4- Protocole expérimentale………………………………………………………….. 67
III-4-1- Extraction………………………………………………………………………… 67
III-4-2- Séparation chromatographique……………………………………………… 69
III-5-Séparation et purification des composants de l’extrait
Butanolique………………………………………………………………………………… 70
III-5-1- Séparation sur colonne……………………………………………………….. 70
III-5-2- Séparation sur couche mince………………………………………………... 72
Références bibliographiques

CHAPITRE IV :Résultat et discussions

IV- Détermination structurale des produits isolés de l’espèce…………………. 74

IV-1- Le composé F2……………………………………………………………………… 74
IV-1-2- Interprétation……………………………………………………………………. 74
IV-2- Le composé Fc……………………………………………………………………… 83
IV-1-3- Interprétation……………………………………………………………………. 83
IV-3- Le composé F1……………………………………………………………………… 86
IV-1-4- Interprétation……………………………………………………………………. 86
Conclusion
Références bibliographiques
75
79
79
79
79
82
86
86
86
86
89
92
92
92
92
95
98
11
1
11
2
 Introduction :

Les substances naturelles issues des végétaux ont des intérêts

multiples mis à profit dans l’industrie : en alimentation, en

cosmétologie et en dermopharmacie. Parmi ces composés on retrouve

dans une grande mesure les flavonoides qui sont présent chez toutes

les plantes vasculaires ; ils se sont surtout illustrés en thérapeutique

comme anticancirogènes, anti-inflammatoires, antitumoraux, et

antioxydants (Bahorun T., 1995).

Des travaux plus anciens (Nitsch et Nitsch 1961 ; Alibert et al.

1977) ont montré que les phénols seraient associés à de nombreux

processus physiologiques : croissance cellulaire, différenciation

organogène, dormance des bougeons, floraison, tubérisation. Les

polyphénols interviennent dans la qualité alimentaire des fruits. Les

flavonoides et certains anthocyanes participent à la coloration des

fruits mûrs. L’intérêt nutritionnel pour les flavonoides date de la

découverte de la vitamine C.

A partir des années quatre-vingt, c’est la découverte du rôle

des radicaux libres dans les processus pathologiques qui a relancé

l’intérêt pour les molécules dont les propriétés antioxydantes sont très

marquées. Parmi les propriétés attribuées on peut citer l’effet

attracteur sur les insectes et les oiseaux pollinisateurs, une action

antifongique et antibactérienne. Les flavonoides sont aussi des

protecteurs contre les risques cardio-vasculaires (Remesey et al, 1998).

 Les composés phénoliques déterminent également la saveur

des fruits : les flavonones sont responsables de l’amertume des Citrus

et peuvent donner naissance, par transformation chimique, à des

dihydrochaélcones à saveur sucrée (Dubois et al. 1977).

Les tanins sont à l’origine de la sensation d’astringence des

fruits non mûrs. L’étude de Centaurea maroccana entre dans le cadre

d’un programme de recherche sur les plantes médicinales algérienne.

Cet intérêt est motivé, d’une part, par le fait que cette espèce n’a fait

l’objet d’aucune étude chimique, au regard de la recherche

bibliographique effectuée, et la richesse des Centaurées en substances

naturelles d’un grand intérêt biologique d’autre part.

La famille des Centaurées est très riche en substances naturelles

tel que : les sesquiterpenes, les terpenes, et les flavonoides.

Ce mémoire est subdivisé en quatre chapitres :

Le premier chapitre est consacré à l’étude des flavonoides : leur

définition, leur biosynthèse et leur intérêt biologique.

Le deuxième chapitre est consacré à l’analyse structurale des

flavonoides.

Le troisième chapitre est consacré au travail personnel qui

consiste en l’extraction, séparation, purification et étude chimique de l’espèce.

Le quatrième chapitre est consacré à la détermination des structures des

composés obtenue.
 Références bibliographiques

-N.Heimeur, L.M. Idrissi, Hassani et M.Amine Serghini, Les

Polyphenols de Pyrus mamorensis (Rosaceae), Rev.Biol.Biotech. Vol.1,
March 2004 pp 37-42.
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

I- Les composés flavoniques :

І-1 - Introduction :

Le terme flavonoide désigne une très large gamme de composés

naturels appartenant à la famille des polyphénols. Ils sont considérés

comme des pigments quasi universels des végétaux. Structurellement, les

flavonoides se répartissent en plusieurs classes de molécules dont les plus

importantes sont : les flavones, les flavanones, les dihydroflavanols, les

isoflavone, les isoflavonones, les chalcones, les aurones, les anthocyanes et

les tanins [1]. Parmi toutes les molécules flavoniques, les flavonols sont

considérés comme l’étendue la plus ancienne [2] (Stafford 1991).

Le terme « flavone » a été utilisé pour la première fois en 1895 par

Von « Kostanecki » et « Tamber » qui étaient des pionniers dans le travail

structurel de cette classe particulière des flavonoides [3].

De nos jours, plus de 8000 flavonoides ont été identifiés [4]. Ils ont

une origine biosynthétique commune et par conséquent possèdent tous un

même squelette de base à quinze atomes de carbone, constitué de deux

unités aromatiques, deux cycles en C6 (A et B) reliés par une chaîne en C3.

figure -1- (Bruneton, 1999) [5].

Figure-1- : Squelette de base des flavonoides

1
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

A l’état naturel, on trouve très souvent les flavonoides sous forme de

glycosides, une ou plusieurs de leurs fonctions hydroxyles sont alors

glycosylés. La partie du flavonoide autre que le sucre est appelée aglycone [5].

Les flavonoides sont présents dans toutes les parties des végétaux

supérieurs : racines, tiges, feuilles, fleurs, pollen, fruits, grains, et bois.

Certains flavonoides sont spécifiés à partir des tissus végétaux, les

anthocyanes sont plutôt localisés dans les parties externes des fruits, fleurs

et feuilles. Les chalcones se retrouvent plus fréquemment dans les pétales

des fleurs, ce sont des pigments naturels au même titre que la chlorophylle

(couleur verte) et les caroténoïdes (nuance jaune et orangée) [5].

Les flavonoides, en particulier les anthocyanes sont les seules

molécules du règne végétal capables de produire une vaste gamme de

couleurs, susceptibles de donner des teintes allant du jaune orangé ou bleu,

en passant par le pourpre et le rouge. Les flavones, aurones et chalcones

donnent plutôt des couleurs jaunes, beige voir blanches, en participant aux

nuances produites par les anthocyanes et les caroténoïdes.

Un des rôles de la couleur chez les plantes est d’attirer les insectes et

cela afin de déclencher la fécondation, les charger de pollen ou de grains de

façon à en assurer la dissémination nécessaire à la reproduction de l’espèce

[6].

2
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Les flavonoides ont un impact considérable sur plusieurs aspects

biologiques des plantes, ils exposent une grande gamme de fonctions dont :

physiologique, biochimique et écologique, par exemple les flavonoides offrent

a la plante une protection contre les rayons UV (Winkel-Shirley, 2001). En

plus une des propriétés majeures des flavonoides est de contribuer à la

couleur des plantes et notamment à celle des fleurs, or c’est par la couleur

de ses fleurs que la plante exerce un effet attracteur sur les insectes et les

oiseaux pollinisateurs, assurant par ce biais une étape fondamentale de sa

reproduction.

On peut également noter que les flavonoides, en repoussant certains

insectes par leur goût désagréable, peuvent jouer un rôle dans la protection

des plantes.

Les flavonoides montrent d’autres propriétés intéressantes dans le

contrôle de la croissance et du développement des plantes en interagissant

d’une manière complexe avec les diverses hormones végétales de croissance,

certains d’entre eux jouent également un rôle de phytoalexines ; c’est-à-dire

les métabolites que la plante synthétise en grande quantité pour lutter

contre une infection causée par des champignons ou par des bactéries [7].

3
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Les composés flavoniques varient relativement au changement de la

nature du cycle oxygéné non homogène (C) figure-2-, ils sont dérivés de

l’un de ces composés : pyrane, y pyrane, pyrylium.

8 1
O 2' 3'
7 2
A C B 4'
6 3
5 4 6' 5'
O

O O O

O
Pyrylium γ-Pyrone Pyrane

Figure-2-

4
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

D’après le degré de l’oxydation du cycle (C), se forme le squelette

flavonique qui est composé de plusieurs parties comme l’indique la figure-3-

[8].

O O

Aurone Isoflavone

H
O

O
O

Chalcone Flavanone

O
O

OH

O
O

Flavone Flavonol

5
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

H
O +
O

OH

OH

Flavanon-3-ol Anthocyanidin

OH
O
O

OH
OH

Flavan-3-ol Proanthocyanidin

H
O

Flavane Dihydrochalcone

OH

OH

Flavan-3,4-diol
Figure-3- : structures de base de principaux types de flavonoides

6
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Parmi les différentes structures des flavonoides on observent une

sous classe appelée les isoflavonoides. Ils forment une sous classe très large

et très distinguée des flavonoides, ces composés très actifs se trouvent

essentiellement chez la famille des fabales (les légumineuses) [9].

Ils jouent un rôle important sur la santé humaine (Davis et al., 1999;

Dixon et Ferreira, 2002 ; Messinna, 1999), certains isoflavonoides

fonctionnent comme des phytoalexines, synthétisées comme défense contre

le stress (microorganisme infectieux, froid, UV), c’est aussi le seul groupe de

flavonoides connus pour être hautement toxiques envers de nombreux

insectes [10].

Structurellement les isoflavonoides se différencient des flavonoides

par le positionnement du cycle (B) du squelette flavonique sur le carbone -3-,

La figure-4- montre les principaux types d’isoflavonoides :

O O

O
Isoflavane
Isoflavanone

O O

OH O

Isoflavanol Isoflavone

Figure-4-

7
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

І – 2 – Biosynthèse :

Vu l’importance des flavonoides et leur propagation de plus en plus

étendue ont attiré l’attention de plusieurs chercheurs : chimistes, biologistes

et même des biogénéticiens qui ont accentué leurs recherches sur l’origine

de l’évolution héréditaire de ces composés quand à leur biosynthèse dans les

plantes.

І – 2-1 - Biosynthèse du squelette C6-C3-C6 :

Les études dans ce domaine ont fait des progrès , grâce à l’utilisation

du C14 qui a montré que le chalcone synthase ( CHS) est l’enzyme clé dans

la biosynthèses des divers flavonoides [11] et que la biosynthèse passe par

deux voies, la voie acétate et la voie shikimate.

Les expériences faites par le chercheur « Grisebach » en 1957 ont

montré le rôle de l’acide acétique dans la formation du cycle A figure-5- et

ceci dans l’étude de la biosynthèse du composé « cyanidine » dans la plante

« le choux rouge » à partir de l’acétate irradié du groupe méthyle ou

carbonyle[12][13].

.
. . . .
. OH
. .
. *
.
. . .
HO
* *
OH
. .
3 +
. .
CH3 COOH HO
3H2O
. . . .
*
O OH O
Acide acétique Acide p-coumarique Chalcone

Figure-5- : formation du chalcone par la condensation de 3 molécules de

l’acide acétique avec une molécule de l’acide para coumarique.

8
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Le cycle (A) est formé par la condensation de trois unités d’acétate en

forme de malonylcoA avec p-coumaroyl-coA figure-6-(Kreuzler and

Hahlbrock, 1975; Heller and hahlbrock ,1980).

