Identification et caractérisation de nouveaux

lipopeptides bactériens par spectrométrie de masse

Amandine Hueber

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Amandine Hueber. Identification et caractérisation de nouveaux lipopeptides bactériens par spec-
trométrie de masse. Physiologie [q-bio.TO]. Université Paul Sabatier - Toulouse III, 2021. Français.
�NNT : 2021TOU30162�. �tel-03653778�

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abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
M. Thierry DURAND, Examinateur
M. Gilles DIETRICH, Examinateur
 Remerciements

Ce travail a été réalisé au sein de la plateforme MetaToul lipidomique de Toulouse et

l’Institut de Recherche en Santé Digestive de l’université Paul Sabatier de Toulouse. Il a été
financé dans le cadre d’une ANR par la région Occitanie et par l’institut national de la santé et
de la recherche médicale.

Je tiens tout d’abord à remercier chacun des membres de mon jury pour avoir accepté
de prendre le temps d’évaluer le travail issu de ces trois années de thèse. Merci au Docteur
François Fenaille, au Docteure Sandra Alves et au Docteure Claire Cherbuy d’avoir accepté
d’en être les rapporteurs. Merci au Professeur Jean-Charles Portais, au Docteur Thierry
Durand et au Docteur Gilles Dietrich d’en avoir été les examinateurs.

Je voudrais remercier mon directeur de thèse Nicolas Cenac pour la confiance qu’il a
placé en moi, pour ses nombreux conseils et surtout pour sa patience à toute épreuve. Son
encadrement m’a permis d’évoluer, de progresser et de m’épanouir scientifiquement, cela a
été un réel plaisir de travailler à ses côtés.

Je remercie également Justine Bertrand-Michel, ma co-directrice de thèse, pour

m’avoir confié ce sujet de recherche au sein de son plateau technologique. Merci de m’avoir
accompagnée pendant ces trois années et de m’avoir donné l’opportunité de travailler de
manière autonome sur un grand nombre de spectromètres de masse.

Je tiens tout particulièrement à remercier le Professeur Jean-Claude Tabet pour

m’avoir tant fait progresser et pour m’avoir transmis autant. Un grand merci pour m’avoir
constamment conseillé tant sur le plan scientifique que personnel, d’avoir cru en mes
capacités et de m’avoir poussée à donner le meilleur de moi-même. Je me souviens encore
de nos premières journées fragmentation où (je dois bien avouer) je ne comprenais vraiment
pas grand-chose, surtout concernant le sens des électrons ! Aujourd’hui je peux enfin « parler
votre langage » et j’ai enfin compris comment placer ces flèches sur un mécanisme de
fragmentation (même si ce n’est qu’un début) ! Je vous remercie sincèrement pour chacune
de nos discussions, pour votre altruisme, votre humilité à toute épreuve et pour votre capacité
d’écoute. J’espère avoir été à la hauteur de votre confiance.

Je voudrais remercier Pauline Le Faouder, pour ses conseils méthodologiques et

instrumentaux qui m’ont permis à la fois de mener à bien mes travaux et d’élargir mes
connaissances scientifiques. Merci d’avoir été présente lors des moments moins faciles.
 Un grand merci à mes voisines de bureau qui ont rendu ces journées plus joviales :
Jessica et Aurélie. Les filles, merci pour toutes les fois ou j’avais besoin de réconfort et que
vous étiez présentes. Merci pour toutes les discussions et pour tous les bons moments passés
ensemble et pour vos conseils, surtout ces derniers mois. Cette thèse n’aurait pas été la même
sans vous.

Je remercie Nancy, merci d’avoir été si souvent à mon écoute. Merci pour toutes les
fois ou tu m’as ramené un petit pain (que dis-je ? une chocolatine) pour me réconforter. Tu
m’as beaucoup aidé pendant cette dernière année de thèse, nos conversations m’ont souvent
apaisé, je t’en remercie. Je te souhaite tout le meilleur pour la suite.

Je souhaite remercier Camille ce fût un réel plaisir de travailler avec toi pendant ces
trois années, merci d’avoir été mon unique « usine de production » de bactérie ! Merci pour
tes nombreux conseils et pour ton aide. Je te souhaite une très bonne continuation, et pleins
de bonnes choses pour la suite !

I would like to thank Martin Green, Jakub Ujma and Keith Richardson from Waters
compagny for their help concerning the ion mobility experiments.

Je souhaite vivement remercier Geoffrey pour toutes les synthèses de lipopeptides !

Sans ces standards ce travail n’aurait jamais pu aboutir, je te souhaite pleins de bonnes
choses (dans cette belle ville qu’est Strasbourg !)

Je souhaite remercier Florian, Hanna, Laurent, Emilien, Carla, et Sylvie de la

plateforme MétaToul pour les nombreuses fois ou nous avons travaillé ensemble, et pour leurs
conseils. Une mention toute particulière pour Hanna, un grand merci pour ta patience, pour
avoir été si réactive quand j’avais besoin d’un prêt de spectro ! Merci de m’avoir fait confiance
en ce qui concerne ton parc analytique.

Je souhaite tout particulièrement remercier les professeurs Dimitri Heintz, Pascaline

Ullmann et Yanis François pour m’avoir transmis cette passion pour la spectrométrie de
masse, sans eux je n’en serai pas là aujourd’hui.
 Enfin, sur un plan plus personnel, je souhaite en premier lieu remercier mes amis,
d’avoir été mon soutien sans faille pendant ces années : Antonin, Eugénie, Maud, Romain,
Enzo, Clément et ceux que j’oublie. Merci pour ces week-ends autour d’une tarte flambée (et
souvent d’une bière). Bref, merci pour toutes vos preuves d’amitié et pour m’avoir souvent
aidé à souffler et à recharger les batteries.

Je souhaite évidemment à adresser un remerciement tout particulier à Antoine, mon

meilleur ami depuis de longues années. Merci d’avoir toujours répondu présent quand j’en
avais besoin, d’avoir toujours dis oui pour une bière (fortement réconfortante), ou pour ces
moments particuliers à la table 12, merci pour ton écoute. Merci pour ton soutien indéfectible,
et d’avoir été le carburant du moteur pendant ces trois longues années, tu le sais : cette
réussite c’est aussi là tienne. T’es le plus chic des amis, et surement le meilleur conducteur
d’autocar qu’il soit !

Merci à ma famille, à mes parents, et plus particulièrement à ma maman, pour m’avoir

encouragée depuis le début. Merci de m’avoir tant apporté, et de toujours avoir cru en moi.
Rien ne me comble plus que de voir cette fierté lorsque tu me regarde dans les yeux, merci
indéfiniment.

Et enfin, Guillaume, je pense que ces trois années n’ont pas dû être faciles pour toi
non plus, surtout la dernière. Je te remercie sincèrement pour ta patience et pour ta
bienveillance. Merci d’avoir supporté mes moments de doutes pour finalement avoir traversé
tout ça avec moi. Merci, de partager ma vie et simplement merci d’être la merveilleuse
personne que tu es.
 Résumé

De nombreuses études ont démontré l’implication du microbiote intestinal dans la

physiologie et la physiopathologie de l’hôte. Parmi les bactéries probiotiques, Escherichia coli
Nissle 1917 a été décrite pour ses propriétés analgésiques. L’étude d’extraits lipidiques de cette
bactérie par spectrométrie de masse à haute résolution a permis d’identifier le C12AsnGABA, un
lipopeptide qu’elle synthétise via son ilot pks. In vivo, le C12AsnGABA est capable d’inhiber
l’hypersensibilité viscérale. Ce lipopeptide bactérien possède donc des propriétés analgésiques.
Afin de déterminer si le C12AsnGABA appartient à une nouvelle famille de lipides, nous avons
étendu l’analyse à plusieurs espèces bactériennes et mis en place un workflow analytique de
chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem à haute résolution
spécifique des lipopeptides. Celui-ci, comprend plusieurs étapes interconnectées entres-elles et
indispensables ayant été optimisées séparément. Vingt-trois nouveaux lipides bactériens ont ainsi
pu être caractérisés. Classiquement, l’élucidation structurale de ces composés est réalisée par
électrospray à l’aide de la spectrométrie de masse en tandem après de la fragmentation par
dissociation induite par collisions. Lors de ma thèse, nous avons combiné les modes d’activation
résonnant et non résonnant afin de mettre en évidence les pertes consécutives et les pertes
directes pour permettre une meilleure compréhension des mécanismes de fragmentations
impliqués. Parmi les résultats obtenus, des ions fragments produits inattendus ont été découverts
et ont fait l’objet d’une seconde étude. Les courbes d’évolutions des profils en fonction de l’énergie
ont été réalisées et ont permis de mettre en évidence pour la première fois la présence de courbes
Gaussiennes élargies et de courbes composites. Ce comportement, jamais décrit auparavant,
questionne sur l’origine de ces processus qui semblent être indépendants de l’instrumentation.
Nous avons considéré la possibilité que deux chemins réactionnels puissent mener à la formation
d’un même ion produit fragment dans le cas des courbes Gaussiennes élargies. Dans le cas des
courbes composites, nous avons émis l’hypothèse que deux chemins réactionnels, le premier à
basse énergie et le second à plus haute énergie menait chacun à la formation d’un ion de
structures différentes mais de masse identique. Par des analyses de mobilité ionique cyclique
couplée à de la spectrométrie de masse et des calculs quantiques, nous avons pu confirmer nos
hypothèses.
Ces travaux de thèse ont permis d’identifier 23 nouveaux composés produits par le
microbiote intestinal. Leur caractérisation structurale nous a permis d’identifier des comportements
de fragmentation inattendus générant des ions fragments d’acides gras jamais décrits. Nous avons
démontré que deux chemins réactionnels pouvaient exister pour générer deux ions produits de
même rapport masse sur charge mais de structures différentes, se traduisant par des courbes
composites.
 Abstract

Numerous studies have highlighted the involvement of intestinal microbiota in the

physiology and pathophysiology of the host. Among probiotic bacteria, Escherichia coli Nissle
1917 (EcN 1917) has been described for its analgesic properties. The study of EcN 1917 lipids
extract by high-resolution mass spectrometry permit to identify C12AsnGABA, a lipopeptide
that its synthesizes by bacteria pks island. In vivo, this compound is able to inhibit visceral
hypersensitivity: this bacterial lipid shows analgesic properties. In order to determine if it
belongs to a new lipid family, we extended the analysis to several bacterial species and
develop an analytical workflow. This one combine a specific lipopeptides extraction and a
specific lipopeptides analysis in liquid chromatography coupled with high-resolution tandem
mass spectrometry and is constituting by several interconnected and essential steps having
been optimized separately. Twenty-three new bacterial lipids have been identified, and
characterized. Usually, the structural elucidation of new compounds is carried out by electro-
nebulization combined with tandem mass spectrometry after fragmentation by collision-
induced dissociation. During my thesis, resonant and non-resonant activation modes were
combined to distinguish consecutive losses from competitive losses for a better understanding
of their fragmentation mechanisms. Among the obtains results, unexpected fragment ions
were discovered and were study. The evolution of the relative abundance of the ions from the
CID spectrum in non-resonant mode as a function of the collision energy (ERMS curves)
shows for the first time Gaussian profiles which can be broad or composites which seem to be
independent of the mass spectrometer. This behavior, that has never been describe, bring up
questions about the origin of the fragmentation mechanisms of these product ions. We
considered the possibility that two reaction paths could permit the formation of the same
fragment product ion for the board Gaussian curves. For the composite curves, we assume
that two fragmentation reactions could occur: the first at low energy and the second at higher
energy, each leading the formation of two isomers ions. These mechanisms of fragmentation
have been confirmed by quantum calculations, and experimental evidences of isomeric ions
formation is provided by cyclic ion mobility analysis coupled with mass spectrometry.
This work allows the identification of twenty-three new lipids, produced by the
intestinal microbiota. The structural characterization allows us to identify unexpected
fragmentation behaviors as the regeneration of fatty acids that has never been describe
before. We have proposed two fragmentation mechanisms that could explain the formation of
two isomers for the shapes of the ERMS curves, for the composites curves.
 Liste des abréviations

AABG : Advanced active beam guide Ec : Energie cinétique

ACC : Acétyl-CoA carboxylase ECD : Electron capture dissociation
AcOEt : Acétate d’étyle EcN : Escherichia coli Nissle 1917
AcN : Acétonitrile ECOM : Energie au centre de masse
AEA : Anandamide N- EDD : Electron detachment dissociation
araciodonoylehanolamide
EESI : Extractive electrospray ionisation
AG : Acide gras
EET : acide epoxyeicosatriénoïque
AGC : Automatic gain control
EID : Electron induced dissociation
AGCC : Acide gras à courte chaîne
EIEIO : Electron impact excitation of ion
AGLC : Acide gras à longue chaîne from organics
AGI : Acide gras insaturé ELAB : Energie laboratoire
APCI : Ionisation chimique à pression ELL : Extraction liquide liquide
atmosphérique
EqC : nombre équivalent carbone
API : Atmospheric pression onisation
ER-IMS : Energy resolved ion mobility
BUME : butanol-méthanol mass spectrometry
C18-3OH : acide 3-hydroxy- ERMS : Energy resolved mass
octadécanoïque spectrometry
CI : Ionisation chimique ESI : Electrospray ionisation
CID : Collision induced dissociation ESSI : Extractive electrospray ionisation
cIM : Cyclic ion mobility FAIMs : Field asymmetric waveform ion
mobility mass spectrometry
Clb : Colibactine
FAS : Fatty acid synthase
COX : Cyclooxygenase
FAS-MS : Fast atom bombardment mass
CV : Compensation voltage spectrometry
CYP : Cytochrome FID : Flamme ionization detector
DART : Direct analysis in real time FT : Transformée de fourier
DESI : Desorption electrospray FT-ICR : Spectrométrie de masse à
DEDL : détecteur évaporatif à diffusion de résonnance cyclotronique des ions
lumière (Transformée de fourier)

DFT : Density functional theory GABA : Acide gamma-aminobutyrique

DG : diacylglycéride GC : Chromatographie gazeuse

DT-IMS : Drift time ion mobility GERLI : Groupe d’étude et de recherche

spectrometry en lipidomique

EC : Energie de collision GL : Glycolipides

GPA : Glycérophosphate LO : Lipogenase
GPE : Glycérophosphatidylethanolamine LpAA : Lipoaminoacide
GPI : Glycérophosphosphoinositol LPS : Lipopolysaccharide
GPIP2 : Glycérophosphoionositol- LR : Low résolution (basse résolution)
biphopshate
LT : Leukotriène
GPL : Glycérophospholipide
LTQ : Linear trap quadrupole
GPG : Glycéroprostaglandine
MALDI : Matrix assisted laser desorption
HCD : Higher energy C-Trap dissociation ionisation
HEPT : Hauteur équivalente à un plateau MeOH : Methanol
théorique
MIKE : Mass-analaysed ion kinetic energy
HETE : Hydroeicosatetranoate
MG : Monoacylglycéride
HILIC : Chromatographie liquide à
interaction hydrophile MS : Spectrométrie de masse

HR : Haute résolution MRM: Multiple reaction monitoring

HYA : Acide 10-hydroxy-cis-12- MtBE: Méthyl tert-butyl éther

octadecenoic NAT: N-acétyltransférase
HYB : Acide 10-hydroxy-octadecanoic NL : Neutral loss (perte de neutre)
HYC : Acide 10-hydroxy-trans-11- NRPS : peptide synthase non ribosomique
octadecenoic
QET : Théorie du quasi-équilibre
IBS : Irritable bowel syndrome
RR : Processus de rearrangement
IE : impact électronique
RS : Processus de rupture simple
ICR : Ion cyclotron resonance
SFAHFA : Short chain fatty-acid ester of
IKE : Ion kinetic energy fatty acid
IRMPD : Infrared multiphoton dissociation SII : Syndrome de l’intestin irritable
ISTD : Internal standard SIMS : Secondary ion mass spectrometry
KetoA : Acide 10-oxo-cis-12-octadecenoic SL: Sphingolipides
KetoB : Acide 10-oxo-octadecanoic SM: Sphingomyéline
KetoC : Acide 10-oxo-trans-11- SMB: Supramolecular bombardment
octadecenoic
SN: Stereospecific numbering
LC : Chromatogrpahie liquide
SPE: Solid phase extraction
LC-HRMS : Chromatographie liquide
couplée à la spectrométrie de masse à SRM: Single reaction monitoring
haute résolution
PA : Affinité protonique
LC-LRMS : Chromatographie liquide
PIS : Precursor ion scan
couplée à la spectrométrie de masse à
basse résolution PrIS : Product ion scan
LLE : Liquid-liquide extraction P-LC : Chromatographie polaire
LMCO : Low mass cut off
PG : Prostaglandine TG : Triacylglécide
QqQ : Triple quadripôle Tm : Temps mort
RCPC : récepteur couplé aux protéines G TOF : Time of flight
RF : Radiofréquence Tr : Temps de rétention
RMN : Résonance magnétique nucléaire TWIMS : Traweling wave ion mobility
mass spectrometry
ROS : Espèces réactives de l’oxygènes
RP-LC : Chromatographie liquide en
phase inverse

Abréviation des acides aminés :

Ala : Alanine (A)

Arg : Arginine (R)

Asn : Asparagine (N)

Asp : Aspartate / Acide aspartique (D)

Cys : Cystéine (C)

Glu : Glutamate / Acide glutamique (Q)

Gly : Glycine (G)

His : Histidine (H)

Ile : Isoleucine (I)

Leu : Leucine (L)

Met : Méthionine (M)

Phe : Phenylalanine (F)

Pro : Proline (P)

Ser : Sérine (S)

Thr : Thréonine (T)

Trp : Tryptophane (W)

Tyr : Tyrosine (Y)

Val : Valine (V)

 Liste des figures
Figure 1 : Unité isoprène, composition élémentaire C5H8

Figure 2 : Fonction carboxylique, avec R chaine alkyle

Figure 3 : Différence entre des composés trans et cis

Figure 4 : Acide palmitique C16H32O2

Figure 5 : Structure de l’acide linoléique, C18:2 ∆(9,12), C18H32O2

Figure 6 : Schéma de la biosynthhèse des acides gras

Figure 7 : Machinerie enzymatique des acides gras

Figure 8 : Structure de l’acide arachidonique (A) et eicosapeintaénoïque (B)

Figure 9 : Métabolisme oxydatif de l’acide arachidonique chez les mammifères

Figure 10 : Structure de la prostaglandine 1 (PGE1)

Figure 11 : Structure du leukotriène LTB44

Figure 12 : Structure du 8-HETE

Figure 13 : Structure de l’anandamide (N-arachiodonoylanolamide (AEA))

Figure 14 : Structure de l’acide arachidonique lié au glutamate

Figure 15 : Structure de l’acide oléique lié au GABA

Figure 16 : Structure du squelette glycérol

Figure 17 : Structure d’un monoacylglycérol, le MG18:0 (1-octadecanoyl-sn-glycerol)

Figure 18 : Structure d’un dyacylglycérol, le DG18:0/18:0, 1-octadecanoyl-2-hexadécanoyl-

sn-glycerol

Figure 19 : Structure d’un triacylglycérol, le TG 18:0/18:0/18:0, 1-octadecanoyl-2-

octadécanoyl-3- octadecanoyl-sn-glycerol

Figure 20 : Structure de base d’un glycérophospholipide

Figure 21 : Structure de base d’un glycérophosphate (GPA)

Figure 22 : Structure de base d’une glycérophosphocholine (GPC)

Figure 23 : Structure de base d’une glycérophosphoéthanolamine (GPE)

Figure 24 : Structure des GPE sous forme diacyl, alkylacyl et alcèylacyl (A, B, C)

Figure 25 : Structure d’un plasmalogène ou R1 et R2 sont des chaines d’acides gras

Figure 26 : Structure de base d’un glycérophosphoglycérol (GPG)

Figure 27 : Structure de base d’un glycérophosphoionisitol (GPI)

Figure 28 : Structure de base d’un glycérophosphoinositol-3,5-biphosphate (PIP2)

Figure 29 : Structure de base d’une glycérophosphatidylsérine (GPS)

Figure 30 : Structure de la sphingosine la plus répandue chez les mammifères

Figure 31 : Structure de la sphinganine la plus répandue chez les mammifères

Figure 32 : Exemple de structure d’un céramide (où R2 est une chaine alkyle)

Figure 33 : Structure d’une sphingomyéline (où R2 est une chaine alkyle)

Figure 34 : Exemple de structure d’un galactosylcéramide, composé de la famille des

glycosphingolipides

Figure 35 : Structure du squelette cyclopentanophénantrène des stérols

Figure 36 : Structure du cholestérol : cholest-5-en-3-ol

Figure 37 : Structure de différentes hormones stéroïdiennes : l’estradiol (A), la testostérone

(B) et la progestérone (C)

Figure 38 : Structure du cholécalciférol (vitamine D3)

Figure 39 : Structure du 7-α-hydroxycholestérol, précurseur des acides biliaires

Figure 40 : Structure de deux acides billiaires majoritaires : l’acide cholique C24H40O5 (A) et
de l’acide chénodésoxycholique C24H40O4 (B), et de de l’acide α-muricholique C24H40O4 (C)

Figure 41 : Structure de l’acide glycocholique (A) et de l’acide taurocholique (B)

Figure 42 : Structure de l’isopentényl-pyrophosphate et du diméthylallyl-pyrophosphate

Figure 43 : Structure d’un prénol, composé issu de la sous famille des isoprénoïdes : le β-
caroténe

Figure 44 : Structure d’un prénol issus de la sous famille des quinones : la ménaquinone, ou
vitamine K2

Figure 45 : Représentation schématique des grands phyla des bactéries

Figure 46 : Gradient de quantités en bactéries dans le tractus digestif humain

Figure 47 : Acide α-mycolique, acide gras retrouvé chez les mycobactéries

Figure 48 : Schéma des principales classes d’acides gras retrouvés chez les bactéries

Figure 49 : Structure d’un acide gras diméthyl acétal (ou R1 est une chaîne alkyle de
longueur variable)

Figure 50 : Dosage relatif des acides gras totaux dans les deux souches bactériennes
utilisées dans notre étude
Figure 51 : Exemple de saccharolipide, le lipide A
Figure 52 : Structure du lanostérol
Figure 53 : Structure du squalène
Figure 54 : Structures de a) l’acide désoxycolique et de b) l’acide lithocholique, les deux
acides biliaires secondaires majoritaires
Figure 55 : Structures de a) l’acide ursodésoxycholique et de b) l’acide
chénodésoxycholique
Figure 56 : Structure des acides gras à courte chaine, acide formique CH2O2 (A), de l’acide
acétique C2H4O2 (B), de l’acide propionique C3H6O2 (C), de l’acide isobutyrique C4H8O2 (D),
Structure de l’acide butyrique C4H8O2 (E), de l’acide iso-valérique C5H10O2 (F), et de l’acide
valérique C5H10O2 (G)

Figure 57 : Exemple d’un acide gras à courte chaine estérifié par un acide gras hydroxylé

Figure 58 : Structure de l’acide 3-hydroxyoctadecanoïque

Figure 59 : Structure de l’acide 10-oxo-octadecanoic, KetoB

Figure 60 : Structure d’un commendamide

Figure 61 : Structure d’un exemple de polycétide : l’érythromycine

Figure 62 : Structure de la surfactine (C53H93N7O13), lipopeptide produit par les bacilles

Figure 63 : Structure du C12AsnGaba (C20H37N3O5), lipopeptide produit par EcN 1917

Figure 64 : Structure du C14Asn (C17H31N2O4), lipoaminoacide produit par EcN 1917

Figure 65 : Gamme de polarité de certains lipides, et de quelques solvants utilisés en

chromatographie liquide, placés sur l’échelle de polarité de Hildebrand

Figure 66 : Principe d’une extraction sur phase solide

Figure 67 : Principales types de phases adsorbantes retrouvés dans les protocoles de
lipidomique
Figure 68 : Représentation schématique d’un système de chromatographie gazeuse
Figure 69 : Structure d’un particule core-shell

Figure 70 : Comparaison des pics chromatographiques obtenus avec deux colonnes, l’une
constituée de la technologie coreshell, l’autre constituée de particules totalement poreuses
Figure 71 : Structure de d’un lipoaminoacide arginine sous forme A) canonique ; B)
déprotonée ; C) protonée et enfin zwiterionique (sous forme négative en D, et positive en E)
Figure 72 : Représentation schématique des éléments constituant le spectromètre de
masse
Figure 73 : A) Représentation schématique de l’ionisation verticale, selon le principe de
Franck-Condon et B) le spectre photo-électronique du bromobenzène
Figure 74 : Représentation schématique du chemin reactionnel de Brauman
Figure 75 : Principe de l’électronébulisation et cône de Taylor d’après Schröder, E.
Massenspektrometrie - Begriffe und Definitionen. (1991).
Figure 76 : Représentation schématique d’un quadripôle vue latérale(a) et vue frontale(b)

Figure 77 : A) Domaines de stabilité des ions m1, m2, m3 et m4 dans les diagrammes
U=f(VRF), et B) le spectre de masse associé.

Figure 78 : A) Domaine de stabilité ions de masse croissante de m1 à m4 sur l’axe VRF

sachant que la tension continue est nulle, et B) Position de ces ions sur l’axe qz ou la
profondeur des puits sont schématisés par des verres.

Figure 79 : Principaux composants du système orthogonal TOF (a) linéaire spectromètre de

masse en mode basse résolution, (b) spectromètre de masse en mode haute résolution

Figure 80 : Coupe longitudinale permettant la visualisation des électrodes d’un détecteur

Orbitrap

Figure 81 : Représentation des vagues successives produites par le champ électrique

oscillant, et du mouvement des ions dans la cellule de mobilité ionique TWIMS

Figure 82 : Schéma de la cellule de mobilité cyclique (waters)

Figure 83 : Représentation schématique d’un analyseur en tandem triple quadripôle

Figure 84 : Représentation schématique du mode d’acquisition SRM, sur un analyseur triple

quadripôle

Figure 85 : Représentation schématique du mode de balayage « Precursor ion scan », sur

un spectromètre de masse triple quadripôle

Figure 86 : Représentation schématique d’un Q-TOF Xevo G2-XS Waters et de sa cellule

de collision segmentée XS

Figure 87 : Représentation schématique d’un spectromètre de masse Q-Exactive Plus

Orbitrap

Figure 88 : Représentation schématique d’un spectromètre de masse VELOS couplé à un

analyseur Orbitrap

Figure 89 : Nomenclature mise en place spécifiquement pour les lipoaminoacides

Figure 90 : Structure du C13Asn

Figure 91 : Structure de certains LpAA identifiés à l’aide du Workflow lipidomique développé

Figure 92 : Schéma récapitulatif du workflow analytique développé pour la recherche de

nouveaux lipides bactériens, produits par le microbiote intestinal

Figure 93 : Annotation des ions fragments produits à partir du C16Glutamate

Figure 94 : Structure du C16OMeGlu

Figure 95 : Annotation des ions fragments produits à partir du C12Glutamate

Figure 96 : Courbes ERMS issus de l’anion précurseur [C12Glu-H]- en a), et des ions
fragments m/z 310 en b), m/z 199 en c) et m/z 128 en d).

Figure 97 : Profils d’évolution de l’abondance relative de l’ion fragment m/z 128 issu du
précurseur [C12Glu-H]− en mobilité ionique en fonction de l’énergie de collision
Figure 98 : Profil d’évolution de l’abondance relative de l’ion fragment m/z 199 issu du
précurseur [C12Glu-H]− en mobilité ionique en fonction de l’énergie de collision
Figure 99 : Positions possibles de la charge sur les LpAA où la chaine latérale de l’aminoacide
conjugué est non-polaire, menant soit à la formation d’un cétène, soit à la perte d’un
groupement CO2

Figure 100 : Structure des ions m/z 128 et m/z 255 et m/z 199 produits en compétitions à
partir du [C16Glu-H]− et du [C12Glu-H]−

Figure 101 : Profils d’évolutions de l’abondance des ions fragments m/z B) 102, C) m/z 310
et D) m/z 198 en fonction de l’énergie de collision à partir du précurseur [C12Glu-H]- m/z 328
sous activation résonante (QqTOF Waters Xevo G2-XS)

Figure 102 : Profils d’évolutions de l’abondance des ions fragments m/z 310, m/z 128, m/z
199 et m/z 284 fonction de l’énergie de collision à partir du précurseur [C12Glu-H]- m/z 328
sous activation non-résonante (LTQ, Thermo)

Figure 103 : Profils ERMS calculés en fonction de l’abondance absolue des ions (m/z 199 et
m/z 128, A et C), en comparaison avec les courbes ERMS normalisés par le courant ionique
total pour les ions m/z 199 et m/z 128 en B et D à partir du précurseur [C12Glu-H]- m/z 328
sous activation non-résonante (QqTOF Waters)
 Liste des tableaux et des schémas

Tableau 1 : Structure de certains acides gras saturés

Schéma 1: Mécanismes possibles de fragmentation par pertes directes compétitives (a) très
mineure de CO2 et (b) majeure d’H2O qui est suivie de pertes consécutives (c) mineures de
(H2O+CO2) et (H2O+CO2+HCN)
Schéma 2 : Mécanisme régiosélectif proposé pour la formation des ions complémentaires
ions [Lpb+O]− et [y-H2O]−
Schéma 3 : Mécanismes possibles de fragmentation par pertes directes compétitives A)
majeure de CO2 et B) mineure d’H2O à partir de [C12AA-H]ˉ (avec AA=Val, Leu et Ile)
Schéma 4 : Proposition de mécanisme de fragmentation particulier de [C14Phe-H]ˉ, m/z 356,
menant aux ions fragments m/z 226 et m/z 147 complémentaires.
Schéma 5 : Proposition de mécanisme de fragmentation particulier de l’ion [C12Trp-H]ˉ,
menant au fragment de m/z 256, où R1 correspond à une chaîne alkyle C10H21de la partie
acide gras
 Identification et caractérisation de nouveaux
lipopeptides bactériens par spectrométrie de masse

INTRODUCTION
PARTIE 1 : LIPIDES ET MICROBIOTE .......................................................................................... 7

Chapitre I : Les différentes classes de lipides, et principales fonctions associées ..................... 9

Chapitre II : Le microbiote intestinal et lipides associés ............................................................ 39

PARTIE 2 : ANALYSES LIPIDOMIQUE ET SPECTROMETRIE DE MASSE ............................. 65

Chapitre I : Généralités sur la lipidomique et les sciences du « omics » .................................. 67

Chapitre II : L’analyse des lipides .............................................................................................. 75
Chapitre III : La spectrométrie de masse ................................................................................... 85
Chapitre IV : La spectrométrie de masse en lipidomique et les différentes types d’analyses
possibles................................................................................................................................... 136

PRESENTATION DES TRAVAUX DE THESE

Objectifs et travaux de thèse .................................................................................................... 145

Résultats ..................................................................................................................................... 147
DISCUSSION GENERALE : ....................................................................................................... 213
CONCLUSION ET PERSPECTIVES .......................................................................................... 231

ANNEXE ...................................................................................................................................... 233

VALORISATION DES TRAVAUX DE RECHERCHE................................................................. 253
BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................ 257
 INTRODUCTION GENERALE

Les pathologies du tractus digestif représentent à ce jour un défi sanitaire et

économique majeur. Un dysfonctionnement de la communication entre le microbiote intestinal
et l’hôte peut en être l’origine. L’étude des relations entre hôte-microbiote permettrait
d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le syndrome de l’intestin irritable (SII) est
le trouble gastro-intestinal le plus répandu. C’est aujourd’hui la première cause de consultation
chez le gastroentérologue, et cette pathologie touche environ 11% de la population mondiale.
Malgré les difficultés rencontrées quotidiennement par les patients, il reste à ce jour difficile
d’identifier les causes à l’origine du SII, ce qui représente un verrou non négligeable dans le
développement de thérapies adaptées en vue d’un traitement médicamenteux efficace.
Actuellement, les traitements proposés sont symptomatiques et non efficaces. L’élucidation
des mécanismes cellulaires responsables du SII pourraient mener à l’identification de
médicaments spécifiques, permettant ainsi de prodiguer un traitement adapté aux patients
atteints de ce syndrome particulièrement délétère. C’est dans ce contexte que le sujet de mes
travaux de thèse se situent.

Une dysbiose bactérienne a été décrite chez les patients atteints du SII, cependant à
ce jour, le rôle qu’elle pourrait avoir en lien avec le SII n’a pas encore été clairement défini.
Dans cette optique, des travaux antérieurs ont permis de démontrer que les bactéries
Escherichia coli Nissle 1917, une souche commensale de bactéries probiotiques, sont
capables de synthétiser du GABA lié à un acide aminé et à un acide gras. Ensemble, ces trois
composés forment un lipopeptide comme par exemple le C12AsnGABA. La liaison peptidique
entre le GABA et l’acide gras permet au GABA de pouvoir passer au travers de la barrière
intestinale. Le GABA, qui est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux,
peut ensuite se fixer sur son récepteur afin de réguler l’activité des neurones sensitifs, à
l’origine de la nociception diminuant ainsi la douleur ressentie par les patients atteints du SII.
Cette action bénéfique pour le patient, ne semble pas s’accompagner d’effets néfastes sur la
motricité intestinale, ni sur la perméabilité cellulaire.

E. coli n’étant pas la seule bactérie du microbiote intestinale capable de synthétiser du

GABA, l’objectif principal de mes travaux de thèse, consistent à étendre l’identification, la
caractérisation et la quantification de nouveaux lipopeptides produits par l’ensemble du
microbiote intestinal et d’évaluer leurs potentiels thérapeutiques. Une stratégie expérimentale
de chimie analytique par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à
haute résolution (LC-HRMS) visant à l’identification et la caractérisation de ces lipopeptides a
été mise en place. J’introduirai dans un premier temps la très grande famille des lipides dont

1
font partis les lipopeptides, puis le microbiote intestinal, ses fonctions principales et les lipides
qu’il produit. Dans une seconde partie j’introduirai la lipidomique, la spectrométrie de masse
et les grands principes de la fragmentation. Une dernière partie sera consacrée à la
présentation de mes résultats de thèse.

2
 Sommaire général

INTRODUCTION GENERALE

PARTIE 1 : LIPIDES ET MICROBIOTE .......................................................................................... 7

Chapitre I : Les différentes classes de lipides, et principales fonctions associées ..................... 9
1. Les acides gras et leurs métabolites .......................................................................... 10
1.1 Les acides gras : nomenclature et biosynthèse ......................................................... 11
1.2 Les lipides issus du métabolisme des acides gras : les oxylipines ............................ 16
2. Les endocannabinoïdes .............................................................................................. 19
3. Les acides aminés acylés ........................................................................................... 19
4. Les glycérolipides ....................................................................................................... 21
4.1 Les monoacylglycérols................................................................................................ 21
4.2 Les diacyglycérols....................................................................................................... 22
4.3 Les triacylglycérols ...................................................................................................... 22
5. Les glycérophospholipides ......................................................................................... 23
5.1 Les glycérophosphates ............................................................................................... 24
5.2 Les glycérophosphocholines ...................................................................................... 25
5.3 Les glycérophosphoéthanolamines ............................................................................ 25
5.4 Les glycérophosphoglycérols ..................................................................................... 27
5.5 Les glycérophosphoinositols....................................................................................... 27
5.6 Les glycérophosphosérines ........................................................................................ 28
6. Les sphingolipides ...................................................................................................... 29
6.1 Les céramides ............................................................................................................. 30
6.2 Les sphingomyélines .................................................................................................. 31
6.3 Les glycosphingolipides .............................................................................................. 32
7. Les stérols ................................................................................................................... 33
7.1 Les stérols libres ......................................................................................................... 33
7.2 Les stéroïdes............................................................................................................... 34
7.3 Les vitamines D .......................................................................................................... 35
7.4 Les acides biliaires...................................................................................................... 36
8. Les prénols.................................................................................................................. 38

3
 Chapitre II : Le microbiote intestinal et lipides associés ............................................................ 39
1. Définitions et notions essentielles............................................................................... 39
2. Origine et composition du microbiote intestinal .......................................................... 40
2.1 Chez l’enfant ............................................................................................................... 40
2.2 Chez l’adulte ............................................................................................................... 41
3. Bactéries utilisées pendant mes travaux de thèse ..................................................... 43
4. Les fonctions du microbiote intestinal ......................................................................... 45
5. Des modifications de la composition du microbiote intestinal peuvent être associées à
des pathologies ou à désordres métaboliques ........................................................... 47
6. Les lipides bactériens ................................................................................................. 49
6.1. Les lipides structuraux ................................................................................................ 49
6.1.1 Généralités .................................................................................................................. 50
6.1.2 Les glycérophospholipides ......................................................................................... 52
6.1.3 Les lipides à longue chaine et les lipides complexes ................................................. 52
6.2. Les lipides issus du métabolisme du microbiote intestinal ......................................... 54
6.2.1 Les acides biliaires secondaires et les dérivés du cholestérol ................................... 55
6.2.2 Les acides gras à courtes chaines ............................................................................. 57
6.2.3 Les acides gras à longues chaines ............................................................................ 59
6.2.4 Les commendamides .................................................................................................. 60
6.2.5 Les polycétides ........................................................................................................... 61
6.2.6 Les lipopeptides et lipoaminoacides ........................................................................... 62

PARTIE 2 : ANALYSES LIPIDOMIQUE ET SPECTROMETRIE DE MASSE ............................. 65

Chapitre I : Généralités sur la lipidomique et les sciences du « omiques » .............................. 67
1. Préparation des échantillons ...................................................................................... 68
1.1. L’extraction des lipides................................................................................................ 69
1.1.1 L’extraction liquide-liquide .......................................................................................... 70
1.1.2 L’extraction en phase solide ....................................................................................... 71
2. L’influence de la matrice ............................................................................................. 74

Chapitre II : L’analyse des lipides .............................................................................................. 75

1. Les méthodes de séparation des lipides .................................................................... 76
1.1 La chromatographie en phase gazeuse ..................................................................... 76
1.2 La chromatographie liquide ........................................................................................ 78
1.2.1. La chromatographie liquide à polarité de phase normale .......................................... 81
1.2.2. La chromatographie liquide à polarité de phase inverse ............................................ 81

4
 1.2.3. Développement des systèmes chromatographiques et dernières innovations en
colonnes chromatographiques.................................................................................... 83

Chapitre III : La spectrométrie de masse ................................................................................... 85

1. Un historique de la spectrométrie de masse .............................................................. 86
2. Généralités sur la spectrométrie de masse ................................................................ 89
3. Généralités sur les principaux constituants d’un spectrométre de masse ................. 93
4. Les sources d’ionisation.............................................................................................. 95
4.1. Ionisation en phase gazeuse sous vide...................................................................... 95
4.2.1. Ionisation à pression atmosphérique ........................................................................ 101
4.2.2 Ionisation par désorption à pression atmosphérique................................................ 103
5. Les différents analyseurs en spectrométrie de masse ............................................. 105
5.1. Analyseur basse résolution avec balayage de tension ............................................ 107
5.1.1 Le quadripôle : analyseur de faisceaux d’ions de faible énergie cinétique .............. 107
5.1.2 Le piège à ions linéaire : analyseur par stockage et éjection sélective d’ions ......... 109
5.1.3 L’analyseur temps-de-vol : faisceaux d’ions de haute énergie cinétique, et analyses
sans balayage de champs ........................................................................................ 111
5.1.4 L’analyseur Orbitrap.................................................................................................. 113
5.1.5 L’analyseur de mobilité ionique ................................................................................ 113
5.1.5 L’analyseur FT-ICR ................................................................................................... 113
5.2. Les analyseurs en tandem ........................................................................................ 123
5.2.1 Le triple quadripôle ................................................................................................... 126
5.2.2 L’hybride quadripôle – temps-de-vol (QqTOF) : analyse en haute résolution des ions
produits ..................................................................................................................... 130
5.2.3 Les analyseurs Orbitrap en tandem : le Q-Exactive Plus et l’Electrospray Linear Trap
Quadrupole Orbitrap VELOS .................................................................................... 132
5.2.4 Séquence de balayage pour les expériences MSn à l’aide d’un piège à ions ......... 134

Chapitre IV : La spectrométrie de masse en lipidomique et les différentes types d’analyses

possibles................................................................................................................................... 136
1. Les analyses globales............................................................................................... 136
2. Les analyses semi-ciblées ...................................................................................... 1377
3. Les analyses ciblées ................................................................................................. 138
4. La quantification en lipidomique ............................................................................... 138
5. Le niveau d’identification en lipidomique .................................................................. 139
6. Les règles de chimie des réactions ions-molécules appliquées pendant ces travaux de
thèse et nomenclature .............................................................................................. 141

5
 PRESENTATION DES TRAVAUX DE THESE

Objectifs et travaux de thèse .................................................................................................... 145

Résultats ..................................................................................................................................... 147
Publication 1 ............................................................................................................................. 147
Publication 2 ............................................................................................................................. 169
Publication 3 ............................................................................................................................ 191

DISCUSSION GENERALE : ....................................................................................................... 213

CONCLUSION ET PERSPECTIVES .......................................................................................... 231
ANNEXE 1 : La théorie du quasi-équilibre .............................................................................. 233
ANNEXE 2 : Supplementary information publication 1 ......................................................... 237
ANNEXE 3 : Supplementary information publication 2 ......................................................... 251

VALORISATION DES TRAVAUX DE RECHERCHE................................................................. 253

CURRICULUM VITAE ................................................................................................................. 255
BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................ 257

6
 INTRODUCTION
PARTIE 1 : LIPIDES ET MICROBIOTE

7
Chapitre I : Les différentes classes de lipides, et principales
fonctions associées
Les lipides constituent une vaste et importante famille de composés chimiques et sont
retrouvés chez tous les organismes vivants1-2. Le nombre de métabolites est estimé à plus de
100 000 espèces chez les mammifères, dont 1 000 appartiennent à la grande famille des
lipides1. Ils sont généralement définis comme étant des espèces chimiques insolubles dans
l’eau et solubles dans les solvants organiques2. Cependant, cette définition limitée aux
propriétés de solubilité des lipides tend à exclure certains lipides tel que les glycolipides et les
isoprénoïdes, qui sont des lipides composés d’une partie hydrophile3,4. Pour donner une
définition permettant de prendre en compte toutes les familles de lipides, il faut considérer que
ce sont des composés de petites tailles moléculaires, hydrophobes ou amphiphiles et produits
via la condensation des carbanions de thioesters et/ou de la condensation d’unités isoprènes
C5H8 (Figure 1). Selon qu’ils soient hydrophobes ou amphiphiles, les lipides peuvent être plus
ou moins polaires.

Figure 1 : Unité isoprène, composition élémentaire C5H8

Les lipides, constituent avec les glucides et les protéines les trois grandes familles de
macronutriments, c’est-à-dire l’un des constituants des aliments contribuant à l’apport
énergique nécessaire aux mammifères sous forme de calories. Les lipides jouent plusieurs
rôles majeurs dans l’organisme, dans un premier temps ils permettent un stockage d’énergie,
sous forme de triglycérides, notamment dans les tissus adipeux. Ils sont impliqués dans le
transport de vitamines ou encore dans la transduction du signal. Ils jouent également le rôle
de précurseurs pour les vitamines ou les prostaglandines par exemple.

Dans ce premier chapitre seuls les lipides non bactériens seront abordés, le prochain
sera consacré aux lipides bactériens, bien qu’un grand nombre de lipides soient communs aux
deux règnes.

9
 La diversité chimique et structurale des lipides nécessite la mise en place d’une
classification particulière4. Celle-ci permet d’inclure tous les lipides existants. Le consortium
LIPID-Metabolites And Pathways Strategy (LIPID-MAPS®) définit et classe les lipides en
fonction de leur biosynthèse.

Ils sont classés en 8 groupes sur la base de leurs origines biosynthétiques et donc de
leurs différentes structures. On y retrouve : le groupe des acides gras, le groupe des
glycérolipides, des glycérophospholipides, des sphingolipides, des stérols, des prénols, des
saccharolipides et le groupe des polycétides. Ces 8 groupes de lipides peuvent être sous
classés en deux types de lipides : les lipides polaires, comprenant les glycérophospholipides,
les sphingolipides, les saccharolipides et les polycétides, et le groupe des lipides apolaires :
les acides gras, les glycérolipides, les stérols et les prénols. L’ensemble des lipides est divisé
en classes, sous-classes et espèces moléculaires5.

1. Les acides gras et leurs métabolites

Les acides gras (AG) sont des acides carboxyliques (Figure 2) pouvant être sous forme
libre, d’ester ou d’amide4.

Figure 2 : Structure de la fonction carboxylique, avec R chaine alkyle

Le radical R de l’acide carboxylique est une chaîne aliphatique carbonée de longueur

variable, généralement de quatre à plus de trente atomes de carbone. La chaîne carbonée
d’un acide gras est considérée comme longue lorsqu’elle comporte entre 12 et 20 atomes de
carbone, et très longue lorsqu’elle dépasse les 20 atomes de carbone6. Chez les mammifères,
généralement, les acides gras sont composés d’une chaîne linéaire, avec un nombre pair
d’atomes de carbone. Cette chaîne carbonée peut être saturée ou insaturée, elle peut contenir
jusqu’à six doubles liaisons. Des modifications peuvent avoir lieu, comme une élongation de
la chaine, une hydroxylation, ou encore une oxydation. Une nomenclature a été mise en place
afin de décrire la structure de l’acide gras sous la forme Cx:y ou x correspond au nombre
d’atomes de carbone et y au nombre d’insaturations.

10
 La position des insaturations peut être notée selon deux écoles : la première en
conformité avec la nomenclature internationale de chimie se note “∆a, b, …, n“ où chaque lettre
indique la position des insaturations par rapport à la fonction acide carboxylique. La seconde
façon de noter les insaturation correspond à la nomenclature biochimique et se note “ω : n”,
où n correspond à la position de la première insaturation en partant du méthyl terminal.

En outre, la présence de doubles liaisons fait apparaître la notion d’isomères de

configuration. L’isomérie trans et cis, est basée quant à elle sur l’encombrement stérique des
groupements fonctionnels (Figure 3). La molécule est dite en configuration cis lorsque les
groupements se trouvent du même côté de la double liaison. La molécule est dite trans lorsque
ses substituants se trouvent de part et d’autre de la double liaison. La conformation cis est
retrouvée chez les mamifères. Les acides gras insaturés présentent généralement des
doubles liaisons de configuration cis. Cependant, il s’avère que celles-ci peuvent être de
configuration trans dans de faibles proportions.

2 1 1
R R H R

2
H H R H
Composé cis Composé trans

Figure 3 : Différence entre des composé trans et cis

1.1.Les acides gras : nomenclature et biosynthèse

L’acide gras le plus représenté dans les cellules du règne animal est l’acide palmitique
(C16:0 ; Figure 4), il est le précurseur d’autres acides gras, par différentes transformations
(allongement de la chaine, hydrogénation de la chaine, ou β-oxydation)7, représentés dans le
Tableau 16,8.

H3C OH

Figure 4 : Structure de l’acide palmitique C16H32O2

11
La synthèse des acides gras monoinsaturés à moyennes et longues chaînes est initiée par la
formation de l’acide palmitique, celui-ci est obtenu par l’action successive de deux enzymes
l’acetyl-coA carboxylase (ACC) et la fatty acid synthase (FAS)9. L’ACC catalyse la première
étape de la biosynthèse des acides gras. Elle mène à la conversion de l’acétyl-CoA en
malonyl-CoA, qui est un intermédiare métabolique participant à la biosynthèse des acides
gras. Le malonyl-CoA est pris en charge par la FAS. Cette enzyme joue divers rôles dans la
synthèse des AG via des activités acétyl-CoA transferase, malonyl-CoA transferase, β-
cétoacyl synthase / réductase, β-hydroxyacyl dehydratase, ect … Le nombre de cycles de la
réaction enzymatique peut varier de deux à huit, ce qui permet d’aboutir à l’ensemble des
acides gras intermédiaires entre les acides gras à courte chaine à partir de l’acide butyrique à
l’acide stéarique9.

Certains AG sont dits essentiels, comme l’acide linoléique, C18:2 ∆(9,12) (Figure 5), et
l’acide α-linolénique C18:3 ∆(9,12,15) puisqu’ils ne peuvent être apportés que par l’alimentation.
Ces acides gras sont principalement retrouvés dans les huiles végétales ou dans certains
poissons9.

OH

CH3

Figure 5 : Structure de l’acide linoléique, C18:2 ∆(9,12), C18H32O2

12
 Chez l’homme la synthèse des AG se déroule principalement dans les tissus lipogéniques,
comme les tissus adipeux, les glandes mammaires, les reins et le foie. Dans certaines
maladies, une lipogénèse accrue est observée dans les tissus touchés par la pathologie. La
synthèse des acides gras insaturés à longues et à très longues chaînes est initiée par des
précurseurs tels que les acétyl-CoA et le malonyl-CoA4 (Figure 6).

Figure 6 : Schéma de la biosynthèse des acides gras10

Puisque les mammifères ne sont pas capables de produire les acides α-linolénique et
linonéique, la seule source de ces précurseurs est située dans l’alimentation. Ces AG sont
alors pris en charge par la machinerie enzymatique11 (Figure 7) permettant la production des
différents AGPI de notre organisme12.

Par voie enzymatique, l’acide linoléique (C18:2 n-6) peut être converti en acide γ-
linolénique (C18:3 n-6) par une ∆6 désaturase13. L’élongation de cet acide par une élongase
conduit à la formation de l’acide dihomo-linonélique (C20:3 n-6). L’acide néo-formé est modifié
par une ∆5 désaturase conduisant à la formation de l’acide arachidonique (C20:4 n-6)14.

13
 L’acide α-linolénique (C18:3 n-3) peut être converti par une ∆6 désaturase en acide
stéaridonique (C18:4 n-3) puis par une élongation à l’acide eicosatetraénoique (C20:4 n-3).
Celui-ci, peut alors être substrat d’une ∆5 désaturase conduisant à l’acide eicosapentaénoique
(C20:5 n-3), converti ensuite en acide docosapentaénoique (C22:5 n-3) sous l’action d’une
élongase. Ce dernier est converti en acide tetracosapentaénoique (C24:5 n-3), qui peut alors
subir une ∆6 désaturation pour former l’acide tetracosahexaénoique (C24:6 n-3)15.

L’acide arachidonique et l’acide eicosapentanoïque sont les précurseurs dans

l’organisme de la classe des eicosanoïdes, ayant de nombreuses fonctions notamment dans
le processus d’inflammation, ou dans certaines maladies comme le diabète et les maladies
cardio-vasculaires16,17,18.

Figure 7 : Machinerie enzymatique menant aux différents acides gras par N. T. Nakamura et
al19

14
 Tableau 1 : Structure de certains acides gras saturés

Composition
Nom vernanculaire élémentaire Structure de la molécule
Nom scientifique
Masse moléculaire

O
Acide caprylique C8H16O2
Acide octanoïque MW : 144.2114 H3C OH

O
Acide caprique C10H20O2
Acide décanoïque MW : 172.2646 H3C OH

O
Acide laurique C12H24O2
Acide dodécanoïque MW : 200.3178 H3C OH

Acide myristique O
C14H28O2
Acide
MW : 284.4772 H3C OH
tétradécanoïque

Acide stéarique O
C18H36O2
Acide
MW : 284.4772 H3C OH
octadécanoïque

O
Acide arachidique C20H40O2
Acide eicosanoïque MW : 312.5304 H3C OH

O
Acide behénique C22H44O2
Acide docosanoïque MW : 340.5836 H3C OH

15
1.2 Les lipides issus du métabolisme des acides gras : les oxylipines
Les oxylipines représentent une très grande famille de composés, ce sont des lipides
issus du métabolisme des acides gras polyinsaturés, et en particulier des acides
arachidoniques et eicosapentaénoïques (Figure 8A et 8B). Ce sont des composés constitués
de 18 à 20 atomes de carbone, issus de “l’arachidonate cascade” (Figure 9) 20,21, et résultent
de différents processus d’oxydation. Cependant, chez les mammifères les oxylipines peuvent
également être synthétisées à partir d’autres acides gras comme l’acide linoléique (C18:2, ω-
6), l’acide-α linolénique (C18:3, ω-3), l’acide-γlinolénique (C18:3, ω-6), l’acide dihomo-γ
linolénique ou eicosatriénoique (C20:3, ω-6), l’acide eicosapentaénoique (C20:5, ω-3), l’acide
docosatétraénoique (C22:4, ω-6) ou l’acide docosahexaénoïque (C22:6, ω-3).

A) B)

Figure 8: Structure des acides arachidonique (A) et eicosapentaénoïque (B)

Figure 9 : Métabolisme oxydatif de l’acide arachidonique chez les mammifères, d’après Blée
200221

16
 Parmi les oxylipines se trouvent grand nombre de composés, qui sont divisés en 3
sous-classes en fonction de leur voie de biosynthèse enzymatique20: la voie des
cyclooxygenase (COX), la voie des lipoxygenases (LO) et la voie des cytochromes P450
pouvant être époxygenase et/ou hydrolase20. Ces différentes sous-classes regroupent
notamment les thromboxanes, les prostaglandines, les leucotriènes, les acides
epoxyeicosatriénoïques (EET) et les hydroxyeicosatetraenoiques (HETE).

Les tromboxanes et les prostaglandines sont des eicosanoïdes issues de la voie de

biosynthèse de la cyclo-oxygénase. Les COXs introduisent deux molécules de dioxygène sur
l’acide arachidonique, conduisant à la synthèse des prostaglandines (Figure 10). Les
prostaglandines, découvertes en 1935 par U. V. Euler, S. Bergstrom et B. Samuelson sont les
précurseurs des tromboxanes. Les métabolites issus de ces enzymes COXs font partis de la
famille des prostanoides. Structuralement, ce sont des métabolites proches de l’acide
arachidonique : ce sont donc des composés à 20 atomes de carbone, possédant au minimum
une insaturation ainsi qu’un cyclopentane entre les atomes 13 et 14 de carbone. On note
également la presence d’un groupement hydroxyle en position C15 sur ces métabolites20. Les
prostaglandines jouent des rôles physiologiques essentiels dans l’homéostasie : elles sont à
l’origine de la vasoconstriction, de la vasodilatation, mais également de la migration et de la
proliferation lymphocytaire.

O
O

OH

CH3
HO OH

Figure 10 : Structure de la prostaglandine 1

Les leucotriènes sont issus de la voie enzymatique des lipoxygenases. Ils sont produits
par l’action de la 5-lipoxygenase (5-LO), enzyme introduisant une molécule d’oxygène, formant
ainsi les leukotriènes, les lipoxines ou les hepoxillines, comme par exemple la molécule de
leukotriène B4 (LTB4, Figure 11), elle-même précurseur d’autres leucotriènes.
Structuralement ce sont des métabolites à 20 atomes de carbone, comprenant trois doubles
liaisons conjuguées, mais ne présentant pas de cycles. Les activités pharmacologiques des
leucotriènes sont nombreuses, notamment en ce qui concerne la perméabilité vasculaire,
l’activation de l’inflammation, notamment via la régulation des neutrophiles, ou encore la
vasoconstriction20.

17
 OH OH O

OH

CH3

Figure 11 : Structure du leukotriène LTB4

Enfin, la voie des cytochromes P450 pouvant être époxygénase et/ou hydrolases, qui
peut permettre la formation de ponts époxy entre deux carbone comme le 5,6-EET. Les HETE
sont formés à partir de l’acide arachidonique. Structuralement, les HETE sont des métabolites
à 20 atomes de carbone, composés généralement de 3 à 4 doubles liaisons carbone-carbone.
Les métabolites issus de la voie des CYP les plus connus sont les 16-HETE, le 19-HETE et le
20-HETE (Figure 12). Ce sont des intermédiaires du métabolisme de l’acide arachidonique.
Cette sous classe d’oxylipines va intervenir au niveau du transport de protéines
membranaires20,22.

OH

OH

Figure 12 : Structure du 20-HETE

De manière générale, les oxylipines sont des métabolites comprenant 20 atomes de

carbone. Ces molécules sont thermosensibles et très réactives, elles ont donc une demi-vie
extrêmement courte, de l’ordre de quelques minutes23.

Chez les mammifères, les oxylipines jouent un rôle essentiel dans de nombreux
processus physiologiques comme dans la régulation du système cardiaque, rénal ou
vasculaire. Ces composés sont également impliqués dans le développement maladies
chroniques, lors du dérèglement de leurs voies de biosynthèse. Elles sont notamment
impliquées dans l’obésité, l’inflammation, certains cancers et certaines maladies
neurodégénératives et cardiaques. Ces oxylipines peuvent être utilisées comme
biomarqueurs, permettant de diagnostiquer précocement des maladies24,25,26 et leurs enzymes
de biosynthèse constituent des cibles thérapeutiques. L’aspirine ou l’ibuprofène sont des
médicaments inhibant la cyclooxygénase 2, permettant le bloquage de la production de PG
lors de réactions inflammatoires27.

18
2. Les endocannabinoïdes

Les endocannabinoïdes, comme le N-arachidonoyl-éthanolamine couramment

appelés anandamide, est un neurotransmetteur lipidique synthétisé et libéré par les
neurones au niveau du cerveau. Ce composé peut être généré par plusieurs voies de
biosynthèse et de dégradation. L’anandamide (AEA, Figure 13) est le composé majoritaire
de cette famille. La voie de synthèse fait intervenir la N-acyltransférase (NAT), qui permet
un transfert de l’acide arachidonique (Tableau 1) sur une phosphatidyléthanolamine (PE,
composé présenté au point 4.3). Ce transfert génère un N-
arachidonoylphosphatidyléthanolamine, qui va être ensuite clivé via une phospholipase D,
générant ainsi l’anandamide28. Ces composés agissent spécifiquement sur des récepteurs
cannabinoïdes. Ils sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques et
pathologiques.

Figure 13 : Structure de l’anandamide (N-araciodonoylean olamide)

3. Les acides aminés acylés

Les acides aminés acylés aussi appelés lipoaminoacides (LpAA) sont des lipides
composés de deux entités : une chaine d’acide gras et un acide aminé. Ces structures ont
été décrites dans le cerveau de rats par l’équipe de J. Michael Walker29. Cinquante
molécules ont été décrites, composées des acides aminés alanine, glutamique, histidine,
glutamine, isoleucine, leucine, phenylalanine, méthionine, proline, serine, thréonine,
tryptophane, tyrosine, valine, arginine ou asparagine.

19
 Ces acides aminés peuvent être liés aux acides gras suivant : les acides oléique,
palmitique, stéarique, arachidonique, docohexanoique. L’ensemble de ces acides gras
sont couramment retrouvés dans le cerveau. Lorsque ces deux composantes sont
associées, la molécule formée est un acide aminé acylé, comme l’acide arachidonique lié
au glutamate (Figure 14).

Figure 14 : Structure de l’acide arachidonique lié au glutamate

D’autres types de composés ont également été décrits par cette même équipe, ou un
neurotransmetteur le GABA remplace l’acide aminé, permettant ainsi de former un l’acide
oléique lié au GABA29 (Figure 15).

Figure 15 : Structure de l’acide oléique lié au GABA

20
 4. Les glycérolipides

Les glycérolipides, aussi appelés acylglycérols ou glycérides sont des lipides non
polaires. Ils sont composés d’un squelette glycérol (Figure 16) estérifié par une, deux ou trois
chaînes d’acides gras formant respectivement les 3 classes de glycérolipides : les
monoacylglycérols ou monoglycérides (MG), les diacylglycérols ou diglycérides (DG) et les
triacylglycérols ou triglycérides (TG). Les structures de base des trois classes de glycérolipides
sont présentées au cours des différentes sections de cette sous-partie4,20.

OH
HO OH
C2
C1 C3

Figure 16 : Structure du squelette glycérol

La nomenclature de ces composés a été définie comme suit : MG(sn-1/2), DG(sn-1/sn-2/3)

et TAG(sn-1/sn-2/sn-3), avec : sn « stereospecific numbering », qui représente la
numérotation stéréospécifique au niveau du glycérol la position estérifiée du glycérol.

Chez les plantes, d’autres glycérolipides sont caractérisés par la présence de résidus
de sucres liés par une liaison osidique située entre une des trois fonctions alcool du glycérol
et une des fonctions alcool de l’ose. Ces glycérolipides constitués d’un galactose sont des
galactoglycérolipides20.

4.1 Les monoacylglycérols

Les monoacylglycérols sont des glycérolipides estérifiés par un seul acide gras, en
position sn-1/2 (Figure 17). Ces lipides sont issus de l’hydrolyse des diacylglycérols via l’action
d’une enzyme : la diacylglycérol lipase. L’action de cette enzyme va permettre la libération de
l’acide gras en position sn-230. Les MG contribuent à la réserve de glycérols, c’est donc une
classe de lipides essentiels.

H3C O OH

OH

Figure 17 : Structure d’un monoacylglycérol, le MG18:0 (1-octadecanoyl-sn-glycerol)

21
 4.2 Les diacyglycérols

Les diacylglycérols sont issus de l’estérification en position sn-1 et sn-2 d’un glycérol
par deux acides gras (Figure 18). Les DG sont issus du réticulum endoplasmique par hydrolyse
des triacylglycérides grâce à l’action d’une enzyme : la triacylglycérol lipase. Cela conduit à la
formation d’un DG via l’hydrolyse d’un acide gras en position sn-3 30,31. Par ailleurs, les DG
sont également issus des glycérophosphates et peuvent parfois intervenir dans la formation
de certains glycérophospholipides tels que les glycérophosphocholines (GPC), les
glycérophosphosérines (GPS) …32. Les MG et les DG ont des rôles importants dans
l’homéostasie de l’hôte, dont certains rôles restent encore méconnus. Certaines études en
lipidomique ont démontré l’accumulation de ces composés chez les personnes atteintes d’un
déficit cognitif léger ainsi que chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer, où leurs
rôles sont encore méconnus33.

H3C O OH

H3C O

Figure 18 : Structure d’un diacylglycérol, le DG18:0/18:0, 1-octadecanoyl-2-hexadécanoyl-

sn-glycerol

4.3 Les triacylglycérols

La synthèse d’un triacylglycéride (Figure 19) se produit en plusieurs étapes. En premier

lieu, les glycérophophates dépourvus de leur groupement phosphate vont former des DG par
l’action d’une acide phosphatidique phosphatase. Ces DG sont ensuite acylés par l’acyl
transférase30,31. Les TG peuvent être hydrolysés en DG et en acides gras complémentaires.
Dans le plasma, les TG sont les glycérolipides les plus abondants. Ces molécules représentent
la réserve majeure d’énergie du corps humain et peuvent être stockées dans les vacuoles
adipocytaires des tissus adipeux. Cette énergie stockée peut ensuite être redistribuée quand
nécessaire, aux différentes cellules et organes du corps34,35. L’énergie produite par les TG est
de l’ordre de 6 fois plus importante que celle produite par les glucides. De plus, les TG
représentent une réserve d’énergie mobilisable sur plusieurs mois, on parle d’énergie utilisable
à long terme via la formation de gouttelettes lipidiques. A l’inverse, les glucides constituent une
réserve immédiate d’énergie, mobilisable pendant 24h uniquement. Le tissu adipeux sous-

22
cutané est composé de TG, qui agissent également comme isolant thermique chez les
animaux à sang chauds36,37.

H3C O OH

H3C O

H3C O

Figure 19 : Structure d’un triacylglycérol, le TG 18:0/18:0/18:0, 1-octadecanoyl-2-

octadécanoyl-3- octadecanoyl-sn-glycerol

5. Les glycérophospholipides

Les glycérophospholipides (GPL) représentent la classe majoritaire des lipides

retrouvés dans la nature. De par leurs propriétés amphiphiles, ces composés sont les
constituants majeurs de la bicouche lipidique des membranes cellulaires. Ces GPL sont des
sites de liaisons pour les protéines intra et inter cellulaires4,20,38.

Les GPL sont des lipides impliqués dans certaines pathologies neurodégénératives
comme la maladie d'Alzheimer39. En effet, ils sont des constituants des membranes
neuronales, assurant le maintien d’une fluidité et d’une perméabilité. Chez les patients atteints
de la maladie d’Alzheimer, le taux de GPL dans les membranes neuronales est fortement
diminué38. Cette diminution s’accompagne d’une augmentation d’activités enzymatiques,
comme c’est le cas par exemple pour les enzymes lipolytiques (enzymes visant à dégrader
les lipides et en particulier les triglycérides en 3 AG). La diminution de la concentration des
GPL peut entraîner une perturbation de la fluidité et de la perméabilité membranaire, ce qui
peut avoir un impact sur l’homéostasie osmotique, et ainsi provoquer une inflammation et un
stress oxydatif. L’ensemble de ces perturbations peuvent aboutir à un processus de
neurodégénérescence40. Cette famille a pour structure commune le sn-glycérol 3 phosphate.
La nomenclature pour cette classe de lipide est la suivante : GP(sn-1/sn-2). Où : GP indique
la classe du glycérophospholipide, et sn-1/sn-2 correspondent aux positions des deux acides
gras sur le squelette glycérol. Les fonctions alcool en position sn-1 et sn-2 sont susceptibles
d’être estérifiés par deux acides gras : ce sont des diacyl-phospholipides.

23
 C’est la tête polaire qui permet de faire la distinction entre les différentes sous-classes
de glycérophospholipides (Figure 20). Ainsi, 6 classes de phospholipides peuvent être
différenciées : les glycérophosphates (GPA), les glycérophosphocholines (GPC), les
glycérophosphoéthanolamines (GPE), les glycérophosphoglycérols (GPG), les
glycérophosphoinositols (GPI) et les glycérophosphosérines (GPS).

Figure 20 : Structure de base des glycérophospholipides

5.1 Les glycérophosphates

Les glycérophosphates sont les glycérophospholipides les plus simples et la classe de

glycérolipide la plus minoritaire (Figure 21). A partir d’un glycérol et de deux acyl-transférases,
ils sont produits dans la mitochondrie et le réticulum endoplasmique1. Cette sous classe de
phospholipides est le précurseur d’autres glycérophoslipides et des glycérolipides comme les
TG et les DG31.

O O
HO
1 P
R O O OH
2
R O

Figure 21 : Structure de base d’un glycérophosphate (GPA)

24
 5.2 Les glycérophosphocholines

Les GPC (Figure 22), sont les lipides les plus abondants dans les membranes des
cellules eucaryotes (tant bien animales et végétales), elles constituent jusqu’à 50% de la
composition totale de la membrane1. Elles sont le principal composant des bicouches
lipidiques, permettant d’assurer leur structure. Les PC sont caractérisées par le groupement
choline qui les composent. Elles sont synthétisées au niveau du réticulum endoplasmique et
dans l’appareil de Golgi à partir d’une choline phosphorylée et d’un DG1. Ces composés sont
essentiels, puisque leur disparition s’accompagne généralement d’une inhibition de croissance
et / ou de mort cellulaire. Hormis leur rôle majeur structural, les GPC sont impliqués dans la
signalisation intracellulaire, ou encore dans la stabilisation de la chromatine. Les GPC sont les
précurseurs des sphingomyélines.

