méthodes de dosage des protéines (dosage des protéines du lactosérum)
composition du lactosérum pour 1 L
protéines 2-10 g
glucides 48 g
lipides 1g
calcium 1,05
Na 1,30
K 1,40
Mg 0,150
Cl 1,00
1. Dosage de l'azote total du lactosérum par la méthode de Kjeldahl:
1.1. Minéralisation:
Dans un matras de minéralisation introduire:
5 mL de lactosérum
0,5 g de catalyseur
10 mL d'acide sulfurique concentré ( environ 18 mol/L)
2 grains de pierre ponce
Minéraliser sous hotte.
Laisser 30 min après éclaircissement.
Laisser refroidir.
Sous un courant d'eau froide, reprendre progressivement par 50 mL d'eau distillée.
1.2. Alcalinisation et dosage:
Monter l'appareil à distiller de Kjeldahl et le rincer par distillation d'eau.
Introduire le minéralisat dans le ballon à distiller. Joindre les eaux de rinçage.
Alcaliniser par de l'hydroxyde de sodium concentré (10 mol/L) en présence de
phénophtaléine. (calculer le volume de NaOH à verser)
Distiller et recueillir l'ammoniac dans exactement 20 mL d'acide sulfurique à
0,050 mol/L, en présence d'indicateur coloré.
Doser l'excès d'acide sulfurique par une solution d'hydroxyde de sodium à
0,100 mol/L.
Réaliser un dosage témoin.
1.2. Résultats:
1.2.1. Déterminer la concentration en azote total du lactosérum en mmol/L.
1.2.2. Déterminer la concentration massique en protéines du lactosérum sachant que
l'azote représente 16 % en masse des protéines.
2. Dosage des protéines par la méthode de Bradford:
2.1. Etalonnage de l'appareil et détermination des caractéristiques de la méthode:
A partir d'une solution étalon de protéines à 2,0 g/L, préparer 10 solutions étalons
filles de concentration allant de 0 à 2,0 g/L. (Volume de 5 mL pour chaque solution)
Utiliser de l'eau physiologique comme diluant.
Coloration:
Introduire dans un tube à hémolyse:
Echantillon à doser 0,100 mL
Réactif au bleu de Coomassie 2 mL
Mélanger. Attendre 5 min. Lire les absorbances à 612 nm contre un témoin réactif.
Stabilité de la réaction : 30 min
Nettoyer les cuves avec un mélange eau-éthanol.
Détermination des seuils de détection et de quantification:
Effectuer 20 mesures successives sur le tube "témoin de gamme". Calculer la moyenne
m des valeurs lues et l'écart-type s sur ces valeurs.
seuil de détection = m + 3*s
seuil de quantification = m + 10*s
Réactif au bleu de Coomassie
Bleu de Coomassie 250 Merck1544 20 mg
Ethanol absolu 25 mL
Acide phosphorique 85% 50 mL
Eau 400 mL
SDS Merck 15 mg
Eau qsp 500 mL
2.2. Caractéristiques de la méthode:
Etablir un tableau de colorimétrie.
Tracer la courbe d'étalonnage : A = f(quantité par tube) et A = f(c g/L)
Analyser l'allure de la courbe, modéliser et indiquer les paramètres de la
modélisation.
Déterminer la limite supérieure de linéarité.
Déterminer la sensibilité de la méthode (préciser les unités)
Déterminer le seuil de détection et le seuil de quantification de la méthode.
2.3. Dosage des protéines du lactosérum: (2 essais)
Le lactosérum a une teneur en protéines comprise entre 2 et 10 g/L.
Déterminer sa concentration massique en protéines.
3. Dosage colorimétrique des protéines par la méthode du biuret :
3.1. Mode opératoire:
Dans un tube à essais, introduire :
* E = 1 mL d'échantillon à doser
* 4 mL de réactif de Gornall
Attendre 30 min à l'obscurité, à température ambiante
Mesurer l'absorbance à 540 nm contre un témoin réactif.
Stabilité de la réaction : 30 min
Limite de linéarité : 12 g/L
3.2. Etalonnage de l'appareil :
A l'aide d'une solution étalon de protéines à 10 g/L en équivalent albumine, réaliser
une gamme large de solutions allant de 0 à 10 g/L sous un volume de 1 mL
Traiter chaque étalon selon le mode opératoire du § 3.1.