COOH

NH2

Phenylalalin

Phenylalalin-
Ammonium- lyase
O
COOH
+ CoASH
OH

Zimtsaure-4-
Hydroxylase
O COOH

S CoA
HO
4- Cumaroyl-CoA-
Ligase
O

O O
S CoA

O S CoA
HO

Malonyl-CoA Chalcon- 4-Cumaryl-CoA

3x
synthase

OH

OH
CoA HO OH

O S

OH O

O O Chalcone

Chalcone-Isomerase
OH

HO O

Flavanone

OH O

Figure-6- : condensation de trois molécules d’acétate avec le p- coumaroyl-

CoA Pour la formation du chalcone et ses isomères.

9
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Tandis que pour le cycle (B) les études faites par le chercheur

« DAVIS » en 1955 sur la plante « Shikimi-no-ki » ont montré le rôle de

L’acide Shikimic dans la formation du cycle (B) [14].

І- 2-2 - Biosynthèse des différents squelettes flavoniques :

Depuis la découverte de l’enzyme CHS qui a été isolée et caractérisée

dans des différentes espèces de plantes, elle est devenue la cible attirante

pour les généticiens qui cherchent en premier lieu à modifier la couleur des

fleurs vers le blanc pur en bloquant la biosynthèse des flavonoides.

L’enzyme CHS catalyse progressivement la condensation de trois

molécules de Malonyl CoA avec 4-coumaroyl en 4, 2, 4, 6 –tetrahydroxy-

chalcone, cette chalcone de couleur jaune est métabolisée sous l’action

d’enzyme la chalcone isomérase, en flavone : naringénine. C’est sur cette

dernière qu’agit ensuite la flavone synthase ou la (2S)-flavanone-3-

hydroxylase pour donner la formation de la flavone apigénine ou le

dihydroflavonol :(2R, 3R)-dihydrokaempférol, respectivement.

Les deux enzymes fonctionnent différemment, la première introduit la

double liaison entre les carbone C-2 et C-3, tandis que la deuxième catalyse

l’hydroxylation du carbone C-3. Le dihydroflavonol en présence de la flavonol

synthase ou la dihydroflavonol-4-réductase, se métabolise en flavonol :

kaempférol ou en flavan-3,4-diol : leucoanthocyanidin, respectivement.

Ce dernier semble être le précurseur des flavan-3-ols et

anthocynidins. Cependant, les étapes ultimes de leur formation ne sont pas

encore élucidées. Le pélargonidin, sous l’action de la 3-O-glycosyl-

transférase se transforme en pélargonidin-3-glucoside figure-7-[15].

10
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

CARBOHYDRATES

Acetyl-CoA Shikimate

Arogenate
OH OH
VI III II
I Phenylalanine
HO HO HO

O O O
4-coumaroyl-CoA 4-Coumarate Cinnamate

3-Manolyl-CoA
1 OH
OH

HO HO O

OH O
O
4.2'.4'.6'-Tetrahydroxychalone 4.6.4'-Trihydroxyaurone
2
OH OH
O
HO O HO O

O 3 4
OH
OH O OH O
Génistine Naringenine Apegenine

5 OH
OH
HO O
HO O
6 OH
OH
OH O
OH O

Dihychrokarmpferol Kaempferol
7
OH OH
HO O HO O
8
OH OH
OH OH OH
L.encopelargonidin Afzeldin

OH
OH HO O
HO O
OH
OH OH
OH
OH Pelargonidin HO O

9 OH OH
OH
HO O PropelagonidinB-3
O-Glu
OH

Pelargonidin3-glucoside

Figure -7- : Biosynthèse des différents squelettes flavoniques

11
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Tableau-1- : Liste des enzymes rentrants dans la biosynthèse

Nom des enzymes Numéro d’enzyme

Acetyl-CoA carboxylase І
Phenylalanine ammonia-lyase ІІ

Cinamate 4-hydroxylase ІІІ

4-coumarate : CoA liase ІV

Chalcone synthase 1
Chalcone isomérase 2

2-hydroxyisoflavonesynthase 3
Flavone synthase 4
(2S) –flavone-3-hydroxylase 5

Flavonol synthase 6
Dihydroflavonol 4-reductase 7

Flavan-3 ,4-cis-diol 4-reductase 8

Anthocyanidin/ flavonol 3-O-
9
glycosyltransferase

І- 3 - Substitution du squelette flavonique :

Les flavonoides se composent en sous classes, les composés variés de

chaque sous classe se distinguent par le nombre, la position et la nature des

substituants (groupements hydroxyles, méthoxyles et autres) sur les deux

cycles aromatiques A et B et la chaîne en C3 intermédiaire.

12
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

І- 3- 1- L’hydroxylation :

Dans plus de 90 % des cas, le cycle A des flavones et flavonols est

substitué par deux hydroxyles en C5 et C7 et hydroxylé en position C'4 sur

le cycle B, qui sont considérés comme originaux et existent avant la

constitution du noyau chalcone [16]. D’autres substitutions sont possibles

avec des fréquences variables : hydroxyles en C6 et en C8, comme exemples

les structures suivantes :

OH

HO O
HO O

HO
OH O
OH O

Dihydronorwogonine
Dihydrobaicaleine
D’autre part, dans plus de 80 % des cas, le cycle B est substitué en

C'4 avant la formation du squelette chalcone ou disubstitué en C'3 et C'4, ou

moins fréquemment 3', 4', 5'-trisubstitué, les autres positions C'2 et C'6 ne

sont qu’exceptionnellement substituées , comme exemples les structures

suivantes [17],[18]:

OH

OH
OH

HO O
HO O
OH

O
OH O

13
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Pour le cycle (C) la substitution sera sur la position 3 qui donne la

Quercetine comme exemple :

OH

OH

HO O

OH

OH O
Quercétine

І- 3- 2- La méthoxylation :

La méthylation fait partie de la biosynthèse de plusieurs flavonoides,

elle joue un rôle important dans la couleur de ces derniers, par exemple le

groupe methyl de l’anthocyanin donne la couleur des fleur ( Harborne et

Williams 2000).

La réaction de mythylation présente chez les plantes est catalysée par

des méthyltransférases qui constituent une classe d’enzymes particuliéres,

elles assurent la synthèse d’un grand nombre de molécules aux fonctions

très variées, il existe plusieurs types de méthyltransférases. Pour les

flavonoides, les O-méthyltransférases jouent le rôle de transportateur du

groupe méthyle à partir de la S-adénosyl L-méthionine (SAM) comme

donneur de méthyle, cette transformation se fera avant la formation du

noyau chalcone.[19].

On note aussi les recherches faites par « Deluca » en 1984 qui a

abouti à faire un schéma montrant les différentes étapes de la substitution

du groupe méthyle sur le squelette flavonique figure-8-

14
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

OH

OH
OH

OH

HO O

HO O
SAM
SAH
OMe

OH
3-O Me OH O

OH O

OH

OH OH

OH
MeO O

HO O SAM
SAH OMe

OMe OH O

OH O
7-O Me

OH

OH OMe

OH
MeO O
SAM
MeO O
SAH
OMe

OMe OH O
4'-O Me OH

OH O
OMe

MeO O

OH HO OMe

OH OH O

SAM 4'-O Me
MeO O OH
SAH
OH

HO OMe
MeO O
OH O 6-O Me

MeO OMe

OH O

OMe OMe

OH OH

MeO O
SAM
MeO O
SAH

HO OMe MeO OMe

6-O Me
OH O OH O

Figure-8- : substitution des groupes (OMe) d’après « DLUCA » en1984.

15
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

І- 3-3 - La glycosylation :

Par définition, c’est l’addition d’un sucre sur le squelette flavonique.

Elle se fait dans la dernière phase de la biosynthèse des flavonoides grâce à

l’enzyme O-glucosyltransférase , cet enzyme transfère le sucre de la UDP-

glycose ( Uridine diphosphate glucose ) au groupe hydroxyl aglycone, par

exemple : l’anthocyanidine avec un libre groupe hydroxyle à la position 3 est

instable aux conditions physiologiques par conséquent il ne se trouve pas

dans la nature sur cette forme ( Forkmann and Heller 1999) .

La 3-Oglycosyl- transférase est considérée comme une enzyme indispensable

dans la biosynthese des anthocyanidins.

OH
OH
OH
OH

+
+ O
O 3-O-Glycosyltransferase
OHH

O O H
OH UDP-Glu UDP OH
OH
Anthocyanidin HO H
H H

H OH
H O O O
HO
HO O P O P O CH2 U
H OH O
O O H H
H H

H
HO OH

Figure-9- : substitution d’un sucre sur l’aglycone

16
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

On distingue deux types de glycosylation :

- La C- Glycosylation.

- La O- Glycosylation.

І- 3-3- 1- La C-glycosylation :

Dans ce type de composés, le sucre est lié directement au cycle

benzénique par une liaison C-C, d’une manière générale la C-glycosylation se

positionne en C6 ou en C8. Pour exemple de ces composés la Isovitexin (6-

C-glycosylflavone), la vitexin (8-C-glycosylflavone), Orientin et l’isoorientin

[20].

R
R
OH
OH
Glu

HO O
HO O

Glu

OH O
OH O
Isovitexin Vitexin

OH

HO OH

Glu 3'
OH O

17
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

І- 3-3-2 - La O-Glycosylation :

Elle lie un hydroxyle du squelette flavonique avec un autre hydroxyle

alcoolique du sucre (glucose…) en présence de l’enzyme Glycosyltransférase

et la UDP-glu ( Uridinediphosphateglucose )comme donneur du sucre .

Les structures suivantes montrent plusieurs positionnements de la

O-glycosylation en 7-OH et 3-OH [21].

OH

OH
GluO O
Glu-O 7 O

O
OH
O
O-Glycosyl-flavone O-Glycosyl-isoflavone

R=glucose Isoquercitrin

OH
O
OH
OH
HO

OH R=galactose Hyperoside
OH
OH OH
O
OH
HO
HO O
R=rutinose Rutin

OH

OR O
OH

OH O HO CH2

HO O O
HO
O-Glycosyl-flavonol OH

18
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Dans la nature on trouve souvent les flavonoides sous forme

glycosylés avec des différents types de sucre comme : D-glucose, L-rhamnose,

glucorhamnose, lignin et arabinose [22].

On peut aussi trouver des flavonoides biglycosylés, la figure-9-

montre des exemples de ces structures [23].

OH OH

OH OCH3 OH OCH3

O O
HO O HO O
O O
HO HO
O O

O O
HO HO
OH OH
O O

HO HO Neohesperidin HO HO
Neodiosmin

OH OCH3 O
HO

O OCH3
OH O
HO O
O
HO HO HO O
O HO O
O
O HO
HO
H2O
OH

O
HO HO
Fortunellin Linarin O

O OH
HO

O OCH3
OH

HO HO O
HO O
O
HO
H2O

Hesperidin O

Figure-10- : structures biglycosylées

19
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

І- 4- L’intérêt des flavonoides :

Les substances naturelles issues des végétaux ont des intérêt

multiples mis à profit dans l’industrie : en alimentation, en cosmétologie et

en dermopharmacie. Parmi ces composés on retrouve dans une grande

mesure les flavonoides ; ils se sont surtout illustrés en thérapeutique comme

anticancirogénes, anti-inflammatoires, antitumoraux et antioxydants

(Bahorun, T 1995) [24]. On peut classer l’intérêt des flavonoides en deux

rôles :

І- 4-1- Le rôle biologique et physiologique :

Des travaux plus anciens (Nitsch et Nitsch 1961 ; Alibert et al. 1977)

ont montré que les flavonoides seraient associés à de nombreux processus

physiologiques : croissance cellulaire, différenciation, organogène, dormance

des bourgeons, floraison et tubérisation.