O O CH3
HO H3C +
1 P N
R O O O CH3
2
R O

O
Figure 22 : Structure de base d’une Glycérophosphocholine (GPC)

5.3 Les glycérophosphoéthanolamines

Les glycérophosphoéthanolamines sont composés d’une tête polaire éthanolamine
(Figure 23). Ce sont les lipides les plus abondants après les GPC chez les animaux et les
végétaux. Dans les cellules animales, la GPE existe sous trois 3 formes : diacyl, alkylacyl ou
bien alcènylacyl (Figure 24)41. Les GPE sont synthétisés au niveau de la mitochondrie et dans
l’appareil de Golgi, à partir d’une éthanolamine phosphorylée et d’un diacylglycérol42,1.Ces
composés sont des médiateurs pro-homéostastiques, qui peuvent être administrés en tant que
principe actif. Ils sont notamment utilisés dans les médicaments anti-inflammatoires et
analgésiques comme le Normast et le Pelvilen.

O O
HO
1 P NH2
R O O O
2
R O

O
Figure 23 : Structure de base d’une Glycérophosphoéthanolamine (GPE)

25
 Figure 24 : Structure des GPE sous forme diacyl, alkylacyl et alcèylacyl (A,B,C)

Une sous classe de GPE existe, il s’agit des plasmalogènes (ou étherphospholipides,
Figure 25). Ce sont des lipides complexes dont les formes plus abondantes sont les
alcénylglycérophospholipides. La synthèse de ces composés nécessite des peroxysomes
fonctionnels43,44. Un défaut de biosynthèse de ces composés est marqueur de certaines
maladies peroxysomales humaines. Structuralement, chez les plasmalogènes, un acide gras
est remplacé par un alcool gras insaturé lié au glycérol par une liaison éther45. Ces composés
sont retrouvés dans la myéline.

1
R
–
O O

O O P O

O
+
O NH 3

2
R

Figure 25 : Structure d’un plasmalogène ou R1 et R2 sont des chaines d’acides gras

26
 5.4 Les glycérophosphoglycérols

Chez les animaux, les glycérophosphoglycérols représentent 1 à 2% des lipides totaux

(Figure 26). Ils sont localisés dans les mitochondries, où ils servent de précurseurs pour la
synthèse des cardiolipides. Ces lipides sont composés d’un glycérophosphate et d’une unité
glycérol, formant la tête polaire. Chez les végétaux, les GPG sont retrouvés dans les plastes,
où ils jouent un rôle essentiel dans la photosynthèse46.

O O
HO
1 P
R O O O OH
2
R O OH

Figure 26 : Structure de base d’un Glycérophosphoglycérol (GPG)

5.5 Les glycérophosphoinositols

Les glycérophosphoionisitols (PI), sont présents dans le feuillet interne des

membranes de tous les types cellulaires, et plus particulièrement dans le cerveau, où ils
peuvent atteindre 10% de la totalité des GPL. Ils sont caractérisés par une tête polaire de type
inositol, et possèdent un résidu alcool qui peut être phosphorylé en position 3, 4 ou 5. Une
première phosphorylation conduit à la formation des glycérophosphoinositols phosphates
(PIP, Figure 27), une seconde conduit à la formation des glycérophosphoinositols-4,5-
biphosphates (PIP2, Figure 28). Ces composés (PIP2) peuvent être hydroxylés sur les positions
3-4, et également 3-5. Les PIP2 peuvent être phosphorylés sur leurs troisièmes positions pour
donner des PIP3. Les PIP2 peuvent être hydrolysés en diacylglycérol et en inositols
triphosphate (IP3)47. Ils sont très faiblement présents dans les membranes plasmiques (de
l’ordre de 5%) mais, jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la motilité cellulaire et dans le
trafic membranaire20,48,49.

Figure 27 : Structure de base d’un Glycérophosphoionisitol (GPI)

27
 O –
O
– P
O
HO O

O
O OH
O –
1 P O
R O
OH –
O HO O P O
2
R O
H
O
O

Figure 28 : Structure de base d’un Glycérophosphoinositol-3,5-biphosphate (PIP2)

5.6 Les glycérophosphosérines

Les glycérophosphatidylsérines, représentant moins de 10 % du contenu lipidique total
sont des glycérophospholipides (Figure 29) présentes au niveau des feuillets internes des
membranes plasmiques et du reticulum endoplasmique des cellules végétales et animales, et
des microorganismes. Les GPS sont constituées d’une tête polaire sérine, elles sont obtenues
par la substitution de la choline ou de l’éthanolamine par une sérine. Etant des
glycérophospholipides anioniques, les GPS sont capables de chélater les cations, et
particulièrement le calcium. Cela va alors modifier la conformation de leurs têtes polaires
entrainant un changement de fonction. Ces lipides se situent à la croisée de très nombreuses
voies métaboliques. Elles sont notamment impliquées dans l’échange entre les têtes polaires
de GPL (GPE et GPC), et constituent, des précurseurs pour leurs synthèses. Les
glycérophosphosérines peuvent agir comme messagers de signalisation, via des interactions
avec des protéines spécifiques39,50.

O O
HO
1 P NH2
R O O O
2
R O
O OH
O

Figure 29 : Structure de base d’une glycérophosphatidylsérine (GPS)

28
 6. Les sphingolipides
Les sphingolipides sont des composés présents dans les membranes cellulaires
majoritairement au niveau du feuillet externe de la bicouche lipidique. Cette classe de lipides
possède de nombreuses fonctions biologiques. Les sphingolipides sont impliqués dans un
grand nombre de maladies génétiques, dans le phénomène d’apoptose, de différenciation et
de reconnaissance cellulaire51,52,53. Les sphingolipides représentent une catégorie de lipides
caractérisée par leur structure commune de type sphingoïde. Ces composés présentent une
chaîne d’acide gras, deux fonctions hydroxyles et une fonction amine. La nomenclature de ces
composés est la suivante : SL(d sn-1/sn-2). Où SL désigne la classe du sphingolipide, d
désigne le groupement 1,3-dihydroxyle du motif sphingoïde, et sn-1/sn-2 désignent
respectivement le motif sphingoïde et le radical acyl relié par une liaison amide au groupement
sphingoïde. La sous-classe des sphingolipides est déterminée par la nature de la tête (choline,
monohexosyl, ou lactosyl par exemple), généralement polaire portée par le groupement
hydroxyle primaire du squelette sphingoïde. Chez les mammifères, la base sphingoïde la plus
généralement répandue est une sphingosine comportant 18 atomes de carbone et une double
liaison (Figure 30). Toutefois il existe également une base sphinganine (Figure 31), comportant
18 atomes de carbone elle aussi, mais pas de double liaison. D’autres sphingolipides sont
maintenant détectées, avec des longueurs de chaine d’acide gras variables, pouvant être
saturées ou insaturées, méthylées ou oxydées (e.g. C16 :0, C16 :1).

NH2

HO CH3

OH

Figure 30 : Structure de la sphingosine la plus répandue chez les mammifères

NH2

HO CH3

OH

Figure 31 : Structure de la sphinganine la plus répendue chez les mammifères

De plus, il est possible de retrouver d’autres structures issues des spingolipides : les
sulfatides. Ce sont des glycosphingolipides où l’un des deux résidus glucidiques a été estérifié
par une molécule d’acide sulfurique54. Ces composés sont retrouvés dans les membranes des
cellules du système nerveux.

29
 6.1 Les céramides

Les plus simple des sphingolipides sont les céramides (Figure 32), ou les
acylsphingosines. Ils constituent une famille lipidique structurellement homogène, et sont
synthétisés dans le réticulum endoplasmique via une réaction entre une sphingosine et un
acide gras, menant à la création d’une liaison amide34. Les acides gras impliqués dans cette
réaction sont généralement composés d’une chaine alkyle entre 14 et 26 carbone, et peuvent
être mono-insaturés4.

Les céramides sont impliqués dans le métabolisme des sphingolipides, puisqu’ils

servent de précurseurs aux cérébrosides, aux gangliosides, aux sphingophospholipides tels
que la sphingomyéline, et aux acylcéramides. Ils sont également impliqués dans la régulation
de l’apoptose.

OH

H3C
OH
HN O

2
R

Figure 32 : Exemple d’un céramide (où R2 est une chaine alkyle variable)

30
 6.2 Les sphingomyélines

Les sphingomyélines, (Figure 33) sont les phosphosphingolipides les plus présents
chez les mammifères, et sont des composants ubiquitaires des membranes des cellules
animales. Ces composés sont particulièrement retrouvés au niveau du système nerveux, où
ils entrent dans la composition des gaines de myélines. Elles sont synthétisées dans la
membrane plasmique et dans l’appareil de Golgi, par réaction entre une céramide et une
GPC1,55. Les chaines d’acides gras qui les composent sont généralement longues, et mono-
insaturées. La chaine d’acide gras R1 est de longueur plutôt fixe (chaine d’acide gras à 18
atomes de carbone), la chaine R2 quant à elle présente une longueur variable. Les
spingomyélines ne semblent pas exister chez les plantes et les microorganismes.

Les sphingomyélines se situent dans la couche externe de la membrane, où elles

jouent un rôle essentiel de régulation des canaux ioniques. Elles sont également impliquées
dans le fonctionnement des récepteurs couplés aux protéines G55. Elles sont capables de
former des microdomaines plasmatiques ou radeau lipidique via leurs interactions avec le
cholestérol56.

OH HO H
O +
P N
H3C O H
O H
O NH

2
R

Figure 33 : Structure d’une sphingomyéline (où R2 est une chaine alkyle variable)

31
 6.3 Les glycosphingolipides

Les sphingolipides sont des lipides complexes, synthétisés dans l’appareil de Golgi.
Ces lipides sont composés d’une unité céramide associée à un ou plusieurs sucres (Figure
34)4,57. Les deux principaux composés de la famille des sphingolipides sont les cérébrosides
et les gangliosides57. Ces lipides sont généralement retrouvés dans le cerveau, ou dans les
membranes des cellules ganglionnaires du système nerveux. Ils sont essentiels au
développement et à la croissance des embryons, à la différenciation tissulaire ainsi qu’au
fonctionnement du système nerveux58.

HO OH

HO O

HO O
NH
HO O

CH3

H3C

Figure 34 : Exemple d’un galactosylcéramide, composé de la famille des

glycosphingolipides

32
 7. Les stérols

Les stérols sont tous issus d’une structure commune : l’unité cyclopentanophénantrène
(Figure 35). Il s’agit d’un tétracycle, responsable du caractère hydrophobe des stérols. Les
stérols sont les principaux lipides non-polaires, qui constituent les membranes cellulaires.
Parmi les stérols, plusieurs sous classes existent : les stérols libres, les stérols estérifiés, les
oxystérols, les stéroïdes, les vitamines D et les acides biliaires4.

CH3

CH3 H

H H

Figure 35 : Structure du squelette cyclopentanophénantrène des stérols

7.1 Les stérols libres

Les stérols les plus abondants chez les mammifères est le cholestérol (Figure 36).
Comparé au squelette cyclopentanophénantrène, le cholestérol comporte deux fonctions
méthyles en positions 10 et 13, une fonction hydroxyle en position 3 ainsi que des doubles
liaisons en positions 5 et 6. Ils sont synthétisés dans le foie, et représentent des composants
majeurs des membranes cellulaires assurant leur rigidité en s’intercalant entre les acides gras
des phospholipides et des sphingomyélines. Les cholestérols sont les précurseurs des
hormones stéroïdiennes, de la vitamine D et des acides biliaires. Leurs concentrations sont
finement régulées, un dérèglement peut entrainer des perturbations plus ou moins importantes
à l’origine de nombreuses pathologiques, comme par exemple l’athérosclérose59.

H3C
CH3

H3C H

CH3
H
CH3 H

H H
HO

Figure 36 : Structure du cholestérol : cholest-5-en-3-ol

33
 7.2 Les stéroïdes

Les stéroïdes sont des hormones, toutes synthétisées à partir d’un même précurseur :
le cholestérol. Seuls les tissus dits stéroïdogéniques sont capables de synthétiser des
stéroïdes. Ce sont principalement les glandes endocrines : les gonades les glandes
surrénales, mais aussi le système nerveux central. La première étape de la synthèse de ces
hormones à lieu dans la mitochondrie et dans le réticulum endoplasmique, ou la biosynthèse
est catalysée par le cytochrome P450 et par des enzymes (hydroxystéroïdes
déhydrogénases)60. Ces molécules sont impliquées dans de nombreuses fonctions
physiologiques telles que le maintien de la pression artérielle, le développement des
caractères sexuels secondaires, la reproduction, le mémoire, le métabolisme des glucides ou
encore le développement osseux61,62,63. Les stéroïdes sont classés en 3 grandes sous
familles. La première regroupe les stéroïdes composés d’un cycle oestrane à 18 atomes de
carbone. Dans cette famille de stéroïdes se trouve notamment les oestrogènes (Figure 37 A).
La seconde sous-famille de stéroïdes regroupe les composés ayant un cycle androstane à 19
atomes de carbone, notamment la testostérone (Figure 37 B). Enfin, la dernière classe de
stéroïdes comporte un cycle prégnane à 21 atomes de carbone, comme par exemple la
progestérone (Figure 37 C).

Il existe une autre famille de composés stérols très vaste, les oxystérols. Il s’agit de
structures dérivées du noyau stérol sur lesquelles plusieurs oxydations ont eu lieu. Ces
composés sont notamment retrouvés chez les plantes, les levures ou chez l’homme.

OH H3C
A H3C B CH3 OH C CH3
O
H
CH3 H
H H H
H H
H H
H H
O
O
HO

Figure 37 : Structure de différentes hormones stéroïdiennes : l’estradiol (A), la testostérone

(B) et la progestérone (C)

34
 7.3 Les vitamines D

Le terme vitamine D regroupe deux composés : l’ergocalciférol ou vitamine D2, et le

cholécalciférol ou vitamine D3 (Figure 38). La première est issue de l’alimentation d’origine
végétale, comme les céréales, alors que la seconde est produite par la peau, sous l’action des
rayons UV. Elle peut également se retrouver dans l’alimentation d’origine végétale ou dans les
poissons gras. Ces vitamines, considérées comme des hormones, facilitent l’absorption
intestinale du calcium et du phosphate. Cette absorption est nécessaire à la minéralisation des
tissus osseux, et donc à la croissance et au maintien de la structure osseuse64,65. Certaines
études suggérent qu’un déficit en vitamine D pourrait entrainer un risque de développement
cancéreux. Une carence en vitamine D entraine un rachitisme chez le jeune enfant en
croissance66. Chez l’adulte, cette carence est associée à un trouble de la minéralisation
osseuse, appelée ostéomalacie67.

H3C
CH3

H
H3C

CH3
H

CH2

HO

Figure 38 : Structure du cholécalciférol (vitamine D3)

35
 7.4 Les acides biliaires
Les acides biliaires sont une famille de stérols synthétisés dans le foie, à partir du
cholestérol oxydé en position 768 : le 7-α-hydroxycholestérol (Figure 39). Ces molécules sont
dérivées du cholestérol, mais ont en commun une structure stéroïdienne (le noyau stéroïdien)
ainsi qu’une chaine latérale constituée au minimum de 4 atomes de carbone. Ce sont des
molécules amphiphiles puisqu’elles sont composées d’une partie hydrophobe, par la structure
stéroïdienne, et d’une partie hydrophile via la chaine latérale, et les groupements hydroxyls. Il
existe une grande diversité d’acides biliaires au niveau structural définie par la position des
groupements hydroxyls portés par les carbones ainsi que par la nature du groupement fixé à
la chaine latérale. Ils peuvent se retrouver sous forme libre ou sous forme conjugués à la
taurine ou à la glycine. Ces composés comportent une fonction acide. Les acides biliaires sont
ensuite stockés dans la vésicule biliaire, sécrétés dans l’intestin, et retournent vers le foie via
un cycle entéro-hépatique69. Les 4 fonctions principales des acides biliaires sont : 1) faciliter
l’absorption intestinale des lipides, 2) faciliter l’excrétion biliaire de métabolites endogènes, 3)
éliminer le cholestérol de l’organisme, et 4) participer à un maintien de l’homéostasie
énergétique. Chez l’homme, les acides biliaires les plus répandus sont l’acide cholique
C24H40O5 (Figure 40A), l’acide chénodésoxycholique C24H40O4 (Figure 40B) et l’acide
muricholique C24H40O5 (Figure 41C)70. L’acide cholique peut être conjugé à la glycine et à la
taurine pour former l’acide glycocholique et l’acide taurocholique (Figure 41A et 41B
respectivement)

H3C
CH3

H3C

CH3
OH
CH3 H

HH

HO OH

Figure 39 : Structure du 7-α-hydroxycholestérol, précurseur des acides biliaires

36
 O O
A B
H3C OH H3C OH
OH
CH3 CH3

CH3 H CH3 H

H H H H
HO OH HO OH
H H

O
C
H3C OH
CH3
H

CH3 H

H H
HO OH
H
OH

Figure 40 : Structure de deux acides billiaires majoritaires : l’acide cholique C24H40O5

(A) et de l’acide chénodésoxycholique C24H40O4 (B), et de de l’acide α-muricholique
C24H40O4 (C)

A B
O O
OH OH HO
H O
NH NH S

H H O
OH

H H H H
O
HO HO
H H
OH OH

Figure 41 : Structure de l’acide glycocholique (A) et de l’acide taurocholique (B)

37
8. Les prénols

Les prénols sont synthétisés à partir de précurseurs constitués de 5 atomes de

carbone : l’isopentényl-pyrophosphate et le diméthylallyl-pyrophosphate (Figure 42). Il existe
différentes familles de prénols, classées en fonction de la longueur du squelette hydrocarboné
et de leurs groupements fonctionnels. Par exemple les isoprénoïdes en C40 sont des
caroténoïdes, comme par exemple le β-caroténe (Figure 43). Les quinones constituent une
famille composée de diènes, les hydroquinones sont constitués de composés organiques
aromatiques (Figure 44). Les composés prénolés jouent un rôle de protection contre le stress
oxydatif, les maladies cardiovasculaires et certains cancers35.

O O O O
H3C O O OH H3C O O OH
P P P P
CH2 OH OH CH3 OH OH

Figure 42 : Structure de l’isopentényl-pyrophosphate et du diméthylallyl-

pyrophosphate

H3C
H3C CH3 CH3 CH3 H3C

CH3 CH3 CH3

CH3

Figure 43 : Structure d’un prénol, composé issu de la sous famille des isoprénoïdes :
le β-caroténe

O
CH3

CH3

O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

Figure 44 : Structure d’un prénol, de la sous famille des quinones : la ménaquinone,

ou vitamine K2

38
Chapitre II : Le microbiote intestinal et lipides associés

Dans ce chapitre, les notions essentielles et indispensables concernant le microbiote

intestinal seront présentées. Les notions telles que la de taxonomie, la dysbiose intestinale, la
mise en place du microbiote intestinal chez l’enfant et l’adulte, et certaines pathologies liées
au microbiote intestinal seront discutées. Dans un second temps les lipides du microbiote
intestinal seront présentés en deux temps : les lipides structuraux puis les lipides issus du
microbiote intestinal.

1. Définitions et notions essentielles

La notion de microbiote est introduit pour la première fois en 2001, définit comme un
“système écologique de microorganismes commensaux symbiotiques et, parfois pathogènes
qui résident dans le corps humain”71. Le microbiote n’est pas uniquement retrouvé chez les
êtres humains, mais également chez les animaux et même les plantes. Depuis 2001 la
définition à évoluée, le microbiote est une collection de microorganismes se regroupant dans
une niche spécifique comme le microbiote intestinal, le microbiote pulmonaire ou le microbiote
de la peau. Les microbiotes sont donc organes spécifiques puisque l’on ne retrouve pas les
mêmes souches de micro-organismes en fonction de l’organe étudié. Cependant, le microbiote
évolue au cours du temps dans une même niche comme au niveau du microbiote intestinal,
objet de ce chapitre, où sa composition varie au cours de la vie de l’hôte.

Le microbiote intestinal, antérieurement appelé flore intestinale, est composé d’une

population de bactéries et d’autres micro-organismes comme les archées, les virus et les
champignons se trouvant dans le tractus gastro-intestinal. Il possède un rôle local en
participant au maintien de l’homéostasie intestinale et un rôle systémique en étant impliqué
dans plusieurs fonctions physiologiques vitales pour l’hôte, comme dans la maturation du
système immunitaire. Le déséquilibre des populations composant le microbiote peut conduire
à des pathologies digestives mais également à des pathologies non-intestinales comme
l’obésité ou l’autisme72,73. Afin de restaurer cet équilibre, de nombreuses thérapies comme la
prise de probiotiques ou les transplantations fécales de microbiote ont été développées. Des
travaux plus récents sur l’activité de certains métabolites synthétisés par le microbiote
intestinal ouvre la porte à des perspectives thérapeutiques prometteuses74.

La caractérisation des métabolites du microbiote concerne essentiellement des

molécules produites par les bactéries. Elles apportent à l’hôte entre 2 et 20 millions de gènes,

39
possédant, pour la majorité d’entre eux, des fonctions non redondantes. Taxonomiquement,
les bactéries sont classées en phylas, classes, familles, genres et espèces. Le microbiote
intestinal est composé de 60 genres, provenant de 4 phyla majoritaires : Firmicutes,
Bacteroidetes, Actinobactéries, Protéobactéries (Figure 45). Pour ce chapitre, nous allons
nous focaliser uniquement sur les bactéries.

Figure 45 : Représentation schématique des grands phyla des bactéries

2. Origine et composition du microbiote intestinal

La composition du microbiote intestinal varie en fonction des espèces. Le microbiote
intestinal de la souris, présente par exemple des différences lorsqu’il est comparé au
microbiote intestinal humain. Au niveau des phylas de ces deux microbiotes, plus de 90% y
sont communs, notamment par l’ultra dominance de deux phylas : les Firmicutes et les
Bacteroidetes. La composition du microbiote intestinal varie également en fonction de l’âge de
l’individu, cette partie est détaillée dans le point suivant.

2.1 Chez l’enfant

Le nouveau-né, se retrouve dès sa naissance en contact avec des bactéries, des

archées, des virus et des organismes unicellulaires permettant la mise en place du microbiote
intestinal. Lors d’un accouchement par voie basse, les bactéries du microbiote vaginal et fécal
de la mère participent à la colonisation du tractus digestif fœtal.

Les premières bactéries colonisatrices retrouvées chez le nouveau-né sont aérobies

et anaérobies facultatives et appartiennent à deux phyla : Firmicutes (staphylocoques,
enterocoques, …) et Proteobacter (Escherichia coli). Elles vont modifier l’environnement pour

40
permettre l’implantation d’autres micro-organismes comme les bactéries anaérobies strictes
(Bacteroides, Clostridioides, Actinobacteries). Le microbiote intestinal des nouveaux nés se
caractérise par une faible abondance et une faible diversité bactérienne et par la dominance
de deux phyla les Proteobacteries et les Actinobacteries. Au cours de l’enfance, le microbiote
du nouveau-né se diversifie, pour au final être dominé par deux autres phylas bactériens : les
Bacteroidetes et les Firmicutes75,76.

Le microbiote intestinal du nouveau-né se complexifie de manière progressive au

courant de sa vie. Dans un premier temps, certaines bactéries vont être apportées via le lait,
et cela qu’il soit d’origine maternelle ou industrielle. Ensuite, ce sont d’autres bactéries, issues
de l’environnement qui vont venir ajouter de la complexité au microbiote intestinal. Au bout
d’un an, l’enfant possède un profil microbien similaire à celui d’un adulte en terme de diversité
et de composition : il contiendra donc des espèces bactériennes appartenant aux phylas des
Firmicutes, des Bacteroidetes, des Proteobacteria et des Actinobacteria77,78,79. C’est à l’âge de
3 ans que le microbiote intestinal de l’enfant commence à se stabiliser en terme de
concentration bactérienne et d’espèces. Une fois que la population bactérienne du microbiote
intestinale s’est stabilisée, elle reste la même tout au long de la vie de l’hôte en bonne santé.

2.2 Chez l’adulte

La quantité de bactéries composant le microbiote intestinal d’un adulte ne fait
qu’augmenter en suivant un gradient de concentration de la bouche à l’anus (Figure 46)80. La
quantité de bactérie atteint son maximum dans le côlon avec une concentration entre 109 à
1012 bactéries par gramme de tissu correspondant à 1000 voire 2000 espèces différentes75.
Chez l’homme adulte, le microbiote intestinal représente environ 1 kilogramme de son poids
total et est reconnu comme un organe à part entière81. Il y a dix fois plus de diversité chez les
cellules bactériennes que chez les cellules humaines du corps82. L’intestin est l’organe le plus
colonisé par le microbiote, il concentre environ 70% des bactéries83,84. Les Firmicutes
(bactéries gram positives) et les Bacteroidetes (bactéries gram négative), constituent à eux
deux près de 90% de la population totale du microbiote intestinal.

41
 Figure 46 : Gradient de quantités en bactéries dans le tractus digestif humain

Les Firmicutes, qui sont plus abondantes, représentent entre 60 et 80% de la

population bactérienne du tractus digestif. Ce phylum est majoritairement composé de
bactéries appartenant à la classe des Clostridia. Les Bacteroidetes, représentant 30% de la
population bactérienne du tractus digestif85, est constitué par plusieurs espèces comme
Bactéroides fragilis. Les deux autres phylas majoritaires de l’intestin humain sont les
Actinobacteria et les Proteobactaria. Le phylum des Actinobacteria comprend les
Bifidobacteries telles que Bifidobacterium Longum.

Bien que la composition du microbiote intestinal puisse varier d’un individu à l’autre, on
retrouvera toujours le même profil d’espèces dominantes au cours du temps chez un même
individu86. Cet équilibre du microbiote intestinal peut être perturbé par un changement brutal
de régime alimentaire ou par un traitement antibiotique. La prise d’antibiotiques va induire la
modification des espèces majoritaires composant le microbiote et/ou la disparition de certaines
espèces initialement présentes. Ce n’est qu’un mois après l’arrêt du traitement antibiotique
qu’un retour au profil initial des espèces bactériennes contenues dans le microbiote intestinal
sera rétabli, c’est le phénomène de résilience87,74.

42
 3. Bactéries utilisées pendant mes travaux de thèse

Les probiotiques est un concept développé par Henry Tessier et Elie Metchnikov dans
les années 1900, mais c’est en 1954 que Ferdinand Vergin utilise pour la première fois le
terme probiote. Lors de la mise en place de cultures de bactéries anaérobies, Henry Tessier
identifie que contrairement aux données de la littérature Escherichia coli n’est pas la bactérie
majoritaire de la flore retrouvée chez l’enfant, mais que c’est une autre bactérie, méconnue
qu’il nommera Bacillus bifidus. Il définit alors certaines bactéries comme « bonnes bactéries »,
abondantes de la flore infantile.

A ce jour, les probiotiques sont définis par l’OMS comme des micro-organismes
vivants, qui confèrent un effet bénéfique à l’hôte lorsqu’ils sont présents en quantité adéquate.
Pour qu’une bactérie soit considérée comme probiotique, celle-ci se doit de répondre à
plusieurs obligations comme par exemple avoir une efficacité prouvée dans des études chez
l’être humain. Plusieurs études cliniques cherchent à mettre en lien probiotiques et effet sur la
douleur viscérale, ou plusieurs études montrent que certains probiotiques peuvent diminuer la
douleur viscérale88, alors que d’autres non89. Il apparait clairement que les effets de certains
probiotiques ne sont pas généralisables à l’ensemble des probiotiques, de même espèce ou
d’espèces différentes, et qu’un nombre limité de souches semblent avoir des effets bénéfiques
pour l’organisme. Les probiotiques peuvent améliorer les fonctions de la barrière intestinale et
possèdent des certains cas des fonctions anti-inflammatoires90, anti-cancéreuses91, anti-
pathologiques92 ou moduler le transit intestinal et la douleur viscérale.

La plupart des probiotiques qui sont utilisés à ce jour ont été caractérisées parmi les
bactéries commensales de l’intestin humain, c’est le cas par exemple des deux bactéries
probiotiques que nous avons utilisées lors de notre étude : Escherichia coli Nissle 1917 (EcN)
et Lactobacillus animalis/murinus.

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) a été la première souche de probiotique utilisée
dans mes travaux puisqu’en 2017, notre équipe a identifié un nouveau lipide bactérien aux
activitées analgésiques issu de cette bactérie : le C12asnGABA93.

Lactobacillus animalis/murinus n’est pas une des bactéries les plus abondante du
tractus digestif humain, cependant les Lactobacillus sont connues pour leurs effets bénéfiques
sur l’homéostasie intestinale. De plus, notre équipe a démontré récemment que la présence
de cette bactérie dans un modèle murin était corrèlement inversé à la diminution de la douleur
viscérale.

43
 Lactobacillus : Le genre des Lactobacillus décrit en 1901 par Beiierinck a été établi
sur la base de la morphologie et des propriétés physiologiques des bactéries qui le
composent94. Les Lactobacillus appartiennent au phylum des Firmicutes et à la famille des
Lactobacillaceae, et sont caractérisées par leur forme en bâtonnet et leur production d’acide
lactique. Ces bactéries gram+ sont immobiles, non flagellées, non sporogènes et anaérobies
facultatives94. Les Lactobacillus ont été parmi les premières espèces de bactéries décrites
pour leurs effets probiotiques. C’est en 1935 qu’est commercialisé pour la première fois
Lactobacillus casei shirota. Les Lactobacillus sont des espèces fortement retrouvées au
niveau des milieux riches en glucose comme les muqueuses intestinales, orales et vaginales
où ils représentent 90 à 100% des bactéries. Le rôle probiotique des Lactobacillus lui est
conféré en partie par sa production d’acides lactique et acétique, qui sont antibactériens, et
son système de capture du fer efficace qui lui confère un avantage face aux pathogènes95.
Elles participent également à la maturation du système immunitaire et de la barrière épithéliale
intestinale95.

Dans une majorité d’études, L. murinus et L. animalis sont considérées comme étant
une seule et même espèce. Difficilement identifiables par les techniques classiques de
caractérisation métabolique, elles se ressemblent également fortement d’un point de vue
génétique puisque leurs ARN 16S présentent peu de différences. Il est donc suggéré de les
identifier en tant que L. murinus/animalis et c’est ce que nous ferons dans notre étude96.

Escherichia coli : Ces bactéries ont été décrites pour la première fois en 1885 par
Theodor Escherich, lorsqu’il isole et caractérise ces bactéries dans des selles d’enfants97. Il
nomme alors cette bactérie Bacterium coli commune. Le nom d’Escherichia coli sera reconu
uniquement à partir de 1954. Les Escherichia coli appartiennent au phylum des
Proteobacteries et à la famille des Enterobacteriaceae98. Ce sont des bactéries à gram -,
anaérobies facultatives en structures de bâtonnets. Elles possèdent un flagelle pour se
déplacer ou des pilis pour adhérer à la surface des cellules99. Environ 90 % de la population
humaine possèdent des E. coli au sein de son tractus digestif100. Ces bactéries sont réparties
en 7 groupes phylogénétiques (A, B1, B2, C, D, E et F) qui regroupent des bactéries
commensales, pathogènes et probiotiques101. Le groupe phylogénétique B2 contient des E.
coli possédant une capacité accrue de colonisation et d’implantation dans le tractus digestif
humain. Dans la population française, 34% des E. coli du tractus digestif appartiennent à ce
groupe102. Il est hautement hétérogène, et renferme à la fois des bactéries commensales et
pathogènes, mais aussi probiotique comme EcN101 EcN Nissle 1917 est une souche
probiotique d’Escherichia coli décrite pour la première fois par Alfred Nissle. Pendant la

44
première guerre mondiale, il remarque son effet bénéfique en l’isolant du microbiote d’un de
ses caporaux, inaffecté par la dysenterie101.

E. coli est vendue en tant que probiotique dans certains pays sous le nom de Mutaflor®
depuis 1917, son utilisation y est indiquée dans les cas de constipation chronique, dans les
phases de rémission de la rectocolite hémorragique et dans le syndrome de l’intestin irritable.
De plus, elle est souvent utilisée en tant que probiotique dans les études cliniques et pré-
cliniques, ce qui a permis d’identifier certains des mécanismes via lesquels elle agît sur l’hôte.

4. Les fonctions du microbiote intestinal

Le microbiote intestinal est considéré comme un organe à part entière et joue un rôle
sur l’homéostasie générale de l’hôte par ses fonctions métaboliques, immunologiques et
endocrines80,103. L’ensemble des bactéries qui peuplent notre système digestif sont en contact
avec les cellules de notre intestin. L’hôte et le microbiote intestinal ont établi une relation
mutualiste et symbiotique : les deux partenaires ont un avantage à vivre ensemble. Les
bactéries qui colonisent nos intestins sont impliquées dans de nombreuses fonctions
physiologiques et participent également au maintien de notre santé. En échange, l’hôte
procure un environnement stable aux bactéries ainsi que les nutriments, via l’alimentation,
nécessaire à sa survie et à son développement. Différents facteurs, comme par exemple
l’alimentation, sont impliqués dans le maintien de cette osmose entre les bactéries et hôte86.

Bien que la composition taxonomique du microbiote intestinal puisse varier d’un

individu à l’autre, les fonctions qu’il exerce sont majoritairement identiques103. Une des
fonctions principales du microbiote intestinal est la fermentation des fibres non-digestibles.
Ces fibres alimentaires, comme l’amidon ou les oligosaccharides, servent de substrat au
microbiote. Elles vont être métabolisées en acides gras à courte chaine (AGCC). Cela implique
de nombreuses activités métaboliques réalisées par le microbiote. La plupart des métabolites
issus de la fermentation par le microbiote intestinal vont être utilisés par l’organisme et auront
des répercussions sur la santé de l’hôte et le maintien de son homéostasie86. Le microbiote
intestinal participe également à la fonction de barrière de la muqueuse intestinale en
empêchant la colonisation du système digestif par d’autres bactéries qui pourraient être
pathogènes pour l’hôte. Le microbiote intestinal participe à la production de xénobiotiques
(métabolites non endogène à l’hôte) comme par exemple la synthèse de vitamines telles que
les vitamines B2, B9, B12 ou K104. Ces vitamines d’origines bactériennes sont essentielles au
bon développement de l’hôte et au maintien de son homéostasie.

45
 Les bactéries assurent le développement et la maturation du système immunitaire et
des cellules épithéliales du tube digestif105. Le microbiote intestinal participe aux effets
trophiques de l’épithélium intestinal en favorisant le développement de microvillosités, la
maturation des réponses immunitaires et adaptatives de l’hôte106,107. Les bactéries protègent
également la muqueuse intestinale via la production de peptides antimicrobiens tels que les
bactériocines. D’autres études ont permis de mettre en évidence que le microbiote intestinal
permet d’améliorer considérablement la qualité du mucus108.

A l’âge adulte, les souris axéniques, dépourvues de microbiote, présentent un grand

nombre d’anomalies qui peuvent être corrigées en quelques semaines par l’inoculation d’un
microbiote intestinal varié. L’absence de bactéries intestinales chez ces souris axéniques
nécessite un apport calorique bien plus élevé ainsi qu’un régime riche en vitamines afin de
maintenir un poids normal. Les souris axéniques sont plus sensibles aux infections car leur
muqueuse intestinale est immature et la croissance épithéliale fortement ralentie109. Ces
études permettent de mettre en lumière la nécessité et l’importance du microbiote intestinal.
Les souris axéniques ont également été utilisées pour étudier le rôle du microbiote intestinal
au cours du développement du système immunitaire du tractus digestif de l’hôte110. Des études
ont démontré que l’exposition précoce à des bactéries est nécessaire pour le bon
développement du système immunitaire et la mise en place de la tolérance du système
immunitaire vis-à-vis du microbiote. L’absence à cette exposition bactérienne peut avoir des
conséquences néfastes et irréversibles sur la santé de l’hôte. D’autres études se sont
focalisées sur l’impact du microbiote sur les allergies. Certaines réactions allergiques
déclenchées chez des souris axéniques ont été inhibées par la colonisation de l’intestin par le
microbiote intestinal de souris sauvages111.

46
 5. Des modifications de la composition du microbiote intestinal
peuvent être associées à des pathologies ou à désordres
métaboliques
De nombreuses pathologies du tractus digestif et systémiques sont associées à une
dysbiose du microbiote c’est-à-dire à une modification majeure de la composition taxonomique
du microbiote intestinal. Certains troubles de l’immunité ou désordres métaboliques peuvent
être déclenchés, ou aggravés par les bactéries intestinales de l’hôte. Au cours des dernières
années, environ 25 pathologies ou troubles fonctionnels ont été associés à des modifications
de la composition du microbiote intestinal112. Le microbiote aurait un impact direct sur l’activité
des nerfs innervant le tractus digestif, sur les cellules épithéliales et sur l’activation des cellules
immunitaires113.

Parmi ces pathologies, le syndrome de l’intestin irritable (SII) est un trouble fonctionnel
digestif associé à une dysbiose du microbiote chez 72% des patients. Il touche environ 5% de
la population française, 11% de la population mondiale et principalement les femmes (sexe
ratio : 2/1)113. C’est la première cause de consultation chez le gastroentérologue114. Bien que
le syndrome de l’intestin irritable n’engage pas directement le pronostic vital, il altère
profondément et de façon chronique la qualité de vie des malades. Les traitements étant
dirigés contre les symptômes sont peu efficaces, c’est pour cela que le SII est un réel problème
de santé publique. Cette pathologie se caractérise par des douleurs abdominales, des
ballonnements (pouvant être associés à un métabolisme excessif du microbiote intestinal), et
des troubles du transit intestinal115. Ce sont ces symptômes qui sont la cible des traitements.
Le but des traitements est également de diminuer les conséquences psycho-sociales qui
parfois peuvent être dramatiques. Les traitements de première intention sont médicamenteux,
mais présentent des effets indésirables notoires. L’efficacité de ces traitements restent faibles
et ne représente qu’un gain thérapeutique allant de 7 à 15%116. Il est donc urgent de
développer de nouveaux traitements et de mieux caractériser la physiopathologie de ce
syndrome.

De nombreuses études ont mis en évidence une dysbiose d’un point de vue
taxonomique entre les patients atteints de SII et les patients contrôles. Néanmoins, les
différentes études montrent de grandes divergences allant jusqu’à des contradictions dans la
description des différences de composition bactérienne du microbiote de patients IBS et
contrôle. Un microbiote est caractérisé par son répertoire de gènes exprimés et, plus important
encore, par les protéines et les métabolites qu’il sécrète. De nombreuses études ont déterminé
la composition taxonomique du microbiote, mais peu d'études ont caractérisé les gènes actifs,
les protéines ou les métabolites. Les études portant sur les molécules produites par le

47
microbiote pourraient être plus pertinentes que celles visant à déterminer sa composition pour
comprendre son rôle dans le SII. En effet, la composition taxonomique du microbiome humain
varie énormément d'un individu à l'autre, tandis que sa composition génétique ou sa capacité
fonctionnelle est très conservée117. La capacité fonctionnelle du microbiote est redondante et
capitale pour maintenir la stabilité et la résilience du microbiome humain117. A la notion de
redondance fonctionnelle du microbiote est associée l'idée que, jusqu'à un certain point, les
espèces sont substituables d’un microbiote à l’autre en termes de fonctionnalité117. Ainsi, deux
microbiotes différents dans leur composition peuvent posséder des profils de protéines et de
métabolites aux fonctions similaires117. Il est donc majeur d'identifier les métabolites
caractéristiques du microbiote intestinal des patients atteints du SII et de déterminer leurs
effets sur l'hôte en mettant l'accent sur l'homéostasie intestinale. Compte tenu qu’aucune
augmentation de la translocation bactérienne n'a pu être observée chez les patients SII, seules
des molécules sécrétées et/ou transformées par les bactéries et capables de traverser la
barrière intestinale pourraient avoir un impact sur la douleur viscérale. Parmi les métabolites
bactériens plusieurs lipides comme les lipopeptides93 et les acides gras à chaîne courtes118 ou
longues119 sont capables de traverser la barrière épithéliale et de réguler l'activation des
neurones sensitifs in vivo. L’identification et la caractérisation de nouveaux métabolites
spécialisés produits par le microbiote intestinal semble aujourd’hui être une voie permettant
de comprendre l’effet du microbiote intestinal sur certaines pathologies comme le SII.

48
 6. Les lipides bactériens

Les lipides bactériens peuvent être de deux sortes :

- Les lipides dits de structure, qui sont les principaux constituants des membranes
bactériennes. Selon les bactéries considérées les lipides structuraux qui les composent
peuvent varier, tant en nombre, qu’au niveau des espèces lipidiques présentes. Cependant,
les lipides structuraux majoritaires des bactéries, quel qu’en soit l’espèce considérée sont
toujours des phospholipides et notamment des glycérophospholipides120.

- Les lipides synthétisés ou transformés ; il s’agit de métabolites spécialisés (ou

métabolites secondaires), que l’on retrouve chez les bactéries, les plantes et les champignons.
Ces métabolites, à l’inverse des métabolites primaires n’assurent pas la croissance de
l’organisme, et ne participent pas à l’assimilation des nutriments. Par exemple, ils peuvent
avoir des rôles de de protection ou de défense vis-à-vis d’autres bactéries, c’est le cas des
toxines. De manière générale, les bactéries peuvent produire et libérer des métabolites
secondaires qui peuvent interagir avec leur environnement, et influencer les cellules de
l’hôte121. Ces métabolites bactériens peuvent être des molécules lipidiques (acides gras à
longue chaine, acides gras à courte chaine), des oligosaccharides, ou bien des métabolites
issus d’acides aminés (comme le gaba, la sérotonine, l’histamine, les indoles, les
catécholamines). Seuls les composés lipidiques seront abordés dans ce manuscrit.

Ces deux types de lipides bactériens seront décrits indépendamment, dans un premier
temps nous nous focaliserons sur les lipides structuraux comme les glycérophospholipides et
les saccharolipides, puis la seconde partie du chapitre sera dédiée aux lipides produits par le
microbiote intestinal comme les acides biliaires ou les acides gras à courtes chaînes.

6.1. Les lipides structuraux

De manière générale, les données bibliométriques concernant les lipides structuraux

bactériens sont très disparates parfois même contradictoires et sont peu abondantes rendant
l’analyse bibliographique difficile. A l’exception des glycérophospholipides, les lipides
majoritaires sont dépendant des bactéries étudiées ; il n’y a pas, à ce jour, de consensus sur
les lipides composants les bactéries. Les concentrations et la nature des lipides structuraux
varient également en fonction des facteurs environnementaux comme les conditions de culture
(aérobie vs. anaérobie, liquide vs. solide, …), la température et la composition des milieux
utilisés120.

49
 6.1.1. Généralités
Les acides gras bactériens présentent des longueurs de chaines carbonées variables,
allant de 10 à 20 atomes de carbone avec une majorité de 15 à 19 atomes de carbone.
Cependant, certaines données bibliométriques, notamment chez les mycobactéries mettent
en évidence la présence d’acides gras avec des longueurs de chaine beaucoup plus grande :
allant de 30 jusqu’à 90 atomes de carbone comme c’est le cas du dihydrophytyl alcool ou de
l’acide α-mycolique (Figure 47). Ces acides gras à très longues chaines, sont retrouvés chez
les Actinobacteries et les Actinomycétales, comme les mycobactéries par exemple 122.

Figure 47 : Acide α-mycolique, acide gras retrouvé chez les mycobactéries d’après 123

Il existe 4 groupes d’acides gras produits par les bactéries (Figure 48) :

- Les acides gras saturés et insaturés (AGI)

- Les acides gras branchés, qui peuvent être de conformation iso ou antéiso
- Les acides gras composés d’un groupement cyclopropane

Les acides gras branchés sont retrouvés parfois chez les bactéries gram négatives,
ainsi que chez les Lactobacilles, mais sont absents chez les autres bactéries à gram positif.

Figure 48 : Schéma des principales classes d’acides gras retrouvés chez les
bactéries, adapté d’après120

50
 Les acides gras saturés, peuvent être β-hydrolysés en positions 12, 14 16 ou 18.
L’acide gras majoritairement β-hydrolysé est l’acide mycolique. Certaines études ont démontré
que les acides gras insaturés bactériens possèdent généralement qu’une seule double liaison,
se situant entre le carbone C11 et le carbone C12 et que les acides gras polyinsaturés étaient
totalement absents chez les bactéries120. Les acides gras branchés majoritaires chez les
bactéries sont les C19 :0 antéiso et les C19 :0 iso122. D’autres acides gras, plus rares peuvent
être retrouvés chez les bactéries, il s’agit des acides gras aldéhydes et des acides gras
diméthyl acétal (Figure 49).

H 3C O

1
H 3C O R
Figure 49 : Structure d’un acide gras diméthyl acétal (ou R1 est une chaîne alkyle de
longueur variable)

Au laboratoire, nous analysons couramment les acides gras totaux (AGT) par
chromatographie gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID) après une
étape d’extraction et d’hydrolyse. Nous avons pu ainsi caractériser les souches bactériennes
utilisées durant ma thèse : Escherichia Coli Nissle 1917 et Lactobacillus animalis. Les AG
suivant ont été quantifiés : C16:0, C14:0, C18:0, C20:0, C16:1w7, C17:1w7, C18:1w9 cis,
C18:1w7, C18:3w3, et C18:4w3 (Figure 50). Nos résultats ne sont pas en adéquation avec les
études citées précédemment car des AG polyinsaturés, annoncés comme étant complètement
absents du règne bactérien, ont été détectés.

60
Abondance relative de l'acide gras (%)

50

40

30
EcN Nissle 1917
20
L. animalis
10

Figure 50 : Dosage relatif des acides gras totaux dans les deux souches bactériennes
utilisées dans notre étude

51
 6.1.2. Les glycérophospholipides
Afin de cataloguer l’ensemble des classes lipidiques présentes chez les bactéries, des
expériences d’extraction des lipides totaux ont été réalisés, ce qui permet de mettre en
évidence la présence de certaines classes lipidiques et de comparer leurs abondances
relatives. Les GPG (glycérophosphoglycérols) et les GPE (glycérophosphatydyléthanolamine)
sont les lipides les plus abondants quelles que soit les bactéries considérées, excepté pour
les Actinomycetales, bactéries du phulym Actinobacteria. Les biglycophosphoglycérols sont
également retrouvés mais en plus faible proportion. Il n’y a généralement pas de PC dans le
règne bactérien, ou dans certains rares cas, en très faible quantité. Les PI non plus ne sont
pas représentés, à l’exception des dérivés de PI, PI mannosides, chez les mycobacterium, les
propionibacterium, les corynebacterium et les arthrobacteria, toutes des bactéries du phylum
des Actinobacteria.

MacFarlane124 réalise une étude similaire à celle précédente sur différentes bactéries
et obtient des résultats semblables confirmant que les classes lipidiques majoritaires chez les
bactéries sont les phosphoglycérols, les phosphatidyletanolamines, dans certains cas les
phosphoinositols dérivés avec du mannose et que certaines classes de lipides sont rarement
représentées dans le règne bactérien comme les phosphatidylcholines. A l’inverse, dans cette
étude, les GPE sont retrouvés dans toutes les espèces de bactéries à gram négatif et les
bacilles mais pas dans toutes les bactéries.

6.1.3. Les lipides à longue chaine et les lipides complexes

Les saccharolipides :

Les saccharolipides sont composés d’acides gras estérifiés directement liés sur des
oses. Il y a peu de bibliographie sur cette classe de lipides, ce sont majoritairement des
composés bactériens retrouvé également chez les végétaux. Le saccharolipide le plus connu
est le C-acétylglucosamine, précurseur du lipide A (Figure 51), composé que l’on retrouve
dans la membrane des bactéries gram négatives125.

52
 Le lipide A :

Le lipide A bactérien est constitué d’un squelette glucosamine disaccharide

phosphorylé en positions 1 et 4 et acylé en positions 2 et 3, sur chacun des
monosaccharides126,127,. La structure de ce lipide A est majoritairement bien conservée, mais
dépend des espèces bactériennes. Habituellement, le lipide A est hexa-acylé, il est constitué
de 6 chaines acylées, de longueurs variables, estérifiées avec le squelette disaccharides. Sa
biosynthèse est réalisée dans le cytosol des bactéries, en 9 étapes successives, catalysées
par des enzymes128. Ce sont les chaînes d’acide gras qui permettent la fixation à la membrane.
Ce composé est extrêmement toxique et pathogène. Lors de la lyse des cellules bactériennes
par le système immunitaire, le lipide A est libéré et peut provoquer des réactions immunitaire
perturbant l’homéostasie de l’hôte129. Les réactions peuvent être variées : fièvre, diarrhée, et
éventuellement choc septique.

Figure 51 : Exemple de saccharolipide, le lipide A

Les lipopolysaccharides :

Les lipopolysaccharides (LPS) sont de grosses molécules constituées d’un lipide A et

de saccharides130. On les retrouve dans les membranes des bactéries gram négatives. Ces
molécules peuvent se lier au récepteur TLR4, ce qui permet la libération de cytokines (pro-
inflammatoires). Dans les laboratoires de recherche, les LPS sont utilisées couramment afin
de provoquer une inflammation, en tant qu’endotoxines131.

53
 Les stérols :

Les données concernant les stérols sont très contradictoires, certaines études
affirment que les stérols ne sont pas retrouvés chez les bactéries120 alors que d’autres ont
décrits les voies de biosynthèse des stérols chez les bactéries132. Des stérols comme le
lanostérol (Figure 52), ou le cycloartenol issus du squalène pourraient être retrouvés dans les
bactéries (Figure 53).

Figure 52 : Structure du lanostérol

Figure 53 : Structure du squalène

6.2. Les lipides issus du métabolisme du microbiote intestinal

Le microbiote est considéré comme essentiel dans la physiologie de l’hôte, mais les
mécanismes d’actions exercés par les bactéries sur l’hôte sont encore mal définit133. Les
bactéries sont capables de produire et libérer des molécules (métabolites spécialisés) qui vont
interagir avec l’environnement et ainsi influencer les cellules de l’hôte. Ces molécules peuvent
provenir de la biotransformation de molécules, de la digestion de nutriments par les bactéries,
comme par exemple les acides gras à courtes chaines, mais peuvent également être néo-
synthétisées par les bactéries comme les commendamides. Il est estimé qu’environ 10% des
molécules qui se retrouvent dans la circulation sanguine sont des métabolites issus du
microbiote intestinal121,134 Cette donnée renforce l’importance des métabolites bactériens dans
la physiologie de l’hôte. Ces métabolites spécialisés produits par le microbiote seront décrits
succinctement dans ce chapitre, cela concerne les lipides transformés par les bactéries dans

54
un premier temps, c’est-à-dire les acides biliaires et les acides gras à courtes chaînes. Seront
ensuite décrits les lipides produits de novo par la bactérie, c’est-à-dire les lipides à longues
chaînes (LCGA)119, et les lipopeptides93. Les oligosaccharides ou les métabolites issus
d’acides aminés comme la sérotonine, l’histamine, ou les catécholamines, bien que
synthétisés de novo par les bactéries, ne seront pas décrits.

6.2.1. Les acides biliaires secondaires et les dérivés du cholestérol

Dans le côlon, le microbiote intestinal peut transformer des acides gras n’ayant pas été
absorbés dans l’intestin grêle via des réactions enzymatiques. Ces transformations peuvent
être des réactions d’hydrolyses, d’oxydations, de réductions ou encore d’hydroxylations. Par
exemple, l’acide cholique qui provient majoritairement de la bile mais parfois également de
l’alimentation et de la desquamation des cellules épithéliales intestinales, est transformé en
coprostanol par le microbiote intestinal135,136. Environ 70% du cholestérol est utilisé par l’hôte,
les 30% restants se trouvent dans le côlon et sont transformés par le microbiote intestinal.
Cependant, le coprostanol n’est pas absorbé, il se retrouve donc éliminé dans les fèces.

Les acides biliaires sont issus de la transformation du cholestérol par le foie (Chapitre
1). Ils sont excrétés par les voies biliaires au niveau du duodénum et sont absorbés au niveau
de l’iléon. Ils sont transportés par la veine porte jusqu’au foie, où ils sont à nouveau excrétés
dans la bile : c’est le cycle entérohépatique137. Chaque jour, environ 5% des acides biliaires
produits par l’hôte (ce qui représente environ 0.2 à 0.5 g/jour) échappent au cycle
entérohépatique et se retrouvent en contact avec le côlon. Ces 5% d’acides biliaires vont être
métabolisés et transformés en acides biliaires secondaires par le microbiote intestinal, via des
processus enzymatiques (déconjugaison, oxydation, désulfation, épimérisation)138. Il existe
plus de 20 acides biliaires secondaires, mis en évidence dans les fèces humaines. Ce sont les
bactéries du genre Clostridium (une bactérie du phylum des Firmicuites) qui possèdent les
enzymes permettant ces transformations. Les acides biliaires secondaires qui les plus
majoritaires sont l’acide désoxycholique et l’acide lithocholique (Figure 54)135. Ces deux acides
biliaires secondaires sont produits par la 7-α-déshydroxylase des bactéries, à partir des
précurseurs que sont l’acide cholique et l’acide chénodésoxycholique.

55
 Figure 54 : Structures de a) l’acide désoxycholique et de b) l’acide lithocholique, les
deux acides biliaires secondaires majoritaires

Ces acides biliaires secondaires influent sur l’état de santé de l’hôte. Par exemple,
l’acide lithocholique est toxique pour les cellules hépatiques et une augmentation d’acide
désoxycholique est associée à des risques accrus de cancers cancers coliques139. A l’inverse,
l’acide ursodésoxycholique (Figure 55a), produit d’épimérisation de l’acide
chénodésoxycholique (Figure 55b), présente des activités protectrices et est largement utilisé
dans le traitement de maladies cholestatiques, notamment la lithiase ou la cirrhose biliaire140.

Figure 55 : Structures de a) l’acide ursodésoxycholique et de b) l’acide

chénodésoxycholique

56
 6.2.2. Les acides gras à courtes chaînes
Certaines fibres alimentaires sont constituées de polysaccharides, qui sont non
digestibles par les enzymes des mammifères. Ces fibres non digestives progressent alors tout
au long du tractus intestinal, tout en résistant aux différents processus liés à la dégradation et
à la digestion. Au niveau de l’intestin elles se retrouvent alors au contact des bactéries du
microbiote intestinal qui sont capables par fermentation124,141,142 de digérer ces fibres
alimentaires. Plus elles progressent vers le côlon, plus la concentration en bactéries est
élevée, et donc plus leur fermentation est importante.

La fermentation bactérienne de ces fibres alimentaires va produire des acides gras à

courte chaine. Ce sont principalement des bactéries anaérobies qui produisent les AGCC
comme des bactéries des phyla Bacteroides, Actinobactéries et Frimicutes comme les
Lactobacilles et les Bifidobactéries124. Les espèces majoritaires des acides gras à courte
chaine sont les acides formique, acétique, butyrique, iso-butyrique, valérique, et iso-valérique
(Figure 56). Les moins abondants sont les acides caprioïque, heptanoïque, octanoïque,
nonanoïque et l’acide caprique. Les AGCC sont des « acides gras » solubles dans l’eau, ce
sont donc, en réalité d’un point de vue chimique plutôt des acides organiques.

Figure 56 : Structure des acides gras à courte chaine, acide formique CH2O2 (A), de l’acide
acétique C2H4O2 (B), de l’acide propionique C3H6O2 (C), de l’acide isobutyrique C4H8O2 (D),
Structure de l’acide butyrique C4H8O2 (E), de l’acide iso-valérique C5H10O2 (F), et de l’acide
valérique C5H10O2 (G)

Le microbiote intestinal va former trois acides gras à courtes chaines majoritaires,

l’acide acétique, l’acide butyrique et l’acide propionique représentant 95% de la production des
AGCC totale143. En réalité, il y a une disparité importante au niveau de la production de ces
trois composés : 60% d’acide acétique, 20% d’acide butyrique et 20% d’acide propionique sont

57
produits par le microbiote intestinal144. Puisque ce sont les 3 acides gras majoritaires, leurs
rôles seront décrits par la suite

Les AGCC sont rapidement absorbés par l’hôte via une diffusion non ionique à travers
les membranes, et presque en totalité, puisque que 90% des AGCC produits vont être
absorbés par les colonocytes et sont retrouvés dans la circulation sanguine145,146. Ils vont
contribuer au métabolisme énergique de l’hôte, notamment au niveau des cellules épithéliales
du côlon147. Les 10% de AGCC restants se retrouvent éliminés dans les fèces148. Cette
production de métabolites secondaires peut varier selon la composition des fibres
alimentaires, ou de la composition du microbiote intestinal. Ces AGCC constituent une source
d’énergie importante pour les cellules du côlon, les muscles, les reins ou encore le cœur149.

L’acide acétique (C2H4O2) est produit majoritairement par les bactéries du phylum des
Bacteroidetes. Il est synthétisé à partir du pyruvate via l’acétyl-CoA150. Au niveau intestinal,
l’acide acétique favorise la différenciation des cellules lymphocytaires du système immunitaire
(notamment les cellules T en cellules T régulatrices)151. L’acide acétique exerce donc un rôle
majeur dans la tolérance du système immunitaire vis-à-vis du microbiote.

L’acide propionique (C3H6O2), est également majoritairement produit par les bactéries
du phylum des Bacteroidetes. Sa production par les bactéries intestinales est initiée par la
conversion du succinate en méthylmalonyl-CoA152. Ce composé comporte les mêmes
propriétés biologiques que l’acide acétique.

L’acide butyrique (C4H8O2) est formé à partir de l’acétyl-CoA, et du butyryl-CoA. Ce

composé possède des effets bénéfiques sur l’homéostasie intestinale, et des effets
anticancéreux. En effet, le traitement de cellules tumorales par l’acide butyrique induit un
processus de mort cellulaire153,154. Il est également capable d’inhiber la migration des cellules
tumorales155. Cet AGCC a également des propriétés anti-oxydantes en diminuant la production
de molécules réactives de l’oxygène (ROS). L’acide butyrique est capable d’augmenter
l’expression d’enzymes permettant la conversion d’H2O2 en H2O156.

Etudier les AGCC permet par analogie l’étude de l’activité de fermentation du

microbiote intestinal. C’est pour cette raison, que durant ma thèse, un développement
analytique par chromatographie gazeuse couplée à un détecteur à ionisation par flamme,
visant à doser ces composés a été réalisé. L’ensemble des AGCC sont disponibles
commercialement, ce qui permet de réaliser des gammes étalons, et d’effectuer une
quantification absolue de ces composés. Afin de valider la méthode, différentes matrices ont
été extraites comme les féces de souris, ou encore le contenu cæcal par exemple. Ces travaux
n’ont pas fait l’objet d’une publication.

58
 Plus récemment, une nouvelle classe de lipides à courte chaine a été identifiée, il s’agit
des AGCC estérifiés par un acide gras hydroxylé (SFAHFA, short-chain fatty acid esters of
hydroxy fatty acids)157. Les AGCC qui sont estérifiés pour produire des SFAHFA sont les
acides acétique et propionique, les acides gras hydroxylés sont constitués d’une chaine
carbonée de moins de 20 atomes de carbone (Figure 57). Ces composés ont été retrouvés
dans les colons et les contenus caecaux de rats, et sont synthétisés par des bactéries du
phylum des Bacteroidetes. Pour l’heure, les activités biologiques de ces composés ne sont
pas connues.

HO CH3
O
CH3
O

Figure 57 : Exemple d’un acide gras à courte chaine estérifié par un acide gras hydroxylé

6.2.3. Les acides gras à longues chaines

Les bactéries du microbiote intestinal sont également capables de produire des acides
gras à longues chaines (AGLC), dont la production est très peu étudiée.

Des travaux antérieurs de l’équipe, portés sur la bactérie EcN Nissle 1917, ont permis
de mettre en évidence que ces bactéries étaient capables de produire en grande quantité des
d’AGLC hydroxylés en position 3, comme l’acide 3-hydroxyoctadecanoïque (C18-3OH), via
une synthèse indépendante de polykétides synthases (Figure 58)119.

OH O
H3C
OH

Figure 58 : Structure de l’acide 3-hydroxyoctadecanoïque

59
 Les acides gras hydroxylés peuvent être saturés ou insaturés, avec un ou plusieurs
groupement hydroxyles, ils peuvent être classés selon deux groupes : les acides gras mono-
hydroxylés en position β ou , ou les métabolites de l’acide linoléique 158. Ils sont formés grâce
aux enzymes de la famille des cytochromes P450, notamment grâce à la CYP1521A
bactérienne159. Ces composés lipidiques peuvent s’accumuler dans les tissus, et sont
capables de réguler l’expression génique via l’activation de récepteurs nucléaires.
L’administration par voie orale à des souris souffrant de colites induit une diminution de
l’intensité de l’inflammation via l’activation de PPAR-γ. Ce récepteur nucléaire localisé tout le
long de l’intestin grêle et du côlon, possède une activité anti-inflammatoire119.

Avec comme substrat l’acide linoléique, des bactéries comme les Lactobacillus ou les
Streptococcus produisent via des hydratases des métabolites possédant des propriétés anti-
inflammatoire. Pour l’instant, les métabolites caractérisés sont : 10-hydroxy-cis-12-
octadecenoic acide (HYA), 10-hydroxy-trans-11-octadecenoique acide (HYC), 10-hydroxy-
octadecanoicacide (HYB) ; 10-oxo-cis-12-octadecenoique (KetoA), 10-oxo-trans-11-
octadecenoique acide (KetoC), 10-oxo-octadecanoique acide (KetoB, Figure 59).

H3C O

OH

Figure 59 : Structure de l’acide 10-oxo-octadecanoique, KetoB

6.2.4. Les commendamides

Les bactéries du microbiote intestinal sont capables de produire une autre famille de
lipides : les commendamides (Figure 60)160. Ces lipides ont été identifiés dans des bactéries
du genre Bacteroides, plus particulièrement chez l’espèce Bacteroides vulgatus, retrouvés
dans le tractus intestinal humain. Les commendamides composés d’un acide gras et d’une
liaison peptidique sont fortement ressemblants aux anandamides et aux endocanabinoïdes.
Les commendamides composés d’un acide gras et d’une liaison peptidique sont comparables
aux anandamides et aux endocanabinoïdes des mammifères. Les commendamides sont des
molécules de signalisation, activant des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG).
Potentiellement, les commendamides peuvent avoir un lien dans les maladies auto-immunes
et l’athérosclérose160.

60
 OH O
H3C OH
NH
O

Figure 60 : Structure d’un commendamide

6.2.5. Les polycétides

Les polycétides sont obtenus par polymérisation entre les groupements propionyls et
acétyls, sous l’action de la polycétide synthase. La grande diversité enzymatique des
polycétides synthases entraine une très grande diversité structurale des polycétides. Les
formes majoritaires sont cycliques et leurs structures peuvent être modifiées par glycosylation,
méthylation, ou encore hydroxylation. Les polycétides sont majoritairement des métabolites
spécialisés retrouvés dans le règle végétal (plantes, champignons) et bactériens. Ils sont
connus pour leurs activités biologiques antiparasitaires, antibactériennes ou encore
anticancéreuses. L’érythromycine (Figure 61), par exemple, est un polycétique, ayant une
activité antibiotique à large spectre, utilisé principalement chez les personnes allergiques à la
pénicilline4.

Figure 61 : Exemple de polycétide, l’érythromycine

61
 6.2.6. Les lipopeptides et lipoaminolipides

Les bactéries du microbiote intestinal peuvent synthétiser des lipopeptides, qui sont
des métabolites spécialisés : ce sont des lipides associés à des acides aminés, sous forme de
peptides. Les lipopeptides sont des molécules peu décrites, qui font l’objet de peu d’études.
Ces molécules sont notamment connues pour les propriétés antibiotiques, antivirales ou
antifongiques dont elles bénéficient. Elles confèrent un avantage compétitif pour l’occupation
des niches microbiennes lors de l’interaction avec d’autres microorganismes. In vitro, les
lipopeptides des espèces bactériennes Pseudomonas et Bacillus comme l’amphisine ou la
tolaasine ont des activités lytiques, elles inhibent la croissance d’un large panel de
microorganismes comprenant les virus, les bactéries et les champignons161. Ces molécules
sont formées par synthèse non ribosomale qui associe des synthases non robosomales
(NRPS) et des polykétides synthases (PKS), qui sont impliquées dans la synthèse de plusieurs
molécules, comme les polycétides ou encore de peptides.

Ils sont constitués d’une chaine alkyle liée par une liaison peptidique à un ou plusieurs
acides aminés. Certaines espèces de bactéries, comme les Bacillus peuvent produire de la
surfactine, lipopeptide de haut poids moléculaire (C53H93N7O13, Figure 62)162. Les bactéries
Pseudomonas peuvent produire de la syringomycine, composé de la sous classe des
lipodepsinonapeptide163,164, qui est également un composé de haut poids moléculaire
(C53H85lN14O17). Les pseudomonas peuvent aussi synthétiser d’autres lipopeptides comme la
tolassine (structure composée de 18 acides aminés, 1985 Da)165, de la sclérostine ou
l’arthrofactine162.

Figure 62 : Structure de la surfactine, (C53H93N7O13), lipopeptide produit par les bacilles

62
 Plus récemment, notre équipe a identifié une nouvelle classe de lipopeptides
synthétisés par les bactéries E. coli. Ce sont des lipopeptides de plus petite taille (aux
alentours de 400 Da) composés d’une chaine alkyle, liée par une liaison peptidique à un seul
acide aminé, celui-ci est lié via une liaison peptidique à un neurotransmetteur : l’acide -amino-
butyrique (GABA) comme le C12AsnGABA (C20H37N3O5, Figure 63)93. Ce lipopeptide est
capable de traverser la barrière épithéliale de l’intestin, à l’inverse du GABA seul. Le GABA,
qui est l’un des neurotransmetteurs majoritaires du système nerveux central se retrouve alors
au contact des terminaisons nerveuses et peut en activant le récepteur GABAB diminuer
l’activation des neurones sensitifs, menant à une diminution de la douleur viscérale. Le
traitement de souris ayant une hypersensibilité viscérale mécanique par le C12AsnGABAOH
les rendait normosensibles.

Figure 63 : Structure du C12AsnGaba (C20H37N3O5), lipopeptide produit par EcN 1917

La production de ces molécules est dépendante au minimum de 3 gènes de l’îlot pks.