3.3. Caractéristiques de la méthode:
Etablir un tableau de colorimétrie.
Tracer la courbe d'étalonnage : A = f(c g/L)
Analyser l'allure de la courbe, modéliser et indiquer les paramètres de la
modélisation.
Déterminer la limite supérieure de linéarité.
Déterminer la sensibilité de la méthode (préciser les unités)
Déterminer le seuil de détection et le seuil de quantification de la méthode.
3.4. Dosage des protéines du lactosérum: (2 essais)
Le lactosérum a une teneur en protéines comprise entre 2 et 10 g/L.
Déterminer sa concentration massique en protéines.
Réactif de Gornall : (abri de la lumière, flacon polyéthylène)
sulfate de cuivre, 5 H2O : 1,50 g eau distillée : 1000 mL
tartrate double de sodium et de potassium : 6 g soude : 30 g
iodure de potassium : 1 g
4. Méthode de Folin –Lowry:
4.1. Mode opératoire:
A partir d'une solution étalon de protéines à 2,0 g/L, préparer sous 5 mL des solutions
étalons filles de concentration allant de 0 à 2,0 g/L .
Utiliser de l'eau physiologique comme diluant.
Coloration:
Echantillon : 1 mL
Sol. R : 5 mL
Agiter. Attendre 10 min.
Réactif de Folin dilué au 1/2 : 0,5 mL
Agiter immédiatement chaque tube.
Mettre 30 min à l'obscurité.
Lire les absorbances contre le blanc de gamme à 650 nm.
solution R: A préparer extemporanément en respectant l'ordre d'addition des réactifs et en
agitant après chaque addition.
solution C de sulfate de cuivre à 10 g/L : 0,5 mL
solution B de tartrate de Na/K à 20 g/L : 0,5 mL
solution A de Na2CO3 à 20 g/L, NaOH 0,1 mol/L: 50 mL
4.2. Caractéristiques de la méthode:
Etablir un tableau de colorimétrie.
Tracer la courbe d'étalonnage : A = f(quantité par tube) et A= f(c g/L)
Analyser l'allure de la courbe, modéliser et indiquer les paramètres de la modélisation.
Déterminer la limite supérieure de linéarité.
Déterminer la sensibilité de la méthode (préciser les unités)
Déterminer le seuil de détection et le seuil de quantification de la méthode.
4.3. Dosage des protéines du lactosérum: ( 2 essais)
Le lactosérum a une teneur en protéines comprise entre 2 et 10 g/L.
Déterminer sa concentration massique en protéines.
5. Méthode au BCA: acide bicinchoninique
Le réactif est constitué d'acide bicinchoninique (BCA) et d'ions cuivriques en milieu alcalin.
Les ions cuivreux générés par réduction par les protéines forment avec le BCA un complexe
stable et intensément coloré ( max =562 nm)
5.1. Mode opératoire:
Etalon Essai
Etalon protéine à 1,00 g/L 10 µL -
Lactosérum dilué - 10 µL
eau physiologique 90 µL 90 µL
Réactif BCA 1 mL 1 mL
Incuber les tubes à 37°C pendant 30 minutes, puis laisser refroidir à la température
ambiante.
Lire les absorbances des tubes à 562 nm contre un témoin de compensation, dans un
délai compris entre 5 et 10 minutes après le retrait des tubes du bain thermostaté à
37°C.
Préparation du réactif au dernier moment:
Réactif BCA pH 11,25 5 mL
CuSO4 0,1 mL
5.2. Dosage des protéines du lactosérum: ( 2 essais)
Le lactosérum a une teneur en protéines comprise entre 2 et 10 g/L.
Déterminer sa concentration massique en protéines.
Comparer la valeur obtenue à celles obtenues par les autres méthodes.
6. Bilan:
Etablir un tableau récapitulatif des caractéristiques des méthodes et des résultats obtenus pour
le lactosérum
Analyser et commenter les résultats.
Indiquer d'autres méthodes de dosage des protéines. Préciser leur spécificité .