Ils déterminent également la saveur des fruits : les flavones sont

responsables de l’amertume des citrus et peuvent donner naissance par

transformation chimique à des dihydrochalcones à saveur sucrée (Dubois et

al, 1977), les tanins sont à l’origine de la sensation d’astringence des fruits

non murs [24].

20
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Les flavonoides jouent un rôle important dans la croissance et le

développement des plantes, ils protégent les plantes contre l’attaque des

micro-organismes et les parasites [25] et ceci par leur couleur et odeur qui

servent comme communicateurs avec l’environnement [26], ils exercent un

effet attracteur sur les oiseaux , les insectes et les animaux qui contribuent

à la dispersion des grains des plantes et assurent la reproduction des

plantes [24], tandis qu’ils peuvent repousser certains insectes par leur goût

désagréable.

Les flavonoides offrent à la plante une protection contre les rayons

ultra violets ( Winkel – Shirley, 2001).

Les flavonoides sont considérés comme de bons chélateurs des ions

métalliques, par exemple : le fer (Fe+2) et le cuivre (Cu+) qui sont essentiels

pour certaines fonctions physiologiques comme constituants des

hémoprotéines, soit des cofacteurs des différentes enzymes du système de

défense antioxydant par exemple le Fer pour la catalase, le Cuivre et le Zinc

pour la superoxyde dismutase (Morris, 1995 ; Brown, 1998).

On peut résumer les sites essentiels pour la chélation des ions

métalliques sur la figure suivante :

21
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

n
Me
OH

OH

B
O

A C
3

5 OH

OH O n
Me
n
Me

Figure-11 - sites proposés pour la chélation des ions métalliques

Piégeage des radicaux libres. De nombreuses études ont établi des

relations entre les structures chimiques des flavonoides et leur capacité de

piéger les radicaux libres (Jovanovic , 1994 ; Van acker 1996…).

Les recherche faites par « Rice-Evans » et ses collaborateurs ont

développé un test basé sur la capacité d’un antioxydant à piéger le radical

cation chromophore, acide 2,2´-azinobis (3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)

(ABTS˙*) ( Rice-Evans,1996). L’activité des flavonoides est comparée avec

celle du Trolox (acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique)

et exprimée en TEAC (Trolox -EquivalentAntioxydant Capacity ), il est a noter

que plus la valeur de TEAC est élevée plus la molécule est active. Afin de

déterminer les éléments majeurs de l’activité antioxydante, la figure suivante

montre les sites essentiels pour l’activité antioxydante des flavonoides.

22
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

R'
3

R' R'
2 4

HO O

R3

Figure-12 - Éléments essentiels pour l’activité antioxydante.

І- 4- 2- Le rôle thérapeutique :

De plus en plus, les flavonoides deviennent le principal sujet médical

de recherche, ils ont été rapportés pour posséder plus d’utilité dans les

activités anti-virales, anti-tumorales, anti-inflammatoires, anti-allergiques et

anti-cancéreuses.

І- 4- 2 –a- Effets antiallergiques :

Les flavonoides sont aussi connus pour leurs effets anti-allergiques,

ces effets sont attribués à l’influence des flavonoides sur la production

d’histamine, en fait les flavonoides inhibent les enzymes qui augmentent

l’apparition de l’histamine dans les cellules mastocytes et des basophites,

par exemple l’ ATP ase Ca+2 dépendante dégrade l’ATP produisant ainsi de

l’energie afin de faciliter l’absorption du calcium par les membranes

cellulaires ce qui favorise la libération de l’histamine stockée dans les

vésicules.

23
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Pour exemple le flavonoide isolé par le chercheur « Khelin » des fruits

de la plante égyptienne « Amuni visnaga » a été utilisé pour le traitement

d’asthme et d’autres troubles [40]. Une autre étude a montré que la

quercétine a un potentiel d’action supérieur à celui du cromolycate de

sodium de l’histamine et d’autres substances endogènes qui causent

l’asthme [27].

І- 4- 2 –b- Effets anticancéreux :

Beaucoup de chercheurs ont conduit dans leurs études sur l’activité

de l’antitumeur potentielle des flavonoides pour exemple : l’activité

antitumeur de la catechin, flavanol présent dans le thé vert et d’autre plante

comme l’areca catechu, la crataegus oxyacantha, la cinnamomum cassia, la

polygonum multiflorum,et la rheum palmatum.

Ce flavonoide particulier a inhibé l’invasion de tumeur et il a été

suggéré que l’activité de la catechin peut être en rapport avec sa capacité de

lier le tissu type plasminogen activator ( t-PA) à laminin, une molécule de la

matrice extracellulaire qui joue un rôle important pendant l’adhésion de la

cellule concérigène, mène à une inactivation partielle de La t-PA [28-29].

Quelques flavonoides (quercetine, epigallocatechine) et l’extrait du thé

vert inhibent l’augmentation de la tumeur en stoppant quelques phases du

cycle cellulaire et en bloquant le récepteur ou revalisant la place de

l’hormone récepteur [30-31].

24
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

En plus des chercheurs ont montré que la tricine et le Kaempferol-3-

0-β-D-glycopyrunoside qui sont isolés de la plante médicinale chinoise

traditionnelle le « Wikstroeia-indica » ont une activité anti-leucémiques, en

outre, les études épidémiologiques ont indiqué qu’un régime alimentaire

contenant les grains de « Lin » et de « soja » (riche en isoflavonoides) peut

protéger contre le cancer du colon, de la poitrine et de la prostate.

І- 4- 2 –c- Effets anti-inflammatoires :

Les recherches faites par « Landolfi et al» ont montré que beaucoup

de flavonoides étudiés étaient capables de modifier le métabolisme d’acide

arachidonique dans les plaquettes pour donner la prostaglandine et le

leucotriènes induisant des phénomènes inflammatoires. Ce groupe a aussi

montré que quelques flavonoides tels que la myricétine et la quercétine

bloquent la cyclooxygénase et la lipooxygénase avec une forte concentration

de ces deux flavonoides, en outre d’autres flavonoides tels que l’apigénine et

la chrysine agissent principalement sur l’activité de la cyclooxygénase [32].

І- 4- 2 –d- Effets anti-ulcéreux :

Dans des expériences réalisées sur les rats, il a été démontré que la

quercetine et la nargénine jouent un rôle important dans la réduction de

l’ulcère et la protection des cellules gastriques.

25
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Il a été suggéré que la quercétine exerce son activité via un

mécanisme complexe impliquant la production du mucus, le piégeage des

radicaux libres et également l’inhibition de la production de leucotiène

(Dicrlo, 1999).

І- 4- 2 –e- D’autres effets biologiques :

Les flavonoides peuvent aussi empêcher le diabète ou du moins le

réduire en inhibant l’enzyme aldose réductase [33]. Les chercheurs « Ong »

et « Khoo » ont reporté que la myricétine et d’autres flavonoides réduissent le

risque des maladies cardiovasculaires [34], plusieurs flavonoides exercent

des effets de l’anti-aggrégatory à travers l’inhibition de la phosphodiesterase

[32]. Des propriétés antivirales et antimicrobiennes ont aussi été démontrées

[35,36].

Le tableau suivant résume les effets potentiels de quelques

flavonoides sur les animaux et les humains [37].

26
Chapitre I : Les Composés Flavoniques

Tableau-2- : Effets potentiels de quelques flavonoides

Analgesic : Anti-inflammatoire :
Hesperidin Apigenin
Khellin Chrysin
Quercetin Gossypin
Hibrifolin
Antianginous : Hypolaetin-8-β-D- glucoside
Isoflavone Luteolin
Myricetin
Antitherogenic : Neptine
Quercetin Quercetin
Quercitrin
Anticancer : Sidertoflavanone
Bacalein
Catechin Antiosteoporotic :
Epigallocatchin Ipriflavone
Kaempferol-3-O-β-D-glucopiranoside
Nobiletin Antispasmotic :
Quercetin Apigenin
Rutin Catchin
Tangeretin Chrysin
Tricin Flavone
Woogonin Kaempferol
Quercetin
Antidibetic :
Quercetin Antiulcer :
Flavanone
Vascular protection : Flavone
Anthocyanidine Kaempferol
Citrin Quercetin
Rutoside Rutin

27
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

ІІ- L’étude structurale des composés flavoniques :

L’identification des structures flavoniques est basée sur plusieurs

techniques chromatographiques et spectroscopiques telles que [1] :

- La fluorescence sous lumière de Wood.

- Facteur de retardement Rf.

- La résonance magnétique nucléaire (RMN ; H¹, C¹³).

- La spectrométrie de masse (SM).

- La spectrophotométrie UV-Visible.

ІІ- 1- Propriétés chromatographiques :

ІІ- 1-1- Fluorescence sous lumière de Wood :

L’absorption des substances flavoniques sous lumière de Wood donne

des renseignements préliminaires sur la structure chimique. Le tableau

suivant montre la relation fluorescence – structure [2].

28
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

Tableau-3- : Relation entre la fluorescence sous lumière de Wood et les

structures flavoniques.

La fluorescence Les structures possibles

Flavones avec 5, 6,7 ou 5, 7,8

trihydroxy flavone
Violette noire
Flavonol avec 3-OR

Chalcones

Flavone ou flavonol sans OH en5

BLEUE Flavanone avec OH en3 ou

flavonol

Flavonol avec 3-OH et sans 5-OH

Flavonol avec 3-OH, et avec ou

Jaune ou jaune terne
sans 5-OH

Orange fluorescente Isoflavones

Jaune-verte Aurones

Flavanone sans 5-OH

Bleue-verte

29
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

ІІ- 1-2- Facteur de retardement Rf :

Ce facteur est défini par l’équation suivante [2] :

Distance parcourue par le composé

Rf =
Distance parcourue par le front de solvant

La valeur du Rf varie avec la nature du couple d’éluant utilisé

(organique ou aqueux), le type de support chromatographique (gel de silice,

polyamide, cellulose, papier) et la forme du produit lui-même (aglycone ou

glycosyle) ainsi que la disposition des différents substituants [3].

Le tableau suivant montre l’influence de la substitution du squelette

flavonique sur la valeur du Rf.

Tableau-4- : La relation entre le Rf et la structure flavonique

Structure flavonique Rf

Rf diminue dans les systèmes de

Augmentation des groupes solvants organiques et augmente dans
hydroxyles les systèmes de solvants aqueux.

Rf augmente dans les systèmes de

Méthylation des hydroxyles
solvants organiques et diminue dans
les systèmes de solvants aqueux.

Rf diminue dans les systèmes de

Glycosylation
solvants organiques et augmente dans
les systèmes de solvants aqueux.

30
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

ІІ-2- La spectrophotométrie UV :

C’est la méthode la plus utilisée pour l’identification des structures

flavoniques. Elle est basée sur l’enregistrement d’un spectre dans un milieu

alcoolique (méthanolique) qui sera caractérisé par deux bandes d’absorption

principales [4].

Le spectre sera ensuite modifié par addition d’un certain nombre de

réactifs tels que : NaOH, NaOAc, AlCl 3 , H 3 BO 3 et HCl. Ces derniers donnent

des informations sur la structure du composé à travers leur réaction avec les

groupements hydroxyles, cela se traduit sur le spectre UV par des

déplacements bathocromiques ou hypsochromiques des bandes d’absorption.