Cet îlot est un cluster de gènes, initialement identifié dans des isolats d’E. coli IHE 3034166, et
contient 19 gènes, codant pour des pokyketides synthases (PKS), des synthases non
ribosomales (NRPS) et des enzymes et protéines accessoires. Parmi ces gènes, ClbA, ClbB
et ClbN sont nécessaires à la production de C12AsnGABA. Cet îlot pks peut également
produire la colibactine.une génotoxine impliquée dans les cassures de l’ADN160. La colibactine
produite par cette machinerie biosynthétique complexe implique l’action de deux protéines :
ClbA et ClbS. ClbA est obligatoire dans la synthèse de la colibactine et d’autres métabolites
bioactifs. Après son activation par ClbA, l’ajout de l’asparagine sur l’acide tétradécanoïque
(acide myristique) est possible : cela mène à la formation du C14Asn (Figure 64). Ce composé
est utilisé afin de produire de la précolibactine, via l’ajout de différents acides aminés par
l’action de malonyol-CoA. La libération du C14Asn peut avoir lieu sous l’action de la peptidase
ClbP qui va cliver la précolibactine en colibactine et en C14Asn. Le C14Asn, sous sa forme
C14(D)Asn possèdent des activités antagonistes modérées aux récepteurs dopaminergiques
et aux récepteurs à la 5-hydroxytryptamine167 (5-HT7).

63
 O

NH
H
COOH
CONH 2

Figure 64 : Structure du C14Asn(C17H31N2O4), lipoaminoacide produit par EcN 1917

Dans les probiotiques E. coli, trois autres métabolites issu de l’ilôt pks ont été identifiés :
l’entérobactine, la salmochéline et la yersiniabactine. Ces molécules présentent des activités
antibiotiques168, antiparasitaires168, immunusuppressives169 et antitumorales170.

Aujourd’hui, cet îlot pks a été identifié dans d’autres souches bactériennes, comme par
exemples chez les enterobacters comme Klebsiella pneumoniae et Citrobacter koseri171.

De manière générale, ces composés sont très peu décrits, il existe des lipopeptides
cycliques, comme les gacamides, mais ce sont généralement de gros peptides de plus de 6
ou 7 acides aminés. En 2017 des lipoaminoacides ont été décrits, notamment dans le cerveau
de rat, comme par exemple le C16Alanine ou encore le C16GABA29. En dehors du C14Asn et
du C12AsnGABA décrit par notre équipe, les données bibliométriques sur les petits
lipopeptides bactériens ne sont pas riches.

L’objectif de mon travail a été d’identifier et nouveaux composés lipidiques bactériens,

l’outil de choix pour répondre à cette problématique a été la spectrométrie de masse. Le
chapitre suivant de ce manuscrit sera consacré dans un premier temps à une étude
bibliographique de la spectrométrie de masse et dans un second temps à la description des
différentes techniques utilisées.

64
PARTIE 2 : ANALYSES LIPIDOMIQUE ET SPECTROMETRIE
DE MASSE

65
Chapitre I : Généralités sur la lipidomique et les sciences du
« omiques »
Depuis les années 1980, avec le développement exponentiel des techniques
d’analyses, la mise en place d’analyses de plus en plus fines et complexes du vivant a été
envisagée. En parallèle, le développement des techniques de bio-informatique a permis
d’augmenter la rapidité du retraitement des données indispensables à ces nouvelles analyses.
Par exemple, le séquençage de l’entièreté de l’ADN du génome humain, lancé en 1988172
permet le développement de la « génomique », définie comme un domaine multidisciplinaire,
visant à caractériser et à quantifier l’ensemble des gènes codant d’un organisme, à étudier
leurs interactions, leurs relations et leurs influences sur l’organisme. Par analogie, d’autres
disciplines émergent, visant à étudier un échantillon biologique dans sa totalité : la
transcriptomique, qui étudie les ARN messagers, la protéomique qui étudie les protéines, la
métabolomique qui s’intéresse à l’étude des métabolites (molécules de poids moléculaire <
1000 Da). La lipidomique qui est une sous partie de la métabolomique, concerne l’analyse
des lipides173.

La lipidomique correspond à l’analyse du lipidome et de ses fonctions174. La

lipidomique est un terme introduit pour la première fois en 2001 par Kishimoto, et fait référence
à l’analyse de la totalité des lipides. En 2003, le GERLI, qui est le groupe d’études et de
recherches sur les lipides, définit la lipidomique comme la caractérisation complète de
l’ensemble des molécules lipidiques contenues dans une cellule ou dans un tissu175. La
lipidomique cherche à comprendre l’influence des lipides, sur les différents processus d’un
organisme : signalisation cellulaire, composition membranaire, modulation des gènes ou
interactions lipides-protéines. L’étape clé d’une analyse en lipidomique est la préparation des
échantillons, cela regroupe plusieurs étapes successives comme l’homogénéisation ou la
précipitation protéique. Les extraits lipidiques peuvent être analysés par spectrométrie de
masse, ou bien par résonance magnétique nucléaire (RMN). Les analyses lipidomiques
« single cell » qui émergent depuis peu, ont pour but de ne pas extraire et d’injecter
directement une cellule en spectrométrie de masse176.

67
 1. Préparation des échantillons

La préparation des échantillons biologique est une étape déterminante et nécessaire

pour l’analyse des molécules en lipidomique3, elle comprend plusieurs étapes : le recueil des
échantillons, l’arrêt du métabolisme, l’homogénéisation des échantillons et leur extraction.
Malgré leur importance les deux premières étapes sont souvent négligées alors que
l’extraction est quant à elle très bien documentée dans la littérature à l’aide de protocoles
standards d’extractions spécifiques à chaque famille de lipides.

La réussite d’une expérience en lipidomique va dépendre non seulement des

conditions d’analyse en chromatographie couplée/ou non à la spectrométrie de masse mais
également de l’ensemble des étapes en amont portant sur la manipulation de l’échantillon et
sur le choix de la matrice utilisée177,178. L’extraction consiste à extraire les molécules d’intérêts
de la matrice biologique. Les échantillons peuvent être de différentes origines biologiques :
humaine, animale, végétale ou encore bactérienne. Ils peuvent provenir de différentes
matrices comme les tissus, les cellules ou encore les fluides biologiques. Toutes ces
variations biologiques entraînent des différences de préparation de l’échantillon. Le protocole
d’extraction est ajusté en fonction de la nature de l’échantillon étudié et du lipide à analyser.
L’extraction se doit d’être la plus reproductive possible afin d’éliminer une source de variation
inter-individuelle. Elle est généralement très chronophage et difficilement automatisable.

Dans certains cas une étape de pré-extraction, qui consiste en un broyage de

l’échantillon, est nécessaire pour libérer les analytes de la matrice biologique et les rendre
accessibles. Une étape d’homogénéisation est nécessaire pour l’extraction des lipides d’un
tissu. Afin de suivre la totalité du processus de préparation d’un échantillon il est possible de
suivre les rendements d’extraction et de préparation qui représentent le pourcentage
d’extraction, propre à chaque composé. Pour cela, un standard interne (ISTD) est ajouté en
début de préparation, il s’agit d’un composé absent initialement dans la matrice, et possédant
des caractéristiques physico-chimiques identiques ou très proches de l’analyte. Dans le
meilleur des cas, un standard interne identique à la molécule d’intérêt mais deutéré ou marqué
à l’aide de 13C est utilisé. Suivre le rendement d’extraction de ce composé permet de s’assurer
de la qualité de la préparation des échantillons.

Le rendement d’extraction se calcule de la façon suivante :

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡 𝑑 ′ 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 = 𝐴𝑖𝑟𝑒 𝐼𝑆𝑇𝐷 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑡⁄𝐴𝑖𝑟𝑒 𝐼𝑆𝑇𝐷 𝑛𝑜𝑛 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑡 ∗ 100

68
 Le rendement de préparation est calculé de la façon suivante :
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡 𝑑𝑒 𝑝𝑟é𝑝𝑎𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 = 𝐴𝑖𝑟𝑒 𝐼𝑆𝑇𝐷 𝑛𝑜𝑛 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑡⁄𝐴𝑖𝑟𝑒 𝐼𝑆𝑇𝐷 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑡 𝑎𝑣𝑒𝑐 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑐𝑒 ∗ 100

Le rendement de préparation prend en compte l’effet matrice, qui sera détaillé plus
tard dans ce chapitre.

1.1. L’extraction des lipides

La figure 65 représente la relation entre la polarité de certains solvants utilisés en
chromatographie liquide et la polarité des classes de lipides, sur l’échelle de Hildebrand. Une
étendue de polarité très importante est obsérvée dûe à l'écart de polarité entre les
phospholipides possédant une tête polaire et les acides gras comme les triglycérides.

En lipidomique, il existe deux grands types d’analyse : l’analyse spécialisée d’une

classe de lipide (par exemple, l’extraction des eicosanoïdes et leur analyse par LC-MS179), et
les analyses dites globales180. Ces dernières ont pour but d’extraire la totalité du lipidome, et
de l’analyser par LC-HRMS. Les analyses dites « molécules spécifiques » font appel à des
techniques d’extraction spécifiques. A l’inverse pour les analyses dites « globales »
l’extraction devra être à large spectre afin de recouvrir toute cette gamme de polarité.

Figure 65 : Gamme de polarité de certains lipides, et de quelques solvants utilisés en

chromatographie liquide placés sur l’échelle de polarité de Hildebrand181

69
 En lipidomique deux grandes méthodes d’extraction sont couramment utilisées :
l’extraction liquide-liquide182, notamment le protocole de Bligh & Dyer183, qui est utilisé dans
les approches de lipidomique globale184, et l’extraction sur phase solide (SPE).

Dans certains cas, il peut être nécessaire de réaliser une étape d’hydrolyse afin de
libérer les lipides tels que les acides gras qui sont estérifiés aux glycérophospholipides ou aux
triacylglycérides185. Dans d’autres cas, il est également nécessaire de cumuler les deux
méthodes d’extractions (LLE et SPE), comme pour l’extraction des oxstérols186.

1.1.1 L’extraction liquide-liquide

L’extraction liquide-liquide est une technique d’extraction chimique basée sur deux
solvants non miscibles entre eux, générant un système biphasique. La séparation des
métabolites est effectuée à l’interface des deux phases et dépend du coefficient de partage
de chacun des analytes entre la phase aqueuse et la phase organique. Les lipides sont
séparés en fonction de leurs affinités préférentielles pour l’une des deux phases. Le choix des
solvants non miscibles entre eux est important et doit se faire en fonction des propriétés
physico-chimiques des lipides à extraire et à séparer. Certains paramètres, comme les
propriétés physico-chimiques des molécules à extraire ou le nombre d’extractions
successives à réaliser pour épuiser totalement la matrice en analyte, sont à prendre en
compte afin d’augmenter au maximum le rendement d’extraction.

En lipidomique, deux extractions liquide-liquide sont utilisées en routine, il s’agit des

extractions selon les protocoles de Bligh & Dyer183 et de Folch187. Pour l’extraction selon Bligh
et Dyer, il s’agit d’un mélange de chloroforme, de méthanol et d’H2O dans les propositions
8/4/3183,187. Le chloroforme faiblement polaire est utilisé en combinaison avec le méthanol,
plus polaire, afin d’extraire l’ensemble du lipidome contenu dans un échantillon biologique. Le
chloroforme et le méthanol forment la phase organique où se trouvent les lipides. L’eau va
former la phase aqueuse, supérieure, contenant les sucres, les protéines, les sels et les autres
composés hydrosolubles. Dans le protocole de Folch187, la différence majeure est la présence
de sels, qui modifie donc légèrement les lipides extraits de la matrice. Dans certains cas, le
chloroforme est remplacé par le dichlorométhane, solvant moins toxique pour
l’expérimentateur aux propriétés similaires188.

D’autres mélanges de solvants existent et sont utilisés en lipidomique, comme

l’extraction au butanol-méthanol (BUME)189 ou l’extraction au méthyl tert-butyl éther (MtBE)189,
ou un mélange de trois solvants est utilisé, MtBE, MeOH et H2O (10/3/2,5). Des rendements

70
d’extraction similaires à l’LLE du Bligh & Dyer ont été observés. Le MtBE étant un solvant de
plus faible densité, la récupération de la phase organique est simplifiée puisqu’elle se situe
sur le dessus. De manière générale, il existe de nombreuses méthodes d’extraction liquide-
liquide190, permettant d’extraire le lipidome et adaptées aux molécules souhaitées.

1.1.2 L’extraction en phase solide (SPE)

Avant d’effectuer une SPE, certaines étapes de prétraitement de l’échantillon sont

parfois nécessaires afin de réduire les interactions entre la matrice et les lipides. Une étape
de précipitation protéique permet d’éliminer les protéines pour éviter qu’elles entrent en
interaction avec la phase adsorbante et détériorent la qualité de la séparation
chromatographique et donc diminuent la sensibilité de détection (augmentation du bruit du
fond). Les solvants organiques ou de fortes concentrations en sels induisent des altérations
de la structure tridimensionnelle des protéines induisant leur précipitation, le MeOH est le
solvant le plus efficace.

L’extraction sur phase solide repose sur l’adsorption des analytes (ou des
contaminants selon les cas) sur une phase stationnaire solide (appelée adsorbant) et leur
élution via une phase éluante liquide. La SPE peut se dérouler sur colonne ou sur plaque 96
puits. Cette extraction est divisée en plusieurs étapes. La première consiste à conditionner
l’adsorbant, c’est-à-dire à l’activer avec un solvant organique, de l’eau, ou avec un mélange
de solvants. Ensuite, l’échantillon est déposé sur l’adsorbant, plusieurs lavages successifs
sont alors réalisés, permettant l’élimination des composés interférents. Enfin, l’élution des
composés d’intérêts a lieu, via l’utilisation d’un solvant éluant adapté. L’affinité des composés
restant sur la phase doit être plus grande envers le solvant pour pouvoir les décrocher (figure
66).

71
 Figure 66 : Principe d’une extraction sur phase solide

Plusieurs types de phases adsorbantes composées de polymères ou de silice existent.

Le choix de cette phase est très important dans le développement d’une méthode d’extraction
en lipidomique et dépend des analytes à extraire, de leurs concentrations, du volume
d’échantillon à déposer et du type d’échange recherché. Les phases polymériques offrent
l’avantage d’être très stables et résistent à une large gamme de pH allant de 0 à 14. Les
phases constituées de silice sont moins stables et supportent des variations de pH allant de
2 à 7.5 mais sont très sélectives.

Dans les adsorbants de silice, il existe plusieurs sous-type de phases : phase normale,
phase inverse, silices échangeuses d’ions ou les phases mixtes. Les phases normales sont
constituées de greffages DIOL, CN ou NH2 et permettent l’extraction de molécules ayant des
fonctions polaires. Les adsorbants en silice de phase inverse sont basés sur des interactions
de type Van der Waals et permettent l’extraction des composés apolaires ou très faiblement
polaires. Les phases échangeuses d’anions et de cations fonctionnent selon le même
principe.

Les phases échangeuses d’anions fonctionnent selon un mécanisme de rétention lié

à l’interaction ionique. L’extrémité du greffon de la phase (Figure 67) va créer une interaction
très forte avec les composés de l’échantillon, portant des fonctions ionisables opposées.
L’étape de lavage est réalisée via l’utilisation d’une base, puis d’un acide faible afin d’éliminer
les cations et les anions faibles. L’interaction des phases échangeuses d’ions dépend
essentiellement du pH et de la force ionique du contre-ion qui va permettre l’élution des

72
composés capturés par l’ion greffé de la phase. Il existe plusieurs types de greffons sur ces
phases, comme par exemple les phases constituées d’amines quaternaires (SPE
commerciales « SAX » interchim, SPE Oasis MAX, Waters). Au laboratoire, nous utilisons ce
type d’interactions afin d’extraire les isoprostanes191.

Les phases échangeuses de cations (de type commerciales « MCX » Waters, greffage
représenté dans la Figure 67), permet l’extraction de composés basiques. Les plaques SPE
de ce type sont recommandées pour le lavage de 99% des phospholipides192.

Les phases polymériques, comme les phases « hydrophilic-lipophilic balance » (HLB)

sont des phases autant hydrophiles qu’hydrophobes (greffage représenté sur la figure 67).
Elles permettent l’élution de presque tous les composés (neutres, basiques, acides, pH 0 à
14). Au laboratoire, nous utilisons cette méthode d’extraction afin d’extraire les
eicosanoïdes179,193.

Figure 67 : Principales types de phases adsorbantes retrouvés dans les protocoles

de lipidomique.

73
 2. L’influence de la matrice
Lors de l’extraction des métabolites d’intérêt, la matrice biologique exerce un impact
non négligeable appelé effet matrice. En effet, le rendement d’extraction va varier si
l’extraction est réalisée à partir d’un fluide biologique (sérum, plasma), de cellules, ou de tissus
(intestins, poumons, cœur…). Il s’agit de matrices complexes c’est-à-dire de matrices
biologiques très riches, composées d’un nombre important de métabolites (primaires et
secondaires), d’ADN, de protéines, … qui peuvent interférer avec les métabolites à extraire.
Ces interférents peuvent être d’origine endogène, exogène, organique ou minérale. Lors de
l’analyse en spectrométrie de masse, les interférents peuvent induire une suppression du
signal. S’ils sont présents en trop forte quantité, ils vont absorber une partie conséquence des
protons disponibles dans le milieu et empêcher les métabolites d’intérêts de s’ioniser et d’être
détectés par l’instrument. L’influence de la matrice sur l’analyse peut se calculer de la manière
suivante :

𝐸𝑓𝑓𝑒𝑡 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑐𝑒 = 𝐼𝑆𝑇𝐷 𝑛𝑜𝑛 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑡⁄𝑀𝑎𝑡𝑟𝑖𝑐𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑡𝑒 + 𝑎𝑗𝑜𝑢𝑡 𝐼𝑆𝑇𝐷 𝑎𝑣𝑎𝑛𝑡 𝑖𝑛𝑗𝑒𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 ∗ 100

74
Chapitre II : L’analyse des lipides
En raison de la complexité des extraits lipidiques, l’analyse par spectrométrie de
masse est généralement associée à une technique séparative, mais peut être également
effectuée en introduction directe dans le spectromètre de masse lors des analyses de shotgun
lipidomique194. Les limites de cette approche sont nombreuses car une forte suppression du
signal est observée, uniquement les lipides majoritaires seront détectés. Certains lipides ne
sont visualisés en spectrométrie de masse uniquement si l’utilisateur de l’argent ou le
lithium195 pour générer des adduits, ce qui rend les analyses difficiles et augmente
considérablement le nombre d’injections. Certains composés s’ionisent uniquement dans un
mode, c’est par exemple le cas des anandamides ou des acyl-serotonine qui ne sont détectés
qu’en ionisation positive alors que d’autres composés s’ionisent qu’en mode négatif : il est
donc nécessaire d’injecter les échantillons dans les deux modes.

L’extrait lipidique peut également être analysé directement en RMN du 1H ou du 31

P
permettant une analyse globale quantitative mais la complexité des extraits lipidiques
complique l’interprétation des spectres en raison d’un grand nombre de recouvrement des
raies. Cependant, cette technique gourmande en matériel est non destructive et permet
d’obtenir une empreinte lipidique quantitative de l’échantillon ce qui n’est pas le cas de la
spectrométrie de masse.

Majoritairement, les lipides sont analysés en chromatographie liquide couplée à la

spectrométrie de masse (LC-ESI/MS), à un DEDL ou à une détection corona, ou en
chromatographie gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (FID), en
chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-EI/MS).

Dans ces travaux nous nous sommes uniquement focalisés sur l’analyse par LC-MS,
qui est de loin la technique la plus utilisée en lipidomique, nécessitant dans notre cas une
extraction lipidique en amont.

75
 1. Les méthodes de séparation des lipides

Historiquement c’est le botanique Mikhaïl Tswett qui s’intéressait à l’étude des

pigments végétaux qui a développé et expliqué les techniques de séparation, ayant conduit
aux bases de la chromatographie moderne dès les années 1900. Tswett a utilisé de l’éther de
pétrole comme phase mobile, ainsi qu’une colonne remplie par de la craie (du carbonate de
calcium) comme phase stationnaire. Il a réussi à détecter des zones de pigments différents,
grâce à leurs différentes couleurs. A la fin des années 1970, la chromatographie moderne
arrive dans les laboratoires et les industries via l’introduction de la chromatographie sur
couche mince. Ces techniques se sont rapidement répandues dans toutes les industries
chimiques : cosmétiques, para-chimiques ou encore pharmaceutiques. Aujourd’hui, les deux
techniques séparatives majoritairement utilisées en lipidomique sont la chromatographie en
phase gazeuse et la chromatographie liquide.

1.1 La chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse (GC) est une méthode de séparation des
molécules sous forme gazeuse, utilisée pour la première fois en 1941 par Martin et Synge.
Les premières analyses de lipides, et plus particulièrement des acides gras libres, ont été
réalisées en chromatographie en phase gazeuse, en 1952 par James et Martin196. En 1955,
seulement 40 publications portent sur la GC, en 1966 ce chiffre passe à 10 000. Ces données
permettent de mettre en évidence l’émergence d’une nouvelle technique analytique puissante.

En GC, la séparation des lipides est faite selon l’affinité qu’ils ont pour la phase
stationnaire et leur température de vaporisation. La séparation des composés est effectuée
en fonction de leur partition entre la phase mobile (gaz) et la phase stationnaire (colonne
chromatographique). L’appareil de chromatographie est composé de 3 pièces principales.
Pour commencer, il possède un injecteur permettant la volatilisation de l’échantillon contenant
les analytes et entrainant les molécules en tête de colonne. Puis, il est composé d’une colonne
de chromatographie comportant la phase stationnaire, celle-ci va séparer les analytes, elle
est placée dans un four thermostaté (Figure 68). En GC, les colonnes de chromatographie
sont des colonnes capillaires, de grande longueur (parfois jusque 100 mètres de longueur).

76
 Figure 68: Représentation schématique d’un système de chromatographie gazeuse
d’après197

Les colonnes capillaires de GC sont composées de deux éléments principaux : le tube

et la phase stationnaire. La phase stationnaire est un film fin revêtu de polymère de haut poids
moléculaire, thermiquement stable qui recouvre la paroi interne du tube. Son diamètre interne
est compris entre 0.05 et 0.53 mm, l’épaisseur de ce film est proportionnellement liée à la
rétention des analytes. Le pouvoir de résolution de la colonne est inversement proportionnel
au diamètre de la colonne. Pour deux colonnes dont l’épaisseur du film est constante,
diminuer son diamètre par 2 revient à doubler son efficacité.

La phase mobile est constituée d’un gaz inerte servant de gaz vecteur, qui va se
déplacer à l’intérieur de ce tube, permettant la séparation des composés. Le gaz pousse les
analytes, présents dans la colonne sous formes volatiles, vers le détecteur placé en sortie de
colonne. Cette phase mobile est composée généralement d’hélium, d’azote ou de
dihydrogène. Un système détendeur-régulateur va réguler les arrivées de gaz vecteur. La
nature du gaz vecteur ne modifie pas de manière significative la séparation
chromatographique. En revanche, la viscosité et la vitesse du gaz dans la colonne ont une
influence sur la dispersion des composés dans la phase stationnaire. Les phases stationnaires
les plus répandues sont des polymères siliconés dérivées du diméthyl polysiloxane. Elles sont
greffées sur une colonne en silice via des liaisons O-Si-O. Des groupements CH3 peuvent
alors être greffés sur la silice. La polarité de la phase stationnaire va dépendre de ces
groupements substitués et de leurs quantités relatives. Les colonnes non-polaires
(composées à 100% de diméthyl polysiloxane, comme les colonnes commerciales « DB 1ms
ou DB 5ms ») sont conseillées pour l’analyse des amines, des pesticides, des hydrocarbures,
des composés soufrés, des stérols, ou des arômes et parfums. Les colonnes moyennement

77
polaires seront greffées de 90 à 65% de diméthylpolysiloxane, et de phényles, (colonnes
commerciales « DB-35ms ») et sont conseillées pour l’analyse des médicaments, des glycols,
des pesticides et des stéroïdes. Les colonnes polaires, sont composées de polyéthylène
glycol, comme les DB-wax/ Stabilwax, et sont utilisées pour l’analyse des acides gras à longue
chaîne, des acides organiques libres comme les SCFA. Enfin, la GC est également constituée
d’un détecteur placé en fin de colonne dont l'objectif est la détection des analytes à la sortie
de la colonne chromatographique.

L’analyse des lipides en GC est décrite notamment pour les acides biliaires, les
stéroïdes, les acides gras à longues et courtes chaînes, hydroxylés ou non198,199. Cependant,
tous les composés ne peuvent pas être analysés en GC, certains lipides thermosensibles ne
peuvent pas être vaporisés ce qui rend leur analyse en GC impossible. Il est nécessaire que
les analytes soient thermiquement stables et possèdent une pression de vapeur suffisante
pour être volatilisés en GC. Ce n’est pas le cas de toutes les classes de lipides, parfois trop
sensibles à la chaleur ou trop peu volatiles200. Le manque de volatilité peut être pallié par une
étape de dérivatisation, consistant à diminuer le point de volatilité d’un composé. Par exemple
les acides gras sont dérivés en esters méthyliques pour être analysés. Ces esters méthyliques
sont préparés par transestérification des TG ou des PL à l’aide d’un catalyseur acide ou
basique (HCl, BF3, méthanolate de sodium)201. Cette technique peut être couplée à deux
types de détecteur : le FID ou bien, un spectromètre de masse à l’aide d’une ionisation à
impact électronique ou chimique202,203.

Cette technique de séparation des analytes est essentiellement utilisée, en

lipidomique pour l’analyse des acides gras et des stérols. Elle sera utilisée uniquement pour
l’analyse des acides gras à courte chaine, pendant mes travaux de thèse. L’ensemble de ces
résultats ne seront pas présentés dans cette thèse.

1.2 La chromatographie liquide

La chromatographie liquide est une technique complexe, où plusieurs facteurs, listés

ci-dessous peuvent influer.

- Le facteur de rétention ou de capacité k

- Le facteur de sélectivité α
- L’efficacité N
- La granulométrie ∆P
- La résolution R

78
 Le facteur de capacité ou de rétention est un paramètre expérimental qui permet de
décrire la vitesse de progression des solutés dans la colonne, il représente la mesure
universelle de la rétention, déterminée à partir du temps de rétention (noté Tr) et du temps
mort (noté Tm ou T0). Le temps de rétention est propre à chaque analyte, le temps mort est
quant à lui, le temps nécessaire à la phase mobile pour traverser la colonne
chromatographique. Ainsi, le facteur de capacité est défini par la formule suivante :

(𝑇𝑟 − 𝑇𝑚)⁄
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑒𝑢𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑝𝑎𝑐𝑖𝑡é 𝑘 = 𝑇𝑚

Plus le temps de rétention est élevé, plus le facteur de capacité augmente, ce qui
signifie que la colonne retient beaucoup la molécule. Cette valeur de k est utilisée afin de
comparer les temps de rétention sur les différents systèmes, puisqu’elle est indépendante de
la longueur de la colonne et du débit appliqué. Lorsque l’on augmente la longueur de la
colonne, on augmente proportionnellement les valeurs de Tr et de T0, et donc k reste
inchangé. La valeur de k reflète la séparation chromatographique, lorsque k est situé entre 2
et 10, la séparation est optimale. A l’inverse, lorsque k est au-delà de 30, alors la séparation
chromatographique est lente, et lorsque k est inférieur à 1, la séparation est mauvaise. En
chromatographie liquide k peut être optimisé en agissant sur la composition de la phase
mobile et de la phase stationnaire.

Le facteur de sélectivité α, représente la capacité de la colonne à séparer deux analytes

voisins. Ce paramètre intervient dans la finesse des sommets des pics chromatographiques.
Il est lié à la différence d’interaction de chaque composé avec les phases mobiles et
stationnaires. Il se calcule selon la formule suivante, où α doit être supérieur à 1, pour que la
séparation des analytes soit optimale.

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑢 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡é 𝑙𝑒 𝑝𝑙𝑢𝑠 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑢⁄

𝛼= 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡é 𝑙𝑒 𝑚𝑜𝑖𝑛𝑠 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑢

L’efficacité N représente le nombre de plateaux théoriques que possède la colonne, et

exprime la finesse des pics chromatographiques. La chromatographie est un phénomène
continu et dynamique où chaque soluté se déplace progressivement en une suite d’étapes

79
distinctes. Ce processus se caractérise par un cycle d’adsorption et de désorption. Chaque
cycle correspond à un nouvel état d’équilibre de toute la colonne. Un plateau théorique est
défini comme une portion de la colonne, de longueur L, dans laquelle l’équilibre de répartition
entre les deux phases est réalisé. Pour chaque plateau théorique N, la concentration en
analyte est à l’équilibre entre les deux phases. A chaque nouvel équilibre, le soluté avance
d’un plateau théorique dans la colonne. Pour une longueur L constante, l’efficacité d’une
colonne augmente lorsque N augmente ou si H (hauteur du plateau) diminue. Cette efficacité
est dépendante de la nature de la colonne et du type de phases qui la compose. Plus une
colonne possède un nombre de plateaux élevé, plus elle est efficace, de la même manière,
plus la hauteur du plateau H est faible, plus la colonne est efficace. L’efficacité N est calculée
selon la relation suivante :

𝑁 = 𝐿⁄𝐻

La hauteur du plateau (HEPT ou H) est essentiellement liée aux caractéristiques de la

colonne : son diamètre, sa porosité, la taille de ses particules ou encore sa qualité de
remplissage.

Lors du développement d’une méthode analytique, l’ensemble de ces paramètres, le

type de colonnes et les phases mobiles sont à prendre en compte en fonction de l’analyte.
Plusieurs types de techniques de chromatographie en phase liquide existent, elles peuvent
être classées en fonction de la polarité de la phase stationnaire. Deux phases stationnaires
sont couramment utilisées et permettent de distinguer les chromatographies liquides à phase
polaire ou phase normale (P-LC) et celles à phase stationnaire apolaire ou de phase inverse
(RP-LC). D’autres phases sont toutefois utilisées pour l’analyse de certaines classes de
lipides, comme la chromatographie d’interactions hydrophiles (HILIC). L’analyse des lipides
nécessite l’utilisation d’une gamme étendue de supports chromatographiques en lien avec la
diversité de polarité et les propriétés physico-chimiques de ces molécules. Dans cette partie
seront détaillé la sélectivité des colonnes, les tailles des particules et les principales colonnes
utilisés pour les analyses en lipidomique.

80
La granulométrie correspond à la perte de charge ∆P, qui représente la différence de pression
entre le haut et le bas de la colonne. Plus la granulométrie est fine, plus la perte de charge
est importante. C’est pour cela qu’en diminuant la longueur de la colonne, le temps de
rétention est diminué. Les plus petites particules offrent une efficacité élevée, cependant, elles
entraînent davantage de pertes de charges.

La résolution R est le dernier paramètre à prendre en compte, celui-ci fait intervenir l’ensemble
des paramètres décrits jusqu’à présent. La résolution mesure le degré de séparation à la base
des pics. Il se calcule de la manière suivante :

𝑅 = 𝑇𝑟2 − 𝑇𝑟1⁄𝜔2 + 𝜔1
Ou Tr est le temps de rétention et ω la largeur à la base du pic chromatographique

Ce rapport de résolution est optimal lorsqu’il est proche de 1, dans ces conditions les
deux analytes 1 et 2 sont efficacement séparés. Lorsque ce rapport est en dessous de 1, alors
la résolution est insuffisante, les pics correspondants aux analytes 1 et 2 se recouvrent.

1.2.1. La chromatographie liquide à polarité de phase normale

Lors d’une analyse par chromatographie liquide sur phase normale, la phase
stationnaire est polaire et la séparation des analytes est basée sur l’échange d’interactions
polaires. La phase stationnaire est, par exemple, composée de silice ou de groupement
amine. La rétention des métabolites analysés en NP-LC dépend donc de la nature de leur tête
polaire204. Dans certains cas, un sel comme l’acétate d’ammonium peut être ajouté aux
phases mobiles, pour permettre une meilleure séparation chromatographique, des pics
chromatographiques affinés et une meilleure détection des lipides. L’analyse par NP-LC
permet de séparer les lipides selon leurs classes et polarité. Elle est utilisée, par exemple pour
l’analyse des glycérophospholipides qui sont séparés par sous-familles en fonction de la
nature de leurs têtes polaires.

81
 1.2.2. La chromatographie liquide à polarité de phase inverse
Lors d’une analyse par RP-LC, la phase stationnaire est généralement composée de
silice greffée de chaînes alkyles (de C4 à C30), de groupements cyano ou parfois de
groupements phényls. La phase mobile utilisée est généralement composée d’un mélange
hydro-organique. Généralement en début d’analyses, les conditions sont polaires et
constituées d’un mélange aqueux/méthanol ou aqueux/acétonitrile. La force éluante va être
augmentée au cours du gradient, par ajout de solvants moins polaires qui constituent la phase
mobile. L’élution des composés est réalisée selon la théorie solvophobique qui considère que
la rétention des analytes est liée au contact entre eux et les chaines alkyles de la phase
stationnaire solvatée. Ainsi, ce sont les analytes les plus apolaires qui auront une plus grande
interaction avec la phase, et seront alors retenus davantage que les composés polaires. De
même, les lipides présentant une ou plusieurs insaturations sont élués plus tôt que les lipides
saturés20. Il est possible de prévoir la rétention des composés en phase inverse en calculant
le nombre d’équivalent carbone (EqC). EqC = CN-2n, où CN est le nombre de carbones des
chaînes et n le nombre d’insaturation. L’EqC permet de prévoir les éventuelles co-élutions des
lipides en chromatographie liquide lorsque l’on utilise une colonne phase inverse. L’addition
d’acide formique à 0.1% permet d’améliorer la séparation chromatographique en affinant la
largeur des pics. Ces colonnes sont utilisées pour l’analyse des eicosanoïdes179, des
isoprostanes191, ou des aminolipides93.

82
1.2.3. Développement des systèmes chromatographiques et dernières
innovations en colonnes chromatographiques
Depuis une quarantaine d’années, de nouvelles technologies concernant les systèmes
chromatographiques émergent. Dans un premier temps, les diamètres internes des tubulures
(connectiques dans le système chromatographique) diminuent de plus en plus, (moins de 10
µm actuellement) pour diminuer les volumes morts. En parallèle, les systèmes d’injection
permettant d’injecter des volumes d’échantillons de plus en plus restreint se développent,
permettant d’atteindre une limite d’injection minimale de 0.1 µL pour les derniers appareils
commerciaux. Avec le développement de colonnes chromatographiques de diamètre interne
plus faible : microLC et nanoLC, pouvant atteindre 0.075 mm, les analyses LC-MS deviennent
alors de plus en plus sensibles permettant de mieux détecter les composés (plus faible limite
de détection) et de mieux les séparer. Lorsque des colonnes de diamètres internes plus faible
sont utilisées, les débits de solvants chromatographiques sont diminués provoquant une
meilleure focalisation du spray, un meilleur transfert de ce spray dans le spectromètre de
masse et une meilleure ionisation des analytes. Il en résulte une meilleure détection. En
conséquence, les analyses LC-MS deviennent miniaturisables, de plus en plus rapides et de
ce fait de plus en plus efficaces. En lipidomique, ce sont les colonnes de microLC qui sont
essentiellement utilisées afin de miniaturiser les analyses, les colonnes de nanoLC sont
utilisées pour la protéomique.

Depuis 2007, les technologies dites « coreshell » se développent (Figure 69). Elles ont
étés initiées par Horváth, puis par Kirkland. Ces supports de particules de silices sont
superficiellement poreuses, et sont composées d’un centre non poreux « core », sur lequel se
fixe une enveloppe « shell », de silice poreuse.

Figure 69 : Structure d’un particule coreshell205

83
 Ces colonnes coreshell sont mieux remplies, leurs tailles sont plus homogènes et plus
régulières comparé à celles constituées uniquement de particules poreuses. Ces particules
poreuses entrainent le phénomène d’anisotropie d’écoulement, due à la non-homogénéité des
tailles des particules, ou encore à un mauvais remplissage de la colonne. Ce manque
d’uniformité entraîne la création de différents chemins de longueurs variables que la phase
mobile peut traverser ayant pour conséquence un élargissement des pics
chromatographiques (Figure 70).

Figure 70 : Comparaison des pics chromatographiques obtenus avec deux colonnes, l’une
constituée de la technologie coreshell, l’autre constituée de particules totalement
poreuses205

Cette technologie Coreshell qui s’accompagne d’une diminution du diamètre des pores
et des particules permet de limiter la diffusion coaxiale des analytes entrainant une meilleure
séparation, une meilleure résolution et une meilleure reproductibilité des analyses par rapport
à des analyses effectuées sur colonnes complètement poreuses

C’est l’ensemble de ces évolutions, qui permettent de développer des analyses LC-
MS de plus en plus fines, permettant de détecter des analytes de plus en plus minoritaires et
faiblement représentés dans l’échantillon. Ces dernières technologies permettent également
des gains de sensibilité importants, (section développée en détails dans la partie 5 du
manuscrit). Cependant, cette miniaturisation des analyses LC-MS s’accompagne de
modifications des différents paramètres du spectromètre de masse, qui sont parfois
chronophages.

84
Chapitre III : La spectrométrie de masse

Différentes techniques analytiques permettent la détection et l’identification de

biomolécules. Les deux méthodes qui sont actuellement les plus utilisées sont la résonance
magnétique nucléaire et la spectrométrie de masse. La résonance magnétique nucléaire a
été la première méthode utilisée en métabolomique, et se trouve être la seule technique à
donner une structure moléculaire de façon générale et cela le plus souvent sans ambiguïté.
C’est une technique rapide, non destructrice, robuste, quantitative et applicable à toutes les
biomolécules. En contrepartie, il est préférable d’étudier des composés purifiés, et en quantité
suffisante (de l’ordre de plusieurs microgrammes)206,207 pour des analyses RMN. En
métabolomique et plus particulièrement en lipidomique, les mélanges étudiés sont
généralement complexes, et les quantités dispersées de composés sont souvent représentés
à l’échelle du nanogramme rendant l’analyse par RMN délicate208. Le couplage LC-RMN
pourrait être une solution, cependant malgré le système développé par Brucker, il ne s’est pas
popularisé comme l’ont été les couplages GC-MS ou LC-MS.

La spectrométrie de masse, est une méthode alternative, qui peut permettre dans
certains cas de déterminer des structures moléculaires à partir de mélanges complexes grâce
aux différents types de couplages possibles avec des méthodes séparatives comme la GC ou
la LC. La détection et l’identification de nouvelles molécules est possible en routine dès que
les composés sont connus et présents dans une banque de données. Toutefois quand il s’agit
de composés de novo la détermination de leurs structures reste toujours difficile, et implique
souvent des experts, les déterminations structurales peuvent être très longues et laborieuses.
A l’inverse de la spectrométrie de masse, la RMN se base uniquement sur des couplages
chimiques entre certains atomes (par exemple proton-proton) pour déterminer leur
environnement et des déplacements chimiques basés sur des effets électroniques liés au
groupements fonctionnels plus ou moins polaires, et donc prédictibles. La détermination
structurale d’un composé en spectrométrie de masse implique son ionisation et la dissociation
en phase gazeuse des espèces moléculaires chargées positivement ou négativement. La
chimie de ces dissociations se base sur une chimie particulière où les ions sont désolvatés et
dont leurs orientations se basent sur la thermochimie et la cinétique. En phase gazeuse, deux
molécules homologues ionisées peuvent présenter des chemins différents de fragmentations.
Par exemple, les acides aminés déprotonés [Asp-H]¯ et [Glu-H]¯ se dissocient différemment
bien qu’ils soient homomogues via la présence d’un groupement CH2 sur la chaine latérale.
En effet, le premier perd NH3 sous activation collisionnelle alors que le second perd plutôt
H2O209. Ainsi, un changement complet d’orientation peut avoir lieu selon des mécanismes de
fragmentations spécifiques et donc une modification des ions fragments peut en résulter.

85
Seuls les calculs quantiques peuvent nous permettre d’interpréter et/ou de confirmer les
mécanismes que nous pouvons proposer en se basant uniquement sur la chimie organique
classique.

Bien que la spectrométrie de masse ait été moins utilisée pour l’analyse de petites
molécules au cours des années 1980 et 1990, au profit des analyses de grosses molécules,
elle s’est développée avec l’apparition des méthodes de désorption par électronébulisation
(électrospray, ESI210,211) et des lasers UV assisté par matrices (MALDI212). Toutefois, le
développement de la spectrométrie de masse en métabolomique est encore plus récent213, et
fréquemment employé dans le cadre d’analyses « omiques » en raison de sa grande
sensibilité208,207. Aujourd’hui, dans ce manuscrit, dans la mesure du possible nous
respecterons les règles de IUPAC dans la nomenclature214.

1. Un historique de la spectrométrie de masse

Il est difficile de considérer la spectrométrie de masse d’aujourd’hui sans rappeler ses

origines. Ce n’est que par ce biais, basé sur l’évolution des idées, parallèlement à celles
d’autres sciences, que l’on peut comprendre la situation de la spectrométrie de masse
d’aujourd’hui. En fait, les mathématiques, la physique, l’atomistique, la chimie-physique, la
chimie …, ont vraiment avancé ensemble, l’un pouvant répondre au besoin de l’autre. Dans
la première partie de ce chapitre l’historique de la spectrométrie de masse sera développé.

Les premiers pas de la spectrométrie de masse remontent à la fin du XIXème siècle,

pour répondre aux premières questions de l’atomistique, c’est-à-dire la constitution de l’atome
pour en faire un modèle. Ainsi Thomson en 1897 a montré les propriétés de l’électron vis-à-
vis de champs magnétiques et de champs électriques215,216. En 1912 il construit son premier
spectromètre de masse parabolique. A la suite de cela, Dempster introduit en 1918 un
instrument à double focalisation, afin de répondre au besoin de la détermination des masses
atomiques de certains éléments à l’état gazeux, et il génère le premier spectre de masse.
L’année suivante, Aston mettait en évidence les premiers isotopes stables, notamment ceux
du néon. A partir de là, le modèle atomique simpliste initié par Thomson (une sphère neutre
constituée de charges positive et négatives en vibrations) commençait à évoluer et à se
concrétiser par différents modèles de plus en plus organisés selon les avancées physiques.
Dans un premier temps se développe le modèle planétaire de Rutherford-Bohr, où les
électrons sont sur des orbites circulaires concentriques correspondantes à certaines raies
émises de l’atome d’hydrogène, et décrites par la formule de Rydberg. Plus tard, Sommerfield
introduit un nouveau modèle selon lequel certaines orbites sont elliptiques et non circulaires.

86
La mesure des rayonnements en spectroscopie devient alors de plus en plus précis
notamment avec la démonstration du dédoublement des raies. C’est ainsi qu’a été introduit la
notion de spin, ou l’électron tourne autour de lui-même, soit dans un sens, soit dans l’autre.
L’ensemble de ces étapes constituent les prémisses du modèle moderne de l’atome.
Concernant la spectrométrie de masse, elle a été dédiée principalement jusqu’aux années
1940 à l’étude des différents éléments du tableau périodique217. En 1938 Harold Washburn
développe l’analyse par ionisation électronique en phase gazeuse des composés organiques
volatils par spectrométrie de masse, qui trouve son application directe dès les années 1941
dans l’analyse des gasoils utilisés dans l’aviation pendant la Seconde Guerre mondiale, et
l’analyse du caoutchouc retrouvé dans les pneumatiques des véhicules de guerre.

Au milieu des années 1950, le développement de la chromatographie gazeuse

couplée à la spectrométrie de masse, notamment par Fred W. Mc Lafferty commence218. Dès
les années 1960, l’analyse des produits naturels suffisamment volatils et des biomolécules de
petites tailles débute. Les molécules moins volatiles sont analysées après leur dérivation
chimique. Cela concerne les molécules comme les sucres (méthylation), les stéroïdes (la
silylation des groupes hydroxyles), les acides gras (estérification) et les lipides en général.
Ces analyses sont réalisées via une ionisation par électron, IE (initialement nommée impact
électronique ou bien bombardement électronique, terminologie ensuite prohibée par
IUPAC)214.

Au milieu des années 1960, Munson et Field développent l’ionisation chimique

permettant de déterminer les masses moléculaires des molécules à partir de molécules
protonées (mode ions positifs) ou déprotonées (mode ions négatifs). Cependant, l’information
sur les fragmentations est perdue car ces espèces sont souvent stables et possèdent une
faible énergie interne selon le gaz réactif utilisé. Dix années plus tard, après l’accident
chimique à Seveso, l’analyse des ions négatifs en ionisation chimique se développe très
rapidement permettant la détection des molécules chlorées, comme les dioxines et les
biphényles. En même temps, des techniques d’ionisation par champs et par désorption de
champs permettant l’étude des molécules moins volatiles et plus fragiles se développent.

A la fin des années 1970, les techniques de désorption SIMS (Secondary-ion mass
spectrometry) et surtout de FAB-MS (Fast atom bombardment mass spectrometry) se sont
développées via l’utilisation de matrices comme le glycerol. Cette dernière méthode répond
aux besoins d’analyses de molécules non volatiles et fragiles notamment pour les grosses
molécules comme les polysaccharides, les peptides et les protéines. Le FAB permet une
première avancée, puis au début des années 1980 apparaît la désorption laser infrarouge219
qui était trop énergétique. Au milieu des années 1980, la désorption par laser UV avec matrice

87
(MALDI) apparait220, en même temps que les méthodes à pression atmosphérique221 (API). A
cette période des méthodes par ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI)
émergent et permettent l’ionisation en phase gazeuse et l’électrospray (ESI) pour la
désorption de plus grosses molécules, par Fenn210 et en désorption laser par Tanaka,222. Cette
dernière approche a été supplantée par le mode MALDI apparu en même temps.

Développement des techniques omiques : Dès lors, les techniques “omiques” les plus
variées se développent. Les efforts ont surtout été réalisés en protéomique et en génomique,
au détriment de l’étude de petites molécules rencontrées en métabolomique et en lipidomique.
Les acquis concernant la décomposition des ions obtenus dans les années 1970-1980 ont été
peu à peu oubliés car la fragmentation des peptides, impliquant principalement la rupture des
liaisons peptidiques, reste plus simple à prédire et interpréter.

Aujourd’hui, ce passé sur l’interprétation des fragmentations des ions dérivant de petites
molécules est pratiquement effacé, ayant pour conséquence un manque dans l’approche des
déterminations structurales de petites molécules en métabolomique. Des programmes in-
silico se développent, comme ils se basent sur des systématiques bien éloignées des règles
de la chimie, ils ne permettent pas de déterminer sereinement les structures des molécules
étudiées223. C’est notamment le cas de solutions informatiques développées actuellement par
certains constructeurs de spectromètre de masse. Une partie y sera consacrée dans le
chapitre présentant mes résultats de thèse.

88
 2. Généralités sur la spectrométrie de masse

Dans cette partie, seront abordés certaines méthodes non utilisées pendant ma thèse,
mais dont certains concepts sont nécessaires à la compréhension des résultats
expérimentaux. Le mode d’ionisation par électrospray et les différents analyseurs utilisés
pendant mes travaux seront décrits en détails.

En spectrométrie de masse, différentes étapes sont à considérer : comme la

séparation des échantillons (en ligne où hors ligne), en amont de la source. Si elle se fait en
ligne, le mode de séparation doit être cohérent avec le mode d’ionisation, le choix de solvants,
co-solvants et sels ne doit pas seulement répondre aux exigences de la méthode séparative
mais au bon fonctionnement de la source d’ionisation. Le mode d’ionisation doit être cohérent
avec la molécule à analyser et à étudier. Concernant les molécules faiblement polaires,
représentées par une forme canonique (charges partielles faibles, Figure 72A), plutôt volatiles,
une ionisation en phase gazeuse peut être appliquée et donc, le couplage GC-MS est
pertinent (ionisation par électrons ou ionisation chimique). Il est éventuellement possible
d’utiliser les ionisations en photo-ionisation à pression atmosphérique ou en APCI, en
couplage LC-MS. Dans ces conditions d’ionisation en phase gazeuse, des distributions de
clusters non covalents mono-chargés (homo-multimères protonés ou déprotonés) sont
formées où les interactions sont uniquement du type liaison hydrogène. Ces clusters
réagissent par réaction ion/molécule avec la molécule à analyser afin de produire uniquement
des agrégats simplement chargés. A l’inverse, les molécules polaires peuvent former de
zwitterions, où les charges sont plus importantes que dans les formes protonées et
déprotonées. (Un exemple de protomère de chacune des formes citées sont représentés dans
la Figure 71D et 71E). Ces espèces ne peuvent pas être obtenues en phase gazeuse. En
effet, pour produire ces zwitterions, les molécules polaires ont besoin d’être solvatées.
Comme elles ne sont pas très volatiles, elles ne peuvent pas être ionisées en APCI. En
conséquence, il est nécessaire d’utiliser une méthode de désorption permettant le passage
en phase gazeuse de paquets de matières, conduisant à des agrégats multichargés (système
hétérogène d’un mélange de la (ou des) molécule(s) à analyser, de solvant, de sels, de
charges, etc).

89
 Figure 71 : Structure de d’un lipoaminoacide arginine sous forme A) canonique ; B)
déprotonée ; C) protonée et enfin zwiterionique (sous forme négative en D, et positive en E)

Dans tous les cas de figure qu’il s’agit de molécules volatiles ou non, stables ou
fragiles, il faut nécessairement la présence d’une charge positive sur la forme cationique
(Figure 71A) et d’une charge supplémentaire aux deux charges opposées préexistante dans
le zwitterion afin de les détecter en spectrométrie de masse.

Au début du XXème siècle, le rapport e/m était utilisé pour noter pour un élément. Puis
de 1950 jusqu’au milieu des années 1970, les rapports m/e sont utilisés. Le terme e
correspondait à un seul électron compte-tenu des modes d’ionisations en phase gazeuse
utilisé. A la fin des années 1970 est apparu la notion du rapport m/z, permettant ainsi de se
libérer de la valeur numérique de l’électron. Le rapport m/z est alors mesuré, où z représente
le nombre de charges, un nombre pur ce qui fait que la dimension du rapport m/z est toujours
une masse. Lors de l’ionisation en phase gazeuse sous vide z est généralement égal à 1 (sauf
en impact électronique où dans certains cas, notamment pour le cas de composés
aromatique, il est possible d’arracher 1, 2 ou 3 électrons). A pression atmosphérique, il est
possible de détecter des ions radicaux mais exclusivement des composés mono-chargés. Au
contraire, pour les méthodes de désorption où il est possible d’obtenir des ions multichargés,
la masse peut être différente du rapport m/z. Le rapport m/z mesuré dans le spectre de masse
doit être traduit. Quand une distribution d’état de charges est produite, un programme de
déconvolution donnant une masse moyenne (au sens mathématique) devra être utilisé.

Ce rapport m/z peut être déterminé en basse résolution avec des spectromètres de
masse équipés de filtres multipolaires (quadripole) ou avec les pièges à ions. Ces instruments
permettent de mesurer des rapports m/z nominaux (nombres entiers qui ne tient pas compte

90
des défauts de masses des atomes). Le rapport m/z peut également être déterminé en haute
résolution permettant de séparer des ions isobares et ainsi de déterminer de manière précise
les rapports m/z, avec en général un rapport m/z donné à quatre décimales. Par ce biais, il
est possible de remonter aux compositions élémentaires des ions. Cette approche reste
précise pour des ions dont la masse n’excède pas 400-500 u (ou Dalton noté Da) et peut être
réalisée sur des appareils équipés d’analyseurs de type temps-de-vol (time-of-flight TOF), à
Transformée de Fourier (FT) ou à résonance cyclotronique des ions (FT-ICR).1* Compte tenu
de la production d‘espèces intactes, il est nécessaire d’avoir des informations sur la structure.
Certains ions fragments caractéristiques correspondant à des pertes informatives et
spécifiques (par exemple des pertes d’H2O pour un alcool ou pour un acide carboxylique)
doivent être mis en évidence. Ainsi, il est essentiel de donner de l’énergie sur l’ion d’intérêt,
d’où l’introduction de la spectrométrie de masse en tandem.

Développement des techniques en tandem : Les tandems ont été dans un premier temps
des instruments à double secteurs (ce sont des instruments à 2 champs, le premier
magnétique et le second électrique) 224,225,,226,,227,,228,,229, qui depuis quelques décennies ont
disparus des laboratoires d’analyse et de recherche, au profit d’instrumentation en tandem de
type “Benchtop” introduits à la fin des années 1970 et au début des années 1980. Il s’agit de
tandems de type triple quadripolaire conçus par Enke et Yost230. Dans ces spectromètres de
masse, les ions sélectionnés dans le premier quadripole (un filtre de masse) sont soumis à
des collisions produites dans le second quadripole (cellule de collision où seule la
radiofréquence est appliquée, « RF only » quadripole). Le fonctionnement de cet instrument
sera détaillé par la suite. En parallèle, les pièges à ions (ITD : ion trap detector)231 où les ions
sont formés dans le piège et sont analysés par éjection, se sont développé. Dans ce piège, il
est possible de produire des séquences de fragmentations MS² ou MSn. Cependant, la limite
de ces instruments à champs quadripolaires était limitée en résolution, c’est à dire la capacité
de l’appareil à faire la distinction entre deux ions m/∆m les plus proches possibles. De plus,
de véritables réactions ions/molécules se produisaient dans cette cellule et le rapport m/z des
ions produits pouvait être supérieur à celui de l’espèce moléculaire ionisée.

1* Ici, seuls les instruments commerciaux seront décrits, afin de répondre à notre besoin. Les
instruments expérimentaux de laboratoire auquels nous avons pas eu accès ne seront pas abordés

91
 Développement des appareils à temps-de-vol : Dans les années 1980, les instruments à
analyseurs TOF se développent afin de répondre aux besoins de la désorption laser
fonctionnant par impulsion comme les TOF/MS. Afin de minimiser les effets de dispersion
temporelle des ions et de leurs dispersion en énergie cinétique (Ec) un réflectron (miroir
électrostatique) est ajouté à l’analyseur232. Les ions peuvent se former à différents endroits de
la source et ainsi subir un champ d’accélération légèrement différent.

Par la suite, l’introduction d’un quadrupole et d’une cellule de collision entre la source
et le temps-de-vol, a permis d’obtenir un tandem hybride ( noté Qq/TOF ou Q/TOF) de haute
résolution (hybride à cause de l’énergie cinétique des ions qui est de plusieurs eV ou de
dizaines d’eV dans les régions des quadripôles et de plusieurs keV à l’entrée du temps-de-
vol)233. Les détails sur les fonctionnalités et le fonctionnement de cet appareil sera donné par
la suite, puisque c’est sur un instrument de ce type qu’un développement analytique a été
réalisé pendant ma thèse.

Les instruments hybrides : Il existe évidemment d’autres instruments hybrides, comme

ceux couplés à un analyseur Orbitrap234 de très haute résolution ou, moins courant, les Qq/FT-
ICR. Contrairement à l’Orbitrap qui est utilisé uniquement comme détecteur, la cellule ICR
peut permettre l’activation particulière de certains ions. Les instruments Qq-FT-ICR (ou avec
multipoles Marshall235) possèdent divers modes d’activation en plus du mode CID. Il s’agit des
activations :

- Par bombardement d’électron de plus de 10 eV (electron induced dissociation, EID236 ou

encore EIEIO) quel que soit la charge (multiple ou simple, positive ou négative) de l’ion.
- Par capture d’électron dissociative (electron captured dissociation, ECD) avec des électron
de faibles énergies cinétique pour dissocier des ions positifs multichargés237.
- Par dissociation induite par détachement d’électron à partir d’ion négatifs multichargés
(electron detachment dissociation, EDD), utile surtout pour l’étude d’ions multichargés, ce
qui ne fait pas parti de notre domaine d’intérêts238.

Ces modes d’activations ne seront pas décrits par la suite car ils n’ont pas été utilisés
durant ma thèse. La première méthode (EID), qui pourtant serait utile pour l’étude de lipides
insaturés n’est pas encore installée sur les instrument commerciaux que nous utilisons239.

92
 3. Généralités sur les principaux constituants d’un spectromètre
de masse

La première partie d’un spectromètre de masse est une source d’ionisation, avec en
amont soit une sonde d’introduction directe, soit une méthode séparative (GC ou LC), (Figure
72).

Figure 72 : Représentation schématique des éléments constituant le spectromètre de

masse (la pression dans la source peut être la pression atmosphérique ou un vide plus ou
moins poussé)

La source d’ionisation peut être sous vide lorsqu’il s’agit des modes d’ionisation en phase
gazeuse comme l’EI (electron ionization, ionisation par électron) et la CI (chemical ionization,
ionisation chimique), ou à pression atmosphérique pour les méthodes d’ionisations de type
API. Dans ce dernier cas, la présence d’une interface 240 entre la source API et l’analyseur est
nécessaire avec comme intermédiaire, une cellule à pression réduite pour la désolvation des
agrégats chargés. La deuxième partie de l’instrument est l’analyseur, généralement sous vide,
ou sous pression réduite (Figure 73). Les ions y sont transférés sous:

- Une faible énergie cinétique de l’ordre de 5 à 20 eV, sous une pression de 10-4 à 10-6 mbar.
Cette pression permet d’éviter la dispersion des ions et leurs dissociations dans l’analyseur
pouvant être un quadripole, un multipole ou un piège à ions. Le transfert du faisceau d’ions
est facilité en faisant varier la “terre” (définie comme tension de référence, égale à 0) sur les
électrodes. Dans cette zone, sous vide, des lois de balayages des tensions (continue et de
l’amplitude de la tension RF) pour séparer les espèces de m/z différents sont appliquées, il
s’agit ici d’un filtre de masse.

- Quelques keV (sous un vide de 10-10 à 10-11 mbar), dans un piège à potentiel quadro-
logarithmique (Orbitrap)234 constitué d’une électrode axiale, en forme de fuseau enfermée
dans une enceinte sous forme de « tonneau » coupée en deux au milieu de l’axe de son plus
grand diamètre. Sur cette paire d’électrodes symétriques, il apparaitra de manière alternative
des charges induites par la présence du nuage d’ions en mouvement, sous forme d’hélices le

93
 long de l’axe de l’électrode « fuseau », plus ou moins déphasé selon leurs rapports m/z. Un
courant alternatif de fréquence liée au rapport de chacun des ions du nuage ionique entre ses
électrodes est mesuré en produisant un signal transitoire (mélange de fréquences
d’amplitudes différentes) dont la durée sera garante de la résolution. Dans ce cas, aucun
balayage de tension ne se produit, le mouvement des ions est lié au potentiel de piégeage
quadro-logarithmique.

- Une forte énergie cinétique de plus de 10 keV (sous un vide de 10-7 à 10-8 mbar), dans un
tube de vol dont la longueur et la pression sont corrélées afin d’éviter toute collision entre les
ions en vol et les molécules de gaz résiduelles (correspondant au libre parcours moyen des
ions). Toute collision reviendrait à disperser les ions et à allonger leur temps de vol, ce qui
entrainerait une perte de résolution ou une perte définitive des ions fragments par
neutralisation de la charge ou par dissociation. Dans ce dernier cas de transmission des ions
de la source vers l’analyseur, il n’y a pas de balayage, et seuls les temps-de-vol sont mesurés
après une accélération des ions sous une haute tension. Cet instrument, contrairement au
quadripole, fonctionne par impulsions.

La troisième partie de l’instrument est le détecteur, qui dépend de l’analyseur (Figure

73). Le détecteur est sous vide pour éviter les claquages électriques et sa détérioration via le
dépôt de sels. Ce détecteur permet l’analyse des courants d’ions, de manière continue, avec
le chaneltron (multiplicateur d’électrons), ou une galette multicanaux qui enregistre le passage
des paquets d’ions.

Ces trois parties décrites succinctement (source, analyseur et détecteur) constituent

le spectromètre de masse. Une dernière partie correspond au système informatique pour
enregistrer les spectres de masses et piloter l’instrument. Ce système est totalement
indépendant du spectromètre de masse, il reçoit uniquement les courants électriques qu’il
traite.

94
 4. Les sources d’ionisation
Le mode d’ionisation choisi va dépendre du caractère volatile ou non des molécules à
étudier. Les molécules plus ou moins volatiles pourront subir après évaporation, soit une
ionisation sous vide (EI et CI), soit une ionisation à pression atmosphérique (APCI, APPI, ou
DART direct analysed in real time ; un mode classé dans l’ionisation ambiante dont on ne
discutera pas dans ce manuscrit). Dans le cas des molécules non volatiles ou lorsqu’il s’agit
de sels, l’évaporation de ces composés étant impossible, des processus de désorption seront
utilisés, soit sous vide (MALDI) soit à pression atmosphérique comme l’ESI, l’AP/MALDI, DESI
et l’EESI (extractive electrospray).

4.1. Ionisation en phase gazeuse sous vide

Ionisation par électrons : Ce mode d’ionisation implique la production d’ions moléculaires M+•
caractérisés par une forte énergie interne. L’énergie interne correspond à l’énergie
vibrationnelle ou rotationnelle distribuée dans l’état fondamental et les états électroniques
excités. Cette distribution d’énergie vibrationnelle s’étale sur 10 à 15 eV et dépend
exclusivement des propriétés spectroscopiques de la molécule ionisée. Dans la source
d’ionisation, les ions moléculaires sont des systèmes isolés, l’énergie interne des ions
moléculaires ne peut donc pas être dispersée exception faite du rayonnement possible des
ions se stabilisant. Le principe de Franck-Condon représente l’ionisation verticale des
molécules allant de M en M+•, et leurs répartitions entre l’état fondamental et ses états
électroniques excités, avant d’être redistribués sur des niveaux inférieurs, au moment où les
surfaces de potentiels des états (représentés par des courbes) se croisent. Ce croisement
permet aux molécules excitées de passer à un niveau d’énergie moindre (Figure 73).

95
 Figure 73 : A) Représentation schématique de l’ionisation verticale, selon le principe de
Franck-Condon et B) le spectre photo-électronique du bromobenzène

Pour exemple, le spectre photoélectronique du bromobenzème (Figure 73) montre la

distribution de l’énergie vibrationnelle dans l’état fondamental et les états excités. Cette
distribution est propre à chaque composé, c’est une garantie de la reproductibilité des
spectres dans leur fragmentation. Dans notre étude, nous considèrerons une distribution
globale, sans séparer l’état fondamental des états excités, représentés par une courbe en
cloche lors de nos expériences. Cette distribution très approximative est suffisante pour rendre
compte qualitativement de l’orientation de processus de décompositions compétitifs soit dans
la source soit dans d’autres régions du spectromètre de masse.

La fragmentation de ces ions est principalement due à la présence des états excités,
qui sont souvent des états triplets (di-radicalaires) qui induisent la fragmentation alors
qu’habituellement celle-ci est induite par la charge. En d‘autres termes, les fragmentations
sont induites par la présence de radicaux, même si la charge se trouve séparée du site
radicalaire (c’est le cas pour les ions distoniques). Chimiquement, les ions radicaux sont des
espèces instables, ce qui explique souvent l’absence de l’ion moléculaire dans les spectres
de masse. Néanmoins, les spectres sont parfaitement reproductibles d’un instrument à l’autre,
et c’est pourquoi les premières banques de données par ce mode d’ionisation ont été
construites des 1975, et sont encore alimentées à ce jour et toujours utilisées. Les
fragmentations obtenues peuvent s’interpréter à partir des règles de la chimie radicalaire, et
ont été dans les années 1950 à l’origine de la construction de la théorie cinétique du quasi-
équilibre (détaillée en Annexe 1). Même s’il est possible de remonter le puzzle de la molécule
grâce aux ions fragments, l’absence de l’ion moléculaire peut être un fort inconvénient lors de

96
la détermination de structure. Pour l’élucidation structurale, il est nécessaire d’utiliser une
méthode d’ionisation permettant de déterminer ces ions moléculaires.

L’ionisation Penning241 où les ions sont formés par interactions molécules-atomes

métastables pourrait être utilisée. Dans ce cas, l’énergie libérée lors de la désexcitation de
l’état métastable est directement transférée à la molécule, qui peut alors être ionisée si cette
énergie est suffisante pour que l’on se situe au-dessus du seuil d’ionisation de la molécule
(énergie d’ionisation). Si cette énergie de désexcitation est proche de l’énergie d’ionisation de
la molécule alors, l’ion moléculaire ne se décompose pas, et reste la seule espèce présente
sur le spectre de masse. Cette méthode n’a jamais vraiment été développée
commercialement, et n’est pas utilisée dans les laboratoires d’analyses. A l’inverse,
l’ionisation chimique est commercialement viable, et facile à introduire sur les instruments.
Cette méthode produit peu d’ions moléculaires par échanges d’électrons mais des molécules
protonées ou déprotonées par échanges de protons.

Ionisation chimique : Inventée en 1971 par Mundson et Field, elle est basée sur des
réactions qui ont lieu dans une source où la pression se situe entre 0,1 et 1 mbar. Ce mode
d’ionisation repose sur la connaissance des réactions ion-molécule242. Afin que ces réactions
puissent se faire, il est nécessaire que les ions aient une énergie cinétique très faible, de
manière à ce qu’un des partenaires puisse capturer le second. Cette réaction de capture est
déterminante pour les réactions ions-molécules à plusieurs étapes. En d’autres termes, les
ions réactifs doivent être thermalisés (relaxés en énergie). Ces réactions ont été initiées dans
un but de meilleure compréhension des réactions pouvant avoir lieu dans la stratosphère,
ainsi que pour augmenter nos connaissances sur la composition des météorites243, autour des
planètes 244,245,246, des échantillons lunaires247, de l’atmosphère planétaire, ou encore pour
l’étude de l’environnement de Saturne 248,249.

Ces réactions ions-molécules peuvent être réalisées en plusieurs étapes, la première

consiste en l’ionisation du gaz (noté G) via une ionisation par électron (noté e) (Eq. 1a).

Eq. 1a : G + e → G+• + 2e

Ce gaz peut réagir sur lui-même, afin de former une molécule protonée réactive (Eq
1b) (comme par exemple les ions CH5+, H3O+, (CH3)3C+ et NH4+).

Eq. 1b : G + <e> → G-•

97
 De la même manière, certaines molécules peuvent conduire aux ions réactions
négatifs, comme Cl−, OH−, CH3O−, CH2CN− (en d’autres termes des solvants utilisés
classiquement en LC-MS). Afin de produire ces ions réactifs (GH+ ou [G-H]−), la première
étape consiste en une ionisation par électrons (Eq 2a et 2b).

Eq. 2a : G+• + G → GH+ + [G-H]•

Eq. 2b : G−• + G → [G-H]−+ [G+H]•

Les ions radicaux produits sont très réactifs, et les électrons libérés sont thermalisés.
Ainsi, dans la source un plasma constitué d’un mélange d’ions positifs et d’ions négatifs
coexistants est produit.