Spectre d’absorption en milieu méthanolique :

Le spectre d’absorption UV pris dans le milieu méthanolique MeOH

se compose de deux bandes d’absorption [4] :

Bande І : Ayant un maximum d’absorption entre 300 et 400 nm, elle

est attribuée à l’absorption du système cinnamoyle qui résulte de la

conjugaison du groupement carbonyle avec la double liaison (C2-C3) et le

noyau (B). Elle donne donc des renseignements sur la variation structurale

du cycle B et l’hétérocycle C.

Bande ІІ : Ayant un maximum d’absorption entre 240 et 280 nm, elle

est attribuée à l’absorption du système benzoyle qui dérive de la conjugaison

du groupement carbonyle avec le noyau A et donne des informations sur les

variations structurales du cycle A [4],[1].

31
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

B
O

Benzoyle O Cynamoyle

Figure-13- : Conjugaison du groupement carbonyle avec les cycles A et B.

Le maximum d’absorption des deux bandes І et ІІ du spectre pris

dans le milieu méthanolique dépend du nombre et de la position des

groupements hydroxyles ou méthoxyles sur le squelette flavonique[5].

L’augmentation du nombre des groupements hydroxyles fait déplacer

le maximum d’absorption vers des longueurs d’onde plus élevés, par contre

la substitution des groupements méthoxyles ou glycosyles fait déplacer ce

maximum vers des longueurs d’onde plus faibles. Le tableau suivant donne

la relation entre le maximum d’absorption en UV et le type des flavonoides.

32
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

Tableau-5- : Relation entre le maximum d’absorption

en UV et le type de flavonoides

Type de composé
Bande І Bande ІІ
flavonique

Flavone
320-350 250-270

Flavonol
352-385 250-280

Flavanone
300-330 245-275

Isoflavone
300-330 245-275

Chalcone
340-390 230-270

Aurone
380-430 230-270

Anthocyanidin
465-560 270-280

Le spectre méthanolique d’un composé flavonique peut être modifié

par l’addition de certains réactifs tels que : NaOH, NaOAc, AlCl 3 , H 3 BO 3 et

HCl, qui permettent la localisation des hydroxyles libres sur le squelette

flavonique.

33
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

Spectre d’absorption en présence de NaOH ou NaOMe :

Une base forte ionise tous les hydroxyles phénoliques du squelette

flavonique. Il en résulte un effet bathochrome sur les deux bandes І et ІІ. Cet

effet est plus important sur la bande І. Les flavonoides trés hydroxylés sont

instables en présence de ce réactif particulièrement pour les flavonoides

ayant un hydroxyle libre en 4' [2].

Ce déplacement bathochrome suivi d’une variation de l’intensité

lumineuse de la bande І renseigne sur le nombre et la position des

hydroxyles libres. L’apparition d’une nouvelle bande entre 320 et 335 nm

par rapport au spectre MeOH indique l’existence d’un OH libre en 7.

Cependant, l’effet de NaOH sur les flavones et les flavonols est de

détecter les groupement hydroxyles dans les positions 3 et ou 4'.

Spectre d’absorption en présence de NaOAc :

NaOAc, base faible ionise les hydroxyles phénoliques les plus acides

de la molécule, soient les groupes 7-OH, 4'-OH et 3-OH et elle ionise

spécialement le groupement hydroxyle en position 7. Ceci se traduit par le

déplacement sur la bande ІІ [6].

Spectre d’absorption en présence de H3BO3 + NaOAc :

L’acide borique (H 3 BO 3 ) forme en présence de NaOAc un complexe

avec les hydroxyles phénolique dans la position ortho du cycle B (3',4') [2].

34
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

OH

OH
OH
O
B
OH
O

O
O

H3BO3
H3O
NaOAC
O
O

Figure-14- : le complexe formé par le flavonoide

et le mélange (NaOAc+ H 3 BO 3 )

Spectre d’absorption en présence de AlCl3 et AlCl3+HCl :

AlCl3 forme avec le carbonyle C4 et l’hydroxyle des positions C3 ou

C5 des complexes qui se traduisent par un déplacement bathochrome de la

bande І. Ces complexes sont stables en présence de HCl, par contre ils

forment des complexes instables avec les groupes ortho dihydroxyles des

noyaux aromatiques A et B et se décomposent en présence de HCl.

La figure-14- montre l’explication précédente [7], [8].

35
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

OH Al Cl
HO O
O
HO O
OH AlCl3
Complexe instable
HCl aq Cl
O
Al
O O

OH
HO O
OH

HO O
AlCl3
O O Complexe stable
Al
OH Cl
Cl
OH O
OH

HO O

HCl aq

O O Cl

Al
Al
OH Cl O
Cl

OH O

HO O HO O

AlCl3 Complexe stable

OH O

O O
OH Al Cl

OH Cl

HO O

O HCl
O
Al
Cl
Cl

Figure-15- : formation des complexes après addition de AlCl 3 et en présence

de HCl

36
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

Le tableau-6 suivant résume les effets des réactifs sur le spectre UV : [1], [4].

Déplacement (nm)
Réactifs Interprétation
Bande І Bande ІІ

310-350 250-280 Flavone

MeOH
330-360 250-280 Flavonol(3-OR)
350-385 250-280 Flavonol(3-OH)

+40 à 60 avec stabilité

4'-OH
d’intensité
+50 à 60 avec
3-OH et 4'OR
diminution d’intensité
Faible déplacement
avec diminution 4'-OR
NaOMe d’intensité
(NaOH)
Apparition d’une 3éme
7-OH
bande entre BΙ et BΙΙ

Absence de bande entre

7-OR
320-335
Transformation de
5-OH (seul hydroxyle libre)
bande Ι en une
Inflexion.
+20 à 45 5-OH
AlCl3/
MeOH
+60 3-OH

-30 à -40 Ortho di OH sur le noyau B

AlCl3+
HCl/ Ortho di OH sur le noyau A (en
-20 à -25
ALCl3 plus ortho di OH sur le noyau B

37
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

5-OH
+35 à 55

AlCl3+
HCl/
+17 à 20 5-OH (avec 6-oxygénation)
MeOH

+50 à 60 3-OH ou 3-OH et 5-OH

+5 à 20 7-OH

Déplacement très faible 7-OR

NaOAc/ Diminution d’intensité

6,7; 7,8 ou 3',4'di OH
MeOH avec le temps

Le spectre se
décompose avec 5, 6,7 ; 5, 7,8 ou3, 3’,4’-tri OH
le temps

+12 à 36 3',4' di OH

NaOAc+
H3BO3
+5 à10 6,7 ou 7,8 di OH

38
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

ІІ- 3- La résonance magnétique nucléaire :

L’analyse par RMN est devenue aujourd’hui une méthode de routine

pour les études de la détermination structurale des composés naturels.

De nombreux noyaux atomiques peuvent être détectés par la

technique de RMN, les noyaux les plus utilisés sont le proton (H 1 ), le

carbone (C 13 ) en plus le phosphore (P 31 ), l’azote (N 16 ), le sodium (Na 23 ), le

potassium (K 3 9 ) et le fluor (F 19 ) (Fan 1996) [9].

ІІ- 3- 1- La RMN du proton (RMN-H¹) :

La RMN-H¹ comparée à la RMN- C¹³ est plus sensible. Le proton est

présent à 99.9 % dans la nature, tandis que l’abondance naturelle du C¹³ est

seulement de 1.1 %. Tous les métabolites organiques qui contiennent des H¹

sont susceptibles de donner des signaux.

Le spectre RMN-H¹ des composés flavoniques donne des informations

sur l’environnement des différents protons flavoniques qui résonnent

généralement entre 6 et 8 PPM et il permet de connaître [9] :

- La position et le nombre des protons portés par le flavonoide.

- Le nombre de substituant méthoxyles portés par le squelette

flavonique.

- Le nombre et la nature des sucres liés à l’aglycone.

39
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

Le tableau suivant montre le déplacement chimique des différents

protons du cycle A et B du squelette flavonique.

Tableau-7- : déplacement chimique des protons du cycle (A) :

H-5 H-6 H-8

Type de
,ppm ,ppm ,ppm
flavonoide
(J ;Hz) (J ;Hz) (J ;Hz)

6.0-6.2 6.3-6.5
5,7-OH
-
(d ; 2.5) (d ; 2.5)

5-OH ; 7-OR
5.9-6.1 6.1-6.4
-
(R=Glu)
(d ; 2.5) (d ; 2.5)

5, 6, 7-OR
- - 6.3 (S)
(R=H, Glu)

5, 7, 8-OR
- 6.3(S) -
(R=H, Glu)

7-OR
8.0 6.7-7.1 6.7-7
(R=H, Glu)
(d ; 9) (dd ; 9 ; 2.5) (d ; 2.5)

40
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

Tableau-8- : déplacement chimique des protons du cycle (B) :

Type de (H-5'/ H-3') (H-2'/ H-6')

Flavonoide ,ppm (J ;Hz) ,ppm (J ;Hz)

Flavone (4’-OR) 6.5-7.1 (d ; 8.5) 7.7-7.9 (d ; 8.5)

Flavonol (4’-OR 6.5-7.1 (d ; 8.5) 7.9-8.1 (d ; 8.5)

Type de H-2' H-6'

Flavonoide ,ppm (J ;Hz) ,ppm (J ;Hz)

Flavone (3',4'-OH ; 3'-OMe; 7.2-7.3 7.3-7.5

4'-OH; 3'-OH; 4'-OMe) (d;2.5) (dd;8.5;2.5)

7.5-7.7 7.6-7.9
Flavonol(3',4'-OH ; 2'-OH;
4'-OMe)
(d;2.5) (dd;8.5;2.5)

7.5-7.7 7.6-7.9
Flavonol (3',4'-OH ; 3'-OH;
4'-OMe)
(d;2.5) (dd;8.5;2.5)

41
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

Les protons du cycle (C) :

Le proton H3 des flavone donne un singulier entre 6.2 et 6.4 ppm.

Les protons des substituant méthoxyles :

Un ou plusieurs méthoxyles donnent des singuliers entre 3.8 et 4.5 ppm.

Les protons des sucres :

Le déplacement chimique du proton anomérique H¹'' des sucres est

lié à la position et la nature de la liaison entre le sucre et l’aglycone qui peut

exister en deux genres : O-glycosyl ou C-glycosyl.

Le tableau suivant donne les valeurs du déplacement des protons

anomériques de quelques glycosides :

Tableau-9- : Les valeurs du déplacement chimique de quelques

sucres dans le DMSO :

H-1’’ (,ppm) Nature de sucre

5.25-5.56 3-O-β-D-Glucoside

5.60 3-O-β-D-Galactoside

5.48 3-O-β-D-Glucuronide

5.37 3-O-β-D-Xyloside

5.31 3-O--L-Rhamnoside

5.00 4'-O-β-D-Galactoside

4.64-4.88 8-C-β-D-Glucoside

4.85-5.26 6-C-β-D-Rhamnoside

42
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

La valeur de la constante de couplage entre les protons H-1'' et H-2''

des glycosides monosacarides sert à identifier la nature de la liaison  ou β

entre le sucre et l’aglycone.

Par exemple pour le sucre glycose qui forme une liaison β, le H-1''

donne un doublet avec une constante de couplage J=7Hz due à un couplage

diaxial avec le H-2''.

Dans le cas du sucre Rhamnose qui forme une liaison , la valeur de

la constante de couplage J=2Hz due a un couplage eq-eq entre H-1''et H-2''

Toutefois on peut l’identifier à travers le doublet du groupe

méthylrhamnose qui se positionne entre 0.8-1.2 ppm avec une constante de

couplage J=6Hz [1].

ІІ- 3- 2- La RMN du carbone (RMN-C¹³) :

Elle donne des informations utiles et parfois nécessaires pour mieux

identifier la molécule telle que : [1], [10].

- Le nombre total des atomes de carbone du composé flavonique ainsi que

leur environnement.

- La connaissance du type des liaisons –C ou –O des sucres.

Le tableau suivant donne les plus importants déplacements de

quelques atomes de carbone.

43
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

Tableau-10 : déplacements chimiques de quelques carbones :

Déplacement chimique (ppm) Nature du carbone

7-22 Aromatique C-CH3

59-63 Aromatique O-CH3 orthodisubstitué

58-59 3-Méthoxyflavone (3-OCH3)

56-78 Sucre CH2-OH, CH-OH, C-glycoside

90-110 5,7-Dihydroxyflavonoide (C6-C8)

90-135 Flavone (C-3)

135-144 Flavonol (C-3)

3-Méthoxyflavone(C-3)

136-158 Flavonol(C-2)

3-Méthoxyflavone(C-2)

155-168 Flavone(C-2)

172-186 Flavone(C-4)

Flavonol(C-4)

3-Méthoxyflavone(C-4)

ІІ- 4- La spectrométrie de masse :

Cette technique permet la détermination du pic moléculaire des

aglycones qui donne globalement le nombre et la nature des substituants

hydroxyles ou méthoxyles. Les pics de fragmentation caractéristiques

fournissent des renseignements utiles, notamment sur les structures de

substitution des noyaux A et B [11,12].

44
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

Il existe différentes techniques en spectrométrie de masse dont les

plus utilisées sont :

- Spectrométrie de masse à impact électronique :

C’est la méthode la plus ancienne et la plus utilisée, le principe de

cette technique consiste à volatiliser la molécule par chauffage sous vide et à

bombarder cette vapeur.

- Spectrométrie de masse à bombardement atomique rapide

(FAB) :

Cette technique permet de connaître la nature des sucres, des

molécules hétérosidiques polaires peu volatiles.

- Spectrométrie de masse electrospray (ES) :

C’est une technique d’ionisation douce, plus récente que la FAB.

L’ionisation par ES dans le cas des flavonoides permet d’accéder à la

masse moléculaire des molécules peu volatiles et à structure fragile.

45
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

+ +

B B
+O O
C O

A A -CO A

O
m/z =105 (B2) m/z =222 (M )

OU / ET +

B
A
HC C
C O

m/z =102 (B1)

m/z =120 (A1 )

OH

C O+

m/z =121 (A1+H )

Figure -16- Principales ruptures sur le flavone.

46
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

+ +

B
H B
O O

A A

O H O

O
O

m/z =238 (M )

+
+
O
+
H B
O
-CO
A
O

m/z =77 (B-28) m/z =105 (B2) O

+
O

H B H
O

C O
A
O

O m/z =121 (A1+H)

Figure -17 - Principales ruptures sur le flavonol.

47
Chapitre II : Analyse Structurale des Flavonoides

ІІ- 5- L’hydrolyse acide des hétérosides :

Cette manipulation concerne dans un premier temps les flavonoides

O-glycosylés, elle renseigne sur la nature du sucre qui peut être étudié une

fois détaché ainsi que celle de l’aglycone. L’identification du sucre se fait par

Co-chromatographie avec des solutions authentiques.

Les hétérosides C-glycosylés résistent à l’hydrolyse acide, cette

propriété permet de différencier ce type de liaison dans les flavonoides

glycosylés.

GluO O HO O

H
(100 C°) Glu
O O

O-GlucosylFlavone Flavone

O O

H
GluOGlu Glu Glu
(100 C°)
O O

C-GlucosylFlavone C-GlucosylFlavone

Figure-18- hydrolyse acide des composés glycosylés.

48
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III-Plante végétale, méthodes d’extraction, séparation et purification:

III- 1 - Principes générales d’extraction, séparation et purification :

III- 1-1- Extraction :

L’extraction des flavonoides se fait selon le protocole préconisé par

LEBRETON (1967) modifié par Boutard (1962), Gonnet (1973) et Jay (1975).

Dont les étapes essentielles sont [1] :

- Macération répétée du matériel végétal dans une solution hydroalcoolique

(méthanol ou éthanol de pourcentage 1/1 ou 3/7).

- Extraction successives de type liquide-liquide par des solvants de polarité

croissante. Les solvants les plus utilisés sont : le dichlorométhane ou le

chloroforme qui permettent l’extraction des aglycones méthoxylés et

hydroxylés, l’acétate d’éthyle qui permet l’extraction des aglycones

polyhydroxylés et monoglycosylés et en dernier le n-butanol qui accède aux

hétérosides polyglycosyles et aussi les hétérosides de type C-glycosyle.

- Les extraits obtenus sont ensuite évaporés à sec et pesés pour un éventuel

traitement.

49
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III- 1-2- Séparation et purification :

a- Séparation :

La séparation des composés phénoliques est fondée essentiellement

sur la technique de chromatographie qui est une méthode physique de

séparation basée sur les différences d’affinités des substances à analyser à

l’égard de deux phases, l’une stationnaire ou fixe et l’autre mobile. Selon la

technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants

entraînés par la phase mobile résulte soit de leur adsorption et de leur

désorption successives sur la phase stationnaires soit de leur solubilité

différente dans chaque phase [2].

Il y a plusieurs techniques chromatographiques telles que :

- Chromatographie liquide sur colonne (CC).

- Chromatographie préparative sur papier (CP).

- Chromatographie préparative sur couche mince (CCM).

- Chromatographie haute performance (HPLC).

III- 1-2-1- Chromatographie sur couche mince :

La Chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement

sur des phénomènes d’adsorption [3] :

La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui

progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou

sur une feuille semi rigide de matière plastique ou d’aluminium.

50
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Après que l’échantillon est déposé sur la phase stationnaire, les

substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du

solvant.

Les principaux éléments d’une séparation chromatographique sur

couche mince sont : La cuve chromatographique, la phase stationnaire (gel

de silice, cellulose ou le polyamide), l’échantillon et l’éluant.

Lorsque les conditions opératoires sont connues, elles permettent un

contrôle aisé et rapide de la pureté d’un composé organique. Si l’analyse

réalisée avec divers solvants et différents adsorbants révèle la présence d’une

seule substance, on peut alors considérer que cet échantillon est

probablement pur.

De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince

indique le nombre de composants d’un mélange, on peut l’employer pour

suivre la progression d’une réaction.

La Chromatographie sur couche mince est également la technique

habituellement employée pour rechercher le meilleur solvant, avant

d’entreprendre une séparation par Chromatographie sur colonne.

L’éluant est formé d’un solvant, le tableau suivant résume les

systèmes de solvant les plus utilisés pour la séparation des flavonoides :

51
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Tableau -11 - : les systèmes les plus utilisés pour la séparation des

flavonoides [1].

Flavonoides Systèmes de séparation

Tol – Hex – MEC – MeOH

(30 : 90 : 2 : 1,5)

(60 : 30 : 10 : 5)

Tol – MEC – MeOH

Aglycones méthoxylés
(4 : 3 : 3)

Tol – Ep – MEC – MeOH

(60 : 26 : 10 : 10)

MeOH – AcOH – H2O

(18 : 1 : 1)

H2O – MeOH – MEC – Acac

Aglycones polyhydroxylés et
glycosylés
(13 : 3 : 3 : 1)

H2O – EtOH – n-BuOH – AcOH

(50 : 25 : 20 : 2)

52
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III- 1-2-2- Chromatographie sur papier :

La technique ressemble à celle de la CCM mais le principe repose sur

des phénomènes de partage. La phase mobile est le plus souvent organique

et l’eau ; la phase stationnaire est constituée par l’eau elle –même adsorbée

sur la cellulose du papier ou liée chimiquement à elle, comme en

chromatographie sur couche mince. L’échantillon mis en solution est déposé

en un point repère du papier et le solvant qui se déplace par capillarité fait

migrer les composants de l’échantillon à des vitesses variables selon leur

solubilité [1].

La chromatographie sur papier est employée principalement pour

l’analyse de composés très polaires tels que les acides aminés, les sucres et

les composés polyfonctionnels.

On peut utiliser du papier filtre ordinaire, mais il est préférable de se

procurer du papier conçu pour cet usage ayant un faible taux d’impuretés et

dont les caractéristiques sont uniformes. Les marques principales sont :

Whatman, Schleicher et Shull, Durieux, Arches. Il existe huit catégories de

papier Whatman, classés selon leur épaisseur, la texture de leur surface et

la vitesse avec laquelle l’eau s’y diffuse. Par exemple le papier Whatman N° 1

est le plus utilisé, mais si on désire une grande vitesse d’écoulement, on

emploiera le N°4 ; le papier N°20 est très lent, mais il permet une meilleure

séparation, donnant des taches très denses et uniformes[1-3].

53
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Les systèmes de solvants chromatographiques de bases sont :

1- AcOH : acide acétique à différentes concentrations.

2- B. A.W : [4/ 1 / 5] : n-butanol / Acide acétique / eau.

3- M. A.W : [4/ 1 / 5] : methanol / Acide acétique / eau.

4- T. B. A : [3/ 1 / 1] : tertiobutanol / Acide acétique / eau.

III- 1-2-3- Chromatographie sur colonne :

Alors que les autres méthodes chromatographiques sont

habituellement employées pour l’analyse et la séparation de très faibles

quantités de produits, la chromatographie sur colonne peut être une

méthode préparative ; elle permet en effet la séparation des constituants

d’un mélange et leur isolement à partir d’échantillons dont la masse peut

atteindre plusieurs grammes [1].

Elle présente cependant plusieurs inconvénients :

- De grandes quantités de solvant sont nécessaires à l’élution.

- La durée de l’élution est généralement très grande.

- La détection des composés exige une attention constante.

Elle est adaptée à la purification de faibles quantités de produit,

lorsque les conditions opératoires sont au point. Cependant, la méthode

étant très empirique, sa mise au point nécessite souvent de nombreux essais.

54
Chapitre IV : Résultats et Discussions

C’est une technique basée sur des phénomènes d’adsorption. La

phase solide, le plus souvent la silice ou l’alumine, remplit une colonne de

longueur et de section variables : l’échantillon en solution concentrée est

déposé en haut de la colonne et la séparation des composants résulte de

l’écoulement continu d’un éluant traversant la colonne par gravité ou sous

l’effet d’une faible pression. On peut utiliser comme éluant un solvant

unique ou bien accroître progressivement la polarité de l’éluant de façon à

accélérer le déplacement des composés [4].

Les molécules sont entraînées vers le bas à des vitesses variables

selon leur affinité pour l’adsorbant et leur solubilité dans l’éluant. Le

chromatogramme se développe en formant une succession de zones

cylindriques qui se séparent en migrant vers le bas. A mesure que chaque

zone s’écoule de la colonne, on la recueille.

Six facteurs dont dépend la séparation :

- L’adsorbant (gel de silice, polyamide SC6).

- Eluant (mélange de solvants).

- Dimension de la colonne.

- Remplissage de la colonne.

a- remplissage par voie humide.

b- remplissage par voie sèche.