Les gaz composés d’hétéroatomes (G) sont tous capables de s’autoprotoner,

exception faite de l’acétone. Ces molécules de gaz protonées peuvent réagir sur la molécule
d’intérêt, pour être solvatée et conduire à la formation d’un ion adduit (M,GH+). Cette réaction
est réversible et exothermique, puisqu’il s’agit de solvatation. A partir de cet ion adduit, le
proton peut passer de GH+ sur M, afin de produire (G,MH+) selon un équilibre et ensuite se
désolvater afin de produire MH+ + G. Cette réaction est décrite selon le chemin réactionnel de
Brauman décrivant la réaction ion-molécule par transfert de proton exothermique, où la
réaction évolue vers les densités d’états les plus grandes (orientation thermo-cinétique). La
conséquence de cette orientation peut se traduire par l’augmentation de l’énergie interne
initiale, qui traduit une efficacité de réaction de plus en plus faible. C’est pour cela que la
barrière centrale devient l’étape limitante (Figure 74).

Pour que cette réaction puisse avoir lieu, il est nécessaire que l’état final soit plus bas
que l’état initial, c’est-à-dire qu’en allant de la gauche vers la droite, au fur et à mesure de
l’avancement de la réaction, le nombre de fréquences infrarouges disponible augmente. C’est
pour cela que naturellement la réaction se déroule de la gauche vers la droite, vers le sens
exothermique. Ce chemin et les mêmes règles s’appliquent aux ions négatifs, lorsque l’on part
de [G-H]− + M –()→ G + (M-H)−.

98
 Figure 74 : Représentation schématique du chemin reactionnel de Brauman

Afin d’estimer si une réaction ion-molécule est exothermique ou non, il est nécessaire de
définir deux fonctions d’états thermodynamiques (représentées par des réactions de pertes
de protons fictives, mais calculables) :

- La première notion importante est la basicité (∆G0Bas) ou l’affinité protonique, qui

représente la capacité d’un composé à capter un proton (∆H0 = PA), cette fonction ne
s’applique que pour les ions positifs.
MH+ → M+H+

- La seconde, qui concerne les ions négatifs, s’apelle l’acidité, qui représente la capacité
qu’à une molécule à perdre un proton. (∆G0Acide) ou (∆H0Acide).
M → [M-H]- + H+

Ainsi, pour que GH+ transfère son proton à M, il faut que PAM > PAG, c’est-à-dire que
la molécule doit être plus acide que le gaz, et pour que [G-H]− arrache un proton à M, il faut
que ∆H0Acide(G) > ∆H0Acide(M).

Les ions négatifs sont des espèces beaucoup plus stables que les ions positifs, pour
deux raisons. La première est chimique, une molécule protonée conduit à un grand nombre
de fragmentations catalysée par le proton. En présence d’un anion, l’hétéroatome portant la

99
charge possède un nombre d’électrons du gaz rare qui le suit, et se trouve naturellement
éléctronégatif, ce qui défavorise sa prompte décomposition. La seconde raison est liée à
l’énergie interne emportée par les ions résultants de l’exothermicité de la réaction ion-
molécule. Cette exothermicité s’accumule dans la liaison créée. Ainsi, pour les ions négatifs,
la liaison créée est dans B (H+ + [B-H]¯ → B) et donc les ions négatifs [M-H]¯ possèdent une
faible énergie interne. Cette situation est contraire à celle des ions positifs où la liaison créée
est dans MH+ (H+ + M → MH+) emportant une grande partie de l’exothermicité et ainsi se
dissocie beaucoup plus rapidement.

Par exemple, une molécule d’ester (PA = 196 kcal.mol-1) protonée par l’acétonitrile (PA
= 186 kcal.mol-1) va conduire à une énergie interne d’environ 10 kcal.mol-1 (~0.45 eV ; avec 1
eV = 23,06 kcal.mol-1) insuffisante pour conduire aux décompositions car 0,7-0,8 eV sont
nécessaires pour atteindre un seuil de fragmentation possible. Cependant, la protonation de
l’ester par le méthane (PA = 135 kcal.mol-1), va conduire au maximum à 61 kcal.mol-1(~2,6
eV). Cette fois, l’énergie est suffisante pour rompre une liaison covalente. Cette énergie est
partiellement dispersée par collisions de très basse énergie cinétique avec le gaz réactif
neutre (relaxation en énergie interne).

Les fragmentations des ions MH+ ne sont pas nécessairement identiques à celles de
M+•. Puisque dans un cas il s’agit d’un ion à nombre pair d’électrons, alors que l’autre possède
un nombre impair d’électrons (ion radical). Dans ce dernier cas, très souvent l’ion radical
s’isomérise en un intermédiaire distonique (où ce n’est pas la charge positive qui induit la
fragmentation, mais le radical.

Cette partie a été développée surtout dans le but de dégager les conditions exigées
pour qu’une réaction ion-molécule soit efficace (c’est-à-dire une réaction où à chaque collision
un produit de réaction est formé). Cette efficacité ne dépend que de la première étape de la
réaction ion-molécule, la réaction de capture, et cela que la réaction soit très fortement ou très
faiblement exothermique : cela ne changera pas l’efficacité globale de la réaction. Ce mode
d’ionisation n’a pas été utilisé pendant ma thèse, cependant le principe a été décrit puisqu’il
est nécessaire pour la compréhension de l’ionisation en phase gazeuse à pression
atmosphérique.

100
 4.2.1. Ionisation à pression atmosphérique

Les techniques à pression atmosphérique permettant l’ionisation en phase gazeuse

sont principalement l’ionisation chimique à pression atmosphérique, la photo ionisation à
pression atmosphérique et le mode d’analyse direct en temps réel. Seule la première méthode
d’ionisation, qui potentiellement, pourrait être utilisée pour certains composés parmi les plus
volatils en métabolomique sera développée. Toutes ces méthodes (ainsi que les méthodes
de désorption à pression atmosphérique) utilisent le même type d’interface, même si les
configurations changent selon la société qui construit l’instrument240. Ces interfaces doivent
permettre le transfert des ions de la pression atmosphérique à un pré-vide (pression réduite)
où la désolvatation des agrégats chargés se produit afin d’être ensuite échantillonnés à l’aide
de cônes successifs.

L’ionisation chimique à pression atmosphérique : Elle a été introduite en 1973 par

Horning et al.250, et s’effectue en phase gazeuse où l’échantillon est en solution dans la phase
mobile. Les analytes sont introduits au travers d’un capillaire à pression atmosphérique, et
sont nébulisés par du diazote hautement chauffé (de 300°C à 400°C). Cette étape permet
l’évaporation rapide de la solution d’analytes (noté M) de manière à obtenir l’échantillon en
phase gazeuse dans une ambiance saturée de gaz, constituée par les solvants évaporés
(noté Solv)251. Les molécules de solvant, en phase gazeuse seront ionisées par décharge
Corona, qui produit un nuage d’électrons, permettant à la fois l’ionisation par électron du
solvant (formation de Solv+•), mais aussi à la thermalisation des électrons. Le solvant à l’état
gazeux est protoné (SolvH+) par «auto protonation» (sauf l’acétone)252 comme en ionisation
chimique. Cette fois-ci, à pression atmosphérique, les ions réactifs sont solvatés pour former
en général des clusters chargés (homo-multimères protonés SolvnH+ ou déprotonés Solv(m-
1)(Solv-H)¯ (ou [Solvm-H]¯) avec m toujours beaucoup plus petit que n, car les molécules qui
sont déprotonées sont acides et par conséquent moins solvatées. Ces ions réactifs libres de
molécules de solvant n’existent pas dans ces conditions, leur solvatation est immédiate par
multiples collisions avec les molécules de solvants en phase gazeuse. Ces clusters vont réagir
comme en ionisation chimique sur la molécule d’intérêt M par capture (selon l’équation Eq
3a). Il en est de même pour les ions négatifs (selon l’équation Eq 3b) pour donner des agrégats
mono-chargés (cluster + molécule) :

Eq. 3a: M + SolvnH+ → [M, SolvnH+]

Eq. 3b: M +( Solvm-H)- → [M, Solvm -H-]

101
 Les agrégats de tailles variables (selon les clusters ayant réagi) pourront coexister
sous certaines conditions. Après leur formation, ceux-ci pourront perdre une ou plusieurs
molécules de solvant, conduisant à un nouvel agrégat de taille plus faible mais moins réactif.
Cela s’explique par exemple en mode positif, en comparant l’affinité protonique du cluster qui
a perdu x molécules de solvant et celle de «l’analyte»: lorsque ces valeurs sont comparables
(PAM ~ PASolv(n-x)) alors l’agrégat protoné à plutôt une longue durée de vie253,. Pour les clusters
deprotonés, ce raisonnement s’applique en comparant les acidités. Après libération des
molécules de solvants, l’agrégat obtenu a une longue durée de vie dès que les acidités
deviennent proches [∆H0Acide(M) < ∆H0Acide(Solvm-y)]. Pour des systèmes polyfonctionnels, cette
interprétation doit être faite pour chacune des fonctions chimiques. En conséquence, des
agrégats avec des tailles différentes coexistent. Cela a été démontré à partir d’agrégats
M(H2O)xH+ (x=2 et 3) avec M étant l’ester méthylique de l’acide p-aminobenzoïque, étudiés
par spectroscopie des ions254. Ces espèces qui survivent sont injectées dans la zone de
désolvatation, au travers du système de l’interface (à pression atmosphérique vers la pression
réduite)255,256,257,258,259 pour conduire à des ions protomères dont la charge ne peut pas migrer
d’un site à l’autre, comme c’est le cas pour les composés aromatiques.

Selon les conditions de désolvatation, c’est-à-dire via la modification des paramètres

du « sampling cone » (voltage de cône), il apparaît à faible voltage principalement les espèces
intactes. L’augmentation de cette valeur de sampling cone peut conduire à des
fragmentations. Toutefois, il n’est pas toujours possible de travailler avec des voltages trop
faibles, la diminution de cette valeur de sampling cone va défavoriser la transmission des ions
de plus hauts rapports m/z. Il est donc nécessaire d’effectuer un compromis entre bonne
transmission des plus hauts rapports m/z et fragmentation via ce paramètre.

Il n’est pas possible de voir des ions multichargés en APCI puisque les réactions ions-
ions de même charge ne peuvent pas avoir lieu. De plus, on ne peut pas avoir de formation
de sels protonés ou déprotonés, car ils ne sont pas volatils, dans le sens où ils sont
nécessairement solvatés. Pour étudier ces espèces, il est nécessaire d’appliquer des
processus de désorption. De plus, il ne peut pas y avoir de formation de molécules cationisées
par des cations métalliques. Ils ne sont pas volatils car leur solvatation est très forte en raison
de la présence des charges. Ces espèces qui pourront être désorbées intactes, peuvent être
sous forme de cation solvaté ([M+Na]+ où le cation est en interaction non covalente avec des
doublets libres d’hétéroatomes), ou des formes tautomères des précédentes comme les sels
protonés (i.e., [(M-H+Na)+H]+) ou déprotonés (i.e., [(M-H+Na)-H]¯)260.

102
 4.2.2 Ionisation par désorption à pression atmosphérique

Parmi les nombreuses méthodes de désorption à pression atmosphérique comme

l’électrospray, le nanospray261, la désorption sous électrospray262, l’«extraction» par
électrospray (EESI)263, l’évaporation par laser combiné à l’électrospray (LAESI)264 ou la
désorption laser assistée par matrice sous pression atmosphérique, nous ne développerons
que l’ionisation par électro-nébulisation utilisée durant cette thèse.

Ionisation par électronébulisation : L’hydrodynamisme est connu depuis le XVIIIème

siècle, et a été introduit par Bossut via le traité théorique et expérimental de
l’hydrodynamisme265. Par la suite, l’électro-hydrodynamisme a surtout été développé par
l’Abbé Nollet266, souvent en discussion et en collaboration avec Benjamin Franklin. Ainsi, ils
ont domestiqué les charges introduites sur des gouttelettes. L’électro nébulisation en tant que
telle est utilisée pour la première fois par Dole et al. en 1968 afin de mettre en évidence des
particules, via l’utilisation de la spectrométrie de masse. Fenn développe réellement cette
technique en 1984267 dans le cadre de détection de très gros polymères via l’utilisation
d’analyseur quadripolaire.

L’ESI est une technique d’ionisation à pression atmosphérique, qui contrairement à

l’APCI, ne permet pas d’évaporer très rapidement les gouttelettes de solvant. En effet en ESI
les gouttelettes sont chargées, et donc leur évaporation devient quasiment impossible.
Néanmoins, le fait d’évaporer partiellement ces gouttelettes multichargées conduit à la perte
de l’équilibre entre le nombre de charge répulsives et la tension superficielle de la gouttelette
conduisant sur le cône de Taylor lors de la limite de Rayleigh à des explosions de Coulomb
(Figure 75). Ces explosions se font selon une cascade de plus en plus rapide afin d’arriver à
la fin, à la désorption de gros agrégats porteurs de nombreuses charges268,,251, il s’agit du
modèle de l’évaporation ionique269,270. Ce sont ces agrégats qui seront partiellement
désolvatés, dans le capillaire de transfert et surtout dans la zone de pression réduite où les
molécules de solvants sont éliminées ainsi que certaines charges271,272. Si la molécule est
petite, évidemment à la fin il ne restera plus qu’une seule charge, ainsi qu’une ou deux
molécules de solvants. Aux concentrations les plus élevées, les formes protonées deviennent
défavorisées au profit des formes cationisées. Cela va néanmoins dépendre des propriétés
physico-chimiques de la molécule analysée. L’analyse de polymères, comme le polyéthylène
glycol va conduire strictement aux formes cationisées par le sodium, alors que certains acides
aminés acides refuseront de donner des formes cationisées, comme c’est le cas pour certains
lipoaminoacides de notre étude.

103
 Figure 75 : Principe de l’électonébulisation, de la limite de Rayleigh et du cône de Taylor
d’après Schröder, E. Massenspektrometrie - Begriffe und Definitionen. (1991).

Dans le cas de plus grosses molécules que celles rencontrées en lipidomique et en

métabolomique, les ions libérés après désolvatation se retrouvent multichargés selon une
distribution d’état de charge qui dépend des conditions de désolvatation et des propriétés
physico-chimiques des solvants, additifs, et des groupements réactifs de l’analyte (la basicité
ou l’acidité en phase gazeuse). Dans ce cas, le rayon de la gouttelette diminuera à son
minimum, il n’y aura pas de désorption mais seulement une désolvatation continue par pertes
consécutives de molécules de solvants jusqu’aux dernières selon un modèle établi par La
Mora273: le modèle de la charge résiduelle. Les gros agrégats multichargés sont transférés
dans la zone de pression réduite, afin d’être désolvatés et plus ou moins déchargés, selon
leurs tailles et leurs potentiels de désolvatation. Il en résulte une distribution d’état de charges
continue dépendant, généralement, de la conformation des macromolécules chargées.

C’est la méthode la plus populaire, puisqu’elle permet un couplage LC-MS206.

Toutefois sa limite majeure se trouve au niveau de la gamme dynamique d’analyses
quantitatives qui n’excèdent pas deux ordres de grandeur. Ce plus, avec cette technique
d’ionisation, les effets de suppression d’ions à cause de la matrice sont importants,
contrairement aux techniques à ionisation en phase gazeuse comme l’APCI274.

104
 5. Les différents analyseurs en spectrométrie de masse
En spectrométrie de masse, c’est l’analyseur qui permet de séparer les ions par leurs
rapports m/z respectifs, pour cela, il mesure le rapport masse-sur-charge de la molécule (m/z).
Plusieurs paramètres permettent de caractériser un analyseur : la gamme de rapport m/z qu’il
peut mesurer, sa vitesse d’acquisition, sa sensibilité, sa résolution, sa précision en masse et
sa compatibilité avec les différentes sources d’ionisations à l’aide d’interfaces adaptées240.

La précision de mesure des rapports m/z des ions mono-isotopique et de leurs ions
fragments dépend de la résolution de(s) l’analyseur(s) du spectromètre de masse. La
résolution correspond à la capacité d’un spectromètre de masse à distinguer deux ions voisins
de rapports masse-sur-charge m/z distincts d’une différence ∆m/z275. La valeur de ∆m/z peut
se mesurer par la largeur à mi-hauteur d’un signal à un m/z donné (Full Width of the peak at
Half its Maximum height, FWHM)275,276. Plus la résolution d’un analyseur est élevée, plus la
mesure en masse de l’ion est précise à condition que l’étalonnage en rapport m/z soit constant
dans le temps. Ces paramètres définissant la résolution et la mesure de masse, sont très
importants et doivent être considérés pour toute analyse.

La précision en masse, caractérisée par la résolution, correspond à la différence entre

la masse calculée (Mcal) de l’ion mono-isotopique et la masse mesurée expérimentalement
(Mexp), et s’exprime en partie par million (ppm) et se calcule de la manière suivante :

𝑀𝑒𝑥𝑝 − 𝑀𝑐𝑎𝑙⁄ 6
𝐸𝑟𝑟𝑒𝑢𝑟 𝑑𝑒 𝑚𝑒𝑠𝑢𝑟𝑒 𝑒𝑛 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 = 𝑀𝑐𝑎𝑙 ∗ 10

Il existe une grande variété d’analyseurs caractérisés par des performances très
différentes, deux grands sous-types d’analyseurs sont distingués : ceux qui travaillent en
haute résolution et ceux en basse résolution. Par exemple, pour un ion m/z 400, l’analyseur
utilisé est de basse résolution, si la valeur de ∆m/z > 0,1 (l’unité est donnée en m/z). Pour une
valeur de 0,01 < ∆m/z < 0,1, la résolution est considérée comme moyenne et pour un ∆m/z
<< 0,01 il s’agit de haute résolution.

En basse résolution les rapports m/z sont souvent exprimés en valeurs nominale. A
l’inverse, les appareils de haute résolution pourront donner les valeurs de rapports m/z au
millième d’unité. Les spectromètres de masses à transformée de Fourrier atteignent des
valeurs de résolution de 1 000 000277. Ces appareils sont dits à très haute résolution, et sont
constitués d’un analyseur par résonance cyclotronique des ions ou d’un analyseur Orbitrap.

Aujourd’hui les spectromètres de masse sont constitués de plusieurs analyseurs

consécutifs séparés par de simple lentilles électrostatiques placées à la suite les unes des

105
autres. Ils impliquent des faisceaux d’ions de faible énergie cinétique (<<100 eV) comme pour
les triples quadripôles (QqQ). Les rôles attribués à ces tandems sont d’identifier les molécules,
d’élucider leurs structures, et de les quantifier en atteignant des limites de sensibilité les plus
basses possibles. Ils permettent de réaliser des analyses MS/MS (MS²) et certains avec les
pièges à ions permettent d’effectuer des analyses séquentielles MSn.

En 1965, K. Jennings a été le précurseur de la spectrométrie de masse en tandem

avec l’activation collisionnelle278. Ensuite, F.W. McLafferty a introduit de nouveaux concepts
comme la comparaison de structures communes pour des ions de même rapports m/z avec
des instruments en tandem pour l’étude de la structure d’ions de très faibles tailles279,280. C’est
en utilisant des instruments à doubles secteurs de géométrie Nier-Johnson, où les rapports
mesurés sont les rapports E/B, que la forme des signaux et des spectres d’énergie cinétique
des ions fragments (IKE: ion kinetic energy) sont alors explorés. Ils ont été ensuite utilisés afin
de comparer les états de transitions des chemins menant aux ions fragments de structures
communes ou isomères, notamment par Beynon et Cooks en 1969281. Finalement, Beynon
282
et Cooks228 ont introduit des instruments à doubles secteurs à géométrie inversée (B/E), et
les spectres MIKE (mass-analyzed ion kinetic energy). A la fin les années 1970 les premiers
instruments commerciaux sont apparus (Varian devenu Finnigan/Thermo et VG devenu
Waters). Ces instruments permettaient d’isoler des ions isobares de petites tailles283 et d’en
étudier leurs structures respectives en utilisant les processus d’activation collisionnels.

Au cours de mes travaux de thèse, j’ai pu travailler sur différents spectromètres de

masse, ayant des spécificités différentes. L’ensemble des analyseurs avec les différentes
théories de bases concernant leurs fonctionnements ne seront pas développés. Par contre,
nous mettrons en valeur les paramètres modifiables importants. Dans un premier temps, nous
nous consacrerons aux analyseurs simples, puis aux analyseurs en tandem.

106
 5.1. Analyseur basse résolution avec balayage de tension

Aucun analyseur simple n’a été utilisé durant ma thèse, cependant les principes de
ces analyseurs doivent être décrits, puisque ce sont les mêmes qui seront utilisés dans les
instruments en tandem (QqQ, QqTOF, LTQ) qui eux ont été utilisés durant mes travaux de
thèse.

5.1.1 Le quadripôle : analyseur de faisceaux d’ions de faible énergie

cinétique

Les analyseurs de type quadripôlaires sont les plus répandus, ils ont été inventés par
Wolfgang Paul en 1953. Un quadripôle est composé de quatre électrodes parfaitement
parallèles (Figure 76) entre lesquelles des potentiels opposés sont appliqués entre deux
électrodes consécutives20. Sur chacune des électrodes est appliqué un potentiel Φ0 (défini
selon l’équation 4):

Eq. 4 : [Φ0 = U± VRF cos(Ωt)]

ou ± signifie seulement une possibilité de déphasage de 180° de la radiofréquence

Figure 76 : Représentation schématique d’un quadripôle de vue latérale et frontale

Sur une première électrode est appliqué un potentiel Φ0 qui est constitué de deux
variables : une tension continue U et une tension alternative d’amplitude VRF. Sur l’électrode
consécutive, est appliquée un potentiel -Φ0. Ces tensions sont référencées à la terre prise
comme 0. Cependant ensuite le référentiel sera changé (donc la valeur de 0), afin de
permettre un transfert des ions vers le détecteur. Ainsi, les molécules chargées vont passer
au travers du quadripôle en parcourant une trajectoire sinusoïdale, sous l’effet du champ
quadripolaire. Lorsque l’amplitude des oscillations se stabilise, les ions entrent en résonnance,
et peuvent sortir de l’analyseur quadripolaire pour atteindre le détecteur.

107
Dans ces conditions un champs quadripolaire est créé, où les ions peuvent être en équilibre,
et traverser entièrement le quadripôle pour en émerger 284,285,286. A l’inverse, d’autres ions ont
des mouvements sinusoïdaux dont l’amplitude diminue ou augmente, entrainant une
neutralisation de la charge sur les électrodes avec lesquelles ils entrent en contact, ces ions
ne peuvent donc plus émerger à l’extrémité axiale de l’analyseur. La résolution des équations
de mouvement d’un ion permet de définir les paramètres de stabilité établis à partir des
équations de Mathieu (non présentées ici). Ces paramètres sont notés : a et q proportionnel
chacun aux rapports zU/m et zVRF/m respectivement. Ainsi, on peut définir des domaines où
les ions m1, m2, m3 et m4 sont stables (Figure 77) et d’autres en dehors des leur frontières, où
les ions sont prématurément éjectés. La stabilité des ions m1, m2, m3 et m4 peut être
représentée sur un diagramme U=f(VRF) où la droite de fonctionnement U/VRF = Cte définie
une résolution donnée. Sur cette droite, les ions m1, m2, m3 et m4 peuvent émerger du
quadripôle uniquement pour les zones de la droite de fonctionnement définies par les
segments de la droite inclus dans chacun des domaines de stabilité des ions. Ainsi, le
quadripôle agit en filtre de masse, il est alors possible de constituer un spectre de masse avec
l’ensemble des ions présents dans le diagramme de stabilité qui peuvent émerger du filtre de
masse. Ces signaux, sont comme des U retournés, dont la largeur est constante quel que soit
le rapport m/z. Aujourd’hui, ils ont une forme quasi-Gaussienne grâce à la présence de pré-
et post-filtres et de lentilles

Figure 77 : A) Domaines de stabilité ddes ions m1, m2, m3 et m4 dans les diagrammes
U=f(VRF), et B) le spectre de masse associé

108
 5.1.2 Le piège à ions linéaire : analyseur par stockage et éjection sélective
d’ions

Le piège à ions linéaire a les mêmes caractéristiques qu’un piège 3D. Ils fonctionnent
tous les deux uniquement avec une tension VRF et une tension continue maintenue nulle.
Néanmoins, celle-ci pourrait être employée pour compenser les effets de la charge d’espace
due au nombre d’ions piégés. Notons que dans le LTQ (Linear Trap Quadrupole) les effets de
charge d’espace sont moindres que dans le piège 3D. Le LTQ peut travailler en basse
résolution avec une éjection résonante (soit quadripolaire soit hexapolaire) qui est radiale (axe
r) alors que dans le piège 3D, elle l’est de façon axiale (axe z). Ainsi en basse résolution, on
passera de la droite de fonctionnement qz (pour le piège 3D) en qr (pour le LTQ) sachant que
qz=-2qr. Toutefois, cela ne change pas les règles de fonctionnement, pour simplifier les
explications uniquement qz sera utilisé. Par ailleurs, l’axe z est employé lors de l’éjection des
ions hors du piège pour les analyser en haute résolution via une C-trap, ou pour les activer
dans une autre cellule d’activation (cellule HCD higher energy collision dissociation).

Le domaine de stabilité de chacun des ions (m1, m2, m3 et m4) peut être représenté
selon des segments de droite se superposant sur l’axe de la tension VRF (Figure 78A), ou ils
peuvent être placés sur la droite de fonctionnement qz (Figure 78B) où les rapports m/z de
ces ions se disposeront, pour une tension VRF donnée, de manière croissante en qz. La valeur
de qz=0.908 correspond à la limite de stabilité et celle-ci correspond à la résonance
quadripolaire, position où les ions seront naturellement éjectés du piège. Avec le piège
commercial LTQ, l’éjection résonante est hexapolaire et a lieu à qz=0,78. Associée à une
diminution de la radiofréquence Ω, l’éjection hexapolaire permet d’accroître la gamme en m/z.
Ainsi pour éjecter par résonance hexapolaire, les ions mi piégés à une valeur de qz,mi donnée
(et inférieure à qz,eject=0,78), il faut augmenter l’amplitude VRF de manière à ce que la valeur
de qz,mi augmente pour tendre vers qz 0.78.

Cette approche permet de savoir si un ion est stable ou pas, mais pas de savoir s’il
est stabilisé de la même manière quel que soit sa position sur son axe de stabilité q z. Par
exemple, pour un nombre constant dans le piège, un ion particulier sera-t-il stabilisé de la
même manière sur une faible ou forte valeur de qz par la force de rappel du champ de
piégeage ? Ainsi, pour une tension VRF donnée, les différents ions m1, m2, m3 et m4, ne seront
pas piégés sur la même position en qz et donc pas de la même manière. La profondeur du
puits de pseudopotentiel (Dz liée à la force de piégeage) varie avec la valeur de qz. Pour les
faibles valeurs de qz, la profondeur du puits de pseudopotentiel est très faible, entrainant une
forte instabilité des ions s’y trouvant dès qu’il y a une charge d’espace. A l’inverse, pour des
valeurs qz plus élevée, le puits de pseudopotentiel est plus profond, les ions y seront donc

109
plus stables. Cependant, dès que les ions arrivent à qz = 0.908 la profondeur du puits s’annule
car c’est à qz = 0.908 que la profondeur du puits de pseudopotentiel est égale à 0 et les ions
sont éjectés. Schématiquement, la profondeur des puits de pseudopotentiels peut se traduire
par des verres de tailles différentes où elle augmente de 0 à 0.908 avant de devenir nulle.
Ainsi, en augmentant de manière régulière la haute tension, il est possible d’éjecter dans
l’ordre des ions m4, m3, m2 puis enfin, l’ion m1 (Figure 78B).

Pour un nombre d’ions donné, les répulsions de Coulomb entre eux, mènent à la
formation d’un nuage de taille bien précise et constante. Les effets de charge d’espace des
ions dans le nuage seront d’autant plus dramatiques que le puits de pseudopotentiel est petit.
Si un ion mi/z lié à cette charge d’espace fait parti des ions les plus proches des électrodes
du piège (par expansion répulsive de la taille du nuage d’ions), il peut alors être éjecté
prématurément si sa position en qz est à 0,78. Son éjection n’a plus lieu sur l’éjection
quadripolaire pour être détecté à mi/z mais est détecté à (mi/z)x(0,78/0,908), faisant apparaitre
des espèces inattendues (pics fantômes). Pour éviter une telle situation le nombre d’ions dans
le piège doit être régulé, en utilisant « l’automatic gain control » (AGC) qui permet de maintenir
constant et pas trop élevé le nombre d’ion injecté dans le piège.

Figure 78: A) Domaine de stabilité ions de masse croissante de m1 à m4 sur l’axe

VRF sachant que la tension continue est nulle, et B) Position de ces ions sur l’axe qz ou la
profondeur des puits sont schématisés par des verres.

Avec ces analyseurs, lorsque l’on étudie des ions possédant de nombreux isotopes
abondants, ils affectent la position de l’ion mono-isotopique d’intérêt. C’est-à-dire que son
rapport m/z est déplacé légèrement vers les plus hautes valeurs de m/z. Afin de pallier à ces
perturbations dues aux charges d’espaces, il est possible de réaliser un mode de balayage «
inverse », nommé « reversed scan » ou « zoom scan » où le premier ion du massif isotopique
éjecté n’est plus l’ion mono-isotopique mais un ion isotope naturel à M+n.

110
5.1.3 L’analyseur temps-de-vol : faisceaux d’ions de haute énergie cinétique, et
analyses sans balayage de champs
L’analyseur à temps-de-vol (TOF) a été décrit en 1948 et exploité commercialement
en 1955287,288. Dans un analyseur TOF, tous les ions mi, quel que soit leurs rapports m/z sont
accélérés par une haute tension Vo pulsée de plusieurs dizaines de kV à la sortie de la source.
Ainsi, tous les ions ont la même énergie cinétique s’exprimant telle que : zeVo=mivi2/2. Les
ions fortement accélérés « volent » au travers du tube de vol selon un même chemin dans le
vide. La longueur de ce tube est calculée par le constructeur, en tenant compte du vide
existant, de manière à ce que la probabilité de collision avec le gaz résiduel soit nulle (que le
libre parcours moyen des ions correspond à la distance entre la source et le détecteur). Dans
ces conditions, ni la dispersion du faisceau d’ions, ni une neutralisation de la charge ou une
dissociation induite par collision peut avoir lieu, ce qui se ferait au détriment de la résolution
et de la sensibilité. Comme les ions mi ont tous la même Ec, leur vitesse vi dépend de la masse
de l’ion considéré [vi=(2zeVo/m)1/2]. Ainsi tous les ions de vitesses différentes arriveront à des
temps différents au détecteur. Les ions les plus légers arriveront ainsi les premiers au
détecteur, et les ions les plus lourds arriveront plus tard.

L’inconvénient majeur des analyseurs de type TOF est que l’ionisation dans la source
peut ne pas toujours se faire en même temps et au même endroit avant l’accélération des
ions ou que, dès la sortie de la source, le transfert des ions conduit à leur dispersion spatiale
qui peut être aggravée par la durée de l’impulsion de la haute tension. La conséquence est
que potentiellement, des ions de rapports masse-sur-charge identiques peuvent présenter
des Ec initiales différentes. Ceci entraine des vitesses différentes ou des distances parcourues
différentes donc des temps de vols différents pour un même ion mi, et donc une dispersion
des mesures de rapports masse-sur-charge ayant pour conséquence une dégradation de la
résolution. Une telle dispersion temporelle est rencontrée lorsque la source d’ionisation est
externe et où les ions sont injectés dans une zone où s’exercera l’accélération pulsée. Afin de
limiter ce phénomène, sur le tandem Qq/TOF que nous avons utilisé, le faisceau d’ions qui
émerge de la cellule de collision et des lentilles qui la suivent, est injecté dans le tube de vol
pour être dévié d’un angle θ < 90° où θ=tangˉ1(vTOF/vfaisc) avec vTOF et vfaisc les vitesses des
ions dans le tube de vol et ceux incidents émergeant de la cellule de collision. Cet angle θ est
aussi celui du tube de vol de Guilhaus289. Cette entrée presque orthogonale permet de limiter
la dispersion spatiale des ions à une dispersion radiale définie par l’angle solide du faisceau
d’ions émergeant des lentilles post-collision. L’avantage des collisions dans cette région
permet une relaxation radiale de l’énergie cinétique des ions mais aussi une meilleure
focalisation dans l’axe des lentilles d’où une amélioration de la résolution du tandem Qq/TOF.
Parmi les différentes modifications instrumentales introduites pour améliorer la résolution de

111
ce type d’instrument, nous nous focaliserons sur celles qui est directement appliquée dans le
cas de l’injection d’ions produits à partir d’une source externe comme l’ESI. Il y a par exemple,
l’introduction d’un miroir électrostatique (nommé réflectron) qui avait été conçu par une équipe
française (Lebeyec et al)290 pour l’étude des décompositions métastables d’ions produits par
désorption laser pour être ensuite appliqué au mode d’ionisation/désorption MALDI et plus
tard pour les sources d’ionisation externe.

Le réflectron (Figure 79) est disposé à l’extrémité du tube de vol, à l’opposé de la

source (ou de la zone d’injection des ions formés dans une source externe). Il est constitué
de lentilles électrostatiques sur lesquelles un gradient de tension est appliqué. Dans le cas de
notre instrument, l’axe du réflectron diffère de celui du temps de vol. Les ions de même rapport
m/z entrent de manière plus ou moins simultanée (dû à la dispersion en Ec) en profondeur
dans le réflectron. Les ions mi de plus grande Ec entrent plus loin dans le réflectron, ou ils
sont ensuite repoussés vers le chemin inverse sous un autre angle et une plus forte énergie
cinétique, alors que ceux ayant une Ec plus faible entrent à peine dans le miroir électrostatique
et en ressortent immédiatement avec une Ec encore plus faible. Ainsi les ions mi ressortent
avec une plus forte Ec mais en retard par rapport à ceux de plus faible Ec. Ces deux paquets
d’ions peuvent alors après un temps de vol arriver en un point commun : une surface
commune perpendiculaire à l’axe moyen du faisceau qui émergea du réflectron. Si en cet
endroit est placé le détecteur, les ions mi ayant subi une dispersion d’énergie cinétique sont
alors détectés en même temps. Comme les ions fragments produits en vol par dissociation
des ions mi sont plus légers que leur précurseur ils vont être plus rapidement éjectés et auront
un temps de vol différent de leurs précurseurs. Le réflectron permet un allongement de la
distance parcourue par les ions dans l’analyseur, ce qui permet en plus de l’effet du miroir
électrostatique, d’augmenter de façon considérable la résolution de 5 000 à 20 000. Ce gain
en résolution se fait du détriment de la gamme de masse utilisable. En effet, les ions de
rapports m/z supérieurs à 3000 m/z ne sont plus détectables par le TOF.

112
 Figure 79 : Principaux composants du système orthogonal TOF (a) en basse
résolution, (b) en mode haute résolution d’après 289

5.1.4 L’analyseur Orbitrap

En 1923, Kingdon291–293 a mis en place les prémices du futur analyseur Orbitrap sous
la forme d’un cylindre, avec à son centre un filament permettant le piégeage des ions. Un
premier champ quadripolaire est créé par le cylindre et un second par le filament central. Ce
dernier champ est inversement proportionnel à sa distance par rapport au filament. Un tel
champ est créé par un potentiel logarithmique dont la dérivée donne l’expression du champ.
Compte tenu des deux composantes du potentiel, il sera considéré comme un potentiel
quadro-logarithmique. En 1981, Knight réalise une modification essentielle sur son
spectromètre de masse, afin d’étudier les ions produits par un laser. Il referme les extrémitées
du cylindre proposé par Kingdon pour permettre la mise en place d’un véritable piège à ions294.
Par la suite, il ajoute un détecteur temps-de-vol au cylindre de Kingdon, pour détecter des
ions éjectés par le piège et de leurs rapports m/z. Au milieu des années 1990, A. Makarov, a
calculé les lignes de potentiel quadro-logarithmique du piège de Kingdon. Au sein de la société
HD Technologies Ltd. (Atlas House, Simonsway, Manchester, M22 5PP, U.K.) il a construit
un piège ayant les formes de ces lignes de potentiels. C’est ainsi qu’est né le piège
électrostatique Orbitrap295 caractérisé par l’absence de tension radiofréquence dont la
première publication est parue en 2000234. Cette nouvelle technologie est constituée
globalement de trois électrodes.

113
L’une est l’électrode centrale, en forme de fuseau imbriqué dans les deux autres, qui sont en
forme de «tonneau creux coupé à mi-hauteur» (Figure 80)234. La forme de ces trois électrodes
vont notamment modifier la façon dont il faut injecter les ions dans un piège sans
radiofréquence de piégeage d’ions : l’Orbitrap296,297,298,299,300.

Figure 80 : Coupe longitudinale permettant la visualisation des électrodes d’un détecteur

Orbitrap

Après injection grâce à une haute tension continue, un paquet d’ions va être piégé. Ils
vont prendre des trajectoires particulières qui peuvent être décrites par deux composantes :
une fréquence ωr dont le mouvement est radial (r) et une fréquence ωz dont le mouvement
est axial (z). La fréquence axiale ωz étant indépendante de l’énergie des ions et de leurs
dispersions spatiales, c’est elle qui sera choisie pour mesurer le courant transitoire. Pour la
mesure d’un tel courant lorsque les ions sont soit d’un côté soit de l’autre, il faut que l’électrode
« tonneaux » soit bien coupée en deux dans son axe. C’est l’origine du choix de la
configuration de ces deux électrodes symétriques. Les ions vont être séparés en fonction de
leurs rapport m/z. Les ions les plus légers ont des forces de répulsions avec les électrodes
supérieures et inférieures plus fortes, ce qui les entraînent au plus proche de l’électrode
centrale et les obligent à parcourir un chemin le long de l’axe z plus important. A l’inverse, les
ions de rapports m/z plus grands, présentent des forces de répulsions plus faibles avec
l’électrode centrale, cela aura pour conséquence des fréquences de mouvements plus faibles
pour ces ions. C’est par ces fréquences de mouvements différentes que le détecteur Orbitrap
permet d’effectuer une séparation des ions en fonction de leurs rapports masse-sur-charge.

En 2005 le premier spectromètre de masse avec la technologie Orbitrap est

commercialisé par l’entreprise ThermoFisher. L’Orbitrap est uniquement un détecteur qui
fonctionne tel un piège à ions, sans radiofréquence, dans lequel les ions se mettent en orbites
à une fréquence spécifique de leur rapport masse-sur-charge. Les ions sont injectés par
paquets dans la cellule et de façon tangentielle à l’aide d’une haute tension. Comme les ions
fragments sont envoyés par paquets, il est nécessaire de les stocker et compresser ce nuages
d’ions en amont : c’est le rôle de la C-Trap. C’est grâce à un vide très poussée, de l’ordre de

114
10-11 hPa, et d’une injection rapide des ions depuis la C-Trap, que l’ensemble des ions restent
stabilisés quelques centaines de millisecondes dans l’Orbitrap. Les fréquences axiales sont
mesurées, elles sont obtenues par l’apparition alternatives des charges induites sur les deux
électrodes qui composent le « tonneau ». L’ensemble des fréquences ainsi obtenues sont
détectées sous forme d’un signal transitoire (de l’ordre de quelques centaines de
millisecondes), qui est d’autant plus long que la pression est faible. Plus ce signal est long
plus la résolution est grande. C’est via la transformée de Fourrier de l’ensemble de ces
fréquences, que l’on obtiendra les rapports masse-sur-charge de chacun des ions constituant
les paquets d’ions stockés dans la C-trap. C’est par ce traitement informatique que cet
analyseur fera parti des instrument FT/MS.

Le critère de Nyquist est à l’origine de la haute résolution que peuvent atteindre les
détecteurs Orbitrap. Il établit que plus le nombre de « points » effectués lors d’une analyse
est grand, plus le calcul de la fréquence est « juste », et plus la précision en masse est
augmentée. Cependant, l’augmentation du nombre de point doit s’accompagner d’une
augmentation du temps de mesure. Généralement, la précision en masse sur ces
spectromètres de masse atteint l’ordre du ppm. Ces détecteurs Orbitrap sont principalement
couplés en tandem. Cependant, il existe également des spectromètres de masse Orbitrap
couplés directement avec une source d’ionisation par électron ou même par électrospray (ce
sont les technologies Exactive, ThermoFisher). Cet appareil, présent au laboratoire n’étant
pas utilisé au courant de ma thèse, il ne sera pas détaillé davantage.

5.1.5. L’analyseur de mobilité ionique

Dans cette partie seront présentés un bref historique concernant le développement

des techniques de mobilité ionique, les principes, les calculs permettant de comparer les
sections efficaces de collisions expérimentales et théoriques, et enfin les techniques de
couplages entre mobilité ionique et spectrométrie de masse. L’ensemble de cette étude
bibliographique concernant la mobilité ionique ne sera pas développé comme je l’ai fait pour
les autres techniques que nous avions utilisées sur notre plateforme. En effet, ne possédant
pas l’instrumentation adéquate nous avons développé une collaboration, au sein de groupes
d’experts, avec dans un premier temps M. Green, J. Ujma et K. Richardson (Waters,
Wilmslow, Angleterre) et ensuite avec D. Ropartz et H. Rogniaux (Plateforme BIBS, INRAE,
Nantes). Ainsi les notions essentielles à la compréhension des résultats obtenus avec ces
nouveaux collaborateurs seront abordées.

115
Historique sur la mobilité ionique : Les fondements de la mobilité ionique sont apparus dès
les années 1900, ou trois grands axes de recherche sont à considérer dans le développement
de cette technique :

1) Au tout début des années 1900, Langevin élabore un travail théorique portant sur
l’ionisation des gaz et sur la théorie cinétique des gaz301. Il met en évidence le rôle des
forces attractives de partenaires sur la section efficace de collision. Il décrit pour la
première fois les interactions ion-molécules et l’influence qu’elles peuvent exercer sur la
mobilité.

2) En 1930 Mitchell et Ridler se consacrent à l’étude de l’influence du champ électrique et de

la pression du gaz tampon sur la mobilité ionique en étudiant la diffusion de cations dans
l’azote302. Leurs études sur la mobilité permettent de définir K la mobilité ionque en fonction
de la relation suivante :

𝐾 = 𝐸⁄𝑁

E : champ électrique, N : densité du gaz

Il est possible de définir différents types de régimes électriques : un régime de faible

champ où K est une constante, et un régime de haut champ où K est dépendante du
champ électrique. En parallèle, à la même période, les premières études portant sur les
innovations techniques, concernant les optiques ioniques et l’amélioration de la détection
des ions voient le jour. Les travaux de Cravath303 et de Van de Graaf en 1926304 sur
l’injection des ions par paquets via l’utilisation de portes à ions (appelées « ion shutters »)
améliorent grandement la technique. En 1935, Bradburry305 développe une technique de
mobilité où il utilise un champ uniforme (c’est-à-dire constant) entre deux plaques.

3) Le développement des instruments de mobilité ionique a lieu 20 ans plus tard,

principalement initié par Mason et Mc Daniel306, qui élaborent ensemble la théorie de
diffusion des ions en phase gazeuse sous l’influence d’un champ électrique. Les premiers
appareils commerciaux ont été développés à partir de leurs travaux. Dans les années
1960 Ferguson développe un instrument à « écoulement d’ions après ionisation »
(« flowing afterglow ») utilisé dans le domaine de l’étude d’atmosphère variées en chimie-
physique. Les développements qui suivent permettent le couplage de la mobilité ionique
avec d’autres techniques de chimie analytique, notamment la GC, la LC et la spectrométrie
de masse. Le premier couplage IMS-MS est réalisé en 1962 par Earl W. Mc Daniel, puis
par les groupes de Ferguson et de Smith dans les années 1970, pour permettre l’étude
des interactions ions-molécules en phase gazeuse307,308. A cette période, la mobilité

116
 ionique est encore nommée « chromatographie plasma »309 (semblable à la technique
« flowing-afterglow »), et prend de l’ampleur, pour l’étude de composés organiques310
comme l’héroïne et la cocaïne311. De plus, l’intérêt croissant des applications militaires
pour cette instrumentation propulse cette technique en avant, notamment puisqu’elle
permet la détection de nombreuses armes chimiques, explosifs, et drogues.

Principe de la mobilité ionique : La mobilité ionique représente la capacité d’un ion M

à se déplacer dans un environnement gazeux, sous l’effet d’un champ électrique E312. L’ion
est entrainé par le champ électrique et est ralenti par les collisions avec le gaz313,314. La
mesure de la mobilité ionique K consiste à déterminer le temps nécessaire pour que l’ion M
traverse un tube de distance L. Classiquement, les paquets d’ions voyagent au travers d’un
tube de dérive, rempli de gaz, sous l’influence d’un champ électrique uniforme, c’est leurs
arrivées respectives au détecteur qui est mesurée selon l’expression suivante :

𝑣 = 𝐾𝐸

Dans cette équation, v est la vitesse de l’ion dans la cellule de mobilité ionique, K est la
mobilité ionique exprimée en cm².V-1. s-1 et E est le champ électrique (eV) appliqué.

Les ions se déplacent à une vitesse constante dans le tube, leurs temps de diffusion
respectifs vont dépendre de leurs sections efficaces de collision, c’est-à-dire de leurs
conformations. Généralement, deux isomères peuvent être séparés en mobilité ionique. Le
moins compact des deux auras a priori un temps de dérive plus élevé que le plus dense. Plus
sa conformation est « ouverte » (volume de plus faible densité) plus sa surface efficace de
collision avec le gaz (appelé gaz tampon) augmente et donc plus l’ion sera ralenti. Le gaz
tampon va ralentir les ions en fonction de leur taille, leur forme, et leur charge. La différence
de temps de dérive des ions peut s’expliquer par la mesure des surfaces de collision efficace
(collision cross-sections (CCS ou Ω)) qui représentent la capacité de chaque ion à subir des
collisions, grâce à la relation de Mason-Schamps315 :

3𝑧𝑒 1 1 2𝜋 1
𝑀𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡é 𝑖𝑜𝑛𝑖𝑞𝑢𝑒 = 𝑥 √( + ) 𝑥 √( ) 𝑥
16𝑁 𝑚 𝑀 𝑘𝑇 𝛺

Où z correspond à l’état de charge de l’analyte ionisé, e la charge de l’électron, N est

la densité du gaz tampon (calculée à partir de la mesure de pression réduite dans le tube de
dérive), m la masse du gaz, M la masse moléculaire de l’ion, k est la constante de Boltzmann,
et T la température du gaz tampon. Cette valeur de CCS (Ω) dépend aussi du gaz tampon
utilisé mais pas de l’instrument316.

117
 Cette relation n’est valable que dans les cas où la masse de l’ion M est plus grande
que celle du gaz317. La valeur de cette section efficace Ω peut être calculée pour chaque
composé, il s’agit d’une propriété intrinsèque de la molécule, qui peut être obtenue à partir
d’une structure théorique (ou validée) de l’ion. Il existe aujourd’hui différents instruments de
mobilité ionique couplés à la spectrométrie de masse. Leurs configurations diffèrent d’un
constructeur à l’autre, et dépendent notamment dans la façon dont le champ électrique et le
gaz tampon sont implantés dans la cellule de mobilité. Tout comme en spectrométrie de
masse, il y a quatre parties essentielles à prendre en compte lors d’une analyse de mobilité
ionique : la source d’ionisation, l’injection des ions dans la zone de mesure de mobilité des
ions, l’analyseur et le détecteur.

Outre l’ionisation à l’aide du Ni318 qui conduit à la formation d’ions radicaux et

63

l’ionisation par transfert de proton, (PTR, proton transfer reaction)319 qui produit de molécules
protonées ou déprotonées (technique dérivant du mode «flowing-after-glow», les modes
d’ionisation les plus courants, combinés aux analyseurs IMS, sont les processus de désorption
par ESI et par MALDI.

L’injection des ions dans le tube de dérive constitue une étape clef dans une
expérience de mobilité ionique. Il est nécessaire que le temps d’injection soit le plus court
possible, afin d’obtenir la meilleure résolution possible du temps de dérive des ions. La
première méthode développée par Brabury-Nielson et Tyndall pour l’injection des ions est la
« porte » à ions. Il s’agit de deux plaques percées, parallèles, avec deux électrodes aux
extrémitées, permettant le piégeage des ions. Lorsqu’un paquet d’ions est formé, le potentiel
de la seconde électrode est annulé, le passage des ions vers le tube de dérive est alors
possible. Cette technique est basée sur l’envoi de paquets d’ions par impulsion contrôlées
dans le temps, selon un cycle pouvant se répéter n fois. Cependant, seule la faible quantité
d’ions stockés entre les deux plaques est transférée vers le tube, les autres ions sont perdus,
cela constitue la limite de la technique. En 1997, Smith320 développe une technique
permettant un gain de sensibilité, où les ions sont piégés dans un système de lentilles co-
axiales dont l’intérieur peut-être décrit comme un entonnoir. Il s’agit d’une alternance
d’électrodes cylindriques sur lesquelles des potentiels opposés sont appliqués, focalisant ainsi
les ions sur leur axe commun, et les injectant dans le tube sans perte notable. En mobilité
ionique, plusieurs types d’analyseurs coexistent, on retrouve notamment les tubes de mobilité
ionique avec un champ électrique homogène (DTIMS Drift time ion mobility spectrometry),
ceux avec un haut champ asymétrique (DMS, FAIMS Field Asymmetric Waveform), et ceux à
champ oscillants (TWIMS Traveling wave IMS ou TWIG), notamment introduits par Waters.

118
 Les analyseurs DTIMS sont composés d’une série d’électrodes cylindriques co-axiales,
séparées par des anneaux isolants où est placée une résistance. Une différence de potentiel
est appliquée sur les deux extrémités du tube de dérive ce qui donne naissance à un champ
électrique faible mais homogène. Le DTIMS mesure un temps de dérive correspondant à la
durée de migration au travers du gaz tampon dont l’ion a besoin pour atteindre le détecteur.
Dans le tube de mobilité ionique la pression en gaz est constante, la vitesse des ions l’est
aussi, c’est pour cela que le temps de dérive des ions peut être mesuré321. Il est possible de
calculer la constante de vitesse des ions injectés ainsi que les sections efficaces de collision
respective des ions vis-à-vis du gaz tampon.

Les analyseurs DMS et FAIMS se développent dans les années 1990 par Buryakov322
ou les ions sont discriminés d’une manière comparable à un quadripôle. Cette technique
fonctionne tel un filtre ionique, permettant la transmission de certains ions ciblés sous l’effets
de paramètres contrôlés. La séparation des ions nécessite l'application sur une surface
(considérée comme une électrode) d'une tension alternative (de l’ordre de 200 mHz) sous
forme d'onde dissymétrique et la mise à la terre de l'autre électrode323. Le principe est
d’appliquer de forts champs électriques oscillants et opposés sur deux électrodes
perpendiculaires à la trajectoire des ions au travers du gaz tampon313. Par ce fait, les ions
oscillent de haut en bas entre les deux électrodes. Le champ appliqué est composé de
portions de champ élevé de courte durée et de portions de champ faible de plus longue durée.
Lorsque le champ élevé est appliqué les ions suivent une trajectoire sinusoïdale, responsable
d’un déplacement des ions d’une électrode vers l’autre. Pour que les ions n’aillent pas sur les
plaques, une tension continue dit voltage de « compensation » CV (compensation voltage)
est ajoutée324. En faisant varier cette tension CV, les ions peuvent, selon leur surface efficace
de collision, émergés du système sans atteindre les électrodes. Une valeur de CV est
appliquée spécifiquement pour une valeur de k donnée, ce qui permet aux ions ciblés de
conserver une trajectoire rectiligne, et de sortir vers l’analyseur. Les ions sont détectés en
fonction de leurs valeurs de CV. Sur ce type d’instrument, les valeurs de CCS ne sont pas
disponibles. Cependant, l’appareil peut être utilisé selon deux modes : le premier consiste à
balayer une gamme de CV afin d’obtenir une empreinte globale des ions présents, ou bien en
sélectionnant un CV d’intérêt, permettant ainsi de réaliser une analyse ciblée325.

119
 Les technologies TWIMS (travelling wave ion mobility spectrometry) fonctionnent selon
un principe similaire aux DTIMS. Le champ électrique va disperser les ions à différentes
vitesses au travers du gaz tampon. Contrairement aux DTIMS, les TWIMS utilisent des
champs oscillants et non des champs électriques uniformes313. Les champs oscillants du
TWIMS peuvent être représentés comme des vagues successives326 (Figure 81). Dans cette
technologie, une série d’impulsions de voltage est utilisée afin de propulser les ions vers le
gaz tampon et au travers de nombreuses collisions. Au fur et à mesure que les vagues passent
le long de l’appareil, les ions « surfent » un certain temps, puis sont entrainés par la vague.
Ce processus est répété, ce qui permet la séparation des ions en fonction de leur mobilité
ionique. Les ions avec une mobilité ionique plus faible seront emportés plus vite que les ions
à longue mobilité ionique, les ions sont détectés en fonction de leurs arrivées au détecteur.
Ces technologies sont développées par la société Waters, le premier TWIMS commercialisé
date de 2006, avec le spectromètre de masse Synapt HDMS (puis les Synapt G2 en 2011 et
les Synapt G2-Si en 2013), et constituent la majorité des cellules de leurs spectromètres de
masse à mobilité ionique327.

Figure 81 : Représentation des vagues successives produites par le champ électrique

oscillant, et du mouvement des ions dans la cellule de mobilité ionique TWIMS326

120
 Les technologies TWIMS peuvent être modifiées, car le TWIMS peut être remplacé
par une cellule de mobilité cyclique (cIM), placée orthogonalement à l’axe principal de
l’appareil, composé de deux zones (Figure 82). La première constitue le corps principal et est
composée de 608 électrodes, la seconde constitue la zone où l’entrée et la sortie des ions est
effectuée. L’avantage qu’offre cette technologie est un allongement du « tube de dérive »,
sans pour autant augmenter la taille de la cellule de mobilité, où les ions peuvent effectuer
autant de tours que nécessaire. L’augmentation du trajet des ions, permet d’accroitre la
résolution en temps de dérive, résultant en une séparation plus efficace de certains
isomères328. Dans ces appareils la résolution augmente, puisqu’elle est proportionnellement
liée à √𝑛 ou n correspond aux nombres des tours dans la cellule de mobilité cyclique. C’est
cette technologie qui a été utilisée durant mes travaux de thèse, en collaboration avec M.
Green, K. Richardson et J. Ujma de la société Waters (Wimslow, UK).

Figure 82 : Schéma de la cellule de mobilité cyclique d’après328

Au départ, le moyen de détection des ions, étaient souvent des plaques de faraday,
où le courant induit par le flux d’ions en fonction du temps était mesuré. A l’heure actuelle, ces
cellules de dérive sont souvent couplées à des analyseurs tels qu’ils ont été décrits
précédemment (TOF, ion trap ou filtre de masse quadripolaires et maintenant Orbitrap)322. Les
premiers couplages IM-MS permettent l’observation de différents conformères, notamment en
ce qui concerne le cytochrome C. Celui-ci après désolvatation est 7 fois chargé et présente 4
conformères une fois désolvaté en phase gazeuse329.

Les couplages IMS-MS permettent de donner une nouvelle dimension à la

métabolomique. En effet, il était jusqu’à présent difficile d’identifier certains métabolites, à
cause de l’existance de nombreux composés isobares ou isomères qui ne pouvaient pas être
distingués malgré les couplages GC et LC316. Le couplage IMS-MS permet la séparation de
ces molécules et leur identification. Pour l’analyse du lipidome, les techniques d’IMS-MS se

121
sont développées et permettent d’améliorer la fiabilité de l’identification des lipides330,
notamment pour les composés isomériques (isomères de positions), ou pour distinguer la
position de doubles liaisons dans des échantillosn biologiques complexes. En effet, à l’aide
des calculs de CCS et de la séparation réalisée en IMS-TOF, il est possible de distinguer des
glycérophosphatydilcholines comme les PC 18:1 (6Z)/18:1(6Z), les PC 18:1 (9Z)/18:1(9Z) et
les PC 18:1 (9E)/18:1(9E)331.

5.1.6. L’analyseur FT-ICR

La spectrométrie de masse à transformée de Fourrier (FT-MS) est apparue au milieu

des années 1970 avec la résonnance cyclotronique des ions (FT-ICR), initiée par Comisarow
et Marshall332,333,332. Il s’agit d’une cellule cubique, installée dans un tube à l’intérieur d’un
champ magnétique de quelques Tesla, initié à l’aide d’un système supraconducteur. Les ions
sont produits via une ionisation par électrons à l’intérieur de cette cellule, et sont piégés par
des plaques opposées. Dans de telles conditions, les ions tournent autour d’un axe dans la
cellule. Dans les années 1985 cet instrument se développe surtout pour la recherche
fondamentale. Dans les années 1990, les instruments ont été suffisamment modifiés pour être
automatisés, et les rendre accessibles à la chimie analytique. Aujourd’hui, les champs des
aimants ont fortement augmenté à 12 Tesla environ et les cellules sont devenues cylindriques.
La résolution de cet appareil se situe au-delà du million pour des rapports masses-sur-charge
aux alentours de 200. Ces instruments se sont démocratisés, les coûts sont amoindris avec
des systèmes récupérateurs d’hélium produit par l’aimant supraconducteur. Ces appareils
sont dédiés à l’analyse des biomolécules quel que soit leurs tailles.

122
 5.2. Les analyseurs en tandem
Pour l’identification de nouvelles molécules et leur caractérisation structurale
notamment en lipidomique, la mesure des rapports m/z des espèces moléculaires chargées
ou de leurs ions fragments impliquent dans le tandem, un dernier analyseur haute résolution.
La haute résolution permet l’attribution plus précise de la composition élémentaire des ions
fragments ce qui facilite l’interprétation des spectres de masse ou des spectres de
fragmentation.

Les ions fragments peuvent être produits à l’aide de plusieurs mode d’activation, nous
nous focaliserons uniquement sur les modes collisionnels d’activation. Les modes comme la
photo-dissociation (IRMPD), le bombardement électronique (EID) ou les autres modes
d’activations plutôt dédiés à l’analyse d’ions multichargés ne seront pas abordés. L’activation
collisionnelle des ions peut se produire de deux manières différentes : le mode resonant et le
mode non resonant qui sont dépendant de l’instrumentation choisie. Il est possible d’activer
les ions après une ou deux collisions (mode non resonant dit « chauffage rapide »), ou après
plusieurs centaines de milliers de collisions (mode resonant dit « chauffage lent »)334.

Activation des ions sous mode résonant : Le mode résonant est le mode d’activation
retrouvé dans les techniques de piégage d’ions (piège à ions et cellule ICR). L’ion sélectionné
est caractérisé par sa fréquence de mouvement propre, ωM pour une valeur de qz,act. donnée.
Cet ion est excité en lui appliquant ωM dont l’amplitude doit être bien inférieure à la profondeur
du puits de pseudo-potentiel afin d’éviter son ejection. Ces collisions sont faiblement
énergétiques, mais plus grandes que les collisions utilisées lors de réactions ions-molécules.
En général lors d’une collision activante, la suivante est souvent désactivante, cela signifie
qu’elle amène l’ion à sa relaxation en Ec et en énergie interne. Cependant, il reste toujours
un résiduel d’énergie vibrationnelle dans l’état fondamental. Au cours des collisions ce résidu
d’énergie vibrationelle va s’accroître, jusqu’au moment où l’énergie interne atteint le seuil de
dissociation de l’ion. La durée de cette opération de collisions multiples atteint une à plusieurs
dizaines de millisecondes. L’excitation avec le mode resonant est donc appelée « chauffage
lent ».

Exemple : Pour un ion précurseur m/z 400, si nous souhaitons détecter un de ces ions
fragments de rapport m/z 85 suite à son activation, il est nécessaire que cet ion soit à une
valeur qz < 0.908 pour que ce dernier reste piégé. Dans les conditions d’activation
recommandée par le constructeur (qz;act = 0.25), l’ion produit, de rapport m/z minimum capable
d’être détecté est défini par l’équation suivante : m = (400/0.908)*0.25 = 111, donc les ions de
rapport m/z < 111 ne peuvent pas être piégé et donc détecté. Ce phénomène est appelé low

123
mass cut off (LMCO). Dans ces conditions, l’ion fragment d’intérêt m/z 85 aura une valeur
qz,m/z 85 de piégeage de 1.17 (i.e., qz = 400⁄85 ∗ 0.25), valeur bien supérieure à 0.908 où
l’éjection naturelle des ions a lieu335. Afin de le détecter, il est nécessaire de le piéger dès sa
formation, il faut alors que sa position sur le diagramme de stabilité soit à une valeur de qz,quad
< 0.908. Pour cela la valeur de qz,act. de l’ion précurseur m/z 400 doit être ramenée à une
valeur plus faible corrélée à celle (qz,m/z 85) imposée pour la détection de l’ion fragment m/z 85.
Si cet ion doit être formé à qz,m/z 85 = 0,85 alors la valeur de qz,act de son ion précurseur m/z
400 devra être égale à 0,18 (résultant de la proportion 85⁄400 ∗ 0,85). Cela signifie que l’ion
m/z 400 est piégé dans un puits moins profond, il est donc nécessaire de réduire l’amplitude
d’excitation de l’ion activé, sous peine de le voir éjecté du puits et de le perdre. En conclusion,
si nous souhaitons voir cet ion fragment de faible rapport masse sur charge, il est nécessaire
de lui donner beaucoup d’énergie interne, il faut donc augmenter son temps d’activation de
10 ms à 100 ms par exemple.

Avantages et inconvénients d’une excitation par mode résonant : Pour finir, il faut
souligner qu’avec le mode résonant ce sont uniquement les processus compétitifs qui peuvent
être mis en évidence. Avec ce type d’analyseur seuls les ions parents sont activés. Les ions
fragments issus de ces ions ont une Ec qui tend vers 0 par relaxation, leurs fréquences de
mouvements sont très différentes de celles de leurs précurseurs (la fréquence d’un ion est
inversement proportionnelle au rapport m/z pour une valeur de qz donnée). C’est pour cette
raison qu’ils ne peuvent pas être excités par la fréquence d’activation des ions parents.
Lorsque des ions fragments de décompositions consécutives apparaissent sur le spectre d’ion
produit à partir d’un ion parent sélectionné, cela signifie que l’énergie interne résiduelle de
l’ion produit de première génération est suffisamment importante pour produire la
fragmentation ou bien, que nous avons affaire à des processus exothermiques223, ce qui reste
rare. C’est pour cela que généralement, il n’y a pas de décompositions consécutives
observées lors d’une analyse MS/MS en mode résonant sur un piège à ions.

Activation des ions en mode non-résonant : Dans le cas du mode d’activation non-
résonant, c’est-à-dire avec un faisceau d’ions traversant la zone de collision, il faut considérer
l’énergie cinétique au centre de masse (ECOM). C’est cette énergie qui correspondra à l’Ec
maximale qui sera convertie en énergie interne, ou en énergie vibrationelle dans l’état
fondamental.

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑖𝑏𝑙𝑒
ECOM = ELAB x ( 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑖𝑏𝑙𝑒 + 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑑𝑒 𝑙′𝑖𝑜𝑛 )

Où la cible est le gaz de collision non réactif

124
 Cette conversion d’Ec en énergie interne sera d’autant plus efficace que la durée de
vie du complexe de collision sera longue. Une collision est efficace lorsque la conversion de
l’Ec en énergie interne est maximale. Cette situation correspond au cas où l’Ec est très faible
(conditions de réaction ion-molécule). Récemment, un modèle simplifié a été proposé336 : ou
il est considéré qu’une collision « n » devient efficace lorsque l’énergie interne acquise
pendant la collision conduit à une constante de vitesse de dissociation de l’ion parent
suffisamment grande pour permettre alors sa décomposition avant qu’une collision
consécutive « n+1 » ne se produise. Ce mode d’activation sera considéré comme un «
chauffage rapide » car il est considéré qu’une ou deux collisions conduisent à une activation
suffisante de l’ion pour que sa fragmentation soit quasi-spontanée. Ce type de «chauffage
rapide» peut se produire à partir de faisceaux d’ions d’énergie cinétique allant de quelques
eV à plus de 100 eV (au-delà les collisions deviennent trop inefficaces) dont la durée de
résidence dans la zone de collision (multipole dit « RF only ») est considérée de l’ordre de 10
à 100 µsecondes337.

Ce même mode d’excitation peut également se produire dans un piège à ions linéaire
(mode HCD). Pour cela, un paquet d’ions sélectionné est injecté et piégé dans la cellule.
L’activation se produit uniquement par la différence de potentiel entre les deux électrodes
d’entrée et de sortie de la cellule. L’excitation dans ce piège n’est plus radiale (mode
d’activation résonant) mais axiale comme pour un faisceau d’ions. Les décompositions
consécutives deviennent alors possibles et une collision efficace peut se produire sur l’ion
fragment de première génération, il n’est donc pas nécessaire d’augmenter la durée
d’activation au delà de 10 µsecondes (valeur prise par défaut)338. L’ion parent et ses ions
fragments sont relaxés en Ec et leurs activations collisionnelle se trouvent fortement réduites.
Cette durée d’activation correspond souvent aux durées utilisées pour la relaxation des ions
dans un piège entre chacune des manipulations des ions (injection, sélection, excitation,
analyse etc…) lors d’analyses par séquence MSn. Notons que dans ce mode non-resonant,
la discrimination en bas rapport m/z due à l’existence du LMCO n’a plus lieu. Un même
comportement est observé pour les ions lorsqu’ils sont activés par collision dans la cellule
HCD ou dans un multipôle (souvent quadripolaire) « RF only », c’est notamment le cas d’un
triple quadripole ou d’un Qq/TOF. Comme la fréquence de mouvement est inversement
proportionelle à la masse, lors de la formation d’un ion fragment, dans un multipôle (ou dans
un quadripôle, ou dans la cellule HCD) sa fréquence de mouvement dans le champ
(quadripôlaire ou multipolaire) est plus grande que celle de son précurseur. Ainsi, le chemin
parcouru par l’ion fragment dans la cellule de collision est plus grand que celui de son
précurseur, donc sa probabilité collisionnelle est supérieure à celle de l’ion précurseur. Si son
énergie au centre de masse est suffisante, une dissociation consécutive spontanée peut se

125
produire. Finalement, ce comportement est différent de celui dans un piège à ions où les
décompositions compétitives sont plutôt mises en évidence.

5.2.1 Le triple quadripôle

Le triple quadripôle (QqQ) a été initié par Yost et Enke en 1979230, il s’agit d’une
association de 3 quadripôles montés en série : Q1, q2 (cellule de collision) et Q3 entre
lesquels se trouvent des lentilles optiques (Figure 83). Cet analyseur est un outil de choix pour
la mesure quantitative de composés d’origine biologique. Le triple quadrupôle peut être utilisé
selon plusieurs modes d’acquisitions20, pour mettre en évidence des réactions du type :
spectre d’ions produits à partir d’un précurseur, spectre d’ions précurseurs à partir d’un ion
fragment, ou spectre de perte de neutres constantes.