- Dépôt des produits à analyser.

- La vitesse d’élution.

55
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III- 2- Etude chimique de l’espèce :

Les centaurées appartiennent à la vaste famille des astéracées ou

composés caractérisés par la présence de nombreuses petites fleurs

groupées en capitules serrées, qu’on a souvent tendance à prendre pour des

fleurs simples. A l’intérieur de cette famille, elles se rapprochent des cerises

et des chardons, mais leurs tiges et leurs feuilles ne portent pas d’épines.

III- 2- 1 - Caractéristiques communes :

Plantes à tiges rigides et pubescentes. Les feuilles alternes sont

disposées en spirale. Les capitules sont tubiliflores avec une périphérie de

fleurs stériles ayant souvent l’apparence d’étoiles.

L’involucre est composé de nombreuses bractées terminées par une écaille

qui peut être épineuse.

La famille Centaurea comprend 700 espèces à travers le monde, elle

est très répondue dans notre pays surtout dans l’est et le sud-est, il y en a

45 espèces [5].

56
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Le tableau-12- suivant résume les principales espèces :

PRINCIPALES ESPECES

Centaurea acaulis L Centaurea melitensis L.

Centaurea algeriensis Coss.& Durrieu Centaurea meryonis DC.
Centaurea alpestris Hegetschw Centaurea microptilon Godr.
Centaurea alpina L Centaurea mollis Waldst.
Centaurea aplolepa Moretti Centaurea montana L.
Centaurea aspera L Centaurea napifolia L.
Centaurea bracteata Scop Centaurea nemoralis Jord.
Centaurea calcitrapa L Centaurea nicaeensis All.
Centaurea centorum L Centaurea nigra L.
Centaurea cineraria L Centaurea nigrescens Willd.
Centaurea corymbosa Pourr Centaurea orientalis L.
Centaurea cyanus L Centaurea paniculata L.
Centaurea debeauxii Godr.& Gren Centaurea pannonica Heuff.
Centaurea decipiens Thuill Centaurea pectinata L.
Centaurea depressa M. Bieb Centaurea phrygia L.
Centaurea diffusa Lam Centaurea pseudophrygia Meyer.
Centaurea diluta Aiton Centaurea pullata L.
Centaurea dracunculifolia Dufour Centaurea ragusina L.
Centaurea glaberrima Tausch Centaurea rhaetica Moritzi.
Centaurea hanryi Jord Centaurea salicifolia M.Bieb
Centaurea hyalolepis Centaurea scabiosa L.
Centaurea iberica Trevir Centaurea solstitialis L.
Centaurea jacea L Centaurea sonchifolia L.
Centaurea jordaniana Godr Centaurea sphaerocephala L.
Centaurea maculosa Lam Centaurea splendens L.
Centaurea macrocephala Puschk Centaurea stoebe L.
Centaurea lecophaea Jord Centaurea thuillieri J.Duvign.

57
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Son importance est due à la variété de ses espèces et à la complexité

de ses composantes morphologiques et chimiques aussi à son activité

biologique.

Le genre centaurea a souvent été utilisé dans la médecine

traditionnelle comme remède à de nombreuses maladies telle que le diabète,

la diarrhée, rhumatisme, malaria, hypertension etc.

Comme exemple, les recherches faites par Beltran sur l’activité

hypoglycémique des quatre espèces : C-solistitialis, C-aspera, C-mélitensis,

C-calcitrapa et qui ont montré qu’après l’injection de l’extrait végétal chez les

lapins, on avait obtenu une diminution du niveau de sucre[6]. Le même

résultat a été constaté chez les souris après avoir utilisé l’extrait de l’espèce

C-aspera [7-8].

On peut citer aussi que les feuilles de C- solistitialis sont utilisées

pour guérir la fièvre et l’espèce C- mélitensis facilite la digestion, l’espèce

C-flaccosa est efficace contre les microbes, la partie supérieure de l’espèce

C-chilensis est utilisé comme remède au rhumatisme [9] aussi l’espèce

C-cyanus a un effet anti-inflammatoire [10].

58
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III- 2- 2- Les flavonoides isolées de la famille centaurea :

Plusieurs flavonoides ont étaient isolées de la famille centaurea,

le tableau-13- suivant montre quelques uns de ces structures :

FLAVONOIDES STRUCTURES ESPECES

C- solstitialis[11]
Aglycone :
C-nicaensis[12]
1
Patuletine
C-incana[13]

C- calcitrapa[14]
2
Quercétine
C-napifolia[15]

C-alexandrina[16]

C-arguta[17]

C-cuneifolia[18]

C-aspera[19]

C-jacea[20]
Jaceosidine 3
C-cineraria[21]

C-pallescens[22]

C-malcitana[23]
]
C-virgata[24]

C-inermis[24]

59
Chapitre IV : Résultats et Discussions

C-maroccana[5]

Apigenine 4 C-furfuracea[25]

C-calcitrapa[26]

C-maroccana[5]

Hispiduline 5 C-incana[13]

C-furfuracea[25]

C-cineraria[27]
Eupatiline
6
C-cuneifolia[18]

Salvigenine 7 C-cuneifolia[28]

C-cineraria[29]

Eupatorine C-cuneifolia[18]
8
C-pseudomaculosa
[30]

Morine 9 C-calcitrapa[31]

Cirsilineol 10 C-bruguierana[32]

Hétéroside :
11 C-incana[13]
Patuletine 7-Oglucoside
C-solstitialis[11]

C-pullata[12]

C-furfuracea[33]

Neptine7-glucoside 12 C-militensis[34]

Luteoline7-Oglucoside 13 C-militensis[34]

60
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Luteoline7-diglucoside 14 C-montana[35]

Apigenin7-Oglucoside 15 C-furfuracea[36]

Kaempférol 7-Oglycoside 16 C-cyanus[37]

Isoorientin 17 C-montana[38]

Isovitexin 18 C-militensis[34]

OH

OH
OH

OH

HO O

HO O

OH

HO OH
OH O

OH O Patuletin Quercétine

1 2
OMe

OH
OH

HO O
HO O

H
MeO H

OH O
OH O Jaceosidine Apigénine

3 4

61
Chapitre IV : Résultats et Discussions

OMe

OH OMe

HO O HO O

MeO H MeO H

OH O OH O
Hispiduline Eupatiline

5 6
OH

OMe OMe

MeO O MeO O

MeO H MeO H

OH O OH O
Salvigenine Eupatorine
7 8
OMe

OH
HO OH

MeO O
HO O

MeO H
OH

OH O
O Morine Cirsilineol

9 10
OH OH

OH OH

GluO O GluO O

MeO OH MeO

OH O OH O
Patuletine 7-Oglucoside Neptine 7-Oglucoside
11 12

62
Chapitre IV : Résultats et Discussions

OH OH

OH OH

GluO O GluOdi O

OH O OH O
Luteoline 7-Oglucoside Luteoline 7-di-glucoside
13 14

OH

GluO O
GluO O

H
OH
OH O
OH O
Apigénine 7-oglucoside Kaempférol 7-Oglucoside
15 16

OH H

OH OH

HO O HO O

ulg ulg

OH O OH O

Isoorientine Isovitexin
17 18

63
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III- 3- Matériel végétal :

La plante a été récoltée en début d’avril 1999 aux environ de la ville

de Biscra dans le sud-est algérien. Après séchage dans un endroit sec et à

l’abri des rayons solaires, les parties aériennes ont été coupées en petits

morceaux et pesées (2,5 Kg).

III- 3-1- Choix du matériel végétal :

Plusieurs critères ont guidé notre chois, parmi lesquels :

- L’endémisme de l’espèce C maroccana.

- notre intérêt au genre Centaurea pour leur richesse en métabolites

- secondaires, notamment les flavonoides.

III- 3-2- Description botanique :

C’est une plante épineuse florale qui s’épanouie en fin de

printemps. Ses tiges sont de longueur qui varie entre 20 et 40 cm et

ses fleurs avec épines sont de couleur jaune et de taille moyenne [5].

III- 3-3- Place dans la systématique :

Embranchement Angiospermes

Classe Dictotyledones

Ordre Asterales

Famille Composées

Sous-famille Tubiflores

Tribu Cynarées

Genre Centaurea

Espèce Maroccana

64
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III- 3-4-Répartition géographique :

Elle est commune au Sahara de l’Algérie et du Maroc.

Figure -19- : photo de Centaurea maroccana

65
Chapitre IV : Résultats et Discussions

L’étude phytochimique de la plante par notre laboratoire sur la phase

Acetate d’éthyle a permis d’identifier cinq produits purs dont deux

flavonoides [5] :

18
20
14
19
17 OH
1 9 O 16
2 10 8
OH
3 7 O
4 5 6 13
11

O 12
15
HO
O
5Hα,6Hβ,7Hα-15-hydroxy-8α(1`,2`-dihydroxyethyl)
-acryloxy-elema-1(2),3(4),11(13)-trien6,12-olide

18

1 9 20
10
O 16 19
2 17
8 OH
14
5 7
3
6
O OH
4 11 13

O 12
HO 15

O
Cnicine

3`
OH
2` 4`
8
HO O 5`
7
6`
6
3
MeO 5

OH O
Hispulidine
3` OH
2`
4`
8 2` 3 1
HO 7 O 5` MeO
6` 3` 1` 2 OH

6 3 6`
4`
5 HO 5`

OH O OH

Apigénine 3-(3-methoxy4,5-dihydroxyphenyl)-propan-1-ol

66
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III- 4- Protocole expérimentale :

III- 4-1- Extraction :

La quantité de matériel végétal obtenue (2500g) a subit une

macération dans un mélange hydroalcoolique (MeOH / H2O ; 80 : 20 ; V/V)

pendant 24 heures. Le premier extrait récupéré est concentré sous pression

réduite et a une température modérée (entre 35-40°C). La macération est

répétée trois fois avec renouvellement du solvant.

Les trois extraits hydro alcooliques récupérés sont réunis et

concentrés à la solution concentrée obtenue, on ajoute de l’eau distillée et du

tétra acétate de plomb Pb(OAc) 4 . La solution ainsi obtenue est laissée au

repos à froid pendant une nuit pour décantation. Cette décantation permet

le dépôt de la chlorophylle.

Après filtration on obtient une solution aqueuse. Cette phase

aqueuse subit une extraction de type liquide-liquide en utilisant des solvants

de polarité croissante, on commence par le chloroforme, puis l’acétate

d’éthyle et en dernier le n-butanol.

Les trois phases organiques récupérées sont séchées avec du

Na 2 SO 4 anhydre puis filtrées, concentrées sous pression réduite à sec et

pesées. On obtient 12g d’extrait pour la phase chloroforme, 20g d’extrait

pour la phase acétate d’éthyle et 40g pour la phase n-butanol.

L’organigramme suivant montre les différentes étapes du processus

d’extraction.

67
 Chapitre IV : Résultats et Discussions

Matière végétale
m=2500g

•Macération à froid pendant 24h dans

un mélange MeOH/H2O (80 :20 ;v/v)
et répétée 3 fois (24-48h)
•filtration

Extrait Méthanolique

•Concentration non à sec (t =35°C)

•Dilution avec de l’eau distillée
Précipitation de la chlorophylle par
le (CH3COO) 4 Pb
•filtration

Filtrat

•Extraction par du CHCL 3 (x3)

•Décantation

Phase aqueuse Phase organique

•Extraction par de l’AcOEt(x3)

•Décantation •Séchage par Na 2 SO 4
anhydre
•Filtration
•Concentration à t=35°C
Phase aqueuse Phase organique

•Extraction par le n- •Séchage par Na 2 SO 4

butanol Anhydre
•Décantation •Filtration
•Concentration à t=35°C

Extrait AcOEt
Phase Phase M =20g
aqueuse organique

•Séchage par Na 2 SO 2 anhydre

•Filtration
•Concentration

Extrait n-butanol
M=30g

68
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III- 4-2- Séparation chromatographique :

Avant d’entamer la séparation par chromatographie nous avons

procédé à des tests analytiques primaires sur l’extrait butanolique en

utilisant la chromatographie sur papier Wathman n=3.