Figure 83 : Représentation schématique d’un analyseur en tandem triple quadripôle

Dans un spectromètre de masse triple quadripôle, les ions sont accélérés en sortie de
source (tension souvent référencée à la terre T0) et sont accompagnés jusqu’au détecteur par
le simple accroissement des référentiels T(1) et T(3) (en valeurs absolues) de U(1) et VRF(1) de
Q1 et de U(3) et VRF(3) ; de Q3 en considérant que les ions émergent aux bonnes tensions U(i)
et VRF(i) à chaque correspondance.

Spectre de masse sur un QqQ : Afin de réaliser un spectre de masse sur un instrument
de type triple-quadripôlaire il faut réaliser un balayage des tensions U et VRF soit du filtre de
masse Q1 soit de Q3. Pour cela les quadripôles fonctionnent en mode « RF only », pour
seulement transmettre les ions d’une zone à une autre. Lors de l’utilisation en filtre d’ions Q1
(avec des valeurs fixes de U(I) et VRF(I)), alors ce quadripôle permet de sélectionner un ou
plusieurs ions spécifiquement, selon leurs valeurs de rapports masses-sur-charges. Un
transfert des ions de la source qui correspondent aux ions précurseurs sélectionnés selon
leurs rapports m/z est effectué dans Q1. Les quadripôles q2 et Q3 sont alors « transparents
», c’est-à-dire que seule la tension VRF est utilisée, ils servent uniquement à transmettre les
ions : ce sont des filtres de masse. Cette étape permet d’obtenir un spectre de masse de tous

126
les ions précurseurs à partir de l’échantillon ionisé et émergeant de la source. De la même
manière, lorsque l’on utilise Q3 plutôt que Q1 pour effectuer un spectre de masse alors c’est
Q1 et q2 qui sont « transparents » servant uniquement à transmettre les composés ionisés
vers Q3.

Spectre d’ions produits sur un QqQ : les ions sélectionnés M en Q1 (U(1)M et VRF(1)M)
fixés pour le rapport m/z de l’ion M choisi sont focalisés et transférés vers la cellule de collision,
ou se produisent les collisions qui activent les ions afin de les dissocier. Elles sont produites
par un gaz inerte, ainsi les fragmentations ont lieu par un processus de « dissociation induite
par collision » (collision-induced dissociation, CID). L’énergie de collision (ELab) est définie par
la différence de potentiel de référence du quadripole q2 de celui de la source (qui est nul - la
terre). Les ions fragments ainsi formés sont transmis vers le filtre de masse Q3 qui sert
uniquement à détecter les ions fragments produits.

Cette méthode de collisions activantes (mode non-résonant) repose sur la probabilité

de collision entre les ions et les atomes de gaz. Cette collision, si elle est efficace, va induire
une conversion partielle de l’énergie translationnelle en énergie vibrationnelle. Lorsque celle-
ci dépasse le seuil énergétique de dissociation alors, l’ion précurseur se fragmente en ions
produits. La fragmentation d’un ion peut se faire à plusieurs niveau d’énergie de collision :
haute (de l’ordre du KeV) ou basse (de l’ordre de la centaine d’eV). En ce qui nous concerne
et avec les instruments employés, seules les collisions sous faible énergies ont été utilisées
(puisque nous n’avons pas utilisé de tandem TOF/TOF ou le mode d’activation EID).

Mode d’acquisition Selected/Multiple reaction monitoring sur un QqQ (Figure 84) : A

partir du tandem QqQ, l’acquisition d’une seule transition correspondante aux rapports m/z
d’un précurseur en Q1 et de son ion fragment associé, généralement l’ion le plus intense est
possible. Pour cela, les tensions de balayage utilisées permettent le mode « selected reaction
monitoring » (SRM). A l’inverse, pour la recherche de plusieurs transitions d’ions fragments
produits pour un même précurseur, le mode MRM (multiple reaction monitoring) qui permet le
passage d’une transition à une autre est utilisé. Pour cela les tensions U et VRF de Q3 ne sont
pas balayées mais sont « sautées » d’un couple de tensions (U/VRF) spécifique, à un autre ce
qui permet de « passer » d’une transition à l’autre pour un même précurseur. Dans ce mode
d’acquisition, le dernier quadripôle (Q3) permet de séparer et transmettre en tant que filtre de
masse les ions produits sélectionnés vers le détecteur. Ce quadripôle aura également sa
valeur de tension de référence qui « flottera » de la même manière que celle de Q1 et q2. Le
choix des rapports m/z des ions fragments détectés lors d’une analyse SRM ou MRM est
réalisée en fonction de l’abondance des ions produits. C’est la transition la plus abondante qui
sera sélectionnée, et demandée au spectromètre de masse de rechercher en mode SRM. Ce

127
mode d’acquisition est spécifique puisqu’il ne demande pas un balayage complet sur une
gamme de tension. En effet, seules les tensions correspondanteds aux rapports m/z
demandés par l’utilisateurs seront balayées. Ainsi, ils offrent l’avantage d’un temps de
balayage par transition beaucoup plus long, permettant d’augmenter la sensibilité de ce type
d’analyseurs, et donc d’abaisser la limite de détection de certains analytes. Ce mode
d’acquisition a été utilisé durant mes travaux de thèse.

Figure 84 : Représentation schématique du mode d’acquisition SRM, sur un

analyseur triple quadripôle

Mode d’acquisition « precursor ion scan » sur un QqQ (Figure 85) : Il s’agit d’un spectre
d’ions précurseurs issus d’un ion fragment constant. Il permet de sélectionner dans Q3 un ion
fragment (en fixant un couple de tensions U/VRF), généré dans la cellule de collision. Tous les
ions précurseurs possibles entrent dans Q1 par balayage continu des tensions U/VRF, ils vont
tous être expulsés consécutivement vers q2, où ils sont tous fragmentés. Ainsi quand un ion
précurseur se fragmente en donnant l’ion sélectionné dans Q3, alors celui-ci sera détecté en
sortie.

Le détecteur ne détecte donc que l’ion fragment sélectionné. La terre pourra « flotter »,
de la même manière que dans le mode d’acquisition MRM. Ce mode d’acquisition permet de
détecter l’ensemble des ions fragments de structure commune ou isomères (voire même
isobares) ayant un enchainement d’atome identique au sein de leurs structures. C’est les
couples de tensions U/VRF, qui sont mesurés à chaque fois qu’un signal est enregistré au
détecteur. Ce sont ces couples qui permettent de remonter à la valeur des rapports m/z des
ions précurseurs. Ce mode d’acquisition a été utilisé à de nombreuses reprises durant mes
travaux de thèse.

128
 Figure 85 : Représentation schématique du mode de balayage « Precursor ion
scan », sur un spectromètre de masse triple quadripôle

Mode d’acquisition perte de neutre sur un QqQ : le mode d’acquisition « neutral loss »
(NL), conduit au spectre de neutre constant, qui est basé sur la perte fixe d’un neutre associé
à l’ion précurseur. Ce mode de balayage est une combinaison des deux modes détaillés
précédemment. Sur Q1 et Q3, l’ensemble des couples de tensions U et VRF sont balayés avec
un décalage de la masse du neutre étudié. Ce mode de balayage est nommé « linked-scan »
ou mode de balayage lié. Ce mode d’acquisition permet de détecter l’ensemble des ions
parents ayant perdu une même neutre. Il peut être utilisé afin de rechercher des molécules
ayant des chemins de fragmentations communs. Ce mode de balayage a été utilisé pendant
mes travaux de thèse.

L’analyseur triple quadripolaire est l’analyseur le plus répandu en spectrométrie de

masse pour la quantification des métabolites, car il est très sensible et qu’il possède une large
gamme linéaire. Il est utilisé couramment en toxicologie et en pharmacologie. Il offre via ses
différents modes de balayages tout un panel d’informations. Toutefois, certaines limites sont
quand même bien présentes, puisqu’il s’agit d’un appareil à basse résolution. L’analyseur
triple quadripôle ne permet pas d’effectuer des mesures de m/z précises, ce qui limite ses
applications pour l’identification et la caractérisation de nouveaux marqueurs ou composés
présents dans une matrice biologique complexe.

Le laboratoire est équipé de deux spectromètres de masse à basse résolution LC-

QqQ : le premier est un spectromètre de masse Agilent K6460 (acheté en 2010), le second
est spectromètre de masse Shimadzu 8060 (acheté en 2020), équipé d’une source Mikros ou
le couplage avec la micro chromatographie liquide est possible, pour permettre un gain de
sensibilité. Dans les instruments à faisceaux d’ions que nous avons utilisés (QqQ et Qq/TOF),
l’activation collisionnelle d’ions sélectionnés a été faite dans des cellules de collision
multipolaire « RF only » pour le mode non-résonant.

129
 5.2.2 L’hybride quadripôle – temps-de-vol (QqTOF) : analyse en haute
résolution des ions produits

Le spectromètre de masse hybride quadripôle temps-de-vol (Qq/TOF) est constitué

d’un premier quadripôle (Q1, filtre de masse), d’une cellule de collision (q2, RF only), et d’un
analyseur temps-de-vol276. La sélection des ions d’intérêts est effectuée dans le premier
quadripôle pour être transférés dans la zone d’activation collisionnelle. Les ions activés se
dissocient dans la cellule de collision q2. Notons que la zone qui suit la cellule de collision,
permet d’obtenir une focalisation résultant en un angle plus étroit, permettant une diminution
de la dispersion axiale à partir de là où le faisceau d’ions est injecté dans la zone où l’impulsion
haute tension orthogonale dite « push-out pulse » se produit. Elle permet d’accélérer le paquet
d’ions selon un axe orthogonal à l’injection du faisceau émergeant de la source ESI, pour
« voler » vers le réflectron. Les ions après le premier trajet entrent dans le réflectron où ils
sont réfléchis selon des vitesses : soit légèrement différentes pour les refocaliser en temps,
afin d’arriver ensemble au détecteur, soit très différentes pour séparer en temps les ions
précurseurs et les ions fragments formés en vol dans la première région libre de champs (zone
avant le réflectron).

L’analyseur temps-de-vol ne permettant pas naturellement la sélection d’un ion parent,

le seul mode d’acquisition possible pour une analyse ciblée (mode MS/MS) est la sélection de
l’ion parent en Q1276. Un tandem hybride Qq/TOF possède une résolution avoisinante les 20
000, pour des m/z de 400. Il est couramment utilisé pour les analyses globales en lipidomique
et pour la recherche de nouveaux composés en vue de leurs élucidations structurales.

Le laboratoire est équipé d’un spectromètre de masse Qq/TOF, Xevo G2-XS (Waters,
Figure 86). Il est équipé d’une source ESI en Z spray, d’une zone de désolvatation
« stepwave » qui permet de désolvater les agrégats chargés et d’éliminer les molécules non
ionisées dans la source, les dernières traces de solvants ou de sels. L’instrument est ensuite
équippé d’un quadripole (nécessaire pour le mode d’acquisition TOF-SRM ou MRM), d’une
cellule de fragmentation de type XS et d’un détecteur de type QuanTOF. La cellule de collision
retrouvée dans cet instrument, la XS collision cell, est un quadripôle segmenté, constituée
d’une association de 37 petits quadripôles de 4mm, avec un espace d’un mm par segment,
pour une longueur totale de 184 mm. Dans cette cellule segmentée un gradient de courant
continu est appliqué, permettant d’attirer très rapidement les ions vers le TOF.

Ce spectromètre de masse permet l’acquisition selon plusieurs modes de balayage :

le mode MSE en est une spécificité. Il correspond au mode de balayage couramment appelé
« data independant acquisition » (DIA). Dans cette configuration l’ensemble des ions de m/z

130
différents entrent dans la cellule de collision, et sont fragmentés sans distinction. Les ions
fragments produits sont envoyés à l’analyseur QuanTOF. Un spectre moyennant les ions
précurseurs et leurs ions fragments produits est obtenu. D’autres types d’acquisition sont
possibles : un balayage des m/z des ions précurseurs ou le mode TOF-MRM, où un ion est
sélectionné spéciquement dans Q1, envoyé dans q2 et ensuite dans le TOF. Ce mode
d’acquisition permet un gain de sensibilité puisque seuls les ions sélectionnés sont analysés
par le spectromètre de masse, évitant ainsi un balayage sur une large gamme de m/z.

Figure 86 : Représentation schématique d’un Q-TOF Xevo G2-XS Waters et de sa cellule

de collision segmentée XS Collision Cell339

131
 5.2.3 Les analyseurs Orbitrap en tandem : le Q-Exactive Plus et Linear Trap
Quadrupole Orbitrap VELOS
Aujourd’hui les spectromètres de masse constitués d’une source API et d’un analyseur
très haute résolution tel que l’Orbitrap sont couplés à d’autres analyseurs pour en faire des
tandems. Ce sont des instruments hybrides comme le Q-Exactive Plus et le Linear Trap
Quadrupole (LTQ) Orbitrap Velos. Au cours de mes travaux de thèse, j’ai été amenée à utiliser
ces deux spectromètres de masse. Le Q-Exactive Plus est composé après la source API,
d’une lentille dite « S Lence » permettant une meilleure désolvatation des agrégats chargés
et une meilleure focalisation du faisceau d’ions. Celui-ci sera injecté dans un guide d’ions
courbé (Advanced Active Beam Guide AABG), afin de réduire le bruit de fond lié aux
rayonnements des ions excités naturellement. L’AABG permet également d’éliminer des
molécules neutres non ionisées dans la source. Par la suite, se trouve un quadripôle
(HyperQuad Mass Filter) hautement sensible, avec en amont un préfiltre et en aval un post-
filtre, permettant ainsi une meilleure focalisation des ions émergeant dans l’axe du quadripole.
A la suite de l’HyperQuad Mass Filter se trouve la C-Trap qui permet de compacter les paquets
d’ions comme décrit précédemment. Depuis la C-Trap deux actions sont possibles : soit
d’envoyer vers l’analyseur Orbitrap un paquet d’ions émergeant de la source afin d’enregistrer
un spectre de masse en très haute résolution, soit de transférer le paquet d’ions depuis la C-
trap vers la cellule de collision HCD afin de produire les décompositions issues d’un ion
sélectionné dans l’HyperQuad. Après dissociation les ions produits peuvent être recompactés
dans la C-Trap afin d’être envoyés à l’analyseur Orbitrap. Dans les technologies VELOS et
QExactive Plus la taille de l’analyseur Orbitrap est de 3 cm, contrairement aux technologies
FUSION ou ELITE qui ont des analyseurs Orbitrap de 2 cm permettant une meilleure
résolution en masse. L’ensemble de ces opérations de manipulations de paquets d’ions se
déroulent en faisant « flotter » la terre de chacun des éléments du spectromètre de masse
afin de diriger les ions dans un sens ou dans l’autre (Figure 87).

132
 Figure 87 : Représentation schématique d’un spectromètre de masse Q-Exactive Plus
Orbitrap

Le LTQ-Orbitrap VELOS (Figure 88) est équipé d’une source API, de S-Lens, d’un
quadripôle parrallélépipédique à sections carrées (« Square quadrupole ») ayant le même rôle
qu’un quadripôle de transfert mais plus facile à usiner ce qui amoindri son coût. A la suite de
ce quadripôle se trouve un octopole permettant un transfert des ions vers le VELOS constitué
de deux LTQ consécutifs. Le premier sous haute pression, constitue la zone d’excitation
résonante et permet de produire la dissociation des ions. Le second LTQ sous plus basse
pression permet notamment une meilleure analyse des ions lors de leur éjection radiale afin
d’obtenir des spectres basse résolution, mais qui restent limités par le LMCO. A la sortie du
LTQ se trouve un second octopole premettant de focaliser et transmettre les paquets d’ions
vers la C-Trap. Les paquets d’ions peuvent suivre deux chemins à la sortie de la C-Trap,
l’activation non-résonant par HCD ou l’analyse HR directe par l’Orbitrap.

Figure 88 : Représentation schématique d’un spectromètre de masse VELOS couplé à un

analyseur Orbitrap

133
 Aujourd’hui le tandem VELOS-Orbitrap n’est pratiquement plus développé au profit du
spectromètre de masse Fusion qui possède un quadripôle suivi d’une C-Trap, d’une cellule
de collision multipolaire HCD, et d’un double piège VELOS. L’avantage de cette configuration
est de permettre à partir des fragmentations en HCD de réaliser des analyses en basse
résolution vers le piège, tout comme en haute résolution vers l’analyseur Orbitrap. La
proximité de la cellule mulipolaire HCD (non résonant) et du VELOS (résonant) permet les
opérations alternées d’isolement et d’activations d’un piège à l’autre.

5.2.4 Séquence de balayage pour les expériences MSn à l’aide d’un piége
à ions
Le principe de la MS/MS avec un piège à ions est le même qu’avec des tandems à
faisceaux d’ions. La différence est que, dans ces derniers les ions traversent une cellule de
collision, alors que dans les pièges à ions, ils sont stockés et manipulés (sélectionnés /activés/
éjectés) par des séquences temporelles et non plus spatiales. Ainsi pour une séquence MS3,
il s’agira d’ajouter une séquence MS à l’expérience en mode MS/MS.

Après un premier balayage permettant d’enregistrer le spectre de masse, un ion

d’intérêt est choisi, puis l’ensemble des ions est réinjecté dans le piège à ions. L’augmentation
de la tension VRF permet d’éjecter l’ensemble des ions de rapports m/z plus petits que celui
de l’ion d’intérêt. Lorsque ce dernier se retrouve à la limite de l’éjection quadripolaire
(profondeur nulle du puits de pseudopotentiel) ou hexapolaire, une haute tension VRF est
appliquée en sens inverse afin de ramener l’ion à la valeur de qz où se fera ensuite son
activation (qz = 0,25). Toutefois, il existe des ions de rapport m/z plus intenses (comme par
exemple ses isotopes naturels). A la valeur de qz < 0,25 (dont la valeur dépend de celle de
l’ion mono-isotopique correspondant), une radiofréquence dipôlaire de forte amplitude est
appliquée, pour permettre aux ions stockés non-souhaités, d’être éjectés du puits de
pseudopotentiel. Cette étape constitue l’isolement de l’ion d’intérêt. Celui-ci, afin d’être
fragmenté peut alors être activé, via l’application de sa fréquence de mouvements à la valeur
de qz=0,25. A ce moment-là, l’amplitude du mouvement de l’ion va augmenter, sans pour
autant modifier sa fréquence, seule son énergie cinétique augmente. Cette étape est
importante et constitue l’activation de l’ion d’intérêt. Une fois activé, cet ion se dissocie en ions
fragments de rapports m/z plus faibles, dont la partie en dessous des valeurs de qz = 0,908
peuvent rester stockés dans le piège à ions. Les autres ions fragments, ayant une valeur de
qz > 0,908 seront éjectés directement. Une augmentation de la valeur de VRF permet alors
d’éjecter du puits de pseudopotentiel l’ensemble des ions fragments ayant été stockés. C’est

134
l’ensemble de ces étapes qui produisent une séquence MS/MS. Pour effectuer une MS3 ou
une MSn il suffit de répéter ces opérations 3 ou n fois en réinjectant préalablement des paquets
d’ions après analyse des ions fragments de l’étape (n-1) pour choisir l’ion fragment qui
deviendra un ion sélectionné. Entre chacune des manipulations ainsi effectuées lors d’une
séquence MSn, il est nécessaire de relaxer en énergie cinétique les ions parents survivants et
les ions fragments produits pour permettre aux ions de se retrouver focalisés au centre du
piège, c’est-à-dire au fond du puits de pseudo-potentiel. Cette étape est nécessaire pour ne
pas risquer de perdre des ions qui seraient ainsi éjectés du puits de Dehmelt via des champs
non linéaires et pour pouvoir appliquer efficacement la fréquence calculée par l’ordinateur
puisque la fréquence des ions diminue lorsqu’ils s’écartent de ce centre et que l’excitation
résonante devient plus ou moins efficace.

135
Chapitre IV : La spectrométrie de masse en lipidomique et les
différentes types d’analyses possibles

Le lipidome est complexe et constitué d’un grand nombre de molécules aux propriétés
physico-chimiques différentes, présentes à des quantités très différentes selon les
échantillons. C’est pour cela que plusieurs types d’analyses coexistent en lipidomique : les
analyses globales, les analyses ciblées et les analyses semi ciblées.

1. Les analyses globales

Les analyses de lipidomique dites « globales » ont pour but de détecter le plus grand
nombres d’espèces moléculaires lipidiques possible dans un seul et même extrait340.
Malheureusement, les protocoles utilisés pour la préparation des échantillons, souvent les
protocoles de Bligh & Dyer183 ou Folch187, ne permettent pas d’extraire l’entièreté du lipidome,
et donc certains lipides minoritaires ne seront pas détectés lors des analyses. C’est le cas par
exemple des métabolites des acides gras polyinsaturés.

Il s’agit d’une analyse sans a priori sur la composition lipidique de l’échantillon. Ces
analyses sont peu sensibles et ne permettent pas d’effectuer une quantification absolue de
chaque composé. La capacité de chaque molécule à s’ioniser étant différente (même au sein
d’une même sous famille), l’analyse quantitative est extrêmement compliquée lorsque les
standards primaires de toutes les molécules recherchées ne sont pas disponibles et injectés
en même temps. Seules les analyses en quantification relative (par rapport au standard
interne) sont possibles lors des analyses globales. Dans certains cas, il est possible de
réaliser des analyses semi-quantitatives, si lors de l’extraction des échantillons, un standard
interne de chaque classe lipidique est ajouté.

Lors d’une analyse globale, le spectromètre de masse réalise un balayage de

l’ensemble des composés sur une large gamme de masse allant de m/z 300 à m/z 12000. Les
spectromètres de masse équipés d’un analyseur TOF ou Orbitrap sont les plus adaptés pour
la mise en place d’une analyse globale, car ils disposent d’une large gamme dynamique. De
manière générale, une haute résolution est nécessaire pour ce type d’approche, c’est pour
cela que des méthodes d’analyses globales sont également réalisées sur des appareils
équipés d’un détecteur Orbitrap, où la résolution et la sensibilité sont plus élevées341. Au
laboratoire, une méthode de lipidomique globale par analyses Qq/TOF a été développée180.

136
 Ces études de lipidomique globales permettent d’obtenir une empreinte des lipides
majoritaires d’un échantillon, qui sont en général comparées en aveugle à l’aide de méthodes
statistiques poussées, permettant de mettre en avant les différences entre plusieurs
échantillons. Les ions discriminants sont ensuite annotés, ce qui est très chronophage et
compliqué à mettre en place. Cette approche est très développée en métabolomique,
notamment via la mise en place de logiciels et d’outils informatiques permettant de faciliter le
retraitement des données. L’application de ces workflows à la lipidomique reste très difficile,
cette solution est peu utilisée à l’heure actuelle en lipidomique.

Il est en général préféré de confronter les différents profils lipidomiques obtenus à une
banque de données (maison, ou disponible en ligne). Cette base de données est
généralement théorique, car les standards primaires ne sont pas toujours disponibles. Les
spectromètres de masses commercialisés aujourd’hui sont équipés d’outils permettant
d’interroger des banques des données immédiatement à partir des données de sortie du
spectromètre de masse, c’est le cas par exemple de UNIFI, le logiciel développé par Waters.

2. Les analyses semi-ciblées

Les analyses semi-ciblées en lipidomique, se focalisent sur certaines familles en

utiisant une préparation d’échantillon et un mode de balayage spécifique sur les instruments
de type triple quadripôle. Les analyses permettent de détecter des espèces lipidiques de
certaines classes de molécules uniquement par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
Les analyses peuvent être effectuées selon deux modes de balayage : le mode MRM, ou le
mode perte de neutre (NL) car certains ions fragments produits ou pertes de neutres sont
spécifiques d’une classe de lipides. Par exemple, pour l’analyse des glycérophospholipides,
le fragment majoritaire détecté correspond à la perte de la tête polaire (par exemple : sérine,
choline, inositol). Il est ainsi possible de programmer des transitions MRM pour ces
composés3,342 et ainsi d’analyser spécifiquement ces familles

Cette méthode d’analyse, est généralement développée sur des spectromètres de masse de
type triple quadripôle, puisque ce sont les seuls capables d’effectuer des balayages de pertes
de neutres, et parfois sur des appareils de type Qq/TOF qui possèdent, tout comme les QqQ
des modes de balayages MRM.

137
 3. Les analyses ciblées

Les analyses ciblées en lipidomique, permettent de détecter spécifiquement certaines

molécules peu abondantes et de les quantifier343. Ces études sont effectuées avec un a priori
des espèces lipidiques attendues (puisque seule une classe de lipides est recherchée
spécifiquement à l’aide de ces analyses). Dans un premier temps, les lipides d’intérêt sont
extraits spécifiquement à l’aide d’une méthode d’extraction dédiée. Cette approche est basée
sur des analyses MS/MS, généralement effectuées à l’aide de spectromètre de masse triple
quadripôle, en utilisant le mode de balayage MRM. Lors de ces analyses, chaque ion
précurseur et son ion fragment majoritaire sont recherchés spécifiquement, ces transitions
sont spécifiques à chaque analyte. L’utilisation de ce mode de balayage permet de diminuer
le bruit de fond et d’accroitre la sensibilité de détection des analytes. Ainsi, grâce à une
analyse ciblée, il est possible de détecter spécifiquement certains métabolites, en atteignant
des limites de détection basses de l’ordre de quelques picogrammes179,191.

4. La quantification en lipidomique

La spectrométrie de masse n’est pas un bon outil pour la quantification, car chaque
molécule analysée présente sa propre efficacité d’ionisation, qui peut être est très différente
d’une espèce moléculaire à l’autre, même pour deux composés structuralement proches. Des
gammes de calibration doivent donc être réalisées pour chaque composé que l’on souhaite
quantifier. Ces gammes sont réalisées avec les standards primaires des analytes à analyser
en utilisant des concentrations croissantes de métabolites, injectées en même temps, et, dans
les mêmes conditions expérimentales. C’est la réalisation de cette gamme de calibration
uniquement, qui permet d’effectuer une quantification absolue des analytes. L’ajout d’un
standard interne est nécessaire afin de limiter les interférences dues au spectromètre de
masse. En lipidomique, il est possible d’effectuer une quantification absolue, notamment pour
les stérols, les acides gras, les acides biliaires344, les oxylipines179 ou les bases sphingoïdes.

Lorsque les standards primaires des molécules ne sont pas disponibles commercialement ou
ne peuvent pas être synthétisés, il est possible d’effectuer une quantification relative. Celle-ci
permet, de comparer l’abondance des lipides présents dans l’échantillon entre eux, en
corrigeant leurs abondances respectives par celle du standard interne. C’est notamment le
cas pour le dosage des lipides complexes ou particuliers comme les phospholipides et les
sphingolipides.

138
 5. Le niveau d’identification en lipidomique

En lipidomique, il existe 4 niveaux d’exigences permettant de classer les molécules

identifiées et les molécules non identifiées. En réalité ce sont les règles de la
métabolomique345 qui sont appliquées à la lipidomique. Actuellement, des groupes de travail
comme par exemple le Lipidomics Standards Initiative Consortium et la société internationale
de lipidomique essaient de faire évoluer ces différents niveaux d’identification afin qu’ils soient
spécifiques à la lipidomique346,347.

Le premier niveau d’identification correspond aux composés totalement identifiés.

Pour qu’un composé puisse être considéré comme identifié, il est nécessaire qu’il soit validé
par a minima deux critères orthogonaux et indépendants d’identification et qu’il soit comparé
à la molécule pure. Dans ce premier niveau d’identification, il est nécessaire de distinguer les
isomères S et R pour un composé identifié. Pour les lipides il sera nécessaire d’avoir les
informations sur l’isomérie trans et cis, ainsi que sur la position de la double liaison. Il faut
donc par exemple, être capable de comparer son temps de rétention en LC ou GC ainsi que
ses ions fragments obtenus en MS/MS à ceux d’un standard synthétisé, analysés tous deux
dans les mêmes conditions expérimentales. En effet, la comparaison avec des données
retrouvées dans la littérature ne permet pas de confirmer l’identification du composé345.
Certains composés qui ont été identifiés pendant ma thèse sont identifiés avec ce premier
niveau d’identification.

Le second niveau d’identification correspond aux composés putativement annotés. Il

s’agit en général de composés pour lesquels certaines annotations sont très probables, mais
pour laquelle le standard n’est pas disponible commercialement ou que sa synthèse est
difficile. Il est possible d’annoter ces fragments à partir d’une banque de données, ou de mener
l’étude « à la main » par les expérimentateurs. Une identification de niveau 2 correspond
également à une identification à partir d’une banque de donnée externe au laboratoire. Par
exemple, dans ce niveau d’identification se retrouvent les composés dont l’isomérie (R ou S)
n’est pas connue, comme le 13(R)-HODE et le 13(S)-HODE345. Certains composés qui ont
été identifiés pendant ma thèse sont identifiés avec ce second niveau d’identification.

Le troisième niveau d’identification correspond aux composés dont l’annotation est

incomplète, ou lorsque plusieurs annotations sont proposées. Par exemple, en lipidomique
c’est le cas pour les acides gras polyinsaturés lorsqu’ils sont analysés en LC-(ESI)-MS, ils ne
se dissocient pas sous excitation collissionnelle en ions fragments produits. Nous obtenons
alors un unique ion fragment correspondant à la chaine alkyle de l’AG. Avec cette méthode il
est alors impossible de déterminer la position de la ou des doubles liaisons, ce qui rend

139
plusieurs annotations (structures) possibles pour un seul et même ion fragment (ou précurseur
s’il ne s’agit que d’un AGI)345. Cependant, les informations dont nous disposons nous
permettent de classer le composé dans une famille chimique. C’est le cas pour les composés
identifiés dans ma thèse, possédant une insaturation sur la chaine carbonée : bien que
l’annotation soit très probable et que la famille dont fait parti le composé est connu, les
lipoaminoacides identifiés ont un niveau 3 d’identification.

Enfin, le dernier niveau d’identification correspond à un composé inconnu. Les

informations à notre disposition ne nous permettent pas de conclure sur la nature, la famille
ou la structure du composé.

Les règles proposées par la société internationale de Lipidomique sont différentes347.

Elles permettent d’identifier les composés selon huit niveaux d’identification. Le niveau le plus
bas d’identification est lorsque la composition élémentaire de la molécule est connue. D’autres
niveaux sont plus spécifique à l’annotation en lipidomique, comme le niveau d’identification
correspondant à l’annotation des phosphates (utilisée pour l’annotation des PIP2, PIP3 par
exemple). Un autre niveau d’identification est quant à lui dédié à la position de la liaison sn
(pour les glycérolipides et les TAG par exemple), un quatrième niveau d’identification est
spécifique à la position de la double liaison sur la chaine d’acide gras (comme par exemple
pour les AG bactériens). Un cinquième niveau d’identification est spécifique aux composés
ayant une identification de l’ensemble des ions fragments d’intérêt, excepté pour la chaîne
d’acide gras (par exemple pour un C12:1Aspartate, ou l’ensemble des ions fragments sont
identifiés, à l’exception de la structure de la chaîne d’acide gras, ou la position de l’insaturation
ainsi que la stéréochimie de la molécule reste inconnue)347. Un septième niveau permet de
définir des composés dont la totalité des ions fragments sont identifiés, mais dont la
stéréochimie de la molécule reste inconnue347. Enfin, le dernier niveau d’identification, comme
en métabolomique correspond à l’annotation complète d’un composé avec son isomérie (par
exemple 13R-HODE et 13S-HODE)347.

Compte tenu de la structure des molécules analysées pendant ma thèse, nous avons
utilisé l’identification conseillée par la métabolomique345.

140
 6. Les règles de chimie des réactions ions-molécules appliquées
pendant ces travaux de thèse et nomenclature

Les lipoaminoacides se dissocient sous mode d’excitation non résonant et génèrent

jusqu’à plus de 10 ions fragments. Identifier les pertes d’atomes entre l’ion précurseur et
chaque ion fragment produit est essentiel pour avoir accès à sa composition élémentaire.
Cependant, il est également nécessaire de connaitre la structure des ions fragments produits
afin de permettre un niveau 1 d’identification. Elles sont obtenues via l’analyse des
mécanismes de fragmentation qui sont inévitablement soumis à certaines règles de chimie
organique, qui seront succintement décrites par la suite.

Règles de fragmentation utilisées pour décrire nos mécanismes : Afin de décrire les
mécanismes proposés dans la suite du manuscrit concernant les différents composés
identifiés, les règles utilisées se sont basées sur la position des charges. Ces règles sont
incontournables pour l’interprétation de la fragmentation des ions. Plus précisément, elles se
basent sur la position des différents sites déprotonés ou protonés. Ces règles sont imposées
notamment lorsque la rupture d’une liaison se produit et affirment :

1) Qu’il n’est pas possible de maintenir une charge positive sur un atome de carbone en alpha
d’un atome de carbone portant un hétéroatome. Si cela doit arriver, nécessairement un
hydrure (H−) doit migrer sur cette position ou bien, une liaison doit se déplacer pour
neutraliser cette charge. Par contre une charge négative peut être localisée sur ce site
naturellement. En particulier si l’hétéroatome est doublement lié au carbone, il peut alors y
avoir délocalisation de la charge qui se trouve dispersée et donc amenant a la stabilisation
de l’anion.

2) Il n’est pas possible de maintenir une charge négative sur un atome de carbone portant un
hétéroatome. Si cela arrive comme intermédiaire immédiatement un proton migre sur ce
site ou une liaison covalente bascule pour neutraliser la charge. Cependant, une charge
positive peut être portée par cet atome de carbone, alors elle sera stabilisée par
délocalisation.

De plus, les agrégats chargés qui émergent des gouttelettes et qui survivent jusque
dans la zone de désolvatation peuvent conduire à des anions où la charge peut être localisée
sur différents sites en compétition. Bien qu’elles soient de mêmes compositions élémentaires,
plusieurs structures (déprotomères336) peuvent être formées. Cela s’explique notamment par

141
la présence de différents sites (basiques ou acides), qui peuvent être en interaction avec le
cluster chargé. Lors de la désolvatation la charge reste attachée sur le site basique ou acide
initial. A partir de ce site, la charge peut migrer par prototropie afin de former d’autres
protomères (ou déprotomères)336,229,348. Dans tous les cas, il y aura une distribution de
positions simplement chargées : c’est-à-dire qu’il sera possible d’avoir plusieurs structures
monochargées différentes pour la molécule déprotonée ou pour la molécule protonée. C’est
à partir de ces positions que les fragmentations sont induites, et c’est pour cette raison que
parfois, plusieurs mécanismes peuvent être proposé. Dans la mesure du possible, nous avons
décidé de n’en proposer qu’un seul, correspondant à celui étant le plus probable.

Jamais des fragmentations non induites par la charge ne seront considérées car elles
ne peuvent être produites qu’à partir de sites radicalaires. Elles sont possibles lors de
collisions de très haute énergie ou lors d’un bombardement par électrons c’est-à-dire par
electron induced dissociation (EID)349, ou encore par interaction avec des atomes
métastables350, mais ces collisions n’ont jamais lieu dans nos conditions expérimentales.
Certains des ions fragments produits par les lipoaminoacides font appels à des processus par
étapes, qui peuvent s’interpréter par la formation d’ions dipôles.

Les ions dipôles : Il s’agit d’espèces décrites pour la première fois à la fin des années 1960
lorsque l’ionisation chimique a été introduite. Ce sont des intermédiaires, résultant de
réactions ions-molécules, à partir desquels les transferts de protons peuvent se faire. Vers la
fin des années 1970 le concept d’ions dipôles revient, lors de l’interprétation de certaines
fragmentations. Pierre Longevialle travaillait sur des diamino-3,17-stéroïdes351, 352. Afin de
permettre l’interprétation des spectres d’ionisation chimique de ces composés, il introduit alors
la notion d’ion dipôles. Les ions fragments impliquent la perte de l’amine du cycle A et ensuite,
celle de l’amine du cycle D bien que ces groupes soient très éloignés et que la conformation
du squelette androstane est complètement figée dans un plan moyen empêchant tout transfert
de proton entre les cycles A et D. A la même période le groupe de D. H. Williams 353 explore
les ions dipôles dans le cas de plus petites molécules, afin d’expliquer certaines
fragmentations inattendues. Par la suite, de tels intermédiaires ont été décrits à partir d’ions
négatifs à nombre pair d’électrons (molécule déprotonée) formés à partir d’esters à longue
chaine d’estradiol via une ionisation négative352,354. Ces résultats ont permis de mettre en
évidence que le site de déprotonation se trouvait dans le cycle A, et que la fragmentation avait
lieu dans le cycle D. Là encore, afin d’expliquer ce phénomène il a fallu introduire cette notion
d’ions dipôles.

Ce concept est un modèle qui permet d’interpréter certaines réactions, et en général,

des réactions où les charges éloignées du centre de fragmentation semblent être

142
spectatrices : ce qui est faux lors d’activation de basse énergie. En réalité cela signifie que
l’espèce moléculaire en question s’isomérise en ion dipôle où des échanges de proton (H+),
d’hydrure (H-), ou dans certains cas concernant les ions radicaux, des charges H•, peuvent
avoir lieu entre les partenaires avant qu’ils se séparent pour produire les ions fragments
compétitifs.
Lorsque les fragmentations impliquent la présence des ions dipôles dans les cas les
plus simples, il est possible d’observer deux ions fragments dont la somme en m/z correspond
à la masse de l’ion précurseur à plus ou moins une unité m/z. Lorsque la variation est de -1
m/z, un échange de proton a eu lieu entre les partenaires. Lorsque la variation est de +1 unité
de masse, un échange d’hydrure a eu lieu entre les partenaires. Lorsque la somme
correspond à la masse de l’ion moléculaire, c’est un électron qui a migré.

Les effets d’énergie sur l’orientation de leurs apparitions peuvent être une aide à leurs
mises en évidence. En effet, lorsque l’ion dipôle est réalisé, la dissociation conduit à deux
processus compétitifs dont l’un correspond à la rupture directe de l’ion dipôle, l’autre
correspondant à un réarrangement via un transfert de proton, d’hydrure ou d’hydrogène
radicalaire. Selon la théorie du quasi-équilibre (Cf. Annexe 1), le premier processus est
favorisé à partir des ions de plus haute énergie interne alors que le second est favorisé à partir
de ceux de plus faible énergie interne. Pour que ces intermédiaires puissent se former, ou
conduire aux échanges de H+, H− il est nécessaire que les partenaires sous leurs formes
neutres aient des basicités en phase gazeuse ou des acidités relativement proches les unes
des autres. Dans ces conditions, leur durée de vie doit être suffisante afin de permettre de
tels échanges.

Mise en place d’une nomenclature pour les LpAA : Afin de simplifier la lecture et d’harmoniser
l’annotation des ions fragments produits par activation collisionnelles pour les
lipoaminoacides, l’introduction d’une nomenclature a été nécessaire. Celle-ci se base sur celle
utilisée pour l’annotation des ions fragments de peptides protonés ou déprotonés. Cette
nomenclature avait été définie il y a une quarantaine d’années355 pour les ions positifs pour
des collisions de haute énergie (au-delà du keV) où la fragmentation des chaines latérales
des résidus (acides aminés) étaient rompues.356 Plus récemment, cette nomenclature avait
été modifiée pour être cohérente avec la fragmentation des peptides déprotonés (pour les
ions négatifs, Figure 89)357. Alors, ici nous avons proposé une nomenclature qui s’applique à
nos conjugués tout comme pour les lipopeptides. Par exemple, la rupture de la liaison amide,
lien entre les deux partenaires des LpAA, va conduire à deux ions compétitifs et

143
complémentaires : yˉ (partie correspondant à l’acide aminé déprotoné) et [Lpb-2H]ˉ (à l’ion
fragment correspondant à la partie acide gras).

Figure 89 : Nomenclature mise en place spécifiquement pour les lipoaminoacides

144
PRESENTATION DES TRAVAUX DE THESE :
résultats et discussion

143
 Objectifs et travaux de thèse

Pour mieux comprendre les relations hôte-microbiote, la caractérisation des

métabolites bactériens est essentielle pour déterminer les interactions fonctionelles. L’objectif
principal de mes travaux de thèse, a été d’étendre l’identification, la caractérisation structurale
et la quantification de nouveaux lipopeptides produits par les bactéries du microbiote
intestinal. Une stratégie expérimentale de chimie analytique par LC-HRMS permettant
l’identification et la caractérisation de ces lipopeptides a été mise en place. Pour cela, un
workflow analytique spécifique aux lipopeptides a été développé. Il comprend plusieurs étapes
complémentaires, dont une extraction sur phase solide et une analyse par spectrométrie de
masse à l’aide d’un appareil Qq/TOF.

Les composés ont été analysés par des expériences d’activation collisionnelle des
ions d’intérêt en modes MS² (avec un Qq/TOF) et MSn (avec LTQ-Orbitrap VELOS). Les
spectres d’ions produits de l’ion précurseur sélectionné soumis au processus CID (collision-
induced dissociation)214 ont été comparés avec ceux des standards purs, synthétisés
spécifiquement, permettant d’identifier la majeure partie des lipopeptides (et lipoaminoacides)
avec un niveau 1 d’identification selon les règles de la métabolomique358.

Les mécanismes de fragmentation de chacune des familles (selon l’acide aminé

présent quel que soit la taille et le niveau d’insaturation de la partie acide gras) des composés
identifiés a été établi, afin de mettre en évidence les processus diagnostiques, indépendants
de la partie lipidique, propres à chacune de ces familles. Pour une meilleure classification des
fragmentations et leur généralisation, une nouvelle nomenclature spécifique aux lipopeptides
a été proposée simplifiant ainsi l’annotation des spectres CID. Après leur identification et leur
caractérisation, ces composés ont été dosés dans plusieurs matrices (bactéries, côlons de
souris, fèces de souris, fèces humaines). Pour cela une méthode de quantification absolue a
été mise en place basée sur l’analyse en basse résolution en utilisant un tandem LC-QqQ
dont la robustesse a été déterminée.

Ce travail d’identification, partie la plus importante de notre étude, nous a amené à

approfondir les dissociations majeures observées. Certaines fragmentations caractéristiques
ont été détectées et interprétées. C’est le cas notamment de la régénération inattendue d’ions
fragments permettant des attributions précises concernant la partie aminoacide. Pour les
étudier en détails, les profils d’évolution des ions fragments, notamment ceux inattendus mais
caractéristiques, en fonction de l’énergie de collision (energy-resolved mass spectrometry,
ERMS) ont été réalisés. Le profil caractérisant les ions produits est Gaussien. Nous avons

145
observé pour la première fois que la largeur à mi-hauteur de ces Gaussiennes augmente
d’autant plus que le rapport m/z de l’ion fragment est faible, le processus physique résultant
des collisions est en cours d’étude et de modélisation. Pour certains ions fragments nous
avons observés deux types de profils inattendus : (1) Gaussiens larges plus ou moins
déformés, (2) composites (superposition non centrée de plusieurs formes probablement
Gaussiennes). L’étude de ces profils particuliers inattendus montrent une certaine corrélation
avec les processus impliqués dans la formation de ces ions produits. Une analyse plus
poussée par mobilité ionique cyclique (cIMS) a été réalisée.

L’ensemble des résultats obtenus au cours de ces différentes études ont fait l’objet de
trois articles dont deux sont soumis et un troisième qui devrait être soumis avant la soutenance
de ma thèse.

146
 Résultats

Dans cette partie, les résultats obtenus et en cours de valorisation sous forme de
publications sont résumés et décrits les uns après les autres. Les publications associées sont
insérées. Une discussion générale qui reprend l’ensemble des résultats est proposée en fin
de chapitre.

Publication 1 : Mise en place d’un workflow analytique, spécifique à la recherche

de nouveaux lipopeptides bactériens par chromatographie liquide couplée à la
spectrométrie de masse à haute résolution (Lc-QqTOF)

Résumé :
L'amélioration des connaissances sur les métabolites produits par le microbiote est un
point clé pour comprendre son rôle en santé humaine. Parmi eux, les lipoaminoacides (LpAA)
contenant de l'asparagine et leurs dérivés sont des métabolites bactériens qui pourraient avoir
un impact sur l'hôte. Dans cette étude, notre objectif était d'étendre la caractérisation de cette
famille. Nous avons développé un « workflow » semi-ciblé afin d’identifier et de quantifier les
nouveaux candidats. Tout d'abord, la préparation d’échantillon (étape d’extraction) et l'analyse
des lipopeptides par chromatographie liquide (LC) couplée à spectrométrie de masse à haute
résolution (HRMS) ont été optimisé. L’utilisation d'une banque de données théoriques
« maison » a permis d’interroger les données brutes manuellement. Cette stratégie nous a
permis de trouver vingt-trois nouveaux LpAA conjugués aux acides aminés Asn, Gln, Asp,
Glu, His, Leu, Ile, Lys, Phe, Trp et Val. Ces métabolites ont ensuite été entièrement
caractérisés par MS² et MSn, et comparés aux standards synthétisés pour valider les
annotations. Enfin, une méthode d’analyse quantitative a été développée par LC couplée à
un instrument triple quadripôle, où la linéarité et limites de quantification et de détection ont
été déterminées. Quatorze nouveaux composés ont ainsi été quantifiés dans des bactéries à
Gram positif, Lactobacilus animalis, et douze dans Escherichia coli Nissle 1917.

147
Résultats détaillés :

Développement d’une méthode d’extraction et d’analyse par chromatographie

couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution spécifique aux
lipopeptides :
Des travaux antérieurs à ceux de ma thèse ont permis l’identification et la
caractérisation de deux lipoaminoacides (C14Asn et C12Asn), et de plusieurs lipopeptides
(C12AsnGABA, C12AsnAla, C12AsnVal). Ces composés ont été extraits à partir de culots
bactériens via une extraction sur phase solide en utilisant une plaque SPE polymérique HLB
où les métabolites d’intérêts sont élués avec du méthanol. Dans le but d’étendre l’identification
de nouveaux lipopeptides, cette méthode a été modifiée en utilisant un mélange de standards
variés (lipopeptides, lipoaminoacides, acides gras hydroxylés, acyl-sérotonine, composés
nitrés, anandamides) comme échantillon test. Plusieurs conditions de broyage et d’extraction
décrites dans la littérature afin d’analyser les lipopeptides ont été comparés. Finalement, nous
avons conservé les conditions de broyage utilisant un mélange tampon Tris (50 mM à pH 9)
dans du méthanol selon des proportions 1:2.
Plusieurs protocoles d’extraction liquide-liquide (LLE) ont été testés, notamment le
protocole de Bligh & Dyer183 classique, modifié et adapté avec du méthanol acidifié (HCl ou
CH3COOH). Les rendements d’extraction de ces 3 LLE avoisinaient les 35%. Une LLE en
utilisant de l’eau et de l’acétate d’éthyle a également été testée, bien que les résultats soient
encourageants la méthode manquait de robustesse. L’utilisation d’une plaque SPE
échangeuse d’anions (utilisée au laboratoire pour l’extraction des isoprostanes) n’a pas
permis d’extraire nos composés d’intérêts. En revanche, les tests réalisés sur des plaques
SPE polymériques HLB, après plusieurs essais de solvants éluant, ont permis d’atteindre un
rendement d’extraction de 20 à 68% selon les métabolites. L’élution successive avec de
l’acétonitrile, du méthanol et de l’acétate d’éthyle a conduit aux meilleurs rendements
d’extraction avec une robustesse supérieure aux autres méthodes d’extractions testés. Nous
avons donc décidé d’utiliser cette méthode d’extraction pour la suite de notre étude.

Afin de garantir une sensibilité maximale pour la détection des composés d’intérêt, une
méthode analytique a été développée et optimisée avec un spectromètre de masse hybride
Qq/TOF en utilisant le même mélange de standards. L’optimisation des paramètres de la
source d’électro-nébulisation (où la polarité négative des ions a été choisie) du spectromètre
de masse n’a eu que très peu d’effets au niveau du gain en sensibilité. Afin d’augmenter la
sensibilité, la méthode analytique a été miniaturisée, via l’utilisation d’une colonne à plus faible
diamètre interne : 1mm de diamètre interne au lieu de 2.1mm, permettant un gain de

148
sensibilité de l’ordre de 80%. Les analyses ont été effectuées selon plusieurs modes de
balayages MS et MSE soit en continuum soit en centroïde.

Standard interne :
Afin de suivre l’ensemble des étapes du workflow analytique, il est important d’utiliser
un standard interne. Afin qu’il soit comparable aux lipopeptides, nous avions commandé à nos
collaborateurs chimistes un C12AsnGABA où les hydrogènes de la chaine d’acide gras étaient
totalement remplacés par des deutérium (d23). Une instabilité du composé se traduisant par
la présence d’un massif isotopique caractéristique des pertes successives d’un, de deux, de
trois et parfois même de quatre atomes de deutérium a été observée. Des variations étaient
notables entre standard extrait et non extrait. Nous avons supposé qu’un échange entre les
atomes d’hydrogène du méthanol et les deutériums du C12AsnGABAd23 était possible lors
de l’extraction, nous empêchant alors de quantifier nos rendements d’extraction et de
préparation.

Par la suite, nous avons alors synthétisé un second standard interne : le C16AsnGABA
substitué par des atomes de 13C sur la totalité de la chaine carbonée de l’acide gras, générant
ainsi une espèce beaucoup plus stable. Par contre son rendement d’extraction était de 20%.
Comme celui des autres standards (C14Asn, 12AsnGABA, C12AsnAla et C12AsnVal) était
autour de 80%, nous avons supposé que la différence de longueur de chaine entre un acide
laurique et un acide palmitique induisait suffisamment de différences de polarité pour modifier
fortement l’élution sur la plaque SPE HLB. Ainsi, nous nous sommes aperçus que nous avions
développé un workflow analytique davantage optimisé pour les lipopeptides de longueurs de
chaine d’acide gras plus courtes que l’acide palmitique.

Mise en place d’une banque de données théoriques des lipopeptides :

Une base de données théorique comprenant 2300 lipopeptides potentiels a été
constituée sur la base du premier lipopeptide identifié : le C12AsnGABA. Celle-ci a été
imaginée en déclinant les différentes parties qui compose le lipopeptide : l’AG (allant de 8 à
20 atomes de carbone, mono insaturés, saturés, hydroxylés ou constitués d’un cyclopropane),
l’acide aminé, et le neurotransmetteur (GABA, histamine, sérotonine et dopamine).
L’ensemble de ces combinaisons a été envisagée, afin de produire une banque de données
à interroger pour identifier et caractériser de nouveaux lipopeptides et LpAA. Cette banque de
données maison composée de 2436 composés, contient la structure de la molécule, son code
SMILES et les masses correspondantes aux molécules protonées et déprotonées (puisque
seules ces deux formes ont été retrouvées pour les lipopeptides).

149
Acquisition des données en LC-HRMS² et retraitement :
Le retraitement des données a été effectué via le logiciel UNIFI, qui permet d’associer
des ions précurseurs détectés (match entre un m/z de la données brute et la banque de
données), à leurs ions fragments produits et d’en proposer une structure. Il est possible
d’entrer une liste d’ions « fragments attendus », et une liste de pertes de neutre attendues qui
seront automatiquement recherchées par le logiciel. De manière générale, le logiciel UNIFI
présente un grand nombre de dysfonctionnement pour notre problématique, générant un
nombre de faux positifs importants (allant parfois jusque 50.000 matchs par échantillon), à
trier manuellement, ce qui s’avère être trop chronophage. De plus, les options d’ions
fragments attendus et de perte de neutres, qui aurait pu nous être très utile, ne semblent pas
fonctionner lorsque l’on recherche des composés minoritaires. A l’inverse le logiciel semble
fonctionner dans les conditions où les composés sont concentrés, c’est-à-dire lorsqu’ils sont
majoritaires.

Nous avons finalement utilisé le logiciel QuanLynx, qui fonctionne de la même

manière : lorsqu’un m/z de la base de données est détecté, celui-ci est identifié. Cependant,
lorsqu’un m/z est détecté, le logiciel n’associe pas les ions fragments correspondants. De
plus, Quanlynx n’est pas capable de vérifier automatiquement si le rapport m/z identifié
correspond à celui d’un ion monoisotopique ou à un isotopologue, cette vérification est
réalisée manuellement, ce qui rend le retraitement contraignant et chronophage.

Identification d’un premier nouvel aminolipide : le C13Asparagine

Dans l’article, une grande partie est dédiée à la détection et à l’élucidation de la
structure d’un nouvel LpAA, le C13Asn (Figure 90). Dans les conditions expérimentales
initiales, c’est-à-dire avec un gradient chromatographique s’étalant sur 18 min, le précurseur
[(C13Asn-H)]− était largement co-élué avec des composés isobares. Les analyses MS² dans
ces conditions ne permettaient de distinguer quels ions fragments étaient issus du composé
d’intérêt, de ceux des ions isobares. La modification des conditions expérimentales afin
d’améliorer la séparation chromatographique du composé a été nécessaire. Le gradient
chromatographique a été allongé et est passé de 18 min à 40 min. Cette modification a permis
de séparer les molécules isobares, et ainsi d’identifier sans ambiguïté les différents ions
produits issus de l’ion précurseur et non plus ceux produits par les interférents isobares issus
d’une co-élution. En effet, les échantillons biologiques sont complexes, c’est pour cela qu’il
est courant de retrouver au même temps de rétention des composés isobares à celui d’intérêt.
Ainsi, les ions fragments caractéristiques du C13Asn sont décrits, et comparés avec ceux
générés à partir d’un standard pur synthétisé spécifiquement. C’est de cette manière que nous
avons pu confirmer l’identification de niveau 1 selon les règles de métabolomique345.

150
 L’identification et la caractérisation de ce premier composé nous a servi de base pour
l’identification et la caractérisation d’autres composés, qui ont tous été identifiés par LC-HRMS
en comparaison avec un standard primaire synthétisé spécifiquement.

NH

COOH
CONH 2

Figure 90 : Structure du C13Asn

Concernant les mécanismes de fragmentation des anions [C13Asn-H]ˉ dérivant de

C13Asn, ils sont décrits dans la publication et suivent tous les règles de fragmentation décrites
préalablement. Il s’agit des processus de pertes directes d’H2O (perte majeure, m/z 309), et
de 3 pertes très faibles (moins de 3%) correspondant aux pertes de CO2 (m/z 283), et des
pertes consécutives de (H2O+CO2) (m/z 265), et de (H2O+CO2+HCN) (m/z 238).

La perte mineure de CO2 est directe mais selon un mécanisme par réarrangement
basé sur un transfert de proton de l’amide vers l’atome de carbone d’où CO2 est éliminé. La
présence d’une charge négative résultante sur un atome de carbone, d’où CO2 est parti,
portant un hétéroatome est pratiquement impossible compte tenu des règles de la chimie
organique (Schema 1a). Par contre, la perte majeure d’eau (Schéma 1b) va se produire à
partir de [C13Asn-H]ˉ où l’amide est déprotonée et où la charge se situe sur l’atome
d’oxygène. Par une attaque nucléophile sur l’acide carboxylique libre pour générer par
cyclisation un intermédiaire tétrahédrique qui pour se dissocier, évolue selon un processus
par étape via une isomérisation en ion dipôle. Au sein de celui-ci, l’ion OHˉ libéré arrache un
proton, après exploration de la surface de son partenaire neutre, à un site acide en phase
gazeuse. Bien que différents sites portent des protons mobilisables ici, c’est le groupe imine
qui sera favorablement déprotoné. Il en résulte une ouverture du cycle à 5-chainons
régénérant un groupe carboxylate avec un groupement nitrile (ion m/z 309). Ce dernier peut
perdre consécutivement le CO2. Bien qu’a priori triviale, cette perte serait très défavorisée si
un proton mobile de la position énolisable (position acide) de l’amide ne venait pas neutraliser
la charge. Cette assistance conduit à la formation d’un énolate (ion m/z 265) qui ensuite, peut
s’isomériser en ion dipôle en se cyclisant selon une substitution nucléophile intramoléculaire
(formation d’alkyl-2-oxazoline) libérant ainsi l’anion CNˉ, qui restant au sein l’ion dipôle. CNˉ
arrache alors un proton au groupe NH de l’hétérocycle pour être éliminé sous forme de HCN
et forme un alkylidène-2-oxazoline déprotoné (ion m/z 238) (Schéma 1c). D’autres ions

151
abondants sont présents, dont le second plus abondant est l’amide de l’acide gras déprotoné
(m/z 212). Les autres ions fragments abondants correspondent aux ions caractéristiques de
l’acide aminé lui-même (m/z 131, 114).

Schéma 1 : Mécanismes possibles de fragmentation par pertes directes compétitives (a)

très mineure de CO2 et (b) majeure d’H2O qui est suivie de pertes consécutives (c) mineures
de (H2O+CO2) et (H2O+CO2+HCN)

Extension à d’autres lipoaminoacides par LR-MS

Une fois le premier composé caractérisé, et son ion fragment le plus intense identifié,
les transitions MRM théoriques d’autres LpAsn ont été prédites, permettant d’identifier en LC-
QqQ les composés putatifs (puisque la résolution est faible et ne conduit qu’aux masses
nominales) : C12:1Asn, C14:1Asn, C15Asn, C16Asn, C16:1Asn, C17Asn, et C17:1Asn. Il a
alors été décidé d’étendre cette méthode, en déclinant les MRM théoriques pour les autres
LpAA, pour tous les acides aminés et longueurs de chaînes potentielles confondus. Cette
méthode a permis d’identifier en basse résolution 48 LpAA putatifs: C12:1Leu/Ile, C13Leu/Ile,
C14Leu/Ile, C14:1Leu/Ile, C15Leu/Ile, C15:1Leu/Ile, C16Leu/Ile, C16:1Leu/Ile, C17Leu/Ile,
C17:1Leu/Ile, C18Leu/Ile, C18:1Leu/Ile, C12Gln, C12:1Gln, C13Val, C14Val, C14:1Val,
C15Val, C16Val, C16:1Val, C17:1Val, C18Val, C12Glu, C12:1Glu, C16Glu, C15:1Glu,
C16Glu, C17:1Glu, C12Lys, C12:1Lys, C14Lys, C15Lys, C16Lys, C16:1Lys, C17Lys,
C17:1Lys, C12:1Phe, C13Phe, C14Phe, C14:1Phe, C15Phe, C15:1Phe, C16Phe, C16:1Phe,
C17Phe, C17:1Phe, C18Phe et C18:1Phe.

Afin de valider les structures de ces composés, il est nécessaire de réaliser des
analyses en LC-HRMS², et de comparer les résultats à ceux des standards purs qui ont été

152
synthétisés à cet effet. Vu le grand nombre de composés putatifs identifiés, nous avons décidé
de nous focaliser uniquement sur la famille entière des LpAsn, puis sur un composé de chaque
famille (une seule longueur de chaine d’AG pour un amino-acide). La synthèse de leur
standard spécifique, nous a permis d’atteindre le niveau 1 d’indentification pour les 22
composés suivants : C12:1Asn, C13Asn, C14:1Asn, C15Asn, C16Asn, C16:1Asn, C17Asn,
C17:1Asn, C12Arg, C12Asp, C12Gln, C12Glu, C14Glu, C16Glu, C12His, C12Leu, C12Ile,
C12Lys, C14Lys, C14Phe, C12Trp, C12Val (Figure 91). Le niveau d’identification des autres
composés sera discuté dans la dernière partie de cette thèse.

Mise en place d’une méthode de quantification de 22 LpAA :

Après l’identification et la caractérisation de ces vingt-deux composés, une méthode
de quantification absolue par LC-QqQ a été développée sur le Shimadzu TQ-8060. Les limites
de quantification et de détection ont été calculées pour chacun des composés, et atteignent
l’ordre du pg/µL. Une gamme de standards primaires composée de 10 points, allant de 0.004
à 1250 pg/µL est injectée en même temps que les échantillons afin de garantir les mêmes
conditions d’analyses et de permettre une quantification absolue où la précision a été
déterminée comme allant de 85 à 115%. Les coefficients de variations intra et inter jour ont
été calculés et sont inférieurs à 5%, permettant ainsi de garantir la robustesse de la méthode
d’analyse.

Quantification des nouveaux LpAA dans deux souches bactériennes :

Cette méthode de quantification a été utilisée afin de doser les LpAA dans des souches
bactériennes à gram négative (EcN), et à gram positive (Lactobacillus animalis). Dans la
souche EcN WT, les lipoaminoacides suivants C12Asn, C13Asn, C14Asn, C14:1Asn,
C15Asn, C16Asn, C16:1Asn, C17:1Asn, C12Glu, et le C12Asp sont dosés. Dans la souche
Lactobacillus animalis, il a été quantifié les lipoaminoacides C12Lys, C14Lys, C12His,
C12Gln, C12Asp, C14:1Asn, C16:1Asn, C15Asn, C17Asn, C12Trp, C12Val, C12Leu,
C16Asn, et C14Phe.

153
Figure 91 : Structures de certains LpAA identifiés à l’aide du Workflow lipidomique
développé

154
 EcN contient un ilot de gènes appelé pks codant pour des enzymes et des protéines
accessoires permettant la synthèse de LpAsn et de la colibactine, une génotoxine. Le premier
gène de ce cluster est ClbA qui code pour une PPtase (Phosphopantethéinyl transférase) qui
permet l’activation des enzymes de synthèse. ClbN code pour une enzyme responsable de
l’ajout de l’asparagine sur l’acide tétradécanoïque (acide myristique) menant à la formation du
C14Asn. Ce composé entre dans la composition de la précolibactine. Le clivage du C14Asn
par une peptidase codée par ClbP permet de libérer du C14Asn et la forme active et mature
de la colibactine. Afin de déterminer l’implication des enzymes codées par ClbA, ClbN et ClbP
dans la synthèse des aminoacides, le dosage des LpAA a été effectué dans des souches
bactériennes sauvages ou délétées pour ces gènes. Les résultats ont été représentés sous
forme d’une heat-map où 4 clusters se dégagent.

Le premier met en évidence les composés dont les concentrations sont diminuées chez les
bactéries mutées versus sauvages et absentes de Lactobacillus animalis (C14Asn, C12Asn,
C14:1Asn, C16Asn, C16:1Asn, C17:1Asn et C12Glu). Ces composés sont donc dépendants
des enzymes codées par ClbA, ClbN et ClbP pour leurs synthèses. Le second cluster met en
évidence les LpAA qui nécessitent les enzymes codées par ClbN et ClbP mais pas ClbA pour
leurs synthèses, ces composés sont également absent des Lactobacillus animalis (C15Asn
et C13Asn). Le troisième cluster permet de déterminer les LpAA retrouvés dans les EcN
sauvages et délétées pour ClbA, mais absents des mutants ClbN, ClbP et des Lactobacillus
animalis (C17Asn, C12Lys et C14Lys). Enfin, le dernier cluster est composé des LpAA
retrouvés uniquement chez Lactobacillus animalis (C12His, C14Phe, C12Gln, C12Trp,
C12Leu/Ile, C12Val et C12Asp).

Ces données permettent de mettre en évidence que la synthèse des LpAA n’est pas
restreinte aux bactéries gram négatives, puisque Lactobacillus animalis en est également
capable. De plus, ces résultats montrent que la délétion d’un gène modifie la concentration
ainsi que la nature des LpAA produits par une bactérie.

155
Conclusion :
Un workflow analytique spécifique aux lipopeptides comportant une extraction
optimisée ainsi qu’une analyse spécifique par LC-HRMS, incluant une base de données
comportant 2436 composés potentiels a été développé. Ce workflow a permis de mettre en
évidence la présence de quarante-neuf nouveaux lipopeptides putatifs dans certaines
souches bactériennes. La caractérisation structurale de vingt-deux LpAA a été réalisée à l’aide
de standards synthétisés, pour lesquels la fragmentation des composés a été étudiée en
détails. Les LpAA régénèrent l’ion produit majoritaire correspondant à la perte de H2O.
Ensuite, une méthode de quantification absolue a été mise en place par LC-QqQ (Figure 92).
L’analyse de bactéries ayant des mutations sur certaines protéines clés a permis de mettre
en évidence leurs rôles dans la biosynthèse de ces LpAA. A ce jour, cette méthode analytique
représente une opportunité d’étudier la production des LpAA, produits par le microbiote.

Figure 92 : Schéma récapitulatif du workflow analytique développé pour la recherche de

nouveaux lipides bactériens, produits par le microbiote intestinal

156
 Analytica Chimica Acta xxx (xxxx) xxx

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Analytica Chimica Acta

journal homepage: www.elsevier.com/locate/aca

Discovery and quantification of lipoamino acids in bacteria

Amandine Hueber a, b, c, Camille Petitfils c, Pauline Le Faouder a, b, Geoffrey Langevin d,
Alexandre Guy d, Jean-Marie Galano d, Thierry Durand d, Jean-François Martin a, e,
Jean-Claude Tabet a, f, g, Nicolas Cenac c, 1, Justine Bertrand-Michel a, b, 1, *
a
MetaboHUB-MetaToul, National Infrastructure of Metabolomics and Fluxomics, Toulouse, France
b
I2MC, Universit
e de Toulouse, Inserm, Universit

e Toulouse 3 Paul Sabatier, Toulouse, France
c
IRSD, Universit
e de Toulouse, INSERM, INRA, INPENVT, Universit
e de Toulouse 3 Paul Sabatier, Toulouse, France
d
Institut des Biomol
ecules Max Mousseron IBMM, UMR 5247 CNRS, Universit
e de Montpellier-ENSCM, Montpellier, France
e
Toxalim (Research Centre in Food Toxicology), INRAE UMR 1331, ENVT, INP-Purpan, Paul Sabatier University (UPS), Toulouse, France
f
Universit

e Paris-Saclay, CEA, INRAE, D
epartement M
edicaments et Technologies pour la Sant
e (DMTS), MetaboHUB, F-91191, Gif sur Yvette, France
g
Sorbonne Universit
e, Facult

e des Sciences et de l’Ing

enierie, Institut Parisien de Chimie Mol
eculaire (IPCM), F-75005, Paris, France

h i g h l i g h t s g r a p h i c a l a b s t r a c t

Lipopeptides and Lipoaminoacids are

a group of bacterial metabolites
which could impact the host
physiology.

A lipidomic workflow by SPE, LC-
HRMS has been developed to
expand their identification.

22 new LpAA has been discovered
and quantified in bacteria.

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: Improving knowledge about metabolites produced by the microbiota is a key point to understand its role
Received 19 August 2021 in human health and disease. Among them, lipoamino acid (LpAA) containing asparagine and their
Received in revised form derivatives are bacterial metabolites which could have an impact on the host. In this study, our aim was
4 November 2021
to extend the characterization of this family. We developed a semi-targeted workflow to identify and
Accepted 21 November 2021
Available online xxx
quantify new candidates. First, the sample preparation and analytical conditions using liquid chroma-
tography (LC) coupled to high resolution mass spectrometry (HRMS) were optimized. Using a theoretical
homemade database, HRMS raw data were manually queried. This strategy allowed us to find 25 new
Keywords:
Lipoaminoacids
LpAA conjugated to Asn, Gln, Asp, Glu, His, Leu, Ile, Lys, Phe, Trp and Val amino acids. These metabolites
Mass spectrometry were then fully characterized by MS2, and compared to the pure synthesized standards to validate
Suspect screening annotation. Finally, a quantitative method was developed by LC coupled to a triple quadrupole instru-
Lipidomic ment, and linearity and limit of quantification were determined. 14 new LpAA were quantified in gram
Microbiota positive bacteria, Lactobacilus animalis, and 12 LpAA in Escherichia coli strain Nissle 1917.
© 2021 Published by Elsevier B.V.

Abbreviations: RT, retention time.

* Corresponding author. MetaboHUB-MetaToul, National Infrastructure of Metabolomics and Fluxomics, Toulouse, France.
E-mail address: [email protected] (J. Bertrand-Michel).
1
nac and Justine Bertrand-Michel jointly supervised this work.
Nicolas Ce

https://doi.org/10.1016/j.aca.2021.339316
0003-2670/© 2021 Published by Elsevier B.V.

Please cite this article as: A. Hueber, C. Petitfils, P. Le Faouder et al., Discovery and quantification of lipoamino acids in bacteria, Analytica Chimica
Acta, https://doi.org/10.1016/j.aca.2021.339316
A. Hueber, C. Petitfils, P. Le Faouder et al. Analytica Chimica Acta xxx (xxxx) xxx

Abbreviations LLE liquid liquid extraction

LLOQ lower limit of quantification
ACN acetonitrile LOD limit of detection
AcOEt ethyl acetate LOQ limit of quantification
CE collision energy MeOH methanol
DCM dichloromethane MS mass spectrometry
ESI electrospray NMM N-methylmorpholine
FA formic acid FWMH: full width at half maximum PIS product ion scan
HBTU N,N,N0 ,N'-tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl) Qq/TOF Quadrupole coupled to time of flight
uronium hexafluorophosphate QqQ triple quadrupole
Hept heptane RF radiofrequency
HLB hydrophobic lipophilic balanced RT retention time
HOBT 1-hydroxybenzotriazole SPE solid phase extraction
IS internal standard SRM selected reaction monitoring
LC-HRMS liquid chromatography high resolution mass TFA Trifluoroacid
spectrometry TIPS triisopropyl silane
LC-LRM liquid chromatography low resolution mass TOF time of flight
spectrometry TRIS 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol
LOD limit of detection

1. Introduction [9e11]. To apply these global approaches, metabolites need to be

present in a sufficient quantity to be characterized or at least
A functional microbiota is formed by the repertoire of expressed detected, which is not our case since the concentration of our lipids
genes and, even more importantly, by proteins and metabolites. For of interest is quite low (about 50e70 pg.mg1 of protein). There-
human microbiota, a lot of studies investigated the compositional fore, it is essential to develop a semi-targeted or suspect screening
level but few studies have investigated active genes, proteins, or method dedicated to LpAAs. The typical approach applied in this
metabolites [1]. However, studies of molecules produced by the case is a large scale suspect screening to generate semi-quantitative
microbiota may be more relevant than composition when it comes data in order to prioritize targeted developments. “Suspects” are
to understand the role played by microbiota in host function. In defined as known compounds (“known/unknowns”) in terms of
fact, the taxonomic composition of the human microbiome varies chemical name and structure which are expected (“suspected”) to
tremendously across individuals, while its functional capacity is be present in a sample. These approaches are often used in envi-
highly conserved in a same individual [2]. This conserved func- ronmental and toxicological studies [12e15]. Even if data are ac-
tional capacity is defined as the functional redundancy of the quired by HRMS, suspect screening differs from untargeted analysis
microbiota [2]. Although this redundancy is important to maintain because the analytes are compared to a user-defined chemical
the stability and resilience of the human microbiome, it introduces database or existing chemical inventories with manual or software-
the idea that, until a certain point, species are substitutable in a matching algorithms using accurate mass and isotope patterns. In
given microbiota in terms of function [3]. The general aim of our this semi-targeted approach sample preparation plays a key role,
consortium is to identify new metabolites produced by the gut and it needs to be adapted to the metabolites of interest [16]. In
microbiota to determine their effect on the host. In several pa- lipidomic, the two main methods which could be combined are: a
thologies related to intestinal microbiota dysbiosis, no increase in liquid-liquid extraction [17] and a solid phase extraction after
bacterial translocation is observed in patients indicating that, if the protein precipitation in a mixture of water and organic solvent
bacteria have an impact on the host, it is through molecules, [8,18,19].
secreted and/or transformed by the bacteria, able to cross the in- To characterize bacterial LpAA, the different steps of the work-
testinal barrier. Amongst bacterial metabolites, several lipids flow developed in this project were to: 1) optimize an adapted and
including lipopeptides [4], long chain [5] and short chain fatty acid miniaturized chromatographic separation, 2) develop a specific
[6] or secondary bile acids [7], have been described for their ca- sample preparation for LpAA, 3) construct a theoritical LpAA home-
pacity to cross the epithelial barrier. As in the brain, lipoamino acids made database, 4) efficiently query HRMS data to find candidates
(LpAA) composed by long chain unsaturated fatty acids conjugated and 5) characterize and confirm the new LpAA. Finally, we assessed
to amino acid (AA) [8] have been identified and that we charac- our quantitative methods of LpAA in gram negative and positive
terized lipopeptides and LpAA containing asparagine produced by bacteria and decipher the synthesis of this new LpAA in EcN.
Escherichia coli Nisle 1917 (EcN) [4], we decided to extend the dis-
covery of LpAA from bacteria to other AA than asparagine. 2. Material and methods
In this study, a specific workflow is developed to identify and
characterize new LpAAs in different bacterial strains using Liquid 2.1. Chemical and reagents
Chromatography High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS).
Advances in high-resolution mass spectrometry and tandem mass Heptane, ethyl acetate (AcOEt), methanol (MeOH), Hank's
spectrometry, such as linear trap quadrupole (LTQ)/Orbitrap or balanced salt solution (HBSS), Trizma® hydrochloride, dichloro-
hybrid Quadrupole Time-Of-Flight (Qq/TOF) technologies, offer an methane (DCM), N,N,N0 ,N'-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)
opportunity to rapidly screen biological and environmental speci- uronium hexafluorophosphate, 1-Hydroxybenzotriazole (HOBT),
mens for a large array of chemicals using untargeted method N-Methylmorpholine (NMM), TriFluoroAcid (TFA), triisopropyl
2
A. Hueber, C. Petitfils, P. Le Faouder et al. Analytica Chimica Acta xxx (xxxx) xxx

silane (TIPS), piperidine and C12Arg were purchased from Sigma Lactobacilli MRS broth (Difco, Fisher scientific SAS, Illkirch, France)
Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Acetonitrile (ACN, HRMS e agar plates supplemented with cysteine chloride monohydrate
grade), and formic acid (HRMS grade) were purchased from 0.5 g.L1 
- . After 24 h of incubation at 37 C, 3 colonies were seeded in
Thermo Scientific. Water used in this study was purified on a milliQ 30 mL of MRS broth supplemented with cysteine chloride mono-
system (Millipore). The 96 well-plate for solid extraction (SPE) hydrate 0.5 g.L1 - (Merck e Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier,
(Oasis HLB 30 mg) were purchased from Waters (Saint-Quentin en France) and incubated overnight at 37  C. All the culture steps have
Yvelines, France). been performed in a hypoxic environment ensured by using a
Whitley H35 hypoxystation (don Whitley scientific, Bingley, United
2.2. Standards Kingdom) and all the incubations were done in an anaeropack jar
(Fisher scientific SAS, Illkirch, France) with an anaeroGen sachet
2.2.1. Synthesis of lipoaminolipids and lipopeptides (Fisher scientific SAS, Illkirch, France) to ensure an anaerobic
LpAA were synthesized following the standard procedure environment.
described in literature, by either liquid phase synthesis (LPS) or
solid phase synthesis (SPS) with 2-chlorotrityl resin. In short, for 2.4. Sample preparation
LPS, the appropriate terbutyl aminoester and fatty acid were
coupled with HBTU/HOBt/NMM in DCM, followed by hydrolysis of 2.4.1. Extraction of LpAA and lipopeptides
ester (and deprotection of an eventual trityl primary amide) with For the extraction, 500 mL of Tris buffer (pH ¼ 9), 1 mL of MeOH
DCM/TFA. Purification of LpAA was carried out by Reversed Flash and 10 mL of IS *C16AsnGABA were added to the bacterial pellets
Chromatography (C4 or C18 column) with H2O/MeOH or H2O/ and crushed with a Fast Prep instrument (MP Biomedicals), using
ACN þ 0.1% TFA. For SPS, appropriate Fmoc-amino acid was two cycles (6,5 m s1, 30 s). Ten mL of suspension were withdrawn
immobilized to 2-chlorotrityl resin with NMM in DCM. Fluo- for protein quantification with Biorad assays, then, 6.6 mL of water
renylmethoxycarbonyl (Fmoc) protection was removed with were added to the homogenate. Samples were centrifuged at
piperidine/DCM (2/8), and resulting amine was coupled to appro- 1016g for 15 min (4  C) and the supernatants submitted to SPE
priate fatty acid with HBTU/HOBt/NMM. After intensive washing, using HLB plates (Oasis HLB, 30 mg, Waters). Plates were condi-
resin was cleaved with TFA/TIPS/Water (95/2.5/2.5) to obtain tioned with 750 mL ethyl acetate, 750 mL MeOH and
desired LpAA with variable yield and high purity, mostly without 750 mL H2O:MeOH (90:10; v/v). Samples were loaded at a flow rate
further purifications. Detailed synthesis of LpAA is developed in of one drop per 2 s and SPE plates washed using 1 mL H2O:MeOH
supplementary data. Internal standard (IS) used in this experiment (90:10; v/v) followed by 1 mL heptane. Lipopeptides were eluted
was (S)-4-(4-amino-4-oxo-2-palmitamidobutanamido)butanoic using 1 mL AcN, 1 mL MeOH and 1 mL AcOEt. Eluent were carefully
acid substituted with 16 atoms of 13C on the fatty acid chain (for removed from the plate, and transferred to a Pyrex tube, dried
detailed standard synthesis see Supplementary Information 1). under nitrogen gas and reconstituted in 10 mL MeOH for LC-HRMS
analysis. Extract was stored at 20  C before LC-MS analysis.
2.2.2. Standard preparation to determine linearity and
reproducibility 2.4.2. Validation of the LpAA specific sample preparation
Standard solutions were prepared in MeOH at the following The extraction yield and the matrix effect were determined to
concentrations 0.004, 0.19, 0.07, 0.30, 1.22, 4.88, 19.53, 78.13, 312.5 validate the preparation of bacteria. Briefly, three sets of bacteria
and 1250 pg.mL1 for all primary standards. The concentration of (ECN) were prepared according to section 2.4.1 in triplicate: 1)
the IS *C16AsnGABA was 600 pg mL1. Calibration curves were bacteria were extracted without IS; 2) bacteria were extracted
calculated by the ratio between the analyte area and the internal without IS and IS were spiked in the final extract at three different
standard area. concentrations (1000 pg mL1, 500 pg.mL1 and 250 pg.mL1) and 3)
bacteria were spiked with the three different concentrations of IS
2.3. Bacterial samples and then extracted. The extraction yield was determined as the
difference between peak areas of IS in pre-spiked (condition 3) and
2.3.1. EcN bacteria strains and culture conditions post-spiked samples (condition 2). Condition 1 was used to ensure
Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) (serotype O6:K5:H1), the the absence of IS in bacteria. The matrix effect was determined as
isogenic mutants EcNDclbA, EcNDclbN and EcNDclbP were used in the difference between peak areas of IS added to the extracted
this study. Gene inactivation was engineered using the lambda red samples (condition 2) and pure IS. Two independent experiments
recombinase method [20] and deletions were confirmed by using have been performed.
flanking primers. EcNwt, EcNDclbA, EcNDclbN, and EcNDclbP were
grown on LB agar plates supplemented with kanamycin 2.5. High resolution mass spectrometry analysis
(50 mg mL1) when required. After overnight incubation at 37  C,
single colonies of each strain were seeded in 3 mL of LB with an- 2.5.1. LC-MS/MS conditions
tibiotics (when needed) and incubated overnight at 37  C in The acquity UPLC-I-Class system (Waters) was equipped with
agitation (250 rpm). Bacteria were then inoculated at OD600 ¼ 0.05 CSH C18 column Waters (1  100 mm; 2,7 mm), as analytical col-
in 10 mL of minimal medium A (K2HPO4 10.5 g.L1; KH2PO4 umn, and maintained at 40  C. The mobile phases consisted of
4.5 g.L1; (NH4)2SO4 1 g.L1; sodium citrate 0.5 g.L1; MgSO4 H2O:HCO2H (99.9:0.1; v/v) (A) and ACN:HCO2H (99.9:0.1, v/v) (B).
0.2 g.L1, thiamine 0,1 g.L1, and glucose 3%) supplemented with Flow rate was 0.15 mL min1. The multi-step gradient was as
kanamycin (when required) and cultures were grown for 12 h at follow: 25% B at 0 min, 100% B at 16 min, 100% B at 18 min, 25% B at
37  C under shaking conditions (250 rpm). The last step was 18,1 until 20 min (Condition A). The autosampler (Acquity UPLC-I-
repeated one more time by inoculating the bacteria at Class FTN) was set at 4  C, and the injection volume was 1 mL per
OD600 ¼ 0.02 for 24 h before sampling them. The bacteria were analysis. UPLC was coupled on-line to a Xevo G2-XS time of flight
stored at -80  C before the LpAA and lipopeptide extraction. (Qq/TOF) (Waters, Saint-Quentin en Yvelines, France) equipped
with electrospray ionization (ESI). The MS, MSE and MS/MS analysis
2.3.2. Anaerobic bacteria strain and culture conditions were achieved in positive and negative ionization mode, in 2
Lactobacillus animalis (DSMZ strain n 20602) was grown on separate runs with a full-width at half maximum (FWHM)
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resolution of 16 000 (m/z 400). For the MS analysis, source tem- degasser on-line DGU-20A3R and a LTO-Mikros column oven. As for
perature was 120  C, cone voltage was set at 40 kV, nebulizer gas HRMS analysis, the analytical column was a CSH C18 column Wa-
flow rate was 400 L h1 and desolvation temperature was set at ters (1  100 mm; 2,7 mm) and was maintained at 40  C. The mobile
380  C. The analysis was performed in continuum mode for both phases consisted of water:formic acid (99.9:0.1; v/v) (A) and ace-
the MS and MS [2] experiments. Mass spectra were recorded in MS tonitrile:HCO2H (99.9:0.1, v/v) (B). Flow rate was 0.1 mL.min1. The
and MSE modes from m/z 50 to m/z 750. For the MS [2] experiments, multi-step gradient starts with 30% B at 0 min, 80% B at 13 min,
nitrogen was the target gas in the XS collision cell (as segmented RF 100% B at 13.5 min, 100% B at 16 min, and at 16.5 min 30% B until
only quadrupole), ion precursors were isolated at ± 5 m/z for the 18 min. The chromatography system was coupled online to a triple
required sensitivity. MS [2] experiments were carried out under quadrupole mass spectrometer Shimadzu 8060 equipped with a ESI
low energy collisional activation conditions. The collision energy source in negative mode and was optimized as follow: nebulizer:
(ELAB) was optimized using synthesized standards to maintain the 2 L.min1; desolvation line: 250  C; heating-block: 450  C, heating
precursor ion relative abundance at 30%. The best condition was an gaz flow: 10 L.min1, and no drying gas was used. Argon gas (purity,
ELAB of 20 eV for LpAA and lipopeptides. For the full characteriza- >99.9995%) was used for collision-induced dissociation (CID).
tion of C13Asn, the same flow rate and solvent A and B were used, Identification tools: the detector was programmed to profile
starting with 48% of A at 0 min, 60% at 40 min, and 2 min to return putative compounds using theoretical SRM transition deducted
on initial conditions (Condition B) and the same mass spectrometer from LpAA fragmentation with variation of fatty acid length. For
parameters were applied. instance, for C12Asn (previously characterized [4], the MRM tran-
sitions were {[M  H]-; [(M  H2O)eH]]-} and {[M  H]-; Lpcˉ}
2.5.2. Data processing corresponding to {313; 295} and {313; 198}. So to identify the other
Unifi software (Version 1.9.4.053): data in continuum mode were compounds of the series, we determined the theoretical MRM
loaded to the software. For the automatic identification by Unifi, the transitions for various alkyl chain length, e.g. the theoretical MRM
homemade database was added to the Unifi library and then to the of the C13Asn were {327; 309} and {327; 212}. This method was
analysis method as expected precursor. The analysis parameters applied to all the amino acids identified in the bacterial LpAA.
were set as follow: find 3D peaks: at low energy peak intensity Quantification tools: for each metabolite the MRM transition was
threshold was 2500 counts and m/z range was set between 30 m/z optimized on the pure standard to get the best selectivity and the
and 600 m/z, at higher energy peak intensity threshold was 80 best sensitivity with a qualitative and a quantitative transition and
counts, and m/z range was set between 150 m/z and 600 m/z; noise was programmed to monitor a 2 min-window (expected chro-
level was set at high level: 100000 counts; 3D peak detection: matographic retention time ± 1 min). The dwelltime were opti-
without any restriction of retention time; 3D isotope cluster was set mized for each compound and were set between 30 and 100 msec.
at 0.3. In addition to the protonated MH þ or deprotonated [M  H]-
molecules, the adduct [MþNa]þ or [M þ HCOO]- ions was chosen 2.6.2. Data processing
for each precursor molecules under positive and negative ioniza- Peak detection, integration and quantitative analysis were per-
tion modes, respectively. The allowed score was set at 8. The soft- formed by Labsolution Post run and Insight software (Version 5.99
ware has been set to automatically search expected fragments: SP2, Shimadzu, Kyoto, Japan). Concentration of the analytes in
deprotonated amino-acid (for the 20 AA), AA ammoniac loss [AA- samples were calculated by calibration curves (Section 2.2.2). LOQ
H)-NH3]- (noted as (z-2H)ˉ with nomenclature showed Fig. 1), (Limit of Quantification) was determined using 3 calibration ranges
deprotonated gamma-aminobutyric acid [GABA-H]-, and fatty amid in triplicate. LLOQ (Lower Limit of Quantification) were determined
from C8 alkyl chain to C19 alkyl chain (i.e [C12H24NOeH]- noted as for accuracy (coefficient of variation) and precision (CV) in the
Lpcˉ). The software has been set to automatically search neutral loss range of 80e120% and LOQ for the accuracy and precision in the
corresponding to the GABA loss: 103,0633. The mass error accepted range of 85e115%. Linear dynamic range was determined as the
for the precursor ion was set at 20 ppm, and at 2 mDa for the ex- range from LOQ to the highest calibration point reached. LOD (Limit
pected fragment ions. of Detection) measured in biological samples was defined as a level
QuanLynx software (application from MassLynx software, with a signal-to-noise ratio (S/N) of 3.
Version 4.2): reprocessing method were created to query m/z, with
5 ppm error accepted for the deprotonated molecule from the 3. Results and discussion
theoritical homemade database, without any RT restriction.
3.1. Analytical optimization to improve LpAA detection

2.6. Low resolution mass spectrometry analysis 3.1.1. Chromatographic separation and detection
A mixture of pure metabolites was used to develop the semi-
2.6.1. LC-MS/MS conditions targeted analysis. We tried to choose a broad spectrum of struc-
High-performance liquid chromatography system was a Shi- tures with different biophysical properties such as: C12AsnGABA,
madzu Mikros LC system, equipped with a thermostatted auto- C12Asn, C14Asn, C16 and C18 hydroxy fatty acids, C20:4 or C18:1
sampler SIL-30AC, a rack changer II, a Nexera Mikros binary pump, a acyl serotonin and 20:4 or 18:1 acyl anandamide at a concentration
of 1 ng.mL1. As an internal standard, we need a molecule close to
the one studied but absent of our matrix then a labelled derivative
of CxAsnGABA was chosen. First, we synthetized a C12AsnGABA
with the C12:0 fully deuterated. Due to a poor quality of labelled
precursor, we finally synthetized a fully 13C16:0AsnGABA labelled
on the fatty acid (Fig. 1). This internal standard was added to the
mixture of standards to develop the analytical method.
The first step of the workflow was to optimize the chromato-
Fig. 1. (A) Structure of the labelled 13C16:0-AsnGABA internal standard (* ¼ 13C); (B)
graphic separation. The classical method used to separate free
nomenclature of product ions from dissociation of the deprotonated lipo-amino-acids oxylipins and hydroxylated fatty acids under low resolution LC/ESI-
(Hueber et al., Amino Acid, Submitted). MS/MS conditions [21,22] was adapted for the high-resolution Qq/
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TOF instrument. To improve the sensitivity, the C18 2.1 mm diam- calculation of preparation yield and of the matrix effect. The
eter column was replaced by a 1 mm diameter columns with a preparation yield was similar between the different concentrations,
reduction of flow rate from 0.4 mL.min1 to 0.15 mL.min1. The with a recovery of 29.6% ± 3.3% for 1000 pg.mL1, 26.3% ± 7.2% for
total ionic current obtained for a EcN extract was increased by 87% 500 pg.mL1 and 43.6% ± 14.2% for 250 pg.mL1. The matrix effect
(data not shown). was also similar between the different concentrations: with a re-
The mixture of standards was used to adjust the MS parameters covery of 35.7% ± 1.3% for 1000 pg.mL1, 30.8% ± 3.2% for
in order to obtain the best sensitivity. Both the desolvation voltage 500 pg.mL1 and 26.2% ± 8% for 250 pg.mL1.
and source temperature modifications did not improved the
sensitivity. The gas flow was optimized between 500 and 800 L.h1 3.2. Workflow for the discovery of new LpAA
to an optimal value at 800 L.h1 in negative ionization mode and at
600 L.h1 in positive ionization mode. The radiofrequency (RF) only 3.2.1. Theoretical lipopeptides and LpAA library inspired by C14Asn
quadrupole offset voltage was set with an optimum value at 130 V and C12AsnGABA
in both ionization modes. These optimizations allowed to achieve To query the LpAA of interest in lipid extracts, a homemade
an average detection improvement of 15% for both the LpAA and database has been constructed based on an amide linkage between
lipopeptides compounds. a fatty acid and an amino acid or/and neurotransmitter (serotonin,
dopamine, GABA or histamine). The length of fatty acid, as usually
3.1.2. Sample preparation described in bacteria [30], was between 8 and 19 carbon atoms,
Two main protocols are typically used to extract fatty acid me- saturated or with one unsaturation (or one cyclopropane which
tabolites: liquid-liquid extraction (LLE) and solid phase extraction present the same mass default), with or without one hydroxyl
(SPE). Bligh and Dyer LLE using a mixture of MeOH, CHCl3 and H2O group. 28 putative fatty acids were generated and one of the 20
is used in limited number of studies [23], others used heptane and natural amino-acids or an ornithine has been added (588 mole-
ethyl acetate, instead of MeOH and CHCl3 to extract endocannobi- cules) or one neurotransmitter such as GABA, serotonin, dopamine
noid with efficient yield [24]. Nevertheless, the use of SPE after or histamine (84 molecules). Finally, each fatty acid linked to one
protein precipitation in a mixture of water and solvent (e.g. amino acid were conjugated to one neurotransmitter (serotonin,
methanol, acetone or acetonitrile) is classically used in lipidomic dopamine, GABA or histamine) to propose 1764 molecules. These
for this family of lipids. Different types of SPE sorbent are used: different associations generated at the end 2436 possible struc-
polymeric reverse-phase sorbent plate for free oxylipins [21], C18 tures. For each putative metabolite, structural drawing, elemental
cartridge combined with ACN elution for surfactine, a bacterial composition of the [M-H] and [MþH]þ molecular species with the
lipopeptide [25], C18 sorbent combined with hexane and iso- corresponding accurate m/z values have been generated and added
propanol elution for anandamide and N-Acyl-ethanolamine [26], or to Unifi or QuanLynx Waters tools (Database not shown).
normal phase SPE to extract endocannabinoid from human tissues
[27]. LLE and SPE could be combined to extract isoprostane [28] or 3.2.2. Acquisition of the data to provide putative candidate by
acyl aminoacid with a series of complex SPE enrichment step [8]. spectral analogy
Due to the ubiquity of lipids, no blank matrix is available to The lipid extracts were injected on the LC-Qq/TOF mass spec-
measure extraction yield, then a mixture of C12Asn, C14Asn, trometer to acquire data in MSE continuum and centroid recording,
C14AsnGABA and IS at a concentration of 1 ng. mL1 in solvent was in both positive and negative ionization modes. The continuum
used to assay the extraction. First, classic Bligh and Dyer extraction scan is required for the sample reprocessing with Unifi software,
was tested. Even with addition of an acid (0.1% of acetic acid or 0.1% but not for Quanlynx software. The analysis on continuum mode
of HCl) to extract acidic metabolite after protonation, the extraction generated heavy data (8 Giga octet per analyzed sample), compared
yield was very low and variable from one metabolite to another to the centroid one (1 Giga octet per analyzed sample), which is not
(data not shown). Then, two different strategies were tested: one suitable to analyze large series of sample under large throughput
using HLB SPE purification and another one using LLE extraction conditions. First, we used the Unifi software to increase probability
(Table S1). For SPE, standards and IS were homogenized in to find new LpAA or lipopeptides using the research of the neuro-
MeOH:H2O (2:1; v/v) or in MeOH:TRIS pH 9 (2:1; v/v). After a transmitter's common neutral losses or the expected fragment ions
centrifugation to precipitate the proteins, a dilution to 15% of by analogy to the fragmentations describes for the C12Asn, C14Asn
methanol was performed. The metabolites were eluted by ACN, and C12AsnGABA [31] assuming that the same fragmentation
MeOH and AcOEt in a first method, by MeOH and CH2Cl2 in a sec- pathways can occur under low energy collision conditions for the
ond, or by ACN, MeOH and CH2Cl2 in a last one. The best yield of LpAA homologues. Nevertheless, after several tests on bacterial
recovery (between 29% and 68%) for the 3 metabolites tested and samples, this application was unable to find candidates. Candidates
for the IS were obtained with the first method (Table S1). For LLE, were only identified in a concentrated standards mixture
the best results were obtained with ethyl acetate in presence of (1 ng mL1). Even when a match occurred in the database, Unifi
water. However, to obtain clear extract ready to inject in case of proposed a structure for the MS/MS associated fragment ions with
complex matrix such as bacteria or tissue, the protocol has been an erroneous interpretation. In our hands, identification of new
completed by a washing step with heptane to remove neutral lipid compounds using this software function worked only for metabo-
[29]. This latter step induced the loss of C14Asn and IS and a lack of lites present at a higher concentration than our metabolites of in-
reproducibility. So, SPE combined with ACN, MeOH and AcOEt terest. If the intensity threshold was enhanced at the maximum to
elution was chosen. identify a maximum of compounds, more than 50 000 matches,
impossible to check manually, were generated. In contrast, if this
3.1.3. Validation of the sample preparation threshold was not enhanced at the maximum, some LpAA were not
To validate the sample preparation, extractions of EcN pellets identified. In addition, when several compounds characterized by
(n ¼ 3; 2 independent experiments) were performed with different different molecular masses co-eluate, their respective molecular
concentrations of IS (250, 500 and 1000 pg mL1). In parallel, EcN ionic species were activated together and their respective product
pellets were extracted without internal standard which was added ions were recorded together. Consequently, for each precursor ion,
at the three concentrations at the end of the preparation. These the software attributes the same product ions without distinction
different protocols compared to the non-extracted ISTD allowed the of their origin. Sometimes, for one fragment ion of interest, the
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software indicated more than 50 precursors ions that should be m/z 311 and m/z 285 disappear at Elab ¼ 20 eV (Fig. 2(d)) and then,
checked manually. Finally, we concluded that the Unifi software the product ion spectrum was characterized by the exclusive
was unsuitable for the identification of LpAA in complex mixtures. presence of the expected fragment ions of [C13Asn-H] with less
Finally, we used QuanLynx (an application from MassLynx than 5 ppm of error (Table S2). However, a main signal arises at m/z
software, Waters usually applied to quantify metabolites) to auto- 327.1645 in addition to the peak at m/z 327.2274 ion (window in
matically query our candidates in the homemade database where Fig. 2(d)). The intensity of the peak at m/z 327.2274 was strongly
the precursor ions as deprotonated [MH]- molecules were added decreased at the high collision energy compared to the low collision
regardless of retention time. For each automatic match, which energy (window in Fig. 2(c)) while the intensity of its satellite peak
could be the natural isotopic peak or an isobaric isotopomer, we at m/z 327.1645 was very low at low energy. This suggests that the
had to check manually the presence of the natural isotopic cluster m/z 327.2274 ion was significantly less stable than its isobaric ion at
for each putative candidate in order to confirm that the match was m/z 327.1645 with an unknown structure.
the deprotonated molecule. Even if it was time consuming, the use Interestingly, at low collision energy (5 eV, Fig. 2(e)), the CID
of QuanLynx seems to be the best option for our purpose. This spectrum of m/z 327 of the synthetic C13Asn did not display frag-
workflow has been used to identify LpAA in lipid extracted from mentation which was not the case for the CID spectrum of the
EcN and L. animalis. We obtained 162 potential matches from the natural product under same collision conditions (Fig. 2(a)). This
2436 available compounds in the database, and after the iso- confirmed the fragility of unknown isobaric ions relative to
topologue verification, 25 of them were real matches that needed [C13Asn-H] and its satellite peaks of the m/z 328 - m/z 330 zone.
to be fully characterized. Finally, both the product ion spectra (Fig. 2(d) and (f)) of m/z 327
provided from biological mixture and from synthetic sample were
3.2.3. Characterization of the structure of a new LpAA: C13-Asn stackable as two identical fingerprints. The structure proposed to
The putative identification of C13-Asn by MassLynx was first the m/z 327.2274 ion was confirmed and the different product ions
done by attribution of its monoisotopic molecular mass of its CID spectrum were completely rationalized on the basis of the
(Mw ¼ 328.2317 Da) from the mixture separation in mLC-HRMS and [C13Asn-H] structure.
molecular deprotonation of compounds under negative ESI condi-
tions. MS/MS analyses suggest the proposed LpAA structure via its 3.2.3.2. Main displayed fragmentations in product ion spectra of the
gas phase fragmentations (through simple cleavages or rear- deprotonated C13-Asn. General interpretations of even-electron
rangements) of the deprotonated [LpAA-H] molecule. molecular ionic species are based on the following consider-
ations: (i) deprotonation can occur competitively at carboxylic acid,
3.2.3.1. Improvement of the chromatographic separation of C13-Asn. amide and enolizable ester sites resulting in a mixture of various
Using the chromatographic separation “conditions A”, the analyzed [LpAA-H] deprotomers [32], (ii) the negative (or positive) charge
selected ions were a broad peak cluster (ranging from m/z 326 to m/ exclusively promotes fragmentations under low collision energy
z 330, Fig. 2(a), (b)). Even if the peaks between m/z 328 and m/z 330 conditions and (iii) dissociations may yield simple cleavages as well
were the most intense signals persisting at higher Elab values, it was as rearrangements. The latter can occur directly or through step-
possible to detect peaks at the m/z 327 nominal values as expected wise processes (e.g. via isomerization into ion-dipole intermediates
for the [C13Asn-H] ion (window of Fig. 2(a)). In addition to the peak prior to complete dissociation) [33]. Due to the role of the charge,
at m/z 327.2274 (i.e., the [C13Asn-H] ion of interest), few isobaric different competitive bond cleavages can take place according to
ions, less intense than the neighboring satellite peaks ranging from the charge location.
m/z 328 and m/z 330, appeared between m/z 326.9867 and m/z The CID spectrum rationalization can allow the selection of the
327.9867. Consequently, the product ion spectrum exhibited a lot of most relevant collision energy to reach the best sensitivity for the
unexpected peaks impossible to interpret on the base of the [LpAA- elucidation of the LpAA molecule structure and the best specificity
H] ion structure. Indeed, recorded at Elab ¼ 5 eV, the product ion for its quantification. To illustrate this purpose, we detailed the
spectrum displays only few fragment ions at m/z 311.2354 dissociations of the [C13Asn-H] ion (m/z 327) activated under the
(15.9920 Da loss), m/z 295.2689 (31.9587 Da loss) and m/z 190.8965 ELab ¼ 20 eV conditions.
(136.3309 Da loss) which were inconsistent with dissociations of Favored loss of water from [C13Asn-H]. This abundant loss
the putative [C13Asn-H] ion at m/z 327.2274. These losses cannot be yielding m/z 309 was particularly specific and was observed inde-
attributed to fragmentations of the expected [C13Asn-H] ion (m/z pendently to the length of fatty acid moiety (its relative abundance
327.2274) but rather, either to its isobaric ions (at m/z 327.2682, m/z is larger than 50%). Indeed, its signal appeared as the base peak (at
327.1608, and m/z 326.9867) or to the other selected ions at the m/z ELab ¼ 20 eV, Fig. 2(f)) in the CID spectrum. It reached an optimum
328-m/z 330 scale. At higher collision energy (Fig. 2(b)), the pre- of 56.8% intensity relative to the total ionic current (TIC) at
vious unknown signals were maintained except m/z 190 which was ELab ¼ 20 eV as shown in the energy resolved mass spectrometry
shifted at m/z 183.0229. Furthermore, additional peaks at m/z (ERMS) breakdown curves (Fig. S1). Such water release did not
255.2102 and m/z 269.2231 appear in addition to the expected exceed an optimum of 10% of TIC (Table S2) for the most abundant
peaks at m/z 309, m/z 265, m/z 238, m/z 212, m/z 131, m/z 114 and m/ one as demonstrated from ERMS of the other studied deprotonated
z 96 (Table S2). The results obtained at higher collision energy [LpAA-H] species (ERMS not reported). Thus, the water loss must be
confirmed that fragmentations take place from either the isobaric assisted by the functional group of the AA side chain since this loss
ion mixture or/and higher mass precursor ions together, according is totally hinder from LpAA with non-polar AA moiety. Conse-
to different relative stabilities under low energy collision quently, the amide group must be deprotonated to drive a nucle-
conditions. ophilic attack at the carboxyl site yielding via cyclization, a
By improvement of chromatographic conditions (conditions B), tetrahedral intermediate (Scheme 1(a)). This one isomerized by
peaks at the m/z 327 nominal values (at 5 eV Fig. 2(c)) were almost CeOH bond cleavage into an OH ion/[(C13Asn-H)-OH] neutral
exclusively constituted by the [C13Asn-H] ion (m/z 327.2274). The complex from which OH removed one proton to the neutral and the
CID spectrum exhibited very weak intense peaks at m/z 311 and m/z resulting complex dissociated by water release and formation of
285 which were not expected. This suggested that the precursor [(C13Asn-H)-H2O] (m/z 309). This carboxylate derivate carries a
ions related to the isobaric compounds which co-elutes with nitrile leaving group capable of being subsequently released.
C13Asn, were more fragile toward the CID processes. The peaks at Consecutive losses of (H2O þ CO2) and (H2O þ CO2þHCN) yielding
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Fig. 2. Product ion spectra of m/z 327 generated from mLC-HRMS in negative ESI mode under the A separative conditions (a)e(b) and under the B conditions (c)e(d) from biological
sample, and by direct injection from synthetic C13Asn sample (e)e(f) under low energy collision conditions: (a)-(c)-(e) ELab ¼ 5 eV and (b)-(d)-(f) at ELab ¼ 20 eV. Normalized m/z
molecular zone in window of each product ion spectrum and in (a) and (b) the peak intensities of the m/z 100-m/z 310 scale were amplified by a factor of 50). In product ion spectra
(b) and (d), the used annotations of peaks (with intensity >5% of base peak) are (i) the asterisk (*) for expected precursor ion, (ii) the empty circle (B) for unexpected peaks and (iii)
the full circle (C) for expected peaks attributed to [C13Asn-H] (according to Table S2 in Supplementary Information).

m/z 265 and m/z 238. The CO2 loss consecutive to that of H2O was elimination of HCN and led to formation of m/z 238 as a deproto-
assisted by a 1e4 proton transfer from the amide enolizable a po- nated 2-alkyl-oxazoline form (Scheme 1(b)).
sition to the carbon atom which initially carried the CO2 lost to Competitive formation of complementary m/z 212 and m/z 114 ion
obtain the [(C13Asn-H)-H2O-CO2] enolate (m/z 265, Scheme 1(b)). pair. From the deprotomer molecular species (originated from the
Consecutively, the alkoxy site can assist the loss of the leaving CN water loss, with the charge at the enolizable position of the amide
group through internal nucleophilic substitution. By this way, the group of Asn), the moiety side chain migrated concomitantly with
CN ion/[(C13Asn-H)-(H2O þ CO2þCN] neutral complex was formed, proton from the neighbored carboxylic acid group. This step led to
and internal proton transfer from enamine site to CN allowed the the RCONH-CH bond cleavage yielding ion/dipole complex

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Scheme 1. Proposed formation of major product anions from the LpAA C13Asn (m/z 327) product anion.

constituted by deprotonated maleic acid monoamide and fatty acid metabolites fully characterized and identified. Two orthogonal
amide. This complex can directly dissociated to release the fatty analysis methods of an authentic chemical standard analyzed in the
acid amide leading to formation of m/z 114 (ion [z-2H]ˉ) or after an same laboratory is mandatory for this level of identification. In
inter-partner proton transfer, the isomerized complex can decom- addition, the standard should be compared to experimentally
posed into fatty acid amidate (ion Lpcˉ, m/z 212) (Scheme 1(c)). identified metabolite in the same laboratory with the same
Formation of deprotonated asparagine (m/z 131). The COeNH analytical method [34]. These 54 compounds were identified with a
bond cleavage was promoted by the neighbored negative charge level 3 of identification corresponding to metabolites with incom-
at the enolizable position of the amide linkage combined with plete or putative annotation. However, this method didn't allow the
proton migration from carboxylic group to nitrogen site. By this identification of LpAA with serine, ornithine, methionine, alanine,
pathway, the fatty acid ketene was directly released (Scheme 1(d)) cysteine and threonine.
and was not enough acid to form an ion/dipole by molecular species We decided to characterize the most abundant LpAA and at least
isomerization prior to dissociation. one per family. We focused on the whole LpAsn family (C12:1Asn,
After C13Asn full fragment pattern elucidation, the same iden- C14:1Asn, C15Asn, C16:1Asn, C17Asn, C17:1Asn), and on C12Lys,
tification has been expanded to other LpAA found by suspect C14Lys, C12Glu, C14Glu, C16Glu, C12Asp, C12Gln, C12Val, C12Trp,
screening experiments performed on a LC-LRMS/MS using triple C12Arg, C12His, C12Leu, C12Ile, and C14Phe. These compounds
quadrupole instrument more sensitive than the Qq/TOF tandem. were synthetized (except C12Arginine which were purchased from
From previous MS [2] characterization, it could be possible to Sigma Aldrich) to be fully characterized by MS [2], with an identi-
predict theoretical MS/MS according to the alkyl chain length and fication level 1 or level 2, to permit construction of the quantitative
to the deprotonated amino acid as product anions. These MRM method (Table S2).
transitions were programmed on mLC-QqQ method to analyze
bacterial extracts. Due to the improved sensitivity, this approach
3.2.3.3. Full characterization of 22 new bacterial LpAA.
permitted to find 54 putative new LpAA: C14:1Asn, C15Asn,
Following the principle of elucidation detailed for the C13Asn, 22
C16Asn, C16:1Asn, C17Asn, C17:1Asn, C12:1Leu/Ile, C13Leu/Ile,
LpAA were fully characterized with their fragmentation pattern
C14Leu/Ile, C14:1Leu/Ile, C15Leu/Ile, C15:1Leu/Ile, C16Leu/Ile,
(Table S2). These 22 molecules were composed by a fatty acid (from
C16:1Leu/Ile, C17Leu/Ile, C17:1Leu/Ile, C18Leu/Ile, C18:1Leu/Ile,
C12 to C17) conjugated to one of 12 following amino acid: aspar-
C12Gln, C12:1Gln, C13Val, C14Val, C14:1Val, C15Val, C16Val,
agine, arginine, aspartate, glutamine, glutamate, histidine, leucine/
C16:1Val, C17:1Val, C18Val, C12Glu, C12:1Glu, C16Glu, C15:1Glu,
isoleucine, lysine, phenylalanine, tryptophan and valine. The dis-
C16Glu, C17:1Glu, C12Lys, C12:1Lys, C14Lys, C15Lys, C16Lys,
sociations presented in section 3.2.3.2 (Scheme 1) were similar for
C16:1Lys, C17Lys, C17:1Lys, C12:1Phe, C13Phe, C14Phe, C14:1Phe,
all the LpAsn (except the product ions containing the fatty acid
C15Phe, C15:1Phe, C16Phe, C16:1Phe, C17Phe, C17:1Phe, C18Phe
moiety) to those displayed in the product ion spectra of the
and C18:1Phe. These compounds were identified in LC-LRMS,
deprotonated C12Asn, C12:1Asn, C14Asn, C14:1Asn, C15Asn,
without a level 1 of identification which correspond to
C16Asn, C17Asn and C17:1Asn molecules.
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The consecutive losses of (H2O þ CO2) and (H2O þ CO2þHCN) took place favorably from [LpGln-H]. When this amide group was
presented in section 3.2.3.2 (Scheme 1 (b)) yielding m/z 265 and m/z exchanged by a carboxyl group (i.e., Asp and Glu), only the fatty acid
238 for the C13Asn, were specific to the LpAsn family (Lp being amidate, Lpcˉ, was detected with an intensity of 38% of TIC for
C12:1, C12, C13, C14:1, C14, C15, C16:1, C16, C17:1 and C17) and to [LpAsp-H] and 4% at maximum for [LpGlu-H]. However, the abun-
LpGln and LpHis even if the abundance of these ions were low dance reduction of Lpcˉ, [z-2H] and yˉ (or their disappearance) was
(Table S2). The loss of water of the [C12Gln-H]ˉ (m/z 327) was accompanied by a strong emergence of fatty acid carboxylate (i.e.,
strongly reduced to 4% compared to the 56.8% observed for [C13Asn- [Lpb þ O]) and deprotonated amino-acid anhydride (i.e., [y-H2O]) as
H] (m/z 327). Such a difference has been already described for the a complementary product ion pair. This regeneration of deproto-
dissociation of the free [Asp-H] and [Glu-H] anion. Concerning the nated fatty acid was specific to the [LpAsp-H] and [LpGlu-H] pre-
observed (H2O þ CO2þHCN) loss sequence of the [C12His-H] ion (m/ cursor ions. For LpAA conjugates with basic AA moieties (i.e., Lys,
z 336), the previous proposed mechanisms cannot be involved. The Arg and His), with aromatic side chain (Phe and Trp) and with non-
water loss was possible, due to the large gas phase acidity of the polar amino acids (Val, Leu and Ile), these above competitive ion
imidazole group of the histidine moiety and induced a bicyclic sys- pairs were replaced by deprotonated amino-acid (y) with abun-
tem from which, the consecutive losses of CO2 and (CO2þHCN) were dance higher than 30% (except for Arg). The y abundance was re-
produced by dissociation pathways as reported in Scheme S1. enforced (>50% of TIC) mainly from non-polar side chain AA.
The formation of the fatty acid amidate (ion Lpcˉ, Fig. 1(b)) and To conclude, the 22 LpAA discovered in this study were char-
its complementary [z-2H] ion specifically occurred from LpAA with acterized by MS [2], but to reach the level 1 of identification, it was
amide group on the side chain of amino-acid moiety (Asn and Gln) necessary to compare the candidates to the pure synthesized
via a similar mechanism (Scheme 1(c)). Note that in competition compounds which allow to verify the fragmentation pattern and
with this ion pair, formation of deprotonated amino acid (i.e., yˉ) the retention time.

Table 1
Comparison of discovered aminolipids measured in bacterial sample and pure synthetized compounds: retention time (RT) comparison with RSD% calculation, m/z with error
ppm.

RT LC-HRMS (min) % RT LC-LRMS (min) % Elementary composition m/z calculated [M  H]- m/z experimental (HRMS) Erreur (ppm)
RSD RSD

C12-ASN Synthesized 3.72 0,56 5.89 0,36 C16H30N2O4 313.2132 313.2119 4.4
Sample 3.75 5.86 313.2120 4.1
C12:1-ASN Synthesized 5.70 0,12 4.81 0,14 C16H28N2O4 311.1976 311.1972 1.4
Sample 5.69 4.80 311.1980 1.2
C13-ASN Synthesized 5.42 1,16 7.04 0,40 C17H32N2O4 327.2289 327.2274 4.7
Sample 5.51 7.00 327.2274 4.7
C14-ASN Synthesized 6.60 0,63 8.18 0 C18H34N2O4 341.2445 341.2443 0.8
Sample 6.66 8.18 341.2446 0.1
C14:1-ASN Synthesized 7.68 0,27 6.79 0 C18H32N2O4 339.2289 339.2278 3.3
Sample 7.65 6.79 339.2296 2.0
C15-ASN Synthesized 8.69 0,24 9.34 0,07 C19H36N2O4 355.2602 355.2599 0.9
Sample 8.66 9.33 355.2605 0.8
C16-ASN Synthesized 7.27 0,88 10.51 0 C20H38N2O4 369.2758 369.2752 1.8
Sample 7.18 10.51 369.2769 2.8
C16:1-ASN Synthesized 9.66 0,14 8.91 0 C20H36N2O4 367.2602 367.2600 2.1
Sample 9.64 8.91 367.2602 0.1
C17-ASN Synthesized 8.14 0,77 11.67 0,06 C21H40N2O4 383.2915 383.2914 0.3
Sample 8.23 11.68 383.2914 0.3
C17:1-ASN Synthesized 8.18 0,25 9.99 0 C21H38N2O4 381.2758 381.2758 0.1
Sample 8.15 9.99 381.2752 1.8
C12-ARG Synthetized 2.30 0,61 3.09 0,45 C18H36N4O3 355.2714 355.2714 0.1
Sample 2.32 3.07 355.2714 0.1
C12-ASP Synthesized 5.48 0,25 6.83 0 C16H29NO5 314.1972 314.1974 0.1
Sample 5.46 6.83 314.1941 10.2
C12-GLN Synthetized 4.63 0,30 5.86 0,36 C17H32N2O4 327.2289 327.2288 0.4
Sample 4.61 5.83 327.2277 3.8
C12-GLU Synthesized 5.42 0,39 6.84 0,10 C17H30NO5 328.2129 328.2122 2.2
Sample 5.45 6.83 328.2136 2.0
C14-GLU Synthesized 7.36 0,28 9.10 0 C19H34NO5 356.2422 356.2427 4.3
Sample 7.39 9.10 356.2420 6.3
C16-GLU Synthesized 9.33 0,07 11.37 0; 06 C21H38NO5 384.2755 384.2756 0.2
Sample 9.32 11.38 384.2755 0.1
C12eHIS Synthesized 2.19 1,59 2.96 0,47 C18H31N3O3 336.2292 336.2290 0.8
Sample 2.24 2.94 336.2303 3.1
C12-LYS Synthesized 2.12 0,99 2.89 0,49 C18H36N2O3 327.2653 327.2646 0.3
Sample 2.15 2.87 327.2653 0.1
C14-LYS Synthesized 3.57 0,98 4.57 0,76 C20H40N2O3 355.2966 355.2961 1.4
Sample 3.62 4.62 355.2959 2.0
C12-LEU/ Synthesized 8.73 0,24 8.68 0,16 C18H35NO3 312.2544 312.2540 1.3
LEU Sample 8.76 8.66 312.2542 0.7
C14-PHE Synthesized 10.84 0,32 13.00 0,05 C23H37NO3 374.2700 374.2699 0.4
Sample 10.79 12.99 374.2700 0.1
C12-TRP Synthesized 8.26 0,51 10.04 0 C23H34N2O3 385.2496 385.2496 0.1
Sample 8.20 10.04 385.2497 0.1
C12-VAL Synthetized 7.95 0 9.81 0 C17H33NO3 298.2387 298.2379 2.9
Sample 7.95 9.81 298.2387 0.1

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3.2.4. Validation for the discovered structures bias, energy collision and Q3 pre bias were automatically optimized
So pure synthesized standards were analyzed in the same by the software. For example for the C13Asn metabolite, the
conditions than bacterial extracts, and HRMS analyses permitted to quantitative transition was {m/z 327}/{m/z 309} corresponding to
confirm m/z ratios and retention time (Table 1). Herein, even with the [M  H]/[(M  H2O)eH-] and the two qualitative transitions
the use of standards, the double bond or hydroxyl positions on fatty were {m/z 327}/{m/z 212} corresponding to the [M  H]-/
acid moiety could not be determined. The level of annotation for [(RCONH2)-H-] and {m/z 327}/{m/z 131} corresponding to the
each LpAA characterized is indicated in Table 1. [M  H]-/[(Amino acid)-H-]. The same transition (qualitative and
Even if LpAA composed by Phe and Val associated to C20:4, quantitative) scheme was effective for all the LpAA in this study,
C22:6 or C18:1 fatty acid have been described in brain [8], from the and are report in Table 2 (the second qualitative transition is not
2200 theoretical aminolipids database, we identified 10 new LpAA shown). Collision energy were optimized to obtain the best
in EcN (Escherichia coli strain Nissle 1917): C13Asn, C14:1Asn, detection for each standard (Table 2).
C15Asn, C16Asn, C16:1Asn, C17:1Asn, C12Glu, C12Lys, C12His and
C12Asp; and 15 LpAA in Lactobacillus animalis: C12Arg, C14Glu,
3.3.2. Sensitivity, linearity and reproducibility of the method
C12Lys, C14Lys, C12His, C12Gln, C12Asp, C14:1Asn, C16:1Asn,
To study the sensitivity and the linearity of the quantitative
C15Asn, C12Trp, C12Val, C12Leu/Ile, C16Asn and C14Phe.
method, calibration lines with 10 calibration points from 0.004 to
1250 pg ml1 (with 600 pg mL1 of IS) were analyzed 3 times in
triplicates. The limit of detection (LOD) used in the analytical
3.3. Quantification of new aminolipid in bacteria
method of biological samples was defined as the level with a signal-
to-noise ratio (S/N) of 3. The limit of quantification (LOQ) was
3.3.1. Development of a sensitive method by LC-MS/MS
determined by measuring the level with a signal-to-noise ratio (S/
To study these new aminolipid in bacteria or in complex ma-
N) greater than 10 and with an accuracy and precision within the
trixes such as intestines or stools it is essential to develop a robust
range of 80e120%. The accuracy and the precision of all 10 cali-
sensitive and quantitative method. As we gave priority to sensi-
bration points above LOQ were in the range of 85e115%. The Linear
tivity in front of resolution, we developed this method on a LR-MS
dynamic range was determined as the range from LOQ to the
triple quadrupole detection Shimadzu 8060 system coupled to a
highest calibration point corresponding to the conditions described
mLC. In order to achieve the necessary selectivity and sensitivity of
above (Table 2). Repeatability and precision were respectively
the method, the source parameter and the mass detection were
calculated using relative standard deviation (% RSD) and accuracy
optimized. For the source parameters nebulizer was assayed from 1
for all range of concentrations of pure standards in triplicates, they
to 5 L min1; desolvation line from 150 to 250  C; interface tem-
were under 2% (data not shown). The same experiment was done to
perature from 100 to 300  C; heating-block from 300 to 450  C,
assay the inter-day variations, calibration curves were analyzed
heating gas flow from 0 to 10 L min1, and finally dry gas at
twice, with 15 days between analyses, and RSD were under 5%. The
0 L min1 in order to obtain the best compromise. Analyses were
method allowed the quantification of LpAA with a great sensitivity
performed in Selected Reaction Monitoring (SRM) detection mode
with a LOQ between 0.39 and 1.56 pg injected, and a large linearity
using argon as a collision gas. Optimization for each compounds
range from LOD until 1250 pg injected.
were done automatically with LabSolution software. The quantifi-
cation transition chosen for each compound was the more abun-
dant, even if it was not a specific transition. The 2 transitions used 3.3.3. LpAA quantification in EcN and L. animalis
for qualitative analysis were chosen among the most abundant Our quantitative method has been used to study LpAA synthesis
with exclusion of the quantitative transition. The values of Q1 pre by a gram negative bacteria EcN and a gram positive Lactobacillus

Table 2
SRM characterization with quantitative and qualitative transition, energy applied to generate the transition (EC et Q1/Q3PreBias), Linear regression equation and correlation
R2.

Compound Linear regression R2 LOD LOQ Quantitative MRM Q1 Pre Bias (V) EC (eV) Q3 Pre Bias (V) Qualitative MRM
(pg.mL1) (pg.mL1) transition transition

C12:1Asn y ¼ 49290x - 173866 0.9990 0.39 1.56 312 / 293 30 15 13 311 / 183
C13Asn y ¼ 63564x - 222566 0.9984 0.19 1.56 327 / 309 34 18 15 327 / 212
C14:1Asn y ¼ 132014x - 110079 0.9977 0.19 0.78 339 / 321 14 17 22 339 / 224
C15Asn y ¼ 25510x - 65143 0.9996 0.39 1.56 355 / 240 25 24 16 355 / 337
C16Asn y ¼ 64907x - 151246 0.9990 0.19 0.39 369 / 351 15 20 16 369 / 254
C16:1Asn y ¼ 53376x - 199389 0.9995 0.78 1.56 367 / 349 28 20 26 367 / 252
C17Asn y ¼ 137315x - 20177 0.9978 0.39 0.78 383 / 365 15 20 18 383 / 96
C17:1Asn y ¼ 40608x - 117983 0.9989 0.19 0.78 381 / 363 14 25 10 381 / 266
C12Arg y ¼ 15767x - 105656 0.9988 0.04 0.78 355 / 131 20 26 20 355 / 131
C12Asp y ¼ 44937x - 317123 0.9950 0.19 0.78 314 / 198 24 23 21 314 / 199
C12Gln y ¼ 22434x - 40015 0.9985 0.19 0.39 327 / 198 24 28 23 327 / 127
C12Glu y ¼ 27518x - 86993 0.9991 0.19 1.56 328 / 198 10 20 20 328 / 128
C14Glu y ¼ 49107x - 214246 0.9983 0.19 0.78 356 / 226 26 22 24 356 / 128
C16Glu y ¼ 1262x - 19015 0.9943 0.19 0.78 384 / 255 30 23 8 384 / 128
C12His y ¼ 30227x - 77911 0.9987 0.39 0.78 336 / 110 25 27 10 336 / 154
C12Leu y ¼ 181029x - 418227 0.9990 0.04 1.56 313 / 130 13 29 26 312 / 268
C12Ile y ¼ 236326x - 425633 0.9985 0.04 1.56 313 / 130 12 29 26 312 / 268
C12Lys y ¼ 45468x - 202933 0.9976 0.19 1.56 327 / 145 13 25 27 327 / 283
C14Lys y ¼ 70865x - 401950 0.9988 0.19 0.78 355 / 145 14 25 27 355 / 311
C14Phe y ¼ 81754x - 29953 0.9981 0.19 0.78 374 / 164 15 24 29 374 / 226
C12Pro y ¼ 77314x - 52780 0.9975 0.19 1.56 296 / 114 21 21 11 296 / 198
C12Trp y ¼ 46967x - 173680 0.9987 0.19 1.56 385 / 203 14 21 20 285 / 256
C12Val y ¼ 180951x - 433184 0.9988 0.04 0.39 298 / 116 22 22 12 298 / 254

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animalis. In wild-type EcN, we quantified the C12Asn, C13Asn, (PPTase) essential for the activation of the NRPS and PKS enzymes
C14Asn, C14:1Asn, C15Asn, C16Asn, C16:1Asn, C17:1Asn, C12Glu, [39], is mandatory for the biosynthesis of colibactin [35] but is also
C12Asp, C12AsnBABA and C12AsnGABA, and in Lactobacillus ani- involved in the biosynthesis of other bioactive metabolites such as
malis the C12Lys, C14Lys, C12His, C12Gln, C12Asp, C14:1Asn, the siderophores enterobactin, salmochelin and yersiniabactin [40].
C16:1Asn, C15Asn, C17Asn, C12Trp, C12Val, C12Leu, C16Asn and Following activation by ClbA, the initiating NRPS ClbN uses Asn as a
C14Phe (Fig. 3, Table S3). substrate to generate an N-myristoyl-D-Asn (C14Asn). The NRPS-
EcN is known to harbour a genomic island, named pks, which PKS assembly line continues the synthesis of precolibactin com-
carries a cluster of genes that enables the synthesis of LpAA and of a pound(s) using malonyl-coA and different amino acids [36e38] as
genotoxin called colibactin [35e38]. This toxin is produced by a substrates. The precolibactin is then cleaved by peptidase ClbP to
complex biosynthetic machinery involving the sequential action of liberate colibactin and N-myristoyl-D-Asn [36e38].
proteins ClbA to ClbS [39]. ClbA, a phosphopantetheinyl transferase In order to determine the implication of ClbA, ClbN and ClbP in
the synthesis of the different identified lipids, LpAA were quantified
in EcN wild type, in EcN deleted for ClbA, ClbN or ClbP, and in L.
animalis. Hierarchical clustering of LpAA amounts quantified in
bacterial pellets (pg/mg of proteins) was used to reveal the main
differences between them (Fig. 3). LpAA formed 4 different clusters.
The first cluster was constituted by LpAA with a concentration
decreased in EcN DclbA, DclbP and DclbN compared to EcN WT and
not expressed in L. animalis. The synthesis of these LpAA was
dependent on clbA, clbN and clbP as previously described for the
C14asn. The second cluster discriminated LpAA which need clbN
and clbP but not clbA to be produce and not present in L. animalis.
The third cluster was composed by LpAA expressed in EcN deleted
for ClbN and ClbP, and in L. animalis. Finally, the fourth cluster was
composed by LpAA expressed mainly in L. animalis. All together
these data indicated that these gram negative and gram positive
bacteria produced LpAA. In addition, a single deletion of genes
modified not only the concentration but also the nature of LpAA
demonstrating the importance to quantify a large panel of LpAA
when studying bacterial metabolites.

4. Conclusion

In conclusion, we developed a workflow which potentially al-

lows the identification of the 2436 compounds of our database
using mass spectrometry. The structural determination of the
compounds by mass spectrometry and its validation with pure
synthetized standards are two important steps for the character-
ization of LpAA and lipopeptides as their low concentration do not
allowed their analysis either by NMR or/and by X-ray, which would
require more than several tens of mg and several mg, respectively.
This method allowed the characterization and quantification of 22
new LpAA in bacteria. Our quantitative method could be applied to
more complex matrix such as patient feces or biopsies in order to
determine the role of these bacterial molecules in diseases related
to microbiota dysbiosis. This method represents a unique oppor-
tunity to connect an innovative and quantitative method to clinical
applications to investigate LpAA synthesis by patient microbiota.

Funding resources

This work was supported by the French National Institutes of

Health (Inserm) and Region Occitanie. NC is a recipient of the grant
from ANR (ANR-18-CE14-0039-01) and NC & JBM are recipient of
the grant from ANR (ANR-20-CE14-0011-01).