- D1 : SI: ( BAW 4/1/5 )

D2 : S II : ( AcOH 15% )

et

- (AcOH 30%)

Nous avons obtenu les chromatogrammes suivants :

Figure-20- : chromatogramme de séparation

69
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III- 5- Séparation et purification des composants de l’extrait

butanolique :

Nous avons procédé à des tests chromatographiques sur couche

mince de gel de silice par de multiple système de solvant polaire, apolaire et

moyennement polaire qui nous ont mené au bon système de séparation.

La meilleure séparation a été obtenue avec le test chromatographique

sur couche mince de gel de silice avec un système : AcOEt/MeOH/Eau

( 8.1.1 ).

III- 5-1- Séparation sur colonne :

L’extrait brut de la phase butanolique des feuilles et des fleurs 8g a

été dissous dans le méthanol et mélangé avec une quantité de gel de silice

puis évaporé à sec conduisant à une poudre solide qui est déposée sur une

colonne de gel de silice préparé dans un système isocratique

( AcOEt/MeOH/Eau 8-1-1 ).

Le mélange est élué par le système 8 :1 :1 en mode isocratique

jusqu'à l’épuisement de l’extrait. Le suivi des fractions est effectué par

chromatographie sur couche mince de gel de silice sur support aluminium.

Les plaques sont visualisées sous lumière UV (254-365 nm). Cette colonne a

permis l’obtention de 48 pots de 25 ml.

70
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Les fractions récoltées de la colonne ont été contrôlées sur des plaques de

CCM de gel de silice 60 en utilisant divers systèmes d’élution. L’examen des

plaques sous UV à 254 et 365 nm a permis de réaliser un regroupement par

le système (8 :1 :0.25) qui est présenté dans le tableau suivant :

Fractions Nom de la fraction Observations

1-10 F10 Mélange séparable

11-14 F14 Mélange séparable

15-18 F18 Mélange séparable

19-24 F24 Mélange séparable

25-28 F28 Mélange complexe

29-31 F31 Mélange complexe

32-38 F38 Mélange complexe

39-44 F44 Absence des produits

44-48 F48 Absence des produits

Tableau-14- : Regroupement des fractions issues de la colonne

chromatographique de l’extrait butanolique de C maroccana.

71
Chapitre IV : Résultats et Discussions

III- 5-2- Séparation sur couche mince :

Fraction F14 :

La fraction F14 a subit une séparation sur plaque de gel de silice en utilisant

comme système d’élution AcOEt /MeOH/Eau (8 :0.5 :0.25).

Les résultats obtenus sont reportés sur le tableau suivant :

Tableau -14 - : résultats de séparation de la fraction F14.

Sous fraction Remarques

F1 produit pur (noir violet 365nm)

F2-1 Produit pur (noir violet 365nm)

F2 produit très pur (noir violet 365nm)

Fraction F18 :

La fraction F18 a subit une séparation sur plaque de gel de silice en

utilisant comme système d’élution : CHCl3/MeOH ( 4: 1 ) .

Les résultats obtenus sont reportés dans le tableau suivant :

Tableau -15 - : résultats de séparation de la fraction F18

Sous fraction Remarques

F5 Produit noir violet 365nm

F6 Produit noir violet 365nm

Fav Produit pur noir violet 365nm

72
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Fraction F24 :

La fraction F24 a subit une séparation sur plaque de gel de silice en utilisant

comme système d’élution : AcOEt /MeOH/Eau (8 :0.5 :0.25).

Tableau -16 - : résultats de séparation de la fraction F24

Sous fraction Remarques

F4 Produit vert noir violet 365nm

Fc Produit jaune noir violet 365nm

Fb Produit orange noir violet 365nm

F7 Produit noir violet 365nm

Fraction F31, F38, F44 et F48 :

Pour les fractions F31, F38, F44 et F48, on remarque après le test sur les
plaques CCM gel de silice l’absence de la fluorescence sous lumière de Wood
à 254 nm et 365 nm.

Résultats de séparation :
L’ensemble des méthodes de séparation a permis d’isolé trois produits : F2,
F1, FC.

73
Chapitre IV : Résultats et Discussions

IV –Détermination structurale des produits isolés de l’espèce :

IV -1 - Le composé F2 :

IV-1-2- Interprétation :

La fluorescence noire violette sous lumière de Wood est

caractéristique d’une flavone ou d’un flavonol substitué en 3.

Les données de la série spectrale UV (spectre Nº-1-, tableau Nº -17-)

montrent :

Le maximum d’absorption de la bande I à 336 nm indique qu’il s’agit

d’un flavonoide de type flavone.

L’addition de NaOH provoquant un déplacement bathochrome de la

bandeI (Δλ= +52 nm) avec augmentation de l’intensité lumineuse indique la

présence d’un OH libre en 4', l’absence d’une nouvelle bande entre 320-330

nm écarte la présence d’un OH libre en 7

L’addition de NaOAc ne provoque pas un déplacement bathochrome

de la bande II (reste 267nm) par rapport au spectre enregistré dans le MeOH

qui confirme l’absence d’un OH libre en 7.

Le déplacement bathochrome de la bande I enregistré dans le milieu

(AlCl 3 + HCl) comparativement à celui enregistré dans le méthanol (Δλ= +48

nm) révèle la présence d’un OH libre en 5.

L’absence du déplacement hypsochrome de la bande I en comparant

le spectre AlCl 3 + HCl par rapport au spectre de AlCl 3 , laisse prévoir

l’absence de système ortho dihydroxylé sur le cycle B.

74
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Tableau -17 - : Données de la série spectrale UV

Réactifs Bande I Autres Bande II Commentaire

bandes

MeOH 336 / 268 Flavone

+NaOH 388 / 268 OH libre en 4'

OH libre en 7

+ AlCl 3 384 300-348 276 Pas de ortho

di-OH sur le
cycle B
+ AlCl 3 /HCl 384 300 - 344 276
OH libre en 5

+ NaOAc 388 344 268 OR en 7

+NaOAc/H 3 BO 3 340 / 268 /

Spectre stable en présence de NaOH après 5mn

Ces données nous permettent de proposer la structure partielle suivante :

OH

RO O

composé F2
OH O

75
Chapitre IV : Résultats et Discussions

L’examen des spectres RMN protons (figure-21,22-, tableau -18-) montre :

- Un singulet à δ = 6,7 ppm attribuable à H-3, ce qui confirme la

structure d’une flavone.

- Deux doublets d’intégration 1H chacun, le premier à δ = 6,5 ppm et le

second à δ = 6,8 ppm (J= 2 Hz) attribuables respectivement à H-6 et H-8 et

confirmant l’hydroxylation des positions 5 et 7.

- Deux doublets d’intégration 2H chacun à δ = 7.9 et δ = 6.9 ppm,

( J=8,7 Hz) attribuables respectivement à H-2', H-6' et H-3', H-5' indiquant

ainsi la substitution du noyau B en position 4' .

- un multiplet entre 3.5 – 4 ppm qui indique la présence d’un sucre.

- un H anomérique sous forme de doublet à 5.2 ppm, J=6.75 qui

oriente vers deux possibilités : un galactose ou un glucose.

- H’’5 du sucre fait un couplage de J= 9 HZ (couplage diaxial avec le

proton H’’4) qui confirme que le sucre est un glucose.

- un OCH3 a J=3.8 ppm appartenant au sucre.

L’emplacement du OCH3 sur le sucre :

L’emplacement ne peut se faire que sur le carbone 6 du glucose

On peut admettre deux possibilités :

1- un : CH2―OMe

2- un : ―C=O―OMe une fonction ester

La valeur du déplacement de H5 a 4.2 ppm montre un déblindage de ce

dernier indiquant ainsi que la fonction ester est en position C6.

76
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Donc une fonction ester substitué comme l’indique la deuxième possibilité.

-L’examen du spectre IR (figure-23-) nous donne une première série

d’information concernant la structure du composé F2.

Les bandes d’absorption observées permettent de déduire la présence de

fonction ou des groupements spécifiques tels que :

La fonction ―C=O― de l’aglycone :

-La valeur de l’absorption du C=O dépend des effets dus aux groupes voisins,

de la conjugaison et des liaisons H . Pour notre aglycone la conjugaison avec

une double liaison C=C diminue la force de la liaison C=O et de la liaison

C=C. Il y a effet bathochrome pour les deux absorptions ∂C=O et ∂C=C

(∂C=O à 1666 cm-1). La bande large à 3419 cm-1 confirme la présence d’une

fonction OH faisant une liaison H….O― Intra moluculaire.

-La fonction OH présentée par une bande forte et pas trop large vers 3419.6

cm-1.yè - 77 - - 77 -

-La fonction ―C=O―O―Me ester du sucre trouvée à 1741.6 cm-1.

77
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Tableau -18- : données du spectre RMN

Déplacement Intégration Multiplicité Attributions

chimiques δ (J Hz)
(ppm)

7.9 2H d (8,7) H-2', H-6'

6.9 2H d (8,7) H-3', H-5'

6,7 1H s H-3

6,8 1H d (2) H-8

6.5 1H d (2) H-6

5.2 1H d (6.75) H-1" glu

3.5 – 4 m / Protons sucre

3.8 3H / OCH3 sucre

4.2 1H d (9) H-5 sucre

L’ensemble des données de la série spectrale UV ainsi que la RMN 1H

oriente vers le composé : 7-O-Methylglucuronyl Apigénine.

H
COOMe
H O
HO
OH
HO H
OH

H O O

O
H2O
Apigénine 7-O-Methylglucuronyl

78
Chapitre IV : Résultats et Discussions

H
COOMe
H O
HO OH
HO H
H OH

H O O

O
H2O
Apigénine 7-O-Methylgluronyl

0,20 0,2

0,18 MeOH
MeOH NaOH
0,16 NaOH+ 5mn

0,14
Y Axis Title
Y Axis Title

0,12

0,10

0,08

0,06

0,04

0,02
0,0
300 400
0,00
300 400 XAxis Title
XAxis Title

0,20 0,20

0,18 MeOH
MeOH NaOAc
AlCl3 0,16 H3Po4
0,15 AlCl3 + HCl
0,14
Y Axis Title

0,12
Y Axis Title

0,10
0,10
0,08

0,06

0,05 0,04

0,02

0,00
0,00 300 400
300 400
X Axis Title
X Axis Title

Spectre-1: Série spectrale UV du composé F2

79
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Figure-21- : Spectre RMN proton F2 dans méthanol

80
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Figure-22- : Spectre RMN proton F2 dans méthanol

81
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Figure-23- : Spectre IR du composé F2 dans KBr solide

82
Chapitre IV : Résultats et Discussions

IV -2 - Le composé Fc :

IV-1-3- Interprétation :

La fluorescence noire violette sous lumière de Wood est

caractéristique d’une flavone ou d’un flavonol substitué en 3.