Fig. 3. Heat map of LpAA and Lipoeptides quantified by LC-MS/MS. Data are shown CRediT authorship contribution statement
in a matrix format: Each row represents a single lipid, and each column represents a
bacterial strain: Escherichia coli strain Nissle 1917 wild type (EcN WT) or delated for
specific gene of the pks island (clbN, clbA or clbP) and Lactobacillus animalis (L. Anim.). Amandine Hueber: Conceptualization, Data curation, Visuali-
Each color patch represents the normalized quantity of lipid (row) in a bacterial strain zation, Investigation, Writing e original draft, Writing e review &
(column), with a continuum of quantity from bright green (lowest) to bright red editing. Camille Petitfils: Resources. Pauline Le Faouder: Re-
(highest). The pattern and length of the branches in the left dendrogram reflect the sources, Conceptualization. Geoffrey Langevin: Organic Synthesis.
relatedness of the lipids and in the top dendogram, the realatedness of the bacterial
strains. The dashed red lines are the dendrogram distance used to cluster lipids or
Alexandre Guy: Organic Synthesis. Jean-Marie Galano: Organic
bacteria. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader Synthesis. Thierry Durand: Organic Synthesis. Jean-François
is referred to the Web version of this article.) Martin: Visualization, Investigation. Jean-Claude Tabet: Writing e
11
A. Hueber, C. Petitfils, P. Le Faouder et al. Analytica Chimica Acta xxx (xxxx) xxx

original draft, Writing e review & editing. Nicolas Cenac: Writing P. Rostkowski, J. Hollender, Non-target screening with high-resolution mass
spectrometry: critical review using a collaborative trial on water analysis,
e original draft, Writing e review & editing, Supervision, Concep-
Anal. Bioanal. Chem. 407 (21) (2015) 6237e6255, https://doi.org/10.1007/
tualization, Project administration, Funding acquisition. Justine s00216-015-8681-7.
Bertrand-Michel: Conceptualization, Writing e original draft, [12] M.G.E. Guardian, P. He, A. Bermudez, S. Duan, S.S. Kaushal, E. Rosenfeldt,
Writing e review & editing, Supervision, Conceptualization, Project D.S. Aga, Optimized suspect screening approach for a comprehensive
assessment of the impact of best management practices in reducing micro-
administration, Funding acquisition. pollutants transport in the potomac river watershed, Water Res. X 11 (2021)
100088, https://doi.org/10.1016/j.wroa.2021.100088.
[13] A. Wang, R.R. Gerona, J.M. Schwartz, T. Lin, M. Sirota, R. Morello-Frosch,
Declaration of competing interest
T.J. Woodruff, A suspect screening method for characterizing multiple
chemical exposures among a demographically diverse population of pregnant
The authors declare that they have no known competing women in San Francisco, Environ. Health Perspect. 126 (7) (2018), 077009,
https://doi.org/10.1289/EHP2920.
financial interests or personal relationships that could have
[14] J.M. Colby, K.L. Thoren, K.L. Lynch, Suspect screening using LCeQqTOF is a
appeared to influence the work reported in this paper. useful tool for detecting drugs in biological samples, J. Anal. Toxicol. 42 (4)
(2018) 207e213, https://doi.org/10.1093/jat/bkx107.
[15] M. Pourchet, L. Debrauwer, J. Klanova, E.J. Price, A. Covaci, N. Caballero-Casero,
Acknowledgements H. Oberacher, M. Lamoree, A. Damont, F. Fenaille, J. Vlaanderen, J. Meijer,
M. Krauss, D. Sarigiannis, R. Barouki, B. Le Bizec, J.-P. Antignac, Suspect and
Mass spectrometry analysis were done on MetaToul (Toulouse non-targeted screening of chemicals of emerging concern for human bio-
monitoring, environmental health studies and support to risk assessment:
metabolomics & fluxomics facilities, www.metatoul.fr) which is
from promises to challenges and harmonisation issues, Environ. Int. 139
part of the French National Infrastructure for Metabolomics and (2020) 105545, https://doi.org/10.1016/j.envint.2020.105545.
Fluxomics MetaboHUB-ANR-11-INBS-0010. We would like to thank [16] I. Liakh, T. Sledzinski, L. Kaska, P. Mozolewska, A. Mika, Sample preparation
Hanna Kulyk-Barbier for helpful discussions. methods for lipidomics approaches used in studies of obesity, Molecules 25
(22) (2020) 5307, https://doi.org/10.3390/molecules25225307.
[17] P. Manirakiza, A. Covaci, P. Schepens, Comparative study on total lipid
Appendix A. Supplementary data determination using soxhlet, roese-gottlieb, Bligh & dyer, and modified Bligh
& dyer extraction methods, J. Food Compos. Anal. 14 (1) (2001) 93e100,
https://doi.org/10.1006/jfca.2000.0972.
Supplementary data to this article can be found online at [18] C.C. Teo, W.P.K. Chong, E. Tan, N.B. Basri, Z.J. Low, Y.S. Ho, Advances in sample
https://doi.org/10.1016/j.aca.2021.339316. preparation and analytical techniques for lipidomics study of clinical samples,
TrAC Trends Anal. Chem. (Reference Ed.) 66 (2015) 1e18, https://doi.org/
10.1016/j.trac.2014.10.010.
References [19] A. Dupuy, P. Le Faouder, C. Vigor, C. Oger, J.-M. Galano, C. Dray, J.C.-Y. Lee,
P. Valet, C. Gladine, T. Durand, J. Bertrand-Michel, Simultaneous quantitative
[1] P. Lepage, M.C. Leclerc, M. Joossens, S. Mondot, H.M. Blottie re, J. Raes, profiling of 20 isoprostanoids from omega-3 and omega-6 polyunsaturated
D. Ehrlich, J. Dore
, A metagenomic Insight into our gut's microbiome, Gut 62 fatty acids by LCeMS/MS in various biological samples, Anal. Chim. Acta 921
(1) (2013) 146e158, https://doi.org/10.1136/gutjnl-2011-301805. (2016) 46e58, https://doi.org/10.1016/j.aca.2016.03.024.
[2] S.D. Allison, J.B.H. Martiny, Resistance, resilience, and redundancy in microbial [20] K.A. Datsenko, B.L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in
communities, Proc. Natl. Acad. Sci. Unit. States Am. 105 (Supplement 1) (2008) Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. Unit. States Am.
11512e11519, https://doi.org/10.1073/pnas.0801925105. 97 (12) (2000) 6640e6645, https://doi.org/10.1073/pnas.120163297.
[3] A.E. Pe
rez-Cobas, A. Artacho, H. Knecht, M.L. Ferrús, A. Friedrichs, S.J. Ott, [21] P. Le Faouder, V. Baillif, I. Spreadbury, J.-P. Motta, P. Rousset, G. Che ^ne,
A. Moya, A. Latorre, M.J. Gosalbes, Differential effects of antibiotic therapy on C. Guigne
, F. Terce
, S. Vanner, N. Vergnolle, J. Bertrand-Michel,
the structure and function of human gut microbiota, PLoS One 8 (11) (2013), M. Dubourdeau, N. Cenac, LCeMS/MS method for rapid and concomitant
e80201, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080201. quantification of pro-inflammatory and pro-resolving polyunsaturated fatty
[4] T. Pe
rez-Berezo, J. Pujo, P. Martin, P. Le Faouder, J.-M. Galano, A. Guy, C. Knauf, acid metabolites, J. Chromatogr. B 932 (2013) 123e133, https://doi.org/
J.C. Tabet, S. Tronnet, F. Barreau, M. Heuillet, G. Dietrich, J. Bertrand-Michel, 10.1016/j.jchromb.2013.06.014.
T. Durand, E. Oswald, N. Cenac, Identification of an analgesic lipopeptide [22] J. Pujo, C. Petitfils, P. Le Faouder, V. Eeckhaut, G. Payros, S. Maurel, T. Perez-
produced by the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917, Nat. Commun. 8 Berezo, M. Van Hul, F. Barreau, C. Blanpied, S. Chavanas, F. Van Immerseel,
(1) (2017) 1314, https://doi.org/10.1038/s41467-017-01403-9. J. Bertrand-Michel, E. Oswald, C. Knauf, G. Dietrich, P.D. Cani, N. Cenac, Bac-
[5] J. Pujo, C. Petitfils, P. Le Faouder, V. Eeckhaut, G. Payros, S. Maurel, T. Perez- teria-derived long chain fatty acid exhibits anti-inflammatory properties in
Berezo, M. Van Hul, F. Barreau, C. Blanpied, S. Chavanas, F. Van Immerseel, colitis, Gut 70 (6) (2021) 1088e1097, https://doi.org/10.1136/gutjnl-2020-
J. Bertrand-Michel, E. Oswald, C. Knauf, G. Dietrich, P.D. Cani, N. Cenac, Bac- 321173.
teria-derived long chain fatty acid exhibits anti-inflammatory properties in [23] E.G. Bligh, W.J. Dyer, A rapid method of total lipid extraction and purification,
colitis, Gut 70 (6) (2021) 1088e1097, https://doi.org/10.1136/gutjnl-2020- Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8) (1959) 911e917, https://doi.org/10.1139/o59-
321173. 099.
[6] E. Pouteau, I. Meirim, S. Me
tairon, L.-B. Fay, Acetate, propionate and butyrate [24] A.A. Zoerner, S. Batkai, M.-T. Suchy, F.-M. Gutzki, S. Engeli, J. Jordan, D. Tsikas,
in plasma: determination of the concentration and isotopic enrichment by gas Simultaneous UPLCeMS/MS quantification of the endocannabinoids 2-
chromatography/mass spectrometry with positive chemical ionization: SCFA arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and ananda-
concentration and isotopic enrichment in plasma, J. Mass Spectrom. 36 (7) mide in human plasma: minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomeriza-
(2001) 798e805, https://doi.org/10.1002/jms.181. tion and degradation by toluene solvent extraction, J. Chromatogr. B 883e884
[7] R. Berkecz, F. To € mo€si, T. Ko
€ rmo€czi, V. Szegedi, J. Horva
th, T. Jan

aky, Compre- (2012) 161e171, https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2011.06.025.
hensive phospholipid and sphingomyelin profiling of different brain regions [25] M. Alajlani, A. Shiekh, S. Hasnain, A. Brantner, Purification of bioactive lip-
in mouse model of anxiety disorder using online two-dimensional (HILIC/RP)- opeptides produced by Bacillus subtilis strain BIA, Chromatographia 79
LC/MS method, J. Pharmaceut. Biomed. Anal. 149 (2018) 308e317, https:// (21e22) (2016) 1527e1532, https://doi.org/10.1007/s10337-016-3164-3.
doi.org/10.1016/j.jpba.2017.10.043. [26] C. Garst, M. Fulmer, D. Thewke, S. Brown, Optimized extraction of 2-
[8] B. Tan, D.K. O'Dell, Y.W. Yu, M.F. Monn, H.V. Hughes, S. Burstein, J.M. Walker, arachidonyl glycerol and anandamide from aortic tissue and plasma for
Identification of endogenous acyl amino acids based on a targeted lipidomics quantification by LC-MS/MS: endocannabinoid extraction from tissue and
approach, J. Lipid Res. 51 (1) (2010) 112e119, https://doi.org/10.1194/ plasma, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (5) (2016) 814e820, https://doi.org/
jlr.M900198-JLR200. 10.1002/ejlt.201500115.
[9] S.S. Andra, C. Austin, D. Patel, G. Dolios, M. Awawda, M. Arora, Trends in the [27] V. Mutemberezi, J. Masquelier, O. Guillemot-Legris, G.G. Muccioli, Develop-
application of high-resolution mass spectrometry for human biomonitoring: ment and validation of an HPLC-MS method for the simultaneous quantifi-
an analytical primer to studying the environmental chemical space of the cation of key oxysterols, endocannabinoids, and ceramides: variations in
human exposome, Environ. Int. 100 (2017) 32e61, https://doi.org/10.1016/ metabolic syndrome, Anal. Bioanal. Chem. 408 (3) (2016) 733e745, https://
j.envint.2016.11.026. doi.org/10.1007/s00216-015-9150-z.
[10] E.L. Schymanski, J. Jeon, R. Gulde, K. Fenner, M. Ruff, H.P. Singer, J. Hollender, [28] A. Dupuy, P. Le Faouder, C. Vigor, C. Oger, J.-M. Galano, C. Dray, J.C.-Y. Lee,
Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: commu- P. Valet, C. Gladine, T. Durand, J. Bertrand-Michel, Simultaneous quantitative
nicating confidence, Environ. Sci. Technol. 48 (4) (2014) 2097e2098, https:// profiling of 20 isoprostanoids from omega-3 and omega-6 polyunsaturated
doi.org/10.1021/es5002105. fatty acids by LCeMS/MS in various biological samples, Anal. Chim. Acta 921
[11] E.L. Schymanski, H.P. Singer, J. Slobodnik, I.M. Ipolyi, P. Oswald, M. Krauss, (2016) 46e58, https://doi.org/10.1016/j.aca.2016.03.024.
T. Schulze, P. Haglund, T. Letzel, S. Grosse, N.S. Thomaidis, A. Bletsou, [29] J. Dalli, R.A. Colas, M.E. Walker, C.N. Serhan, Lipid mediator metabolomics via
C. Zwiener, M. Ib
~ ez, T. Portole
an
s, R. de Boer, M.J. Reid, M. Onghena, U. Kunkel, LC-MS/MS profiling and analysis, in: M. Giera (Ed.), Clinical Metabolomics,
W. Schulz, A. Guillon, N. Noyon, G. Leroy, P. Bados, S. Bogialli, D. Stipani cev, Methods in Molecular Biology, vol. 1730, Springer New York, New York, NY,

12
A. Hueber, C. Petitfils, P. Le Faouder et al. Analytica Chimica Acta xxx (xxxx) xxx

2018, pp. 59e72, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7592-1_4. eukaryotic cells, Science 313 (5788) (2006) 848e851, https://doi.org/10.1126/
[30] H. Goldfine, Bacterial membranes and lipid packing theory, J. Lipid Res. 25 (13) science.1127059.
(1984) 1501e1507, https://doi.org/10.1016/S0022-2275(20)34423-0. [36] X. Bian, J. Fu, A. Plaza, J. Herrmann, D. Pistorius, A.F. Stewart, Y. Zhang,
[31] J. Pujo, C. Petitfils, P. Le Faouder, V. Eeckhaut, G. Payros, S. Maurel, T. Perez- R. Müller, In vivo evidence for a prodrug activation mechanism during col-
Berezo, M. Van Hul, F. Barreau, C. Blanpied, S. Chavanas, F. Van Immerseel, ibactin maturation, Chembiochem 14 (10) (2013) 1194e1197, https://doi.org/
J. Bertrand-Michel, E. Oswald, C. Knauf, G. Dietrich, P.D. Cani, N. Cenac, Bac- 10.1002/cbic.201300208.
teria-derived long chain fatty acid exhibits anti-inflammatory properties in [37] C.A. Brotherton, E.P. Balskus, A prodrug resistance mechanism is involved in
colitis, Gut 70 (6) (2021) 1088e1097, https://doi.org/10.1136/gutjnl-2020- colibactin biosynthesis and cytotoxicity, J. Am. Chem. Soc. 135 (9) (2013)
321173. 3359e3362, https://doi.org/10.1021/ja312154m.
[32] E. Darii, Y. Gimbert, S. Alves, A. Damont, A. Perret, A.S. Woods, F. Fenaille, J.- [38] M.I. Vizcaino, P. Engel, E. Trautman, J.M. Crawford, Comparative metabolomics
C. Tabet, First direct evidence of interpartner hydride/deuteride exchanges for and structural characterizations illuminate colibactin pathway-dependent
stored sodiated arginine/fructose-6-phosphate complex anions within salt- small molecules, J. Am. Chem. Soc. 136 (26) (2014) 9244e9247, https://
solvated structures, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 32 (6) (2021) 1424e1440, doi.org/10.1021/ja503450q.
https://doi.org/10.1021/jasms.1c00040. [39] de, E. Oswald, The enterobacterial genotoxins:
F. Taieb, C. Petit, J.-P. Nougayre
[33] R.B. Cole (Ed.), Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, cytolethal distending toxin and colibactin, EcoSal Plus 7 (1) (2016), https://
Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications, second ed., Wiley, doi.org/10.1128/ecosalplus.ESP-0008-2016 ecosalplus.ESP-0008-2016.
Hoboken, N.J, 2010. [40] P. Martin, I. Marcq, G. Magistro, M. Penary, C. Garcie, D. Payros, M. Boury,
[34] R.M. Salek, C. Steinbeck, M.R. Viant, R. Goodacre, W.B. Dunn, The role of M. Olier, J.-P. Nougayre de, M. Audebert, C. Chalut, S. Schubert, E. Oswald,
reporting standards for metabolite annotation and identification in metab- Interplay between siderophores and colibactin genotoxin biosynthetic path-
olomic studies, GigaScience 2 (1) (2013) 13, https://doi.org/10.1186/2047- ways in Escherichia coli, PLoS Pathog. 9 (7) (2013), e1003437, https://doi.org/
217X-2-13. 10.1371/journal.ppat.1003437.
[35] J.-P. Nougayrede, Escherichia coli induces DNA double-strand breaks in

13
Table 1: Comparison of discovered aminolipids measured in bacterial sample and pure compounds: RT comparison, m/z with error ppm and %RSD.
m/z
RT LC-HRMS RT LC-LRMS Elementary m/z experimental Erreur
%RSD %RSD calculated
(min) (min) composition (HRMS) (ppm)
[M-H]-

Synthesized 3.72 5.89 313.2119 4.4

C12-ASN 0,56 0,36 C16H30N2O4 313.2132
Sample 3.75 5.86 313.2120 4.1

Synthesized 5.70 4.81 311.1972 1.4

C12:1-ASN 0,12 0,14 C16H28N2O4 311.1976
Sample 5.69 4.80 311.1980 1.2

Synthesized 5.42 7.04 327.2274 4.7

C13-ASN 1,16 0,40 C17H32N2O4 327.2289
Sample 5.51 7.00 327.2274 4.7

Synthesized 6.60 8.18 341.2443 0.8

C14-ASN 0,63 0 C18H34N2O4 341.2445
Sample 6.66 8.18 341.2446 0.1

Synthesized 7.68 6.79 339.2278 3.3

C14:1-ASN 0,27 0 C18H32N2O4 339.2289
Sample 7.65 6.79 339.2296 2.0

Synthesized 8.69 9.34 355.2599 0.9

C15-ASN 0,24 0,07 C19H36N2O4 355.2602
Sample 8.66 9.33 355.2605 0.8

C16-ASN Synthesized 7.27 0,88 10.51 0 C20H38N2O4 369.2758 369.2752 1.8

 Sample 7.18 10.51 369.2769 2.8

Synthesized 9.66 8.91 367.2600 2.1

C16:1-ASN 0,14 0 C20H36N2O4 367.2602
Sample 9.64 8.91 367.2602 0.1

Synthesized 8.14 11.67 383.2914 0.3

C17-ASN 0,77 0,06 C21H40N2O4 383.2915
Sample 8.23 11.68 383.2914 0.3

Synthesized 8.18 9.99 381.2758 0.1

C17:1-ASN 0,25 0 C21H38N2O4 381.2758
Sample 8.15 9.99 381.2752 1.8

Synthetized 2.30 3.09 355.2714 0.1

C12-ARG 0,61 0,45 C18H36N4O3 355.2714
Sample 2.32 3.07 355.2714 0.1

Synthesized 5.48 6.83 314.1974 0.1

C12-ASP 0,25 0 C16H29NO5 314.1972
Sample 5.46 6.83 314.1941 10.2

Synthetized 4.63 5.86 327.2288 0.4

C12-GLN 0,30 0,36 C17H32N2O4 327.2289
Sample 4.61 5.83 327.2277 3.8

Synthesized 5.42 6.84 328.2122 2.2

C12-GLU 0,39 0,10 C17H30NO5 328.2129
Sample 5.45 6.83 328.2136 2.0

C14-GLU Synthesized 7.36 0,28 9.10 0 C19H34NO5 356.2422 356.2427 4.3

 Sample 7.39 9.10 356.2420 6.3

Synthesized 9.33 11.37 384.2756 0.2

C16-GLU 0,07 0;06 C21H38NO5 384.2755
Sample 9.32 11.38 384.2755 0.1

Synthesized 2.19 2.96 336.2290 0.8

C12-HIS 1,59 0,47 C18H31N3O3 336.2292
Sample 2.24 2.94 336.2303 3.1

Synthesized 2.12 2.89 327.2646 0.3

C12-LYS 0,99 0,49 C18H36N2O3 327.2653
Sample 2.15 2.87 327.2653 0.1

Synthesized 3.57 4.57 355.2961 1.4

C14-LYS 0,98 0,76 C20H40N2O3 355.2966
Sample 3.62 4.62 355.2959 2.0

C12- Synthesized 8.73 8.68 312.2540 1.3

0,24 0,16 C18H35NO3 312.2544
LEU/LEU Sample 8.76 8.66 312.2542 0.7

Synthesized 10.84 13.00 374.2699 0.4

C14-PHE 0,32 0,05 C23H37NO3 374.2700
Sample 10.79 12.99 374.2700 0.1

Synthesized 8.26 10.04 385.2496 0.1

C12-TRP 0,51 0 C23H34N2O3 385.2496
Sample 8.20 10.04 385.2497 0.1

C12-VAL Synthetized 7.95 0 9.81 0 C17H33NO3 298.2387 298.2379 2.9

 Sample 7.95 9.81 298.2387 0.1

Table 2: SRM characterisation with quantitative and qualitative transition, energy applied to generate the transition (EC et Q1/Q3PreBias),
Linear regression equation and correlation R2.

Quantitative
Q1 Pre Q3 Pre Qualitative
Compound Linear regression R² LOD (pg.µL-1) LOQ (pg.µL-1) MRM EC (eV)
Bias (V) Bias (V) MRM transition
transition

C12:1Asn y = 49290x - 173866 0.9990 0.39 1.56 312 → 293 30 15 13 311 → 183

C13Asn y = 63564x - 222566 0.9984 0.19 1.56 327 → 309 34 18 15 327 → 212

C14:1Asn y = 132014x - 110079 0.9977 0.19 0.78 339 → 321 14 17 22 339 → 224

C15Asn y = 25510x - 65143 0.9996 0.39 1.56 355 → 240 25 24 16 355 → 337

C16Asn y = 64907x - 151246 0.9990 0.19 0.39 369 → 351 15 20 16 369 → 254

C16:1Asn y = 53376x - 199389 0.9995 0.78 1.56 367 → 349 28 20 26 367 → 252

C17Asn y = 137315x - 20177 0.9978 0.39 0.78 383 → 365 15 20 18 383 → 96

C17:1Asn y =40608x - 117983 0.9989 0.19 0.78 381 → 363 14 25 10 381 → 266

C12Arg y =15767x - 105656 0.9988 0.04 0.78 355 → 131 20 26 20 355 → 131
C12Asp y = 44937x - 317123 0.9950 0.19 0.78 314 → 198 24 23 21 314 → 199

C12Gln y = 22434x - 40015 0.9985 0.19 0.39 327 → 198 24 28 23 327 → 127

C12Glu y = 27518x - 86993 0.9991 0.19 1.56 328 → 198 10 20 20 328 → 128

C14Glu y = 49107x - 214246 0.9983 0.19 0.78 356 → 226 26 22 24 356 → 128

C16Glu y =1262x - 19015 0.9943 0.19 0.78 384 → 255 30 23 8 384 → 128

C12His y = 30227x - 77911 0.9987 0.39 0.78 336 → 110 25 27 10 336 → 154

C12Leu y = 181029x - 418227 0.9990 0.04 1.56 313 → 130 13 29 26 312 → 268

C12Ile y = 236326x - 425633 0.9985 0.04 1.56 313 → 130 12 29 26 312 → 268

C12Lys y = 45468x - 202933 0.9976 0.19 1.56 327 → 145 13 25 27 327 → 283

C14Lys y =70865x - 401950 0.9988 0.19 0.78 355 → 145 14 25 27 355 → 311

C14Phe y = 81754x - 29953 0.9981 0.19 0.78 374 → 164 15 24 29 374 → 226

C12Pro y = 77314x - 52780 0.9975 0.19 1.56 296 → 114 21 21 11 296 → 198

C12Trp y = 46967x - 173680 0.9987 0.19 1.56 385 → 203 14 21 20 285 → 256

C12Val y = 180951x - 433184 0.9988 0.04 0.39 298 → 116 22 22 12 298 → 254
 Supplementary Table S1:
Yield of extraction (%) for C12-Asn, C14-Asn, C14:1-Asn, C14-AsnGABA, IS in different
sample preparation conditions.
C12-Asn C14-Asn C14 1-Asn C14-AsnGABA IS

Crush : Tris/MeOH (2/1)

Solubilisation : MeOH/H2O
(85/15)
56 ±3 29±2 68±4 56±3 43±2
SPE HLB

Elution : 1 mL AcN, MeOH,

AcOEt

Crush: MeOH/H2O (85/15)

SPE HLB 63±6 12±8 33±3 31±3 1±1

Elution: 1 mL MeOH CHCl2

Crush: MeOH/H2O (85/15)

SPE HLB
47±14 6±6 68±17 31±2 0.5±0.5
Elution: 1 mL AcN MeOH
CHCl2

Crush: Tris/MeOH (2/1)

LLE
76±5 14±5 24±6 33±5 20±0
Washing: heptane

Elution: AcOEt/H2O

157
 Supplementary Table S2: Accurate experimental m/z ratios from the main product ions(a),(b),(c)
for deprotonated LpAA molecules display in low collision energy product ion spectra under
(ELAB = 20eV and high resolution conditions, using Q/TOF MS) and corresponding elemental
composition of product ions and associated neutral losses. Experimental m/z deviation (giving
in ppm) for all product ions, by comparison with calculated m/z ratios for the proposed
elemental composition.
Product ions
Precursor [LpAA-
H]¯ ions selected m/z values Relative m/z values Error Elemental Formal neutral losses
from ESI source (experimental) abundances (%) (ppm) compositions
(calculated)

293.1870 56.4 293.1870 0.2 C16H25N2O3 H2O

267.2074 (b) 267.2078 1.5 C15H27N2O2 CO2

C12:1Asn 249.1972 (b)
249.1972 0.1 C15H25N2O (H2O + CO2)
MW : 312.2049
222.1860 3.9 222.1863 1.5 C14H24NO (CO2 + H2O + HCN)
[M-H]¯ : 311.1972
(1.4 ppm ; 4.4%) 196.1709 15.7 196.1706 1.1 C12H22NO(d) C4H5NO3

C16H27N2O4 131.0460 8.4 131.0456 1.6 C4H7N2O3 (f) C14H20O

114.0195 8.0 114.0191 1.5 C4H4NO3 C14H23NO

96.0090 3.1 96.0086 1.1 C4H2NO2 C14H25NO2

295.2023 44.2 295.2027 1.4 C16H27N2O3 H2O

(a)
269.2219 269.2234 5.7 C15H29N2O2 CO2
C12Asn(h) 251.2113 (a)
251.2128 6.3 C15H27N2O (H2O + CO2)
MW : 314.2205
(a)
224.2006 224.2019 6.2 C14H26NO (CO2 + H2O + HCN)
[M-H]¯ : 313.2119
(4.4 ppm ; 3.4%) 198.1855 34.6 198.1863 2.5 C12H24NO(d) C4H5NO3

C16H29N2O4 131.0452 5.0 131.0456 7.5 C4H7N2O3(f) C12H22O

114.0188 5.1 114.0191 7.6 C4H4NO3 C12H25NO

96.0093 (a) 96.0086 2.1 C4H2NO2 C12H27NO2

309.2191 56.8 309.2184 2.4 C17H29N2O3 H2O

283.2376 (a) 283.2376 0.1 C16H31N2O2 CO2

C13Asn
MW : 328.2362 (a)
265.2285 265.2285 0.1 C16H29N2O (H2O + CO2)
(b)
[M-H]¯ : 327.2274 238.2173 238.2176 1.4 C15H28NO (CO2 + H2O + HCN)
(4.7 ppm ; 4.3%)
212.2008 23.5 212.2019 5.6 C13H26NO(d) C4H5NO3
C17H31N2O4
131.0454 3.8 131.0456 6.2 C4H7N2O3(f) C13H24O

114.0196 4.1 114.0191 0.6 C4H4NO3 C13H27NO

158
 (a)
113.0345 113.0356 2.2 C4H5N2O2 C13H26O2
(a)
96.0089 96.0086 2.1 C4H2NO2 C13H29NO2

323.2343 50.5 323.2340 0.6 C18H31N2O3 H2O

(a)
297.2536 297.2547 3.9 C17H33N2O2 CO2
C14Asn(h) 279.2440 (a)
279.2441 0.7 C17H31N2O (H2O + CO2)
MW : 342.2518
252.2325 (a) 252.2332 3.1 C16H30NO (CO2 + H2O + HCN)
[M-H]¯: 341.2443
(0.8 ppm ; 7.7%) 226.2174 27.6 226.2176 1.1 C14H28NO(d) C4H5NO3

C18H33N2O4 131.0453 4.0 131.0456 7.0 C4H7N2O3(f) C14H26O

114.0191 3.9 114.0191 5.0 C4H4NO3 C14H29NO

(a)
96.0086 96.0086 8.2 C4H2NO2 C14H31NO2

321.2175 60.5 321.2183 2.7 C18H29N2O3 H2O

295.2376 (b) 295.2391 5.0 C17H31N2O2 CO2

C14:1ASN 277.2279 (a)
277.2285 2.2 C17H30N2O (H2O + CO2)
MW : 340.236
250.2159 (b) 250.2176 6.9 C16H28NO (CO2 + H2O + HCN)
[M-H]¯ : 339.2278
(3.3 ppm ; 8.4%) 224.2020 19.2 224.2019 0.1 C14H28NO(d) C4H5NO3

C18H31N2O4 131.0462 6.2 131.0456 0.1 C4H7N2O3(f) C14H24O

114.0196 5.7 114.0191 0.6 C4H4NO3 C14H27NO

(b)
96.0080 96.0086 2.5 C4H2NO2 C14H29NO2

337.2496 53.2 337.2496 0.2 C19H33N2O3 H2O

311.2697 (b) 311.2704 2.3 C18H35N2O2 CO2

C15Asn 293.2593 (b)
293.2598 1.8 C18H33N2O (H2O + CO2)
MW : 356.2675
266.2482 (b) 266.2489 2.8 C17H32NO (CO2 + H2O + HCN)
[M-H]¯ : 355.2599
(0.9 ppm ; 13%) 240.2333 24.4 240.2338 0.1 C15H30NO(d) C4H5NO3

C19H35N2O4 131.0454 4.7 131.0456 6.2 C4H7N2O3(f) C15H28NO

114.0196 4.6 114.0191 0.6 C4H4NO3 C15H31NO

96.0088 (b) 96.0086 3.1 C4H2NO2 C15H33NO2

351.2648 52.8 351.2653 1.4 C20H37N2O3 H2O

C16Asn
MW : 370.2831 325.2851 (b) 325.2860 2.9 C19H37N2O2 CO2
(b)
[M-H]¯ : 369.2752 307.2751 307.2754 1.3 C19H35N2O (H2O + CO2)
(1.8 ppm ; 18.3%) (b)
280.2639 280.2645 2.5 C18H34NO (CO2 + H2O + HCN)
C20H37N2O3
254.2485 20.5 254.2489 1.7 C16H32NO(d) C4H5NO3

159
 131.0455 4.2 131.0456 6.2 C4H7N2O3(f) C16H30O

114.0191 4.1 114.0191 0.2 C4H4NO3 C16H33NO

96.0089 (b) 96.0086 1.1 C4H2NO2 C16H35NO2

349.2498 53.2 349.2496 0.4 C20H33N2O3 H2O

323.2701 5.3 323.2704 0.9 C19H35N2O2 CO2

C16:1Asn 305.2592 (b) 305.2598 2.1 C19H33N2O (H2O + CO2)
MW : 368.2675
(b)
278.2489 278.2489 0.1 C18H32NO (CO2 + H2O + HCN)
[M-H]¯: 367.2600
(2.1 ppm ; 29.8%) 252.2327 6.0 252.2328 2.3 C16H30NO(d) C4H5NO3

C20H35N2O3 131.0457 3.6 131.0456 3.9 C4H7N2O3(f) C16H28O

(b)
114.0194 114.0191 2.3 C4H4NO3 C16H31NO
(b)
96.0089 96.0086 2.1 C4H2NO2 C16H33NO2

363.2645 54.3 363.2653 2.2 C21H35N2O3 H2O

337.2848 3.2 337.2860 3.7 C20H37N2O2 CO2

C17:1Asn 307.2747 (b) 307.2754 2.6 C19H35N2O (H2O + CO2)
MW : 382.2831
292.2628 (b) 292.2645 6.1 C19H34NO (CO2 + H2O + HCN)
[M-H]¯ : 381.2758
(0.2 ppm ; 20.5%) 266.2480 15.0 266.2489 3.5 C17H32NO(d) C4H5NO3

C21H37N2O4 131.0451 3.8 131.0456 8.5 C4H7N2O3(f) C17H30NO

114.0185 3.2 114.0191 10.2 C4H4NO3 C17H33NO

(b)
96.0087 96.0086 0.3 C4H2NO2 C17H35NO2

365.2808 50.6 365.2809 0.5 C21H37N2O3 H2O

339.3013 3.6 339.3017 1.2 C20H39N2O2 CO2

C17Asn 321.2908 (b) 321.2911 1.0 C20H37N2O (H2O + CO2)
MW : 384.2988
(b)
294.2798 294.2802 1.5 C19H36NO (CO2 + H2O + HCN)
[M-H]¯ : 383.2914
(0.3 ppm ; 23.5%) 268.2646 15.2 268.2645 0.1 C17H34NO(d) C4H5NO3

C21H39N2O4 131.0460 3.7 131.0456 1.6 C4H7N2O3(f) C17H32NO

114.0197 3.4 114.0191 0.3 C4H4NO3 C17H35NO

(b)
96.0092 96.0086 1.0 C4H2NO2 C19H37NO2

338.2441 (a) 338.2449 2.4 C18H32N3O3 NH3

C12Arg
MW : 356.2787 313.2483 34.5 313.2496 0.8 C17H33N2O3 (CH2N2)
(b)
[M-H]¯ : 355.2715 311.2816 311.2816 0.1 C17H35N4O CO2
(0.1 ppm ; 21.2%)
269.2568 14.2 269.2598 7.2 C16H33N2O C2H2N2O2

160
 (b)
C18H35N4O3 252.2330 252.2332 1.1 C16H30NO C2H5N3O2
(b)
198.1845 198.1863 2.5 C12H24NO(d) C6H11N3O2

173.1022 16.7 173.1043 6.4 C6H13N4O2(f) C12H22O

(b)
156.0769 156.0778 6.0 C6H10N3O2 C12H25NO

131.0806 13.5 131.0826 6.9 C5H10N2O2 C13H25N2O

296.1842 (b) 296.1867 8.7 C16H26NO4 H2O

270.2060 16.5 270.2074 5.4 C15H28NO3 CO2

C12Asp 252.1946 (b)
252.1969 9.2 C15H26NO2 (H2O + CO2)
MW : 315.2045
199.1706 27.4 199.1703 1.2 C12H23O2 C4H5NO3
[M-H]¯: 314.1971
(0.1 ppm ; 5.0%) 198.1853 37.8 198.1863 5.2 C12H24NO(d) C4H4O4
(b)
C16H28NO5 132.0298 132.0302 3.2 C4H6NO4(f) C12H22O

115.0031 4.5 115.0036 5.1 C4H3O4 C12H25NO

88.0401 8.7 88.0404 3.4 C3H6NO2 C13H22O3

309.2188 4.0 309.2183 1.4 C17H29N2O3 H2O

283.2388 4.0 283.2391 1.1 C16H31N2O2 CO2

C12Gln
MW : 328.2362 (b)
265.2283 265.2285 0.3 C16H29N2O (H2O + CO2)
(b)
[M-H]¯ : 327.2288 238.2173 238.2176 1.4 C15H28NO (CO2 + H2O + HCN)
(0.4 ppm ; 21.7%)
198.1859 21.6 198.1863 2.2 C12H24NO(d) C5H7NO3
C17H31N2O4
145.0615 28.5 145.0618 2.5 C5H9N2O3(f) C12H22O

127.0513 20.2 127.0513 0.1 C5H7N2O2 C12H24O2

(b)
310.2023 310.2023 0.3 C17H28NO4 H2O

284.2231 17.3 284.2231 0.2 C16H30NO3 CO2

(b)
266.2122 266.2125 1.3 C16H28NO2 (H2O + CO2)
C12Glu
MW : 329.2202 240.2333 12.8 240.2332 0.1 C15H30NO (C2O4)

[M-H]¯ : 328.2122 199.1702 31.2 199.1703 0.8 C12H23O2(e) C5H7NO3

(2.2 ppm ; 6.0%)
198.1854 3.5 198.1863 4.7 C12H24NO(d) C5H6O4
C17H30NO5
146.0459 3.8 146.0458 0.1 C5H8NO4(f) C12H22O

128.0359 18.3 128.0353 4.5 C5H6NO3 C12H24NO2

102.0554 7.1 102.0555 0.1 C4H8NO2 C13H22O3

C14Glu 338.2332 3.2 338.2336 1.4 C19H32NO4 H2O

MW : 357.2515 312.2539 22.0 312.2544 1.7 C18H34NO3 CO2

161
 (b)
[M-H]¯ : 356.2427 294.2434 294.2438 1.5 C18H32NO2 (H2O + CO2)
(4.3 ppm ; 13.0%)
268.2647 8.0 268.2645 0.4 C17H34NO (CO2 + CO2)
C19H34NO5
227.2016 33.1 227.2016 0.2 C14H26O2(e) C5H8NO3
(b)
226.2162 226.2176 6.3 C14H28NO(d) C5H6NO4
(a)
146.0455 146.0458 2.6 C5H8NO4(f) C14H26O

128.0350 14.3 128.0353 2.5 C5H6NO3 C14H28O2

102.0557 3.4 102.0555 0.1 C4H8NO2 C15H26O3

366.2664 3.7 366.2649 3.8 C21H36NO4 H2O

340.2848 19.9 340.2857 2.7 C20H38NO3 CO2

(b)
322.2749 322.2751 0.8 C20H36NO2 (H2O + CO2)
C16Glu
MW : 385.2828 296.2957 3.7 296.2958 0.6 C19H38NO (CO2 + CO2)

[M-H]¯: 384.2756 255.2321 33.9 255.2329 3.3 C16H31O2(e) C5H7O3N

(0.2 ppm ; 25.6%) (b)
254.2488 254.2489 1.0 C16H32NO(d) C5H4O4
C21H38NO5
146.0455 13.3 146.0458 2.6 C5H8NO4(f) C16H30O

128.0350 (b) 128.0353 2.4 C5H6NO3 C16H32O2

(b)
102.0568 102.0555 7.3 C4H8NO2 C17H30O3
(b)
318.2190 318.2187 0.9 C18H28N3O2 H2O

292.2409 11.8 292.2394 5.0 C17H30N3O CO2

274.2302 7.7 274.2288 5.5 C17H28N3 (H2O + CO2)

C12His
(b)
MW : 337.2365 247.2185 247.2179 2.1 C16H27N2 (CO2 + H2O + HCN)

[M-H]¯ : 336.2310 199.1712 5.7 199.1703 4.2 C12H23O2 C6H7N3O

(5.5 ppm ; 27.2%) (b)
198.1862 198.1863 0.1 C12H24NO(d) C6H6N2O2
C18H30N3O3
154.0624 32.3 154.0621 1.3 C6H8N3O2(f) C12H22O
(b)
137.0356 137.0356 1.0 C6H5N2O2 C12H25NO

110.0721 15.1 110.0723 2.5 C5H8N3 C13H22O3

C12Leu 294.2417 (b) 294.2438 7.3 C18H32NO2 H2O

MW : 313.2616
268.2628 13.8 268.2645 1.3 C17H34NO CO2
[M-H]¯ : 312.2531 (a)
198.1847 198.1863 1.3 C12H24NO(d) C6H10O2
(4.2 ppm ; 19.1%)
65.4
C18H34NO3 130.0873 130.0873 6.5 C6H12NO2(f) C12H22O

(b)
294.2443 294.2438 1.5 C18H32NO2 H2O

162
 C12Ile 268.2642 23.2 268.2645 1.4 C17H34NO CO2
MW : 313.2616
198.1862 3.4 198.1863 0.3 C12H24NO(d) C6H10O2
[M-H]¯ : 312.2540
(1.3 ppm ; 5.1%)
130.0880 68.1 130.0873 5.0 C6H12NO2(f) C12H22O
C18H34NO3
(c)
310.XXXX 310.2387 C18H32NO3 NH3
C12Lys
MW : 328.2725 309.2552 (b) 309.2547 1.4 C18H33N2O2 H2O

[M-H]¯ : 327.2645 283.2747 22.5 283.2754 2.8 C17H35N2O CO2

(2.5 ppm ; 18.0%) (a)
198.1836 198.1863 1.3 C12H24NO(d) C6H11NO2
C18H35N2O3
145.0984 57.0 145.0982 1.0 C6H13N2O2(f) C12H22O
(c)
338.XXXX 338.2700 C20H36NO3 NH3
C14Lys
MW : 356.3038 (b)
337.2856 337.2860 1.3 C20H37N2O2 H2O

[M-H]¯ : 355.2959 311.3059 16.7 311.3068 2.8 C19H39N2O CO2

(2.0 ppm ; 38.6%) (a)
226.2175 226.2176 0.2 C14H28NO(d) C6H11NO2
C20H39N2O3
145.0980 44.7 145.0982 1.7 C6H13N2O2(f) C14H26O

356.2577 (b) 356.2595 5.0 C23H34NO2 H2O

(b)
330.2798 330.2802 1.3 C22H36NO CO2
C14Phe
MW : 375.277 238.2171 4.3 238.2173 2.3 C15H28NO C8H8O2

[M-H]¯ : 374.2697 226.2164 12.3 226.2176 0.6 C14H28NO(d) C9H8O2

(1.9 ppm ; 41.6%)
164.0718 35.8 164.0717 0.3 C9H10NO2(f) C14H26O
C23H36NO3
147.0451 5.9 147.0451 0.1 C9H7O2 C14H29NO
(b)
91.0554 91.0553 1.2 C7H 7 C16H29
(b)
367.2382 367.2391 2.5 C23H31N2O2 H2O

341.2587 7.9 341.2598 0.2 C22H33N2O CO2

(b)
323.2477 323.2492 4.9 C22H31N2 (H2O + CO2)
C12Trp
MW : 386.2569 256.1908 19.4 256.1918 0.3 C14H26NO3 C9H7N

[M-H]¯ : 385.2493 238.1812 6.7 238.1812 4.4 C14H24NO2 C9H9NO

(1.9 ppm ; 30.6%)
212.2008 4.8 212.2019 0.4 C13H26NO(d) C10H7NO2
C23H33N2O3
203.0816 30.6 203.0826 0.4 C11H11N2O2(f) C12H22O
(b)
159.0915 159.0927 0.2 C10H11N2 C13H22O3

116.0494 (b) 116.0505 0.1 C8H6N C15H27N

163
 (b)
74.0242 74.0247 0.5 C2H4NO2 C21H29NO
(b)
280.2281 280.2282 0.4 C17H30NO2 H2O
C12Val
MW : 299.2460 254.2482 25.7 254.2489 1.4 C16H32NO CO2
(b)
[M-H]¯: 298.2379 236.2375 236.2383 3.7 C16H30N (H2O + CO2)
(2.9 ppm ; 23.4%) (b)
198.1856 198.1863 3.7 C12H24NO(d) C5H8O2
C23H33N2O3
116.0712 51.0 116.0717 4.3 C5H10NO2(f) C12H22O

(a)
Detected product ion, with relative abundance lower than 3% at E LAB = 20eV but may be higher than this
abundance limit at different ELAB values.
(b)
Detected product ion with relative abundance lower than 3% of relative abundance.
(c)
Possible product ion never detected.
(d)
Deprotonated fatty acid amines with the side chain size related to the LpAA considered
(e)
Deprotonated fatty acid with the side chain size related to the LpAA considered
(f)
Deprotonated amino acid related to the LpAA considered
(g)
Fragment ions (without anticipating their origin) of the amino acid corresponding of LpAA
(h)
Deprotonated LpAA already described from Pujo et al, nature com. but recorded in other conditions (HCD
mode using quadrupole/orbitrap FT/MS instrument)

164
Supplementary Table 3: Quantification of LpAA in EcN and L. animalis. Data are
represented as the mean ± SEM in pg/mg of proteins. ND: not detectable, NQ: Not Quantifiable

EcN WT EcN DclbA EcN DclbN EcN Dclbp L. animalis

C12Arg ND ND ND ND NQ

C16Glu ND ND ND ND NQ

C16PheGABA ND ND ND ND ND

C12Lys ND 0.03 ± 0.01 0.22 ± 0.12 0.19 ± 0.09 0.15 ± 0.09

C12His ND 0.12 ± 0.05 0.14 ± 0.06 0.76 ± 0.29 3.083 ± 1.23

C14Lys ND 0.04 ± 0.02 0.08 ± 0.03 0.07 ± 0.04 0.07 ± 0.03

C12:1Asn ND ND ND ND ND

C12AsnAABA ND ND ND ND ND

C12AsnBABA 0.13 ± 0.01 0.019 ± 0.02 ND 20.4 ± 7.93 ND

C12AsnGABA 0.12 ± 0.003 ± 0.001 ND 1.16 ± 0.47 ND

0.005

C12Asn 4.55 ± 1.88 2.74 ± 1.43 ND 0.81 ± 0.29 ND

C12Gln ND ND ND ND 0.61 ± 0.04

C16GluGABA ND ND ND ND ND

C12Asp 0.07 ± 0.01 0.004 ± 0.002 0.001 ± 0.0009 0.004 ± 0.003 0.23 ± 0.11

C14:1Asn 3.22 ± 0.44 0.75 ± 0.09 ND 0.11 ± 0.04 0.03 ± 0.01

C13Asn 0.26 ± 0.03 0.67 ± 0.12 ND 0.14 ± 0.05 0.002 ± 0.001

C13AsnDopamine ND ND ND ND ND

C12Glu 0.03 ± ND ND ND ND
0.007

C14AsnGABA ND 0.005 ± 0.002 0.06 ± 0.04 0.03 ± 0.01 ND

C14:1AlaGABA ND ND ND ND ND

C14Asn 69.42 ± 41.49 ± 0.96 0.006 ± 0.003 12.00 ± 4.33 ND

4.23

C12ValGABA ND ND ND ND ND

C16:1Asn 1.89 ± 0.20 0.39 ± 0.09 ND 0.07 ± 0.02 0.23 ± 0.11

C12MetDopamine ND ND ND ND ND

C12LeuGABA ND ND ND ND ND

C15Asn 47.09 ± 59.66 ± 5.76 ND 11.64 ± 4.49 1.19 ± 0.61

3.92

165
C12Pro ND ND ND ND NQ

C14Glu ND ND ND ND NQ

C17:1Asn 0.29 ± 0.04 0.04 ± 0.01 ND 0.04 ± 0.01 ND

C12Trp ND ND ND ND 0.05 ± 0.02

C12Val ND ND ND ND 0.04 ± 0.02

C14GABA ND ND ND ND ND

C12Leu ND ND ND ND 0.24 ± 0.09

C16Asn 0.58 ± 0.05 0.17 ± 0.02 0.05 ± 0.02 0.06 ± 0.02 0.02 ± 0.01

C14IleGABA ND ND ND ND ND

C17Asn ND 0.011 ± 0.004 0.017 ± 0.007 0.019 ± 0.007 0.019 ± 0.009

C14Phe ND 0.006 ± 0.002 0.007 ± 0.003 0.009 ± 0.003 0.03 ± 0.01

C16LeuGABA ND ND ND ND ND

C12AlaGABA ND ND ND ND ND

166
Figure S1. Product ion spectra of m/z 327 generated from µLC-HRMS in negative ESI mode under
the A separative conditions (a)-(b) and under the B conditions (c)-(d) from biological sample, and by
direct injection from synthetic C13Asn sample (e)-(f) under low energy collision conditions: (a)-(c)-(e)
ELab = 5 eV and (b)-(d)-(f) at ELab = 20 eV. Normalized m/z molecular zone in window of each product
ion spectrum and in (a) and (b) the peak intensities of the m/z 100-m/z 310 scale were amplified by a
factor of 15 (ou 50). In product ion spectra (b) and (d), the used annotations of peaks (with intensity >
5% of base peak) are (i) the asterisk (*) for expected precursor ion, (ii) the empty circle (○) for
unexpected peaks and (iii) the full circle (●) for expected peaks.

Scheme S1: Proposed formation of major product anions from the LpAA C12His (m/z 336)
product anions

Les informations concernant la synthèse organique des composés sont en annexe 2.

167
Publication 2 : Nouveaux lipoaminoacides produits par Escherichia coli : origine
de l’ion fragment carboxylate d’acide gras, régénéré à partir de la dissociation
de l’anion lipo-glutamate

Résumé
L'amélioration des connaissances sur les lipoaminoacides est un point clé afin de
comprendre le rôle du microbiote intestinal dans la santé humaine à travers ses diverses
fonctions. L’élucidation structurale de ces composés est souvent réalisée en ESI à l’aide de
la spectrométrie de masse en tandem, généralement après fragmentation par dissociation
induite par collision. Généralement, les acides aminés sont analysés via le mode d’ionisation
positif, cependant nous avons préféré le mode d’ionisation négatif, qui procure l’avantage de
ne produire que peu d’ions fragments, mais suffisamment pour caractériser les structures des
composés. De cette manière, lors de notre précédente étude, nous avons identifié les LpGlu.
Dans cette présente étude, nous nous sommes intéressés aux mécanismes de fragmentation,
permettant ainsi d’obtenir des informations sur les structures des ions fragments du LpAA N-
palmytol acyl, lié à l’acide glutamate (noté C16Glu). Le comportement singulier du [C16Glu-
H]¯ sous CID mène à la production d’une dizaine d’ions fragments. Certains d’entre eux sont
décrits par des fragmentations attendues, alors qu’une paire abondante d’ions
complémentaires et inattendus est observée correspondant aux ions fragments [y-H2O]¯ et
[Lpb+O]¯ selon notre nomenclature. Spécifique au glutamate, ces ions produits sont formés
par un processus de dissociation par étapes, comportant une isomérisation moléculaire par
cyclisation formant un cycle à 7 chaînons, suivie de la formation d’un ion dipôle. Ce complexe
ion dipôle peut se dissocier soit directement par séparation des partenaires, soit après le
transfert de proton d’un partenaire vers l’autre. Selon le mécanisme direct de dissociation, la
régénération inattendue de l’acide gras déprotoné a lieu, de la même manière qu’elle est
observée lors de la fragmentation de peptides déprotonés quand il existe un ou plusieurs
résidus Glu (ou Asp) dans sa séquence. Les mécanismes proposés ont été confirmés à l’aide
des calculs quantiques (DFT), expliquant le comportement inattendu de cet anion [C16Glu-
H]¯. La longueur de la chaine lipidique ou la présence d’insaturation(s) sur cette chaine,
semble ne pas avoir une influence déterminante sur l’importance de ces ions fragments, ce
qui n’est pas le cas de l’acide aminé conjugué.

169
Résultats détaillés :

Formation d’ions fragments inattendus à partir du [C16Glu-H]− :

Lors de l’étape d’ionisation/désorption dans la source électrospray, seule la forme
déprotonée [C16Glu-H]¯ est détectée. Malgré la présence de deux acides carboxyliques, la
forme déprotonée n’est jamais accompagnée de la forme sodée [C16Glu+Na]¯). Cette forme
annotée [(C16Glu-H+Na)-H]¯ peut être distinguée de la forme cation solvatée qui est annotée
par l’écriture générique [C16Glu+Na]ˉ)359,260. Ces deux formes se distinguent à l’aide des
spectres d’ions fragments (spectres CID), la première forme conduit aux ruptures de liaisons
covalentes alors que la seconde, sous collision régénère le cation Na+360. Ainsi contrairement
aux composés constitués d’au moins deux groupes carboxylates qui conduisent à de telles
molécules sodées, le C16Glu n’est jamais cationisé même si des sels de sodium sont ajoutés
ou que la concentration de l’échantillon est fortement augmentée. Le sel déprotoné n’a donc
pas pu être utilisé pour démontrer quel site était déprotoné pour conduire à certains ions
fragments. L’alternative a été d’utiliser la méthylation régiosélective du groupe carboxylate de
la chaine latérale du résidu Glutamate.

Le spectre d’ions produits de l’ion sélectionné [C16Glu-H]¯ permet de mettre en

évidence la formation d’une dizaine d’ions fragments. Par comparaison avec les autres
aminolipides décrits comme les [LpAsn-H]¯, il était attendu de retrouver les ions fragments
[Lpc]¯ (m/z 254), [z-2H]¯ (m/z 129) et l’ion [(C16Glu-H2O)-H]ˉ (Figure 93).

Figure 93 : Annotation des ions fragments produits à partir du C16Glutamate

170
De manière surprenante, l’abondance relative de ces ions à 20 eV est fortement réduite
comparée aux [LpAsn-H]¯, puisqu’avec l’acide glutamique conjugué, ils sont inférieurs à 3,7%.
L’ion m/z 129 que nous observons correspond en réalité à l’isotopologue d’un ion m/z 128,
dont la composition élémentaire est de C413C1H6NO3 (1.7 ppm d’erreur), l’ion m/z 128 sera
12

noté comme étant [y-H2O]¯. De la même manière, nous détectons un ion fragment inattendu
de rapport m/z 255, qui pourrait correspondre à l’ion [Lpc+1]¯ (de composition élémentaire :
C1513CH32NO) mais qui correspond à l’ion isobare de composition C16H31O2 et sera annoté
comme [Lpb+O]¯. L’abondance relative de ces deux ions fragments sont respectivement de
34% ([Lpb+O]¯ , m/z 255) et de <3% ([Lpc]¯, m/z 254).

Mécanisme de fragmentations des ions m/z 255 et m/z 128 à partir du

[C16Glu-H]− :
Les ions m/z 255 (Lpb+O]¯) et m/z 128 ([y-H2O]¯) sont spécifiques au résidu
glutamate. Ils sont formés selon un processus de dissociation par étapes dû à une
isomerisation de l’espèce moléculaire [C16Glu-H]¯ en ion dipôle avant dissociation (Schéma
2). La première étape consiste en une attaque nucléophile régiosélective du carboxylate de
la chaine latérale de l’acide aminé sur la liaison amide (liaison C-N). Cette première étape
mène à la formation d’un intermédiaire hétérocyclique tétravalent à 7-chainons qui devient
défavorisé dès que le groupement carboxyle de la chaine latérale est méthylé. La seconde
étape est l’ouverture du cycle, induit par la charge de l’alcoolate, qui se fait par rupture de la
liaison C-N. Cette rupture est concomitante avec un transfert de proton de l’acide carboxylique
voisin sur le groupe NH libéré (ce groupe ne pouvant pas porter la charge négative car les
amines en phase gazeuse font parties des fonctions chimiques les moins acides).

Ainsi un anhydride alicyclique est formé avec un groupe carboxylate sur l’extrémité de
la chaine. Ce dernier peut à nouveau faire une attaque nucléophile sur le groupe C=O de
l’anhydride le plus proche, pour générer à nouveau un intermédiaire tétraédrique cyclique à
6-chainons. Le groupe alcoolate de cet intermédiaire induit la libération de l’acide gras ainsi
régénéré sous forme de carboxylate et d’un anhydride aminé cyclique à 6-chainons, qui reste
en interaction non covalente au sein d’un complexe ion-dipôle. Ce complexe peut évoluer de
deux manières, conduisant soit à sa dissociation directe donnant l’ion m/z 255 [Lpb+O]¯, soit
par transfert de proton inter-partenaires, conduisant à la déprotonation de l’anhydride aminé
cyclique et la neutralisation du carboxylate de l’acide gras régénéré. Cette étape conduit à
l’ion m/z 128 [y-H2O]¯.

171
Afin d’élucider le mécanisme mis en jeu lors de la fragmentation du C16Glu, la synthèse d’un
ester C16OMeGlu (Figure 94).

O O
H3C

O
OH
H3C NH
O
Figure 94 : Structure du C16OMeGlu

La méthylation entraine, outre l’empêchement des pertes consécutives de CO2, la

quasi disparition de l’ion fragment m/z 255 montrant la régiosélectivité de la première étape
du mécanisme (Schema 2). L’ensemble de ces résultats ont été confirmés par les calculs
quantiques qui ne seront pas développés ici car ils ont été réalisés en collaboration avec un
groupe extérieur : M. Green, K. Richardson et J. Ujma de la société Waters (Wilmslow, UK).

Schéma 2 : Mécanisme régiosélectif proposé pour la formation des ions complémentaires

ions [Lpb+O]¯ et [y-H2O]¯

172
Conclusion :
Dans cette étude, la LC-ESI-HRMS/MS réalisée en ionisation négative pour l’analyse
des lipoaminoacides présente certains avantages en terme de sensibilité et de spécificité des
ions fragments obtenus. Dans les conditions de dissociation induite par collision à basse
énergie, l’anion [C16Glu-H]¯ se dissocie principalement en une paire d’ions produits,
complémentaires, permettant de qualifier sans ambiguïté les deux composants du
lipoaminoacide. La mise en place d’une annotation spécifique aux lipopeptides permet de
définir cette paire d’ions complémentaires inattendue, correspondant aux ions fragments
[Lpb+O]¯ qui représente l’amide déprotoné d’acide gras et [y-H2O]¯ qui représente l’acide
aminé déshydraté et déprotoné. De plus, la paire d’ions correspondantes aux ions fragments
[Lpc]¯ / [z-2H]¯ attendue disparait de façon surprenante dans le cas de la dissociation de
[C16Glu-H]¯. La formation des ions [Lpb+O]¯ et [y-H2O]¯ complémentaires implique un
processus par étapes, dont la première est une cyclisation par attaque nucléophile
régiosélective sur la liaison amide exclusivement par le carboxylate de la chaine latérale . Il
en résulte un intermédiaire cyclique tétravalent, qui évolue par isomérisation en un ion dipôle
à partir duquel en compétition, les ions fragments [Lpb+O]¯ et [y-H2O]¯ sont régénérés. La
régiosélectivité ainsi que la pertinence des mécanismes de fragmentations proposés ont été
confirmés expérimentalement et à l’aide de calculs quantiques.

173
Identification of bacterial lipo-amino acids: origin of regenerated fatty acid carboxylate
from dissociation of lipo-glutamate anion

Amandine Huebera,b,c, Yves Gimbertd,e, Geoffrey Langevinf, Jean-Marie Galanof, Alexandre Guyf,
Thierry Durandf, Nicolas Cenacb, Justine Bertrand-Michela,c*, Jean-Claude Tabeta,d, g

a
. MetaboHUB-MetaToul, National Infrastructure of Metabolomics and Fluxomics, Toulouse, F-31077, France

b
. IRSD, Université de Toulouse, INSERM, INRA, INPENVT, Université de Toulouse 3 Paul Sabatier, F-31024
Toulouse, France

c
. I2MC, Université de Toulouse, Inserm, Université Toulouse 3 Paul Sabatier, F-31432 Toulouse, France

d
. Sorbonne Université, CNRS, Institut Parisien de Chimie Moléculaire (UMR 8232), 4 place Jussieu, F-
75005 Paris, France

e
. Département de Chimie Moléculaire (UMR 5250), CNRS, Université Grenoble Alpes, 38610 Gières,
France

f
. Institut des Biomolécules Max Mousseron, UMR 5247 CNRS, Université de Montpellier-ENSCM, F-34093
Montpellier, France

g
. Université Paris-Saclay, CEA, INRAE, Département Médicaments et Technologies pour la Santé, F-91191
Gif-sur-Yvette, France

*Corresponding author: Justine Bertrand-Michel, [email protected]

Keywords: Lipidomic, Lipoamino acid, Tandem Mass Spectrometry, Ion-dipole

Abstract: Background: The identification of bacterial metabolites produced by the microbiota is a key
point to understand its role in human health. Among them, lipo-amino acids (LpAA), which are able to
cross the epithelial barrier and to act on the host, are poorly identified. Methods: Structural elucidation
of few of them was performed by high resolution tandem mass spectrometry based on electrospray
combined with selective ion dissociations reach by collision-induced dissociation (CID). The negative
ions were used for their advantages of yielding only few fragment ions sufficient to specify each part
of LpAA with sensitivity. In order to find specific processes that help structural assignment, the negative
ion dissociations have been scrutinized for a LpAA: the N-palmitoyl acyl group linked to glutamic acid
(C16Glu). Results: the singular behavior of [C16Glu-H]¯ towards CID showed tenth product ions,
eight were described by expected fragment ions. In contrast, instead of the expected product ions due
to CONH-CH bond cleavage, an abundant complementary dehydrated glutamic acid and fatty acid
anion pair were observed. Specific to glutamic moiety, they were formed by a stepwise dissociation via
molecular isomerization through ion-dipole formation prior to dissociation. This complex dissociated

175
by partner splitting either directly or after inter-partner proton transfer. By this pathway, surprising
regeneration of deprotonated fatty acid takes place. Conclusion: such regeneration is comparable to
that occurred from dissociation to peptides containing acid amino-acid. Modeling allow to confirm the
proposed mechanisms explaining the unexpected behavior of this glutamate conjugate.

Introduction
Among intestinal microbiota metabolites, lipopeptides (Pérez-Berezo et al. 2017) and lipo-
amino acids (LpAA) (Vizcaino et al. 2014) have been described for their capacity to regulate host
homeostasis. The major technical barrier for the identification of bacterial LpAA or lipopeptides is the
difficulty or even the impossibility to isolate a sufficient sample amount to make the analysis either by
NMR or/and by X-ray, which would require more than several tens of μg and several mg, respectively.
In a previous study, identification of LpAA and lipopeptides produced by Escherichia coli Nissle 1917,
such as the N-lauroyl acyl group linked to asparagine (C12Asn), has been done in negative ESI mode
yielding abundant [C12Asn-H]¯ anions (Pérez-Berezo et al. 2017).
Analysis of these metabolites by hyphenated methods as liquid chromatography-tandem high-
resolution mass spectrometry LC-HRMS/MS is especially versatile for complex mixture analysis. This
method is characterized by a large selectivity, specificity and sensitivity when it is combined to
desorption/ionization as electrospray (ESI). Indeed, this mode is suitable for ionization of a broad
variety of more or less polar metabolites. Furthermore, it may be a powerful method for structural
elucidation of do novo compounds (Thomas et al. 2019) especially, by using ion collisional activation
(i.e. collision-induced dissociation, CID). Firstly, by using low resolution instrumentation based on
linear ion trap quadrupole, an encouraging study of ornithine and glutamine lipids (from Rhodobacter
sphaeroides) proposed mechanisms (Zhang, Ferguson-Miller, et Reid 2009) or a possible
rationalization of ion dissociations under low energy collision conditions in resonant excitation mode.
In this mode, only the parent ion is excited by its own frequency. Therefore, since the produced
ions are not excited, their consecutive dissociations are inhibited unlike competitive dissociations
(Bennaceur et al. 2013). However, they occur when the dissociative process is exothermic and/or the
residual internal energy carried by the produced ions is sufficient to drive consecutive dissociations
(Darii et al. 2021) (Tabet et al. 2021). A previous study (Boukerche et al. 2016) investigated the detected
fragment ions of protonated LpAA ([LpAA+H]+) resonantly excited under low-energy collisional
activation conditions. They interpreted formation of these product ions using exclusively mechanisms
based on charge-promoted dissociations. In certain cases, as a consequence, molecular isomerization
into ion-dipole as intermediate of stepwise dissociation pathways is considered (Afonso, Cole, et Tabet
2010). Such an isomerization explains competitive dissociations mainly based on internal proton
transfer into ion/neutral complex responsible of the complementary product ions. This approach is in
fact an alternative to the one previously proposed (Zhang et al. 2009) for some fragmentations where
the charge remained spectator as it happened during collision process with energies in the keV range

176
(Wysocki et al. 1988) (Gross et al. 1992). Interestingly, to test the hypothesis that many lipo-amino
acids originate in brain, the identification of new LpAAs was conducted in LC/HRMS/MS by Tan et al
(Tan et al. 2010) and explained the observed fragmentations by charge-driven dissociations after CID
of selected ions.

With the future aim to identify more metabolites from bacteria of the microbiota and based on
these above results, the LpAA characterization will be extended to different amino acids conjugated to
various fatty acyl groups using LC-ESI/HRMS/MS. For this, a broader study will be conducted to build
a database of product ion spectra (or fragment ion spectra (Murray et al. 2013)) of various LpAA ions
with a specific and clear fragmentations of [LpAA-H]¯ to detect, identify and elucidate the do novo
molecule structure of LpAA (Thomas et al. 2019). The negative ESI mode was chosen to provide
abundant deprotonated LpAA useful to deliver, after CID, fragment ions which are characteristic of
both the amino-acid and fatty acyl moieties.

For our purpose, dissociations of deprotonated LpAA standards were investigated under low collision
energy conditions (i.e., non-resonant mode) by considering previous studies. In our previous study
(Pérez-Berezo et al. 2017), the major dissociative processes of the [C12Asn-H]¯ from N-lauroyl-
asparagine occurred, in addition to the water loss (corresponding to the base peak), through competitive
covalent bond cleavages around the amide linkage with competitive formations of complementary ion
pairs. This takes place through stepwise dissociation via ion/neutral molecular isomerization resulting
in the [(C12Asn-H)-(Asn-NH3)]¯ and [(Asn-H)-NH3]¯ product ion pair through competitive proton
transfer allowing to define the two parts of the LpAA. In this study, behavior of the system constituted
by both the glutamic residue and the C16 fatty acyl moieties (Scheme 1) was deeply scrutinized. It will
be compared to a polar, asparagine (C12Asn) and non-polar amino acid, leucine (C12Leu) (Scheme 1)
to reach a pertinent interpretation of the [C16Glu-H]¯ fragmentations based on elemental composition
of precursor ion and product ions using an hybrid Qq/TOF tandem mass spectrometer.

177
Scheme 1. Structure of the studied lipoamino acids: N-palmitoyl acyl group linked to glutamic acid
(C16Glu) and monoester derivate (C16GluMe), N-lauroyl acyl group linked to leucine (C12Leu) and
to asparagine (C12Asn).

Our study will focus on the production of the observed product ions and especially those that are
unexpected i.e., product ions generated from LpAA skeleton rearrangement and in particular the
carboxylate of the fatty acid. This ion has also been observed and described by Tan et al. (Tan et al.
2010). Their work can be considered as a landmark since their proposed interpretation for regeneration
of the fatty acid carboxylate from [LpGlu-H]¯ . Indeed, without involving the second carboxylic acid
group, the proposed tetrahedral intermediate of dissociative [LpGlu-H]¯ evolved directly towards the
fatty acid carboxylate product ion. However, dissociation of [LpGABA-H]¯ (containing only one
carboxylic acid group) did not lead to regeneration of the carboxylate product ion (Tan et al. 2010).
This suggests that the second carboxylic acid in [LpGlu-H]¯ must play important role in the
regeneration of the unexpected fatty acid carboxylate product ion. In addition, they suggested that the
[(Glu-H)-H2O]¯ ion was generated from [Glu-H]¯ by water loss. However, product ion spectrum of
[C16Glu-H]¯ (m/z 384) under resonant excitation conditions displayed, in addition to the H2O and CO2
losses (ions at m/z 366 and m/z 340), only the pair of the deprotonated fatty acid and dehydrated
glutamate product ions (Figure S1) which evidences that the latter ions is directly formed from the
precursor ion rather than from dehydration of glutamate anion as intermediate.

To rationalize formation of this particular species, the product ion spectrum of the deprotonated
[C16GluMe-H]¯ mono ester (Scheme 1) was investigated and compared to [C16Glu-H]¯. For a better
description of the origin of the unexpected regeneration of the deprotonated C16 fatty acid, the
respective product ion spectra of the C16Glu and C16GluMe anions were investigated under different
collision energy conditions. Finally, this study provided an analytical approach to determine without
ambiguity the structure of lipoamino acids and lipopeptides within the framework of mass spectrometry
analysis essential for bacterial LpAA identification. For this purpose, it is necessary to better account
for the dissociation processes of these compounds by means of well-defined systematic mechanisms.
The described mechanisms must explain formation of both the expected and unexpected product ions
with similar mechanisms based on the chemical reactivity.

Material and method

Chemical synthesis of LpAA
Synthesis of lipoaminoacids such as N-lauroyl-asparagine (C12Asn), N-lauroyl-leucine (C12Leu), N-
palmitoyl-glutamic acid (C16Glu) and N-palmitoyl-glutamic acid 5-methyl ester (C16GluMe) were
done by solid phase chemistry in a SPS reactor using a 2-chlorotrityl resin (max loading 1.6 mmol/g,
250 mg, 400 µmol, 2.0 eq.). Very briefly, after the fixation of the appropriate Fmoc-amino acid (200
µmol, 1.0 eq.) in presence of NMM (800 µmol, 4.0 eq.) in DCM for 3h, the resin was capped by

178
DCM/MeOH/NMM (17/2/1) for 5 min and the Fmoc group removed with Piperidine/DMF (2/8) for 10
min. After washing, the fatty acid is added in presence of HBTU (750 µmol, 5.0 eq.), HOBt (15 µmol,
0.1 eq.) and NMM (7.5 mmol, 10.0 eq.) in NMP (5mL) for 3 hours to overnight monitoring with a
Kaiser’s test. After washing, the resin is cleaved with TFA/TIPS/Water (95/2.5/2.5) for 10 min.
Obtained filtrate were concentrated and triturated in ACN to obtained desired LpAA without further
purifications: C16Glu (53 mg, Yield = 69%); C12Leu (112 mg, Yield = 67 %); C12-Asn (63mg, Yield
= 100%) C16GluMe (30mg, Yield = 58 %). LpAA were dissolved in methanol with a concentration of
10ng/µL.

Mass spectrometry analysis:

Direct infusion mass-spectrometry analysis: were done in negative mode ESI(-) using a Xevo G2-XS
time of flight (Qq/TOF) mass spectrometer (Waters, Milford, MA) equipped with electrospray
ionization (ESI). The source parameters were set as follows: source temperature = 120°C, capillary
voltage = -2.6 kV, desolvation gas flow rate = 300 L/h, cone gas flow = 40 L/h, desolvation temperature
= 380°C, collision gas nitrogen pressure = 10-1 mbar, voltage QqTOF = 9.00 kV, pressure in flying tube
= 2.7x10-7 mbar, average number of spectra = 35 (1 spectra every 14 msec for 500 ms),
MS/MS experiments: product ion spectra of the precursor [C16Glu-H]ˉ ion were performed in
segmented RF only quadrupole (Waters , Milford, MA) under collision-induced-dissociation conditions
(i.e., CID, using non-resonant excitation mode) within a full width at half maximum (FWHM)
resolution of 16 000 resolution at m/z 400 for product ion analysis. Precursor ions were selected within
± 5 m/z. The product ion spectra (Murray et al. 2013) (called also CID spectra) were recorded at two
collision energies (noted as ELab): 17 eV and 30 eV. These CID spectra were inspected manually using
MassLynx software (Waters) to confirm annotations (vide infra). Only the signal higher than 5% of
base peak were annotated in CID spectra and in the supplementary Table S1, the reported signals were
those with relative abundances ≥ 0.4% of the total ionic current TIC at one Elab values. The ion
abundances were relative to TIC which included precursor and product ions and were given in percent
of TIC. Relative and absolute ion abundances were reported in the supplementary Table S1.

Modeling
DFT calculations were performed using Gaussian16 package, employing the B3LYP functional with
the 6-31+G(d,p) basis set. Zero Point Energies (ZPE) are added as computed at the optimizing level.
The nature of all stationary points was confirmed by analyzing the harmonic vibrational frequencies.
The energies reported in this work are E energies in kcal/mol, corrected from ZPE. For reasons of
computational time and under the reasonable assumption that the length of the aliphatic chain will not
significantly influence the nature of the pathways studied, the structures were modeled with an ethyl
group (for computational details see Supplementary Information S1).

179
Nomenclature and notation of product anions
The notations used to describe and discuss mass spectrometry results were based on IUPAC
recommendations (Murray et al. 2013) to provide more accurate and consistent text throughout the
manuscript. In addition, it was proposed a simple nomenclature which could be applied to the LpAA
anion dissociation (Tan et al. 2010). In this nomenclature only some fragmentations are described and
concern only the loss of small neutrals (H2O, NH3, CO2….) which can be also consecutive losses
(H2O+CO2) from the amino-acid (AA) residue. Such an annotation suggests their formations occur
through consecutive fragmentations from this AA residue generated by dissociation of LpAA anions.
This is not true since some of these fragment ions (the abundant ones) are generated from direct
cleavages of the deprotonated lipoamino-acid and not from the amino-acid as intermediate. This
nomenclature cannot be applied for deprotonated lipopeptide dissociations since, N-terminus (linked to
fatty acyl moiety) or C-terminus (related to peptide moiety) product ions from peptide bond cleavages
cannot be attributed. In order to meet this requirement , the nomenclature on deprotonated peptide
dissociations (Chu et al. 2015) based on fragmentations of protonated peptide ions (with (i+j) residues
in sequence) yielding was adapted, e.g. fragment ions as [bi-2H]ˉ, ciˉ for the N-terminus and yjˉ, [zj-
2H]ˉ for the C-terminus. This was based on the nomenclature of product ions generated under keV
collision energy conditions introduced by Roepstorff et Fohlman (Roepstorff et Fohlman 1984) and
Biemann (Biemann 1988). This nomenclature as reported in Scheme 2 allows to describe both the lipo-
amino acid and lipo-peptide fragmentations.