Les données de la série spectrale UV (spectre Nº-2-, tableau Nº -19-)

montrent :

Le maximum d’absorption de la bande I à 332 nm indique qu’il s’agit

d’un flavonoide de type flavone.

L’addition de NaOH provoquant un déplacement bathochrome de la

bande I (Δλ= +48 nm) avec augmentation de l’intensité lumineuse indique la

présence d’un OH libre en 4', l’absence d’une nouvelle bande entre 320-330

nm écarte la présence d’un OH libre en 7.

L’addition de NaOAc ne provoque pas un déplacement bathochrome

de la bande II (reste 276 nm) par rapport au spectre enregistré dans le MeOH

qui confirme l’absence d’un OH libre en 7.

Le déplacement bathochrome de la bande I enregistré dans le milieu

(AlCl 3 + HCl) comparativement à celui enregistré dans le méthanol (Δλ= +20

nm) révèle la présence d’un OH libre en 5 et un OH libre en 6.

Le déplacement bathochrome de la bande I enregistré dans le milieu

(NaOAc/H 3 BO 3 ) comparativement à celui enregistré dans le méthanol (Δλ=

+4 nm) révèle la présence d’un OH libre en 6

L’absence du déplacement hypsochrome de la bande I en comparant

le spectre AlCl 3 + HCl par rapport au spectre de AlCl 3 laisse prévoir

l’absence de système ortho dihydroxylé sur le cycle B.

83
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Tableau -19 - : Données de la série spectrale UV

Réactifs Bande I Autres Bande II Commentaire

bandes

MeOH 332 / 272 Flavone

+NaOH 388 / 272 OH libre en 4'

+ AlCl 3 356 296 276 Pas de ortho

di-OH sur le
cycle B
+ AlCl 3 /HCl 352 300 276
OH libre en 5
OH libre en 6

+ NaOAc 392 336 272 OR en 7

+NaOAc/H 3 BO 3 336 / 272 OH en 6

Spectre stable en présence de NaOH après 5mn

Les déférentes méthodes chromatographiques utilisées ont permis de mettre

une structure probable du composé Fc.

OH

RO O

HO

OH O
Composé Fc

84
Chapitre IV : Résultats et Discussions

OH

RO O

HO
Composé Fc
OH O

0,2 0,5

MeOH
MeOH 0,4 NaOH
NaOH +5mn
Y Axis Title

Y Axis Title
0,3

0,1

0,2

0,1

0,0 0,0
300 400 300 400
X Axis Title X Axis Title

0,20
MeOH
MeOH NaOAc
AlCl3 NaOAc+H3PO3
0,15 AlCl3 + HCl
0,1
Y Axis Title
Y Axis Title

0,10

0,05

0,0
300 400
0,00
300 400 X Axis Title
X Axis Title

Spectre-2: Série spectrale UV du composé Fc

85
Chapitre IV : Résultats et Discussions

IV -3 - Le composé F1 :

IV-1-4- Interprétation :

La fluorescence noire violette sous lumière de Wood est

caractéristique d’une flavone ou d’un flavonol substitué en 3.

Les données de la série spectrale UV (spectre Nº-3-, tableau Nº -20-)

montrent :

Le maximum d’absorption de la bande I à 348 nm indique qu’il s’agit

d’un flavonoide de type flavone.

L’addition de NaOH provoquant un déplacement bathochrome de la

bandeI (Δλ= +48 nm) avec augmentation de l’intensité lumineuse indique la

présence d’un OH libre en 4', l’absence d’une nouvelle bande entre 320-330

nm écarte la présence d’un OH libre en 7

L’addition de NaOAc ne provoque pas un déplacement bathochrome

de la bande II (reste 276nm) par rapport au spectre enregistré dans le MeOH

qui confirme l’absence d’un OH libre en 7.

Le déplacement bathochrome de la bande I enregistré dans le milieu

(AlCl 3 + HCl) comparativement à celui enregistré dans le méthanol (Δλ= +44

nm) révèle la présence d’un OH libre en 5.

L’absence du déplacement hypsochrome de la bande I en comparant

le spectre AlCl 3 + HCl par rapport au spectre de AlCl 3 laisse prévoir

l’absence de système ortho dihydroxylé sur le cycle B.

86
Chapitre IV : Résultats et Discussions

Tableau -20 - : Données de la série spectrale UV

Réactifs Bande I Autres Bande II Commentaire

bandes

MeOH 348 / 276 Flavone

+NaOH 396 / 276 OH libre en 4'

OH libre en 7

+ AlCl 3 388 348 272 Pas de ortho

di-OH sur le
cycle B
+ AlCl 3 /HCl 392 348 268
OH libre en 5

+ NaOAc 348 304 276 OR en 7

+NaOAc/H 3 BO 3 336 / 268 /

Spectre stable en présence de NaOH après 5mn

Les différentes méthodes chromatographiques utilisées ont permis de mettre

une structure probable du composé F1

OH

R'O O

OH O Composé F1

87
Chapitre IV : Résultats et Discussions

OH

R'O O

OH O Composé F1

0,2 0,5

MeOH
NaOH
MeOH NaOH + 5mn

Y Axis Title
Y Axis Title

0,1

0,0
0,0 300 400
300 400
X Axis Title
X Axis Title

0,3 0,2

MeOH
MeOH
AlCl3
NaOAc
AlCl3+HCl
H3PO3

0,2
Y Axis Title

Y Axis Title

0,1

0,0 0,0
300 400 300 400
X Axis Title X Axis Title

Spectre-3: Série spectrale UV du composé Fa

88
 Le but principal de notre travail est d’étudier les métabolites

secondaires de Centaurea maroccana récoltée au sud est de Biskra.

Les différentes méthodes chromatographiques utilisées ont permis

l’isolement et la purification de trois produits. Nous avons pu par des

méthodes de spectroscopie de résonance magnétique et de la

spectrophotométrie UV d’établir la structure d’un produit isolé : qui est

décrit pour la première fois pour cette espèce, il s’agit de l’Apigenine 7-O-

Methylglucuronyl et de donner deux structures probables qui sont :

H
COOMe
H O
HO OH
HO H
H OH

H O O

OH O

Apigénine 7-O-Methylglucuronyl

OH OH

RO O R'O O

HO

OH O Composé Fc OH O Composé F1

L’étude phytochimique de Centaurea maroccana a donné d’autres

composés chimiques d’après chromatogrammes des plaques CCM.

La purification de ces composés c’est avérée très difficile, voir même

impossible.

Les faibles quantités d’autres composés n’ont pas permis de réaliser

les analyses spectrales.

 Nos perspectives de recherche pour le futur sont les suivantes :

- poursuivre l’étude phytochimique de l’espèce Centaurea maroccana. Afin

d’isoler d’autres métabolites secondaires contenus dans nos extraits.

- Etudier l’activité de ces métabolites afin de confirmer ou d’infirmer l’activité

biologique attribuée à cette plante.

- Réaliser l’étude biologique des molécules actives.

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[35] Gonnet, J.F. (1989). These Lyon I

[36] Akkal, S., Benayache, F., Benayache, S. Medjroubi, K. And Jay, M.

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[37] Asen, S. Putun E,(1987). Doga.Kim. Ser., 11(2), 66-71.

[38] Gonnet, J.F. (1989). These Lyon I

 Résumé

Ce travail fait partie de notre programme de recherche sur les

plantes médicinales algériennes de la famille des composés pour

obtenir des molécules « Flavonoides » actives qui peuvent contribuer

dans l’industrie pharmaceutique.

L’utilisation des différentes méthodes de séparation

chromatographiques (Colonne, papier et couche mince) nous ont

permis d’isoler trois flavonoides issues de la plante médicinale

Centaurea maroccana.

La structure des composés isolés a été bien établie grâce aux

méthodes Spectroscopiques (UV, RMN).

Mots-clés : Composés, Flavonoides, Centaurea maroccana.

 ‫ﻤﻠﺨﺹ‬

‫ﻴﻨﺩﺭﺝ ﻫﺫﺍ ﺍﻟﻌﻤل ﻀﻤﻥ ﺒﺭﻨﺎﻤﺞ ﺒﺤﺙ ﻟﻠﻨﺒﺎﺘﺎﺕ ﺍﻟﻁﺒﻴﺔ ﻟﻠﻌﺎﺌﻠﺔ ‪ composée‬ﺒﻐﻴﺔ ﺍﻟﺤﺼﻭل ﻋﻠﻰ ﺠﺯﻴﺌﺎﺕ‬
‫ﻓﻼﻓﻭﻨﻴﺩﻴﺔ ﻓﻌﺎﻟﺔ ﻗﺩ ﺘﺴﺎﻫﻡ ﻓﻲ ﺘﻘﺩﻴﻡ ﻨﻔﻊ ﻟﻠﺼﻨﺎﻋﺔ ﺍﻟﺼﻴﺩﻻﻨﻴﺔ‪.‬‬

‫ﻤﻥ ﺨﻼل ﻤﺨﺘﻠﻑ ﺍﻟﻁﺭﻕ ﺍﻟﻜﺭﻭﻤﺎﺘﻭﻏﺭﺍﻓﻴﺔ )ﺍﻟﻌﻤﻭﺩ ﺍﻟﻭﺭﻕ ﻭ ﺍﻟﻁﺒﻘﺔ ﺍﻟﺭﻗﻴﻘﺔ( ﺘﻤﻜﻨﺎ ﻤﻥ ﻓﺼل ﺜﻼﺜﺔ ﻤﺭﻜﺒﺎﺕ‬
‫ﻓﻼﻓﻭﻨﻭﻴﺩﻴﺔ ﻤﻥ ﻨﺒﺎﺕ ‪. Centaurea Maroccana‬‬

‫ﺘﺤﺩﻴﺩ ﺒﻨﻴﺎﺕ ﺍﻟﺠﺯﻴﺌﺎﺕ ﺘﻡ ﺤﺴﺏ ﺍﻟﺘﻘﻨﻴﺎﺕ ﺍﻟﻔﻴﺯﻴﻭﻜﻴﻤﻴﺎﺌﻴﺔ ‪ :‬ﻤﻁﻴﺎﻓﻴﺔ ﺍﻷﺸﻌﺔ ﻓﻭﻕ ﺍﻟﺒﻨﻔﺴﺠﻴﺔ ‪ UV‬ﻤﻁﻴﺎﻓﻴﺔ‬
‫ﺍﻟﺭﻨﻴﻥ ﺍﻟﻨﻭﻭﻱ ﺍﻟﻤﻐﻨﺎﻁﻴﺴﻲ ‪.RMN‬‬

‫ﺍﻟﻜﻠﻤﺎﺕ ﺍﻟﻤﻔﺘﺎﺤﻴﺔ ‪:‬ﺍﻟﻌﺎﺌﻠﺔ ‪ Composés‬ﺍﻟﻔﻼﻓﻭﻨﻭﻴﺩﺍﺕ‪ ,‬ﻨﺒﺎﺕ ‪Centaurea Maroccana‬‬

 Summary

This work makes part of research program on the algerian

plants of the family composé which might help in the pharmaceutical

industry

The use of the different chromatographic separation methods

(column, paper, thin layer) permitted the isolation of three flavonoids

from Centaurea maroccana.

The recognition of the structure of the separated and purified

molecules is done according to the physico-chemical technics we

usually use: Ultraviolet-visible spectroscopy, Magnetic resonance

spectroscopy.

Key Words: Apiaceae, Flavonoids, Centaurea maroccana .