Scheme 2. Annotation of the observed product ions from dissociation of deprotonated lipoamino
acids

Indeed, annotation distinction between (i) fragment ions constituted by the fatty acyl moiety (related to
N-terminus of peptide sequence) was annotated by the Lp prefix linked to peptide fragment (e.g. [Lpbi-
2H]ˉ, Lpciˉ …) and (ii) fragment ions related to the C-terminus peptide sequence contains exclusively
a peptide fragment sequence (e.g. yjˉ, [zj-2H]ˉ …). When Glu or Asp are included in the peptide

180
sequence, then a complementary ion pair such as [Lpbi+O]ˉ and [yj-H2O]ˉ appeared. From the
lipoamino-acids with AA=Glu, the particular product ions specific to (i) the fatty acyl moiety such as
fatty acid amidate and fatty acid carboxylate formally annotated as lpc¯ and as [lpb+O]ˉ, respectively
and (ii) the amino acid residue such as deprotonated AA (i.e., [Glu-H]¯), and its fragment [(Glu-H)-
NH3]¯ ion annotated as y¯ and [z-2H]¯ were detected. The consecutive fragment ions due to the small
neutral loss, e.g. CO2 or H2O, from the first generation product y¯ and [z-2H]¯ ions, will be annotated
as [y-CO2]¯ and [(z-2H)-H2O]¯, respectively.

Result and discussion

The mass spectrum of the C16Glu compound (Mw 385 u) displayed essentially the [C16Glu-
H]ˉ anions (base peak at m/z 384, Figure S1). Under the source conditions used, adduct ions
[C16Glu+anion]¯ (anions as inorganic or organic acids) as well as deprotonated [(C16Glu+Na-H)-H]¯
salt were not observed even if the concentration of C16Glu was increased. This behavior characterized
the other LpAA studied. The absence of adduct ions was due to the presence of one or several
sufficiently acidic sites able to protonate the reactive anions from the used solvents and allowed to reach
a large sensibility of the [C16Glu-H]¯ detection. In MS/MS mode, this is one of the advantages for the
investigation of the dissociations of the [C16Glu-H]ˉ anion in order to perform structural analysis of
this family of conjugates. Such a detailed studied were only performed for protonated LpAA
(Boukerche et al. 2016) which as expected was driven different dissociation pathways. The [C16Glu-
H]ˉ anion (m/z 384) submitted to collisional activation (CID with Elab=17 eV, and Elab=30 eV, Figure
1(a),(b)) was characterized by a product ion spectrum (at Elab=17 eV) displaying tenth peaks
representative to product ions. The peaks with intensities lower than 5% of the base peak at Elab=17 eV
were annotated in the CID spectrum only when their intensities became higher than 5% of base peak at
Elab=30 eV, and conversely for the intensities of base peaks lower than 5% at E lab=30 eV and higher
than 5% at Elab=17 eV.
In our previous study (Pérez-Berezo et al. 2017), two intense peaks at m/z 198 (ion lpc¯) and
m/z 114 (ion [z-2H]¯) emerged in addition to the base peak at m/z 295 (related to the H2O release) from
CID spectrum of [C12Asn-H]¯ (m/z 313, Figure S2). The complementary lpc¯/[z-2H]¯ ion pair were
interpreted to be formed via ion/dipole intermediate which allows the production of these
complementary fragment ions. By analogy with C12Asn, the product ion spectrum of the [C16Glu-H]ˉ
anion (m/z 384) (Figure 1(a),(b)) should display the fragment ions at m/z 254.2483 (ion lpc¯ as
C16H32NO with error of 2.5 ppm), and m/z 129,0193 (ion [z-2H]- as C5H5O4, with error of 151.6 ppm.
This product fragment ion m/z 129 may match, with the first 13C isotopologue of the m/z 128 ion (ion
[(y-H2O)-1]- as 12C413C1H6NO3 with error of 1.7 ppm). Surprisingly, the abundance of this ion lpc¯ and
[z-2H]¯ pair was of very low. A pair of product ions corresponding to [lpc+1]¯ (at m/z 255) and [(z-
2H)-1]¯ (at m/z 128) appeared. Less abundant fragment ions corresponding to either small size neutral
losses or cleavage of bonds close the amide linkage were displayed in the CID spectra (Figure 1(a)(b)).

181
The latter corresponded to product ions with charge retention at the amino acid moiety or at the fatty
acyl part as confirmed by high resolution measurements (Table S1 and interpretations were reported in
Schemes S1 and S2).

Figure 1. Product ion spectra (i.e., MS2 fragmentations) of (a)-(b) [C16Glu-H]ˉ (m/z 384 with R1 =
CH3(CH2)13-) at ELab = 17 eV and ELab = 30 eV, and (c)-(d) [C16GluMe-H]ˉ (m/z 398) at ELab = 17 eV
and ELab = 30 eV, respectively (accurate m/z values and corresponding elemental composition reported
in Table S1).

These signals were detected at:

(i) m/z 366 and m/z 340 are abundant species accompanied by weaker ion at m/z 322 (less than 5%
of TIC at this energy at Elab=17 eV and increases to 1.8 at 30 eV) and m/z 296 (~ 1% at 17 eV and 21%
at 30 eV) respectively due to the expected H2O, CO2, (H2O + CO2) and 2CO2 small size neutral losses
(proposed fragmentation mechanisms in Scheme S1);
(ii) m/z 146 (i.e., y¯) and m/z 102 i.e., [y-CO2]¯, < 1% at 17 eV and 13% at 30 eV) resulting from the
loss of fatty acyl moiety (proposed fragmentation mechanisms reported Scheme S2). The detected m/z
129 ion which was the 13C natural isotopologue of the abundant m/z 128 ion (i.e., [y-H2O]¯) and not
the [y-NH3]¯ isobaric ion, is not reported in Table S1.
Since the formation mechanisms of product ions described above have already been studied (Pérez-
Berezo et al. 2017), we focused on the origin and formation mechanism of the abundant unexpected
m/z 255 and m/z 128 product ions displayed in the CID spectra recorded at 17 eV and 30 eV. These
complementary ions are considered together rather than separately as proposed by Tan et al. (Tan et al.
2010).The elemental compositions attributed to the ions at m/z 255.2321 and at m/z 128.0363 were

182
respectively C16H31O2 (error of 3.3 ppm) and C5H6NO3 (error of 2.4 ppm) (Table S1). Thus, they may
be respectively annotated as the complementary [lpb+O]¯ and [y-H2O]¯ product ions rather than
[lpc+1]¯ and [(z-2H)-1]¯. Indeed, formation of the [y-H2O]¯ and [ lpb+O]¯ ion pair can be rationalized
by a stepwise dissociation process from [C16Glu-H]¯ ion through molecular isomerization into
ion/dipole complex intermediate followed by competitive splitting processes (Scheme 2) (Afonso et al.
2010). The first step is a regioselective nucleophilic attack of amino acid side chain carboxylate site to
amide linkage resulting in cyclic tetravalent intermediate. The negative alkoxide site migration induces
the C-N bond cleavage and ring opening concomitant with proton transfer to nitrogen atom and resulting
in an anhydride linkage. The end group carboxylate interacts with the closer anhydride C=O group
yielding a 6-membered tetravalent system which isomerizes in ion/dipole consisting in α amino
anhydride neutral and long chain carboxylate. This complex can evolve either to a direct partner
splitting to yield m/z 255 (i.e., the fatty acid carboxylate as [lpb+O]¯) or after internal proton transfer
from the amino anhydride neutral to the C16carboxylate partner, release fatty acid neutral to drive to
the deprotonated 6-membered amino-anhydride (m/z 128 annotated as [y-H2O]¯) (Scheme 2).

Scheme 2. Proposed regioselective stepwise formation of complementary [y-H2O]¯ (m/z 128) and
[lpb+O]¯ (m/z 255) product anions through ion-dipole complex molecular isomerization.

The regioselectivity of the first step was confirmed by the CID spectrum of [C16GluMe-H]¯,
m/z 398 for which the peak at m/z 255 was strongly reduced in this product ion spectrum (Figure
1(c)(d)). Indeed, the peak at m/z 255 which was the base peak in the CID spectra of [C16Glu-H]¯ did
not reach 1% of base peak at ELab=17 eV and 9.3% at ELab=30 eV for [C16GluMe-H]¯. This confirmed
that the nucleophilic reactivity of the carboxylic acid in α position of amide linkage is significantly
hindered compared to the carboxylic group of the side chain. In addition, the CID spectra of [C12Leu-

183
H]¯ (m/z 312), a non-polar LpAA, (Scheme S2 and Table S1) did not display peak at m/z 199 ion
corresponding to the [lpb+O]¯ ion confirming the very weak reactivity of the amino α carboxyl group.
On the other hand, this explained also why the dissociation of the [LpGABA-H]¯ ion did not yield the
lpc¯ product ion (Tan et al. 2010).

In order to confirm the validity of the proposed mechanism above, modeling was performed. A
first investigation was carried out starting from the structure A corresponding to the LpGlu (pathway in
black, Figure 2). For reasons of computational time and under the reasonable assumption that the length
of the aliphatic chain will not significantly influence the nature of the pathways studied, the structures
were modeled with an ethyl group.

Figure 2. Energetic profiles (B3LYP/6-31+G(d,p)), ZPE at the optimizing level): (a) the black pathway,
an evolutionary dead-end yielding the A carboxylate isomerization into the deprotomer C and (b) the
red pathway: competitive fragmentations of the hydrated (A +H2O) carboxylate towards the product
anions as (i) propionic carboxylate and (ii) the deprotonated α amino glutaric anhydride (energy in
kcal/mol)

A transition state (TSA->B) leading to the cyclization into a tetrahedral intermediate B situated 40.8
kcal/mol above A and corresponding to an endothermic transformation by 36.1 kcal/mol could be
located. This cyclization is facilitated by an assistance of the proton of the COOH group of the amino
acid which stabilizes the produced alkoxide by its neutralization. In a second step, we explored the
possibility of the C-N bond cleavage by proton migration from the OH group of tetrahedral intermediate
to the neighbored nitrogen atom. This migration results in the creation of an ammonium group which
should promote the anticipated cleavage to open the ring and to form an anhydride group (i.e., the C’

184
intermediate). A transition state (TSB->C) for such a proton transfer was found (25.4 kcal/mol above B).
However, the opened ring product C to which it connects is not the result of the C-N bond cleavage
wished. Indeed, this proton transfer leads to the opening of the anhydride, immediately followed by the
migration of the proton initially on -NH- groups which is captured by the -CO2¯ group (Scheme 3).

Scheme 3. Formation of the C anion (deprotomer of the initial A anion) connected by TSB->C as a dead
end of this pathway.

In order to strongly hinder protonation of the carboxylate group by an ammonium proton for favoring
C-N cleavage and ring-opening, a water molecule was introduced (A’ + H2O) in calculations to check
its effect on the re-orientation of reaction toward formation of the (C’+H2O) intermediate rather than
that the C deprotomer. In a similar way, a first cyclization (via TSA’->B’ + H2O) leads to structure (B’ +
H2O) with a lower energy cost than in the absence of water (36.7 versus 40.8 kcal/mol). From the 7-
membered ring tetrahedral (B’ + H2O) intermediate, the proton transfers to the nitrogen atom triggers,
this time, the rupture of the C-N bond to yield, through rearrangement process, the anhydride (C’ +
H2O) intermediate. This cleavage corresponds to an exothermic transformation by 8.1 kcal/mol with
respect to the solvated (B’ + H2O) form. At the end, to reach deprotonated fatty acid (ion [lpb+O]¯)
from the (C’ + H2O) intermediate, the carboxylic group must drive a nucleophilic attack at the adequate
C-O bond of the anhydride group yielding ion/neutral complex (D intermediate stabilized by hydrogen
bond) consisting in deprotonated fatty acid (herein propionic carboxylate, EtCOO¯) and the α amino
glutaric anhydride neutral. This cyclization leading to D and the formation of the carboxylate ([lpb+O]¯)
occurs via TSC’->D with a barrier of 10.1 kcal/mol in an exothermic process of 3.0 kcal/mol. In the D
intermediate (Figure 3), the EtCOO- group is favorably positioned to attract a mobile proton from the
enolizable CH2 site of the carbonyl group. This deprotonation requires a cost of 9.1 kcal/mol to form an
intermediate E located very slightly (1.4 kcal/mol) above the TSD->E. This is probably due to a persistent
interaction between the OH group of the carboxylic acid and the CH that prevents the full formation of
the enolate form. This is evidenced by the analysis of the value of the dihedral angle OC-CH in this
structure which is 20.2 degrees while it would expect a value very close to 0° for an enolate form. The
system gains energy by migration of the acid towards the oxygen atom of the enolate by developing a
hydrogen bond type interaction. In structure F, the enolate is this time completely formed, the
previously discussed dihedral angle being now close to 0 degrees (-1.0). Evolutions of the C-C and C-
O distances between E and F are also logical.

185
 1.85 1.88
2.01 1.24 1.28 1.49
O
1.38 O
C
C 1.36
H
C
2.16 C
H
2.08 2.35
0.85

dihedral OCCH = 20.2° dihedral OCCH = -1.0°

D E F

Figure 3: Structures D, E and F. Distances in Å.

Finally, the competitive dissociation of both the D and F intermediates are only desolvation steps (i.e.,
cleavage of hydrogen bond) characterized by level lower than the highest transition state (i.e., TSB’->C’)
of these stepwise dissociations of the mono-hydrated model system of lipo-glutamic acid.

Conclusion
In this study, LC-ESI-HRMS/MS performed in negative ion mode for the LpAA analysis has some
advantages in terms of sensibility and specificity. Under low energy collision-induced-dissociation
(CID) conditions, [LpAA-H]¯ anion dissociate mainly into complementary product ion pair allowing
to unambiguously qualify the two conjugated components of LpAA except for non-polar AA residues
which present only one characteristic product ion. Using the peptide dissociation annotation, the
complementary [lpc]¯ and [z-2H]¯ ion pair respectively corresponding to the fatty acid amidate and
deaminated amino-acid carboxylate are abundant in the product ion spectra of [LpAA-H]¯. However,
from deprotonated glutamate conjugates such as [C16Glu-H]¯, the [lpc]¯ and [z-2H]¯ anion pair
disappears in favor to another diagnostic ion pair. Indeed, the complementary [lpb+O]¯ and [y-H2O]¯
product anions appears due to regeneration of fatty acid carboxylate and formation of dehydrated
glutamate via a nucleophilic attack of amide group by one of the two carboxylic groups. This annotation
was the one used for deprotonated peptide dissociation. Interestingly, dissociation of deprotonated
C16GluMe mono methyl-ester located at the glutamic side chain leads to reduction of the [lpb+O]¯ ion
abundance which evidences the strong regioselectivity of the δ carboxylic acid on the nucleophilic
attack on amide linkage resulting in 7-membered ring with a tetrahedral reactive site. From this
intermediate evolves toward a stepwise process via isomerization into ion-dipole intermediate from
which through internal proton transfer and complex splitting yields in competition, the [lpb+O]¯ and
[y-H2O]¯ product anions. The specific behavior of the glutamate residue allows it to be distinguished
from other amino acid residues independently to the fatty acid amide chain length. Thanks to the
modeling, the pertinence of the above proposed stepwise process mechanism leading to the
complementary product ions especially the regeneration of the fatty acid carboxylate is confirmed. All
these results allow to improve the identification of LpAA using mass spectrometry which is essential
for the study of this low concentrated bacterial metabolites.

186
Abbreviations : ACN: acetonitrile; CID : collision induced dissociation;, DCM : Dichloromethane;
DFT: density functional theory ; EcN : Escherichia coli ; ESI : electrospeay ; GABA : γ- aminobutyric
acid; HOBt: 1-hydroxybenzotriazole hydrate; Fmoc: 9-fluorenylmethoxycarbonyl; LC-HRMS : liquid-
chromatography high resolution mass spectrometry ; LpAA : Lipoaminoacids ; MeOH: Methanol;
NMM: N-methylmorpholine ; NMP: N-methyl-2-pyrrolidone; RF : radio-frequence ;TFA:
trifluoroacetic acid TIPS: Triisopropylsilane ; ZPE : zero point energy.

Acknowledgements: Mass spectrometry analysis were done on MetaToul (Toulouse Metabolomics &
Fluxomics facilities, www.metatoul.fr) which is part of the French National Infrastructure for
Metabolomics and Fluxomics MetaboHUB-ANR-11-INBS-0010. All the computations presented in
this article were performed using the Ceciccluster platform of the PCECIC infrastructure, which is
supported by ICMG (FR 2607). We would like to thank Hanna Kulik-Barbier, Jean-François Martin
and Pauline Le Faouder for helpful discussions.

Declarations:

Conflict of interest: The authors have no conflicts of interest to declare that are relevant to the content
of this article.

Research involving Human Participants and/or Animals & informed consent: No biological
neither human material were used in this study

Bibliography

Afonso, Carlos, Richard B. Cole, et Jean Claude Tabet. 2010. « Even-Electron Dissociation in ESI and MALDI/MS :
Fundamental, Instrumentation, Practicalities and Applications ». P. 631‑84 in Electrospray and MALDI
Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications, 2nd
Edition. Wiley.
Bennaceur, Chafia, Carlos Afonso, Sandra Alves, Anne Bossée, et Jean-Claude Tabet. 2013. « Instrumental
Dependent Dissociations of N-Propyl/Isopropyl Phosphonate Isomers: Evaluation of Resonant and Non-
Resonant Vibrational Activations ». Journal of The American Society for Mass Spectrometry 24(8):1260‑70.
doi: 10.1007/s13361-013-0656-3.
Biemann, Klaus. 1988. « Contributions of Mass Spectrometry to Peptide and Protein Structure ». Biological Mass
Spectrometry 16(1‑12):99‑111. doi: 10.1002/bms.1200160119.
Boukerche, Toufik Taalibi, Sandra Alves, Pauline Le Faouder, Anna Warnet, Justine Bertrand-Michel, Mohamed
Bouchekara, Mohammed Belbachir, et Jean-Claude Tabet. 2016. « Atypical Cleavage of Protonated N-
Fatty Acyl Amino Acids Derived from Aspartic Acid Evidenced by Sequential MS3 Experiments ». Amino
Acids 48(12):2717‑29. doi: 10.1007/s00726-016-2286-0.
Chu, Ivan K., Chi-Kit Siu, Justin Kai-Chi Lau, Wai Kit Tang, Xiaoyan Mu, Cheuk Kuen Lai, Xinhua Guo, Xian Wang,
Ning Li, Yu Xia, Xianglei Kong, Han Bin Oh, Victor Ryzhov, František Tureček, Alan C. Hopkinson, et K. W.
Michael Siu. 2015. « Proposed Nomenclature for Peptide Ion Fragmentation ». International Journal of
Mass Spectrometry 390:24‑27. doi: 10.1016/j.ijms.2015.07.021.
Darii, Ekaterina, Yves Gimbert, Sandra Alves, Annelaure Damont, Alain Perret, Amina S. Woods, François Fenaille,
et Jean-Claude Tabet. 2021. « First Direct Evidence of Interpartner Hydride/Deuteride Exchanges for
Stored Sodiated Arginine/Fructose-6-Phosphate Complex Anions within Salt-Solvated Structures ».
Journal of the American Society for Mass Spectrometry 32(6):1424‑40. doi: 10.1021/jasms.1c00040.
Gross, Michael L. 1992. « Charge-Remote Fragmentations: Method, Mechanism and Applications ».
International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 118‑119:137‑65. doi: 10.1016/0168-
1176(92)85060-D.
Murray, Kermit K., Robert K. Boyd, Marcos N. Eberlin, G. John Langley, Liang Li, et Yasuhide Naito. 2013.
« Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013) ». Pure and Applied
Chemistry 85(7):1515‑1609. doi: 10.1351/PAC-REC-06-04-06.

187
Pérez-Berezo, Teresa, Julien Pujo, Patricia Martin, Pauline Le Faouder, Jean-Marie Galano, Alexandre Guy,
Claude Knauf, Jean Claude Tabet, Sophie Tronnet, Frederick Barreau, Maud Heuillet, Gilles Dietrich, Justine
Bertrand-Michel, Thierry Durand, Eric Oswald, et Nicolas Cenac. 2017. « Identification of an Analgesic
Lipopeptide Produced by the Probiotic Escherichia Coli Strain Nissle 1917 ». Nature Communications
8(1):1314. doi: 10.1038/s41467-017-01403-9.
Roepstorff, P., et J. Fohlman. 1984. « Letter to the Editors ». Biological Mass Spectrometry 11(11):601‑601. doi:
10.1002/bms.1200111109.
Tabet, Jean Claude, Yves Gimbert, Annelaure Damont, David Touboul, et Amina S. Woods. in press. « Combining
chemical knowledge and quantum calculation for interpreting low-energy product ion spectra of
metabolite adduct ions: Sodiated diterpene diester species as a case study ». J. Amer. Soc. Mass Spectrom.
Tabet, Jean-Claude, Yves Gimbert, Annelaure Damont, David Touboul, François Fenaille, et Amina S. Woods.
2021. « Combining Chemical Knowledge and Quantum Calculation for Interpreting Low-Energy Product
Ion Spectra of Metabolite Adduct Ions: Sodiated Diterpene Diester Species as a Case Study ». Journal of
the American Society for Mass Spectrometry 32(10):2499‑2504. doi: 10.1021/jasms.1c00154.
Tan, Bo, David K. O’Dell, Y. William Yu, M. Francesca Monn, H. Velocity Hughes, Sumner Burstein, et J. Michael
Walker. 2010. « Identification of Endogenous Acyl Amino Acids Based on a Targeted Lipidomics
Approach ». Journal of Lipid Research 51(1):112‑19. doi: 10.1194/jlr.M900198-JLR200.
Thomas, Marion, Lucille Stuani, Ekaterina Darii, Christophe Lechaplais, Emilie Pateau, Jean-Claude Tabet, Marcel
Salanoubat, Pierre-Loïc Saaidi, et Alain Perret. 2019. « De Novo Structure Determination of 3-((3-
Aminopropyl)Amino)-4-Hydroxybenzoic Acid, a Novel and Abundant Metabolite in Acinetobacter Baylyi
ADP1 ». Metabolomics 15(3):45. doi: 10.1007/s11306-019-1508-3.
Vizcaino, Maria I., Philipp Engel, Eric Trautman, et Jason M. Crawford. 2014. « Comparative Metabolomics and
Structural Characterizations Illuminate Colibactin Pathway-Dependent Small Molecules ». Journal of the
American Chemical Society 136(26):9244‑47. doi: 10.1021/ja503450q.
Wysocki, Vicki H., Mark E. Bier, et R. Graham Cooks. 1988. « Internal Energy Requirements for Remote Site
Fragmentation ». Organic Mass Spectrometry 23(9):627‑33. doi: 10.1002/oms.1210230902.
Zhang, Xi, Shelagh M. Ferguson-Miller, et Gavin E. Reid. 2009. « Characterization of Ornithine and Glutamine
Lipids Extracted from Cell Membranes of Rhodobacter Sphaeroides ». Journal of the American Society for
Mass Spectrometry 20(2):198‑212. doi: 10.1016/j.jasms.2008.08.017.

188
 Supplementary Informations

New lipoamino acid from E.Coli Bacteria: origin of regenerated fatty acid carboxylate from
dissociation of lipo-glutamate anion

Figure S1. Negative ESI mass spectrum of the C16Glu standard (Mw=385 u)

A) [C12Asn-H]- B) [C12Leu-H]-
m/z 313; Elab = 17eV 295 100 m/z 312; Elab = 17eV 312
100

130
Relative abundance (%)
Relative abundance (%)

75 75

50 50

198
313
25 25
268
269 181
114 131
96 224 251 198
0 0
100 200 300 100 200 300
m/z m/z

Figure S2. Product ion spectra of A) [C12Asn-H]- (m/z 313), at ELab = 17 eV (a), and B) [C12Leu-H]ˉ (m/z 312)
at ELab = 17 eV (b)

189
 –
O O H
1
R 1
1 (v) –
(v) R
R NH O
NH
O -CO2 –
O -CO2 O
O NH H O
CH3
O CH3

m/z 384 m/z 340 m/z 296

1
R = C14H29

Scheme S1. Possible interpretations of the small size losses from competitive and consecutive dissociations of
the [C16Glu-H]¯ anion: (a) stepwise processes (i) nucleophilic attack yielding cyclisation and (ii) ion-dipole
intermediate resulting in (iii) the H2O release (ion m/z 366) followed consecutively (iv)+(v) by the CO2 loss (ion
m/z 322); and (b) the direct loss of CO2 (v) (m/z 340), competitive to the stepwise water loss (a), followed
consecutively by a second loss of CO2 (v) (m/z 296).

Scheme S2 : Possible interpretation of the complementary product m/z 146 and m/z 237 ion pair via molecular
species isomerization into ion-dipole intermediate yielding either by direct partner splitting, product m/z 146 ion
(able to release consecutively CO2 into m/z 102) or by internal proton transfer and isomerized intermediate
splitting in the ynolate m/z 237 ion.

Les informations concernant les calculs quantiques sont en annexe 3.

190
Publication 3 : Courbes d’évolution des profils de mobilité ionique des ions après
collision en fonction de l’énergie d’excitation, un nouveau concept : allures de
courbes composites permettant la distinction d’ions produits isomères

Résumé :
Nous avons démontré l’importance de l’analyse des lipoaminoacides en mode
d’ionisation négatif, pour l’interprétation des mécanismes de fragmentation, permettant
d’obtenir des informations sur les structures des ions fragments. Par exemple l’acide
glutamique conjugué à l’acide laurique (C12Glu) après déprotonation donne [C12Glu-H]¯, qui
sous CID mène à la production d’une dizaine d’ions fragments attendus et inattendus, comme
les ions fragments complémentaires [y-H2O]¯ et [Lpb+O]¯. Afin de mieux comprendre le
comportement de ce couple d’ions fragments, les courbes d’évolution d’abondances relatives
à l’ensemble des ions produits et de l’ion précurseur en fonction de l’énergie de collision ont
été analysées. L’ensemble de ces courbes d’évolution sur un même graphique est appelé
couramment « energy-resolved mass spectrometry » (ERMS). Les courbes qui constituent
l’ensemble ERMS de l’anion [C12Glu-H]ˉ présentent des profils Gaussiens pour la majorité
d’entre-elles, comme obtenu à partir d’un même traitement en utilisant les abondances en
valeurs absolues. Toutefois, si cette tendance est générale avec les valeurs absolues, ce n’est
plus le cas de certains profils notamment des ions m/z 128 et m/z 199 (Figure 95), quand le
retraitement des données est fait à partir de leurs abondances relatives comparé au courant
ionique total. Ces profils étaient Gaussiens déformés et élargis, ou composites (avec deux
composantes ou plus). Ce comportement jamais décrit, semble être indépendant de
l’instrument à condition que la sensibilité soit suffisante, que ce soit un tandem à faisceau
d’ions ou à piégeage d’ions. Nous avons émis l’hypothèse que la forme élargie pour l’ion m/z
199 était dû à une structure commune bien que formées selon des chemins différents. La
forme composite du profil de l’ion m/z 128, est la conséquence de la formation de deux
structures isomères produites selon un chemin direct ou par décompositions consécutives
dont les seuils de dissociation diffèrent. Pour tester ces hypothèses, les calculs quantiques
ont été effectués pour la production des ions m/z 199 et m/z 128. Concernant l’ion m/z 128,
les calculs démontrent bien la possibilité de deux structures isomères. Des expériences de
spectrométrie de mobilité ionique (IMS ion mobility spectrometry) ont été réalisées et nous
avons créé un nouveau concept : la spectrométrie de mobilité ionique résolue en énergie
(ERIMS, energy resolved ion mobility spectrometry). Les courbes d’évolution de mobilité
ionique en mode cyclique en fonction de l’énergie de collision ont été réalisées. Après 15
cycles, les temps de dérive (mesures de sections efficaces) nous ont permis de mettre en

191
évidence, pour l’ion fragment m/z 128, deux structures isomères, dont l’intensité des signaux
variaient selon l’énergie de collision. Pour l’ion fragment m/z 199, un seul temps de dérive le
caractérise bien qu’il soit produit selon des chemins différents. Ainsi la structure de l’ion m/z
199 reste indépendante du processus de dissociation.

Figure 95 : Annotation des ions fragments produits à partir du C12Glutamate

192
Résultats détaillés :

Courbes ERMS:
Les courbes ERMS qui représentent l’évolution de l’abondance relative de chaque ion
fragment par rapport à l’abondance totale des ions en fonction de l’énergie de collision du
[C12Glu-H]ˉ (m/z 312) et du [C16Glu-H]¯ (m/z 384) ont été réalisées à l’aide d’un spectromètre
de masse Qq/TOF. Celles-ci ont été réalisées pour l’ensemble des ions fragments
caractérisés précédemment. Les courbes ERMS pour les ions fragments correspondant aux
pertes d’H2O, de CO2, (H2O + CO2), (CO2 + CO2), celles des fragments acides gras amides et
de l’aminoacide déprotoné présentent des profils Gaussiens, et cela à partir des précurseurs
déprotonés du C12Glu et du C16Glu. L’ion m/z 102, correspondant à l’acide aminé ayant
perdu le CO2, est caractérisé par une évolution continument croissante, tendant vers un
maximum (100%). Par contre, les profils caractérisant la paire d’ions [y-H2O]¯ et [Lpb+O]¯
(Figure 96) sont particuliers : ils sont dissymétriques en «Gaussiennes élargies » ou «
composites ». Ces expériences sont parfaitement reproductibles sur deux Qq/TOF Waters
Xevo G2-XS et sur un Synapt G2-Si.

Figure 96 : Courbes ERMS issus de l’anion précurseur [C12Glu-H]- en a), et des ions
fragments m/z 310 en b), m/z 199 en c) et m/z 128 en d).

193
Recherche des précurseurs de l’ion m/z 128 :
Notre première hypothèse pour expliquer la courbe composite est qu’il existe plusieurs
chemins de fragmentations différents, l’un impliquant un mécanisme à basse énergie, et un
second à plus haute énergie. Nous avons émis l’hypothèse que le premier était issu d’un
mécanisme à plusieurs étapes, impliquant des réarrangements, alors que le second était issu
d’un processus direct de fragmentation. Afin de valider cette hypothèse, des expériences de
recherche d’ions précurseurs ont été réalisées à l’aide d’un triple quadripôle (TQ 8060
Shimadzu). Deux ions forment l’ion fragment m/z 128 : la molécule déprotonée m/z 384 et,
l’ion m/z 366 correspondant à la perte de H2O. Les mêmes résultats sont retrouvés pour
l’anion [C12Glu-H]¯ m/z 328, où les ions m/z 328 et m/z 310 sont les précurseurs de l’ion m/z
128.

Largeur à mi-hauteur des courbes ERMS :

La largeur à mi-hauteur (en eV) de chacune des courbes ERMS a été mesurée. Les
largeurs mesurées pour les profils Gaussiens et reportées sur un graphique, semblent
présenter une tendance linéaire, alors que les ions m/z 102, m/z 128 et m/z 199
(correspondant respectivement aux ions [(Glu- H)- CO2]¯, [y-H2O]¯ et [Lpb+O]¯) s’éloignent
de cette tendance. Cette droite obtenue dans ce domaine de rapports m/z est définie par la
corrélation y = 0.06428x + 26.97, avec R² = 0.9411.

Courbes ER-IMS :
Pour lever l’ambiguïté sur la présence d’une ou de plusieurs structures pour les ions
fragments m/z 199 et m/z 128, des expériences de mobilité ionique ont été réalisées en
sélectionnant les ions selon différentes énergies de collision. Dans un premier temps en
utilisant un Synapt G2-XS, où les ions m/z 199 et m/z 128 montraient chacun une seule valeur
de section efficace, quel que soit l’énergie de collision appliquée.

Dans un second temps, les mêmes expériences réalisées à l’aide d’un instrument de
mobilité ionique cyclique (Waters). Après 15 cycles dans la cellule de mobilité, deux valeurs
de sections efficaces (DT = 205 et 212 msec) ont pu être attribuées pour l’ion m/z 128 (Figure
97). L’évolution de l’énergie de collision permet de voir l’évolution des deux composés pour le
m/z 128.

194
 Figure 97 : Profils d’évolution de l’abondance relative de l’ion fragment m/z 128 issu du
précurseur [C12Glu-H]¯ en mobilité ionique en fonction de l’énergie de collision

L’ion m/z 199 présente toujours une seule valeur de collision efficace (DT = 351 msec),
indépendamment de l’énergie de collision appliquée (de 0 à 50 eV, Figure 98).

Figure 98 : Profil d’évolution de l’abondance relative de l’ion fragment m/z 199 issu du
précurseur [C12Glu-H]¯ en mobilité ionique en fonction de l’énergie de collision

Afin de d’assurer que nous n’étions pas en présence d’un mélange d’ions précurseurs
isomères (m/z 328) et que la conformation du précurseur est unique selon l’énergie de
collision une expérience par mobilité ionique cyclique avec 90 cycles dans la cellule de
mobilité a été réalisée, et une seule valeur de section efficace a été détectée pour l’ion
précurseur.

195
Conclusion :
Dans cette étude, les courbes d’évolution des profils en fonction de l’énergie ont
démontrées pour la première fois des profils « Gaussiens élargies » ou « composites » pour
un couple d’ions complémentaires, respectivement les ions [Lpb+O]ˉ m/z 199 , et [y-H2O]ˉ m/z
128. Par mobilité ionique cyclique, il a été possible de mettre en évidence la présence de deux
isomères aux sections efficaces différentes pour l’ion m/z 128, permettant de mettre en avant
la présence de deux isomères produits selon deux chemins de fragmentation différents pour
lesquels nous avons proposé deux mécanismes de fragmentation. Les mêmes expériences
ont également été réalisées sur l’ion m/z 199, cependant il n’a pas été possible de confirmer
la présence de deux structures, permettant une meilleure compréhension du profil Gaussien
élargi obtenue.

196
Abstract: Tandem mass spectrometry based on collisional activation (in non-resonant mode) is commonly
used to determine molecular structures. Energy resolved mass spectrometry (ERMS) is useful to elucidate
the mechanism(s) of unexpected fragment ion formations such as the regeneration of fatty acid carboxylate
and its complementary ion (dehydrated glutamic acid anion) from deprotonated N-acyl glutamic acid [1].
The absolute abundance evolution of these ions according to the collision energy from the ERMS breakdown
of this precursor ion usually shows Gaussian-like profiles. This trend remains generally true for the product
ion abundances relative to the total ionic current (TIC) and their width at half maximum of these Gaussian
profiles increases as the product ion m/z ratios decrease. In some case the breakdown profiles of studied
unexpected ions become broad or composite. Being never described, they are used to demonstrate that these
complementary fragment ions are generated by two (or more) distinct pathways having different appearance
thresholds. Since it is not clear whether these pathways lead to product ions with common or isomeric
structures, this approach combined with cyclic ion mobility spectrometry (cIMS) removes this ambiguity.
This allows to show that each one of the double pathways leads to a single structure for the deprotonated
fatty acid and isomeric forms for the dehydrated glutamate. This coupling, available for instruments having
a collision cell in front to the ion mobility drift tube, introduce a new concept: the energy resolved ion
mobility spectrometry (ER-IMS), a powerful tool for structural elucidation.

Introduction: In the 1970's, during the early days of tandem mass spectrometry based on double sector
instrument (electric (Eo) and magnetic (B) sectors with both the fixed and scanned fields), the product mi+
ion resulting from spontaneous dissociation of precursor M+• ion (accelerated by a fixed high voltage Vo)
along its flight to the detector and especially in the field-free-regions (FFR) of instrument was detected as
metastable ion. This ion characterized by its kinetic energy, Ekin,i (Ekin,i = zeVo(mi/M)) was displayed in the
Ion Kinetic Energy (IKE) spectrum [2],[3] using E/B double sector Nier-Johnson geometry or in the Mass-
Analyzed IKE (MIKE) spectrum by E scanning (after precursor ion selection) using reversed B/E geometry
[4]. The product ion is detected as a signal of which the width and its shape [5] depend on the internal energy
excess required above the dissociation transition state, TS (Transition state plus the kinetic shift related to
the instrument) to reach the energy threshold, EThreshold, combined with the reversed energy barrier (related
to its mechanism) [5],[6]. The signal width results from the conversion of some of the excess internal energy
(essentially in terms of vibrational energy carried out by the product ion) into translational energy called
kinetic energy release (KER). The different shapes and KER values [4],[5] characterizing the signals can be
summarized for the most common, by the following characteristics. First for product ion formed from simple
cleavage (negligible reversed energy barrier), the corresponding signal can be relatively narrow with a
Gaussian shape contrasting with those generated from characterizing rearrangement processes for which the
significant reversed energy barrier results in a large increase in signal width [8]. Consequently, the signal
appears strongly broader with a “flat-topped” (or “dished”) shape [8],[4],[8]. Finally, if several channels give
common product ions (isomeric or not), their corresponding KER components are superimposed and a
symmetrical composite signal results. The shape of these signals has been widely used to interpret

197
fragmentations and to specify TS, especially for stepwise processes [7]. High energy collision activation (in
the keV range) is also used and is called as MIKE-collision-induced dissociation (MIKE-CID) [10]. Since
the advent of quadrupole instruments at the end of the 70’s, energy-resolved mass spectrometry (ERMS)
breakdown curves [11] of a selected precursor ion, collisional activated either in resonant or non-resonant
excitation mode under low energy conditions (modes called as CID), have been developed to gradually
replaced MIKE spectra and KER measurements while sector instruments were replaced by smaller benchtop
instruments. However, they do not provide the same information of MIKE signals but, are complementary.
The ERMS profile consists of a set of breakdown curves, each curve being related to evolution of a product
ion mi abundance versus collision energy. ERMS profiles [9] allow (i) to distinguish isomeric precursor ions
[9],[10], (ii) to contribute to a better understanding of dissociations even those taking place along complex
pathways [14] and (iii) to determine fragmentation EThreshold of selected ions [15], [16]. However, to our
knowledge, a given product ion has never been demonstrated to be generated by different mechanisms from
only the direct analysis of a ERMS profile of a selected precursor ion.

In this study, the behavior of a deprotonated lipoamino acid, glutamic acid conjugated to a C16 fatty acid
(C16Glu), towards low energy collisions gives us the opportunity to explore ERMS profiles in which a
composite evolution has been highlighted for certain fragment ions. Recently, dissociations resulting from
non-resonant collisional activation of the [C16Glu-H]¯ anion were studied using a Qq/TOF instrument [17].
Under low energy CID conditions, among the ten product ions observed from the [C16Glu-H]¯ anion (m/z
384), the unexpected fatty acid m/z 255 carboxylate [18], [(C16Glu-H)-(Glu-H2O)]¯ annotated as [Lpb+O]ˉ
(Scheme S1) [17] mainly appeared. In addition, its complementary anion species as dehydrated glutamic m/z
128 carboxylate ([(Glu-H)-H2O]¯ annotated as [y-H2O]ˉ) was detected within less abundance (Figure S1a,b).
The [Lpb+O]ˉ ions are similar to the [b+O]ˉ product ion generated from dissociation peptide containing
glutamic residue [19], [20].

Experimental section:

Chemicals and Reagents: Formic acid and analytical solvents (acetonitrile and methanol) were purchased
from Fischer Scientific (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, France). Ultrapure water was generated from a
Milli-Q system (Millipore, Saint-Quentin, Yvelines, France). N-palmitoyl acyl and N-lauroyl acyl group
linked to glutamic acid were synthetized as described in [17].

Tandem Mass Spectrometry analysis: The compounds were analyzed by mass spectrometry in electrospray
source in negative mode by direct infusion using a Hamilton syringe, at 5µL/min flow rate, at the
concentration of 10ng/µL. Analysis were performed on a XevoTM G2-XS mass spectrometer (Waters,
Wimslow, UK), source conditions were: gas temp was set at 120°C; nebulizer gas flow was set at 400 L/h;
cone gas flow was set at 40 L/h; desolvation temp was set at 380°C; resolution R=16 000 at m/z 400. Analysis
was performed on a SYNAPTTM G2-XS mass spectrometer (Waters, Wimslow, UK); source temperature
was set at 100°C; nebulizer pressure was set at 6.5 Bar; cone gas flow was set at 50 L/h, desolvation temp
was set at 200°C, Desolvation gas flow 600L/hr). CID was performed in the trap cell of the TriWave region.
Precursor ion scan analysis were performed on a triple quadrupole tandem 8060 (Shimadzu), experimental

198
source conditions were: gas temp, 325°C; gas flow, 10 L/min; sheath gas temp, 400°C; sheath gas flow, 12
L/min; capillary, 3500 V; voltage nozzle, 2000V; fragmentor, 135 V. MS/MS experiments were performed
on a linear trap quadrupole (LTQ) Orbitrap Velos mass spectrometer (ThermoFisher Scientific, Bremen,
Germany), experimental conditions: source voltage was set at 2.7 kV, capillary temp was set at 300°C, sheath
gas flow was set at 9 L/min. Product ion spectra (from m/z 50 to 400) were acquired in Orbitrap FT/MS with
a resolution R=30,000 at m/z 400. ERMS experiment conditions: selected m/z 384 and m/z 328 precursor
ions were resonantly excited during 10 ms at qz,exc=0.20 for normalized collision energy (NCE) was ramped
from 0% to 50%. For acquisition, Xcalibur 2.0 software (ThermoFisher Scientific, Bremen, Germany) was
used).

Cyclic Ion mobility spectrometry

Ion mobility analysis of product ions was performed using SELECT SERIESTM CyclicTM IMS (cIMS)
Qq/TOF instrument using electrospray ionization in negative mode. Samples were introduced by direct
infusion using a Hamilton syringe, at 10µL/min flow rate, at the concentration of 10 ng/µL. Ion source
condition were: ion source temperature was set to 100°C; nebulizer gas flow was set at 400 L/h; cone gas
flow was set at 50 L/h, desolvation temperature was set at 200°C, This instrument has a Q-cIM-TOF
geometry, as described elsewhere [21]. The precursor m/z ion was selected using the quadrupole mass filter
prior to the IMS separator and subjected to CID in the trap ion guide (non-resonant lab frame collision energy
from 0 eV to 50 eV). Product ions where then injected into the cIM device operating at 1.75 mbar of N2,
with a travelling wave height of 10 V and wave velocity of 375 m/s. Ions may be subjected to different
numbers of passes of the cIMS separation device with more passes resulting in higher IMS resolution. The
cIMS cell is 98 cm in length and a single pass of the device results in a resolution (CCS/ΔCCS) of ~ 65. 15
passes around the cIM yield’s a resolving a power of ~250.

Collision Cross Section calculation

Preliminary structures were obtained in Avogadro [22] using the MMFF94 force field. Structures were then
fully optimized in Gaussian 16 [23] using the B3LYP functional and the 6-31++G(d,p) basis set. Partial
charges were assigned using the Merz-Singh-Kollman scheme, constrained to reproduce the dipole moment.
CCS values were calculated using IMoS v1.10 [24] for both of them using the “Trajectory Method” [25].
IMoS software utilizes a variant of the trajectory method that has been adapted for use with N2 gas [26], [27]
and further tuned against Travelling Wave Ion Mobility data [28]. Two calculation methods were used: the
first - “Trajectory method (no ion-induced quadrupole)” - models the dipole induced on the N2 molecules by
the ion, while the second - “Trajectory method (ion-induced quadrupole)” - additionally models the induced
quadrupole.

Results and discussion:

Various origins of the [Lpb+O]ˉ and [y-H2O]ˉ product ions from [C16Glu-H]¯ and [C12Glu-H]¯: the
precursor ion spectra of these complementary m/z 255 ([Lpb+O]¯) and m/z 128 ([y-H2O]ˉ) ions were
performed using triple quadrupole tandem under non-resonant conditions (Figure S1). These spectra shows

199
that [C16Glu-H]¯ is the unique precursor ion of m/z 255 (Figure S2a) and that the complementary m/z 128
ion is generated competitively from the [(C16Glu-H)-H2O]¯ (m/z 366) and [C16Glu-H]¯ (m/z 384) ions
(Figure S2b). Nevertheless, detection of m/z 384 as precursor did not necessarily mean that it was a direct
precursor ion of m/z 128. Indeed, if very early in the collision cell, m/z 384 rapidly decomposes in the m/z
366 ion by a loss of water, which itself promptly dissociates into m/z 128 by efficient additional collision.
Then m/z 384 ion is detected as a precursor ion instead of m/z 366 which no longer appears in the precursor
ion spectrum of m/z 128. Using resonant excitation in ion trap cell, it is possible to evidence the exclusive
occurrence of direct competitive dissociations when they are endothermic. In contrast, the consecutive
pathways can be detected exclusively if they are exothermic [29], [30]. Resonant excitation on the stored
m/z 384 precursor ion (Figure S3a, b) resulted mainly in the endothermic formation of the m/z 366, m/z 255,
and m/z 128 ions, strictly provided from the competitive dissociations of the m/z 384 ion. Abundance of the
m/z 340 due to the CO2 loss is too close of the noise to be observed in the product ion spectra. By increasing
excitation energy, the relative abundances of the product m/z 128 and m/z 255 ions similarly increased
relatively to the selected m/z 384 ion abundance (Figure S3). Finally, if the m/z 128 ion was directly
produced from m/z 384 in both the resonant and non-resonant modes, the contribution of the m/z 366 product
ion in the m/z 128 formation should be considered exclusively in the later excitation mode. Thus, the double
origin of the m/z 128 ion (Figure S2) may explain why the relative abundances of both m/z 255 ([Lpb+O]¯)
and m/z 128 ([y-H2O]¯ product ions were not significantly affected by the collision energy increased from
ELab=17 eV to ELab=30 eV (Figure S1). Indeed, if the m/z 255 and m/z 128 product ions were competitively
formed only from a stepwise dissociation of [C16Glu-H]¯ (m/z 384) isomerized into ion-dipole complex
([1] Figure S4a), then the direct complex splitting resulting in the [Lpb+O]¯ ion must be preferred at the
highest energies, in contrast to [y-H2O]¯ generated by rearrangement through internal proton transfer
between partners of the ion-dipole intermediate (Figure S4a) [31]. This mechanism has been corroborated
by modeling density functional theory (DFT) level calculations that detailed these competitive stepwise
pathways shown as endothermic [1]. Thus, the [y-H2O]¯ ion would decrease relative to that of [Lpb+O]¯
with increasing collision energy, which is not experimentally shown, meaning that another dissociation
pathway must contribute to the dehydrated glutamate [y-H2O]¯ formation.

A similar behavior was observed for the dissociations of [C12Glu-H]¯ (m/z 328), homologue of the
deprotonated C16Glu, since the complementary product m/z 199 and m/z 128 ion pair was abundantly
displayed in CID spectra recorded at 14 eV and 27 eV (Figure S1c,d). To compare the CID spectra of
homologues, the ELab values were chosen to roughly correspond to the energy at the center of mass
(Ecom=ELabxmA/(mAr+384) with ELab=17 eV and 30 eV) of the activated [C16Glu-H]¯ ion. It was expected
that the dehydrated glutamate m/z 128 formed by internal proton transfer through prototropy [28],[29]
between the ion-dipole intermediate partners (by analogy with mechanisms proposed for dissociations of
[C16Glu-H]¯, Figure S4a), should disappear by increasing ELab in contrast to the fatty acid m/z 199
carboxylate produced by direct splitting of the same ion-dipole intermediate. By increasing ELab from 14 eV
to 27 eV, their relative abundances were not strongly modified as observed for the [C16Glu-H]¯ ion (Figure
S1a,b). On the other hand, the m/z 199 ion (as well as m/z 255 from [C16Glu-H]¯) provided from

200
regeneration of fatty acid carboxylate ([Lpb+O]ˉ) associated to its complementary dehydrated amino-acid
product anion ([y-H2O]ˉ) should be from two or more dissociative pathways.

A 7-membered tetrahedral intermediate (Figure S4a) is formed at the lower energy from the side chain
carboxylate group to competitively yield m/z 128 (form a) and m/z 199 (or m/z 255). This selectivity was
evidenced by dissociation of its methyl ester derivative at the side chain ([C16GluMe-H]¯,[1]) which
exhibits a strong hindrance to the m/z 255 formation (less than 1% at Elab=17 eV which increases to 9% at
30 eV) compared to its abundance from [C16Glu-H]¯ as the greatest of the product ions at these collision
energy. This can mean that the  carboxylate group may play a weak role in the m/z 255 formation through
a possible 5-membered tetrahedral intermediate (Figure S4b) at Elab=30 eV. Alternatively, m/z 128 (within
the same form a, Figure S4b) due to internal proton transfer must be hindered and not considered under these
collision energy conditions. A same orientation characterizes the fatty acid carboxylate (m/z 199, [Lpb+O]¯)
regeneration and the dehydrated glutamate (m/z 128, [y-H2O]¯) formation from the [C12Glu-H]¯ (m/z 328)
precursor ion (Figure S4a,b).

The m/z 310 (or m/z 366) ion ([(C12Glu-H)-H2O]¯) yielding consecutively the m/z 128 ion ([y-H2O]¯) must
result by water loss from the molecular deprotomer with an amidate structure (Figure S4c) rather than the
carboxylate deprotomer considered for the above competitive m/z 199 (or m/z 255) and m/z 128 product
ions (Figure S4a). To dissociate the nitrogen atom of amidate group may yield nucleophilic attack at the
nearest carboxylic acid group allowing the 5-membered cyclisation and the tetrahedral intermediate
formation (Figure S4c). From this intermediate, water release occurs after formation of the OH¯/neutral
complex to result in m/z 366 ion carrying the negative charge at the amide enolizable position. Through fatty
acid ketene loss, the m/z 366 ion possibly dissociated to give rise to formation of the dehydrated m/z 128
glutamate (with γ lactam ring, Figure S4c) either by proton transfer (deprotomer b, expected favored at lower
energy) or by simple cleavage (deprotomer c, favored at higher energy) (Figure S4c).

Finally, the regeneration of the fatty acid carboxylate ([Lpb+O]¯) associated to its complementary
dehydrated amino-acid ([y-H2O]¯) characterized the conjugated acidic amino-acids. However, for the
conjugated aspartate, this process occurred in competition with the fatty acid amidate formation. Finally,
[Lpb+O]ˉ) and [y-H2O]ˉ were not formed from other conjugated basic and non-polar amino-acid anions
which mainly formed the complementary fatty acid amidate and deaminated glutamate anions [1], [17]. The
pertinence of the proposed mechanisms to explain the different formations of this product ion pair will be
evidenced below.

Different pathways yielding the [Lpb+O]ˉ) and [y-H2O]ˉ ion confirmed from the ERMS breakdown
of [C12Glu-H]¯: In order to obtain more information about the competitive dissociations responsible to the
[Lpb+O]ˉ) and [y-H2O]ˉ ion origins, ERMS breakdown of the [C12Glu-H]¯ precursor ion was performed
under non-resonant excitation conditions, first using absolute ion abundances (Figure 1a). The shapes of the
breakdown curves of product ions are similar to more or less symmetrical Gaussian-like profile (Figure 1b,
c and d). Furthermore, it shows that beyond Elab=35 eV, the larger absolute abundance of product ion does
not exceed 5% of initial abundance of the precursor ion. The loss of product ion signals at higher collision

201
energies is attributed to a reduced transmission resulting from their dispersion occurring at higher kinetic
energies.

The abundance relative to the total ionic current (TIC) of the ions contributing to the product ion spectrum
was also used to highlight their relative evolution with Elab allowing a better comparison of the shape and
width of their respective profile (Figure 1e). Besides the most abundant ion at m/z 102 ([y-CO2]ˉ, Figure 1e),
only m/z 199 ([Lpb+O]ˉ) and m/z 128 ([y-H2O]ˉ) have a relative abundance greater than 15% of TIC of the
surviving product ions corresponding to about 6% of the initial TIC measured at ELab=5 eV.

Figure 1. ERMS (a), (e), (i) of the precursor [C12Glu-H]¯ ion (m/z 328), and breakdown profiles of
product ions: (b),(f),(j) m/z 310 (water loss), with a Gaussian-like shape, (c),(g),(k) m/z 199 ([Lpb+O]ˉ),
with broader Gaussian-like shape and (d),(h),(l) m/z 128 ([y-H2O]ˉ), with a multi-component shape. In the
ERMS and product ion breakdown profiles, the ion abundances reported in the left column [(a), (b), (c),
(d)] are given in absolute values (using the Xevo G2-XS mass spectrometer); abundances are relative to
TIC in the middle column [(e), (f), (g), (h)] (same experiment of left column), and the right one [(i), (j),
(k), (l)] (experiments using the Synapt G2-XS instrument),

The breakdown curves of each product ions are too Gaussian-like (e.g. m/z 310, Figure 1f) except for certain
as m/z 199, and m/z 128 whom the profile shapes are broad Gaussian (more or less symmetric) (Figure 1g),
and composite signal (Figure 1h), respectively. Note that these profiles are similar from one instrument
(Figure 1g,h) to another (Figure 1k,l) despite the low TIC beyond 35 eV. This composite signal can be

202
 considered as two partially overlapping Gaussian-like components which can be deconvoluted into two
components. Each of the product ion profiles are characterized by their respective full width at half maximum
(FWHM) and apex (collision energy, ELab,apex and relative intensity, Table 1). Except a few measurements
which deviated to the general trend, the statistical precision of the product ion breakdown profiles is
sufficient to give reproducible measurements. However, the abundance of m/z 181 and m/z 84 was
insufficient to accurately obtain the breakdown profiles above ELab=45 eV, and therefore they were not
included in these results.

Table 1. Evolution of the characteristics(a) (profile shape, FWHM, collision energy at the apex, ELab,apex, and
its normalized and absolute intensities) of product ion breakdown profiles from ERMS of the [C12Glu-H]¯
ion (m/z 328)(b)

Apex intensity:
Product Elemental Neutral Profile FWHM ELab,apex
ion (m/z) composition loss shape Absolute Normalized (eV) (eV)
(arbitrary unit) (%)
310,2023 C17H28NO4 H 2O Gaussian 3956770 12.6 7 12
284,2231 C16H30NO3 CO2 Gaussian 7353592 19.9 11 17
266,2140 C16H28NO2 (H2O + CO2) Gaussian 794143 3.6 10 22
240,2350 C15H30NO (2CO2) Gaussian 2128050 20.0 13 27
199,1718 C12H23O2 C5H7NO3 Broad(c) 61545688 30.7 24 23
198,1873 C12H24NO C5H6O4 Gaussian 842783 7.9 14 27
146,0458 C5H8NO4 C12H22O Non-Gaussian 652903 3.7 19 22
C12H24NO2 multi-
128,0353 C5H6NO3 302868 28.3(d) 40(d) 39(d)
component(d)
(e)
102,0565 C4H8NO2 C13H22O3 39283 78.0 20(e) 55(e)
(a)
When the intensity at half height measured on the negative slope of Gaussian signal is less than 5% of TIC for a
corresponding ELab higher than 45 eV then, the accuracy of the estimated FWHM is poor, as for m/z 181 and m/z 84 then,
not considered
(b)
Sigmoid inflexion point at 12.5 eV for the survivor [C12Glu-H]¯ ion
(c)
Broad Gaussian shape
(d)
Two or more components may contribute to this broad signal, the intensity and apex of which are artificially measured
from the greatest height of the broad signal. However, FWHM was measured over the whole signal.
(e)
Monotonically increasing intensity starting from 10 eV to 55 eV reaching the height-half of the increase at 35 eV. The
FWHM was 20 eV formally measured between the height-half of profile at 35 eV and 55 eV

The plot as a function of collision energy of the evolution of the FWHM value of each of the profiles related
to the product ions (Figure 2) indicated that the lower m/z value was associated with the higher FWHM
value. In particular, the Gaussian shape profile FWHM (empty circle ○, Figure 2), as a function of m/z,
decreased as a quasi-linear manner with negative slope in this m/z ratio range. FWHM of the breakdown
profile related to m/z 146 being weakly accurate, it is omitted.

203
As the two other values were far from this linear trend (solid circle ●, Figure 2), the corresponding product
ions (m/z 199 and m/z 128) were formed by two or more mechanisms. Each of the components of the m/z
128 ion profile (deprotonated glutamic anhydride, [y-H2O]ˉ) could be associated to a particular dissociation
(either simple cleavage vs. rearrangement or direct mechanism vs. consecutive decompositions). Thus, this
product ion could be characterized either by a common structure or by isomeric forms depending on the
mechanism. The shape of the breakdown curve of the very abundant product ion at m/z 199 (regenerated
fatty acid carboxylate, [Lpb+O]ˉ likely with one or two structures resulting through different mechanisms)
was broader (24 eV) than the other Gaussian profiles (Figure 2).

Figure 2. Evolution of the FWHM of the breakdown curves of the ERMS profiles versus the m/z ratio of
corresponding product ion of [C12Glu-H]¯, m/z 328 (empty circle for Gaussian shape ○, solid circle for
broad or composite signal ●): a) measured with the Xevo G2-XS (Qq/TOF) of the lipidomic platform, the
linear dependence as y= -0.0579x + 26.2, with R² = 0.85; and b) measured on a Synapt G2-XS (IMS
instrument), the linear dependence as y= -0.0720x + 31.2 with R² = 0.93)

The consistence of the [C12Glu-H]¯ results (Gaussian-like shape, ○) provided from a Qq/TOF Xevo G2-XS
and a Synapt G2-XS illustrated in Figure 2 indicates similar trend toward collisions. This suggests that the
ERMS are independent to the collision cell device (RF only segmented quadrupole and the stacked ring ion
guide) working in non-resonant collision mode. In addition, the small variations of (i) source conditions
(desolvation voltage) can affect internal energy carried out by the precursor ion [34] and eventually its
tertiary structure (hydrogen bond vs. salt bridge) [35] and (ii) lifetime of survivor ions in collision cell
influences the kinetic shift. Consequently, the competitive dissociation rate constants can be modified and
thus, the relative contribution of pathway for each one of the m/z 199 and m/z 128 ions resulting in the shape
symmetry change. Indeed, the more or less symmetric breakdown profile related to the broad Gaussian shape
of m/z 199 can be rationalized by considering the different pathways occurring under variable contributions
without presuming the structures of m/z 199 (isomers or common). This may account for the small
differences in the breakdown profile of m/z 128 provided from the two used instruments.

Interestingly, ERMS of the homologous [C16Glu-H]¯ ion (m/z 384) provided from two platforms are very
similar (Figure S5(a),(e)) and are comparable to that of [C12Glu-H]¯(Figure 1(e)). Especially, breakdown
profiles of m/z 366 (Figure S5(f)), and m/z 255 (Figure S5(g)) are respectively comparable to those of the

204
homologous m/z 310 (Figure 1f) and m/z 199 (Figure 1g) product ions of [C12Glu-H]¯ (m/z 328), as well
as the common m/z 128 ion from [C16Glu-H]¯ and [C12Glu-H]¯ (Figure S5(h) and Figure 1(h)). The set of
these results indicated that the breakdown signal shape is independent to the fatty acid moiety size.

Close energy thresholds for the competitive [Lpb+O]¯ and [y-H2O]¯ ion formations directly from
[C12Glu-H]¯: it is expected that the product ion spectra, will be markedly different when recorded under
resonant excitation conditions. Consequently, ERMS breakdown curves are also expected to be different
from those generated by non-resonant conditions (known as “fast heating” processes yielding prompt
dissociations after one efficient collision) [36]. Indeed, under resonant excitation conditions, the ERMS
breakdowns were completely modified (Figure S6) with the product ion breakdown profile shapes as
sigmoidal. Such a difference was expected due to a very large number of very low energy collisions
(competitive activation/relaxation called as “slow heating”) [36] occur to reach ion dissociation threshold.
As a consequence, only few fragment ions at m/z 310, m/z 284, m/z 199 and m/z 128, with positive sigmoid
shape, were formed directly from [C12Glu-H]¯. When 10% of precursor ion population survived from
activation, the maxima of the product ion sigmoid curves were reached at a common collision energy,
NCE=27.5%. This means that as soon as all the precursor ion population is consumed (or resonantly ejected
from the Dehmelt pseudo-potential well) [12], the product ions are relaxed and stored in constant relative
abundances. Interestingly, the estimated Ethreshold (normalized collision energy [37], NCE, given in %), of
each product ion can be roughly determined by the log (product ion relative abundance) vs. the NCE values
(not reported) corresponding to 15% and 19.5% respectively, for m/z 310 (H2O loss) and m/z 284 (CO2loss)
while Ethreshold was roughly similar (i.e., 17.3%) for the m/z 199 and m/z 128 ions. This common values for
Ethreshold of formation of these two ions suggested that they are generated from a common intermediate from
the precursor m/z 328 ion isomerization prior to dissociation.

The FWHM evolution of the Gaussian profiles could be fortuitous unless they could be directly related the
KER associated to each fragmentation. This is unlikely since the water loss yielding m/z 310 is a stepwise
process requiring proton transfer [20], whereas the CO2 loss (m/z 284 formation ) involves rather a direct
cleavage. The first process must be accompanied by a larger back energy barrier (a non-negligible KER)
than for the second process with a most likely lower KER, yet the profile associated with the m/z 310 ion is
narrower than that observed for the m/z 284 product ion. Thus, the FWHM evolution must be attributed to
another origin than KER associated to the fragment ions. A study underway to explain this trend is based on
a simplistic model: the lower the fragment ion mass compared to its associated neutral during the dissociation
of a given precursor ion, the more the fragment ion is deviated from its initial trajectory during its collision.
In other words our results could be related to those obtained on the evolution of the fragment ion abundances
in MIKE spectra according to the detection angle [40]. The discrimination can be applied for energy resolved
of isomeric m/z 128 structures originate either directly from [C12Glu-H]¯ or through the [(C12Glu-H)-
H2O]¯ intermediate ion. To answer this question, ion mobility spectrometry analysis of these ions formed at
different collision energies is studied.

205
ERMS/IMS coupling (ER-IMS) to evidence the various competitive pathways resulting in the
[Lpb+O]¯ and [y-H2O]¯ ion : the ion mobility spectrum [41] for the m/z 328 product ions through non-
resonant excitation (Elab=35 eV) after a single pass (98 cm of ion cloud flight, within resolution as
(CCS/ΔCCS) ~ 65) of the cIMS device (Figure 3a) displays the main expected fragmentations. Note it does
not exhibit several signals (different cross-sections) for the m/z 128 and m/z 199 ions. Moreover, this ion
mobility spectrum does not display the water loss (resulting in m/z 310) at this energy, which is consistent
with the disappearance of this ion as early as Elab=25 eV (Figures 1f and 1g). Interestingly, the arrival time
distribution (ATD) after 90 passes of the cIMS for the m/z 328 precursor ion at ELab=5eV (Figure 3b) presents
a single peak suggesting that it has a single structure. Indeed, the precursor ion surviving to collision for
roughly 90% is characterized by one single peak meaning only one structure (nor a isomer or conformer
mixture ) that would be injected into the source. It also means that this ion has not yet isomerized, at Elab=5
eV, into a 7-membered cyclic tetrahedral intermediate (or an ion-dipole form) that would be characterized
by another ATD. Figure 3c, d shows the ATD recorded for the m/z 199 and m/z 128 ions respectively after
15 passes of the cIMS device for Elab as 15 eV, 20 eV, 35 eV, 40 eV, 50 eV (each cIMS ATD profiles are
superposed) with normalized ion abundances.

Figure 3. Extracted ions from the product ion mobility spectrum of the [C12Glu-H]¯ ion (m/z 328): (a) ion
mobility spectrum of various product ions at Elab=35 eV after 1 pass (p.), (b) the precursor m/z 328 ion
after 90 passes, (c) [lpb+O]¯ (m/z 199) and (d) [y-H2O]¯ (m/z 128), after 15 passes at different Elab values
as 15 eV, 20 eV, 35 eV, 40 eV, 50 eV (each ions profiles are superposed).
The ATD for the fatty acid carboxylate [lpb+O]¯, m/z 199 (after fifteen passes) is independent of collision
energy, only the signal abundance increases from Elab=15 eV to reach optimum at Elab=35 eV. Furthermore,
signals centered on the common ATD are characterized by the superimposable shapes for all collision
energies (Figure 3c). This supports the hypothesis that a common structure characterizes the m/z 199 ion

206
(the fatty acid carboxylate) although generated from the energy-dependent dissociation pathways as above
proposed in Figure S4a,b.

By contrast, Figure 3d shows that the ATD for the m/z 128 ion, [y-H2O]¯ (dehydrated glutamate) has two
structures revealed after 15 passes of the cIMS. The relative abundances of the two ATD peaks evolve with
the collision energy: ER-IMS presents a composite profile for [y-H2O]¯ (Figure 3d). As the collision energy
increases, the abundance of the higher drift time component decreases relative to the abundance of the lower
drift time component. This suggests that the former is the [y-H2O]¯ ion directly produced from [C12Glu-
H]¯ from splitting of the ion-dipole intermediate after inter-partner proton transfer, a low energy process
yielding the deprotonated α amino glutaric anhydride (Figure S4a). The component at lower drift time could
be attributed the isomeric [y-H2O]¯ ion generated from consecutive dissociation of [C12Glu-H]¯ via the
intermediate m/z 310 ion, an high energy process resulting in formation of the 2-pyrrolidone-5-carboxylate
(Figure S4c). However, it is not possible to rule out the occurrence of various competitive pathways through
the direct dissociation yielding a common [y-H2O]¯ structure.

To probe these interpretations, calculation of the respective cross-section for the proposed isomeric m/z 128
structures compared to those provided in the IMS experiments were performed using variants of the
trajectory method incorporating ion-induced dipole and quadrupole contributions to the ion-gas potential
(Table 2).

Table 2. CCSs calculated in helium for the isomeric C5H6NO3ˉ ions (m/z 128)
using different trajectory methods

Trajectory method CCS calculations

Isomeric m/z 128 structures Ion dipole-induced ion-induced quadrupole
potential model potential model
–
O

Deprotonated α amino O
glutaric anhydride (form 128.6 Å2 132.9 Å2
a) O
NH2

2-pyrrolidone-5- HN
carboxylate 127.2 Å2 125.5 Å2
O
(deprotomers b and c)
–
O

The isomeric ion which disappears by ELab increase, corresponds to the one characterized by the larger CCS
value, independently of the potential model used for its calculation. Its structure is attributed to deprotonated
α-amino glutaric anhydride formed by a stepwise rearrangement through an ion-dipole intermediate evolving
to proton transfer prior to ion-dipole splitting (Figure 4Sa). Such a dissociation pathway which in

207
competition with fatty acid m/z 199 carboxylate, is favored from precursor ion carrying the lower internal
energy. Furthermore, the second pathway of the m/z 199 formation as proposed in Figure S4b appears only
at higher collision energy and thus, the direct dissociation of the ion dipole intermediate is energetically
favored and its complementary m/z 128 ion cannot be produced in these energy conditions. Finally, a third
pathway is based on consecutive dissociation after a water loss (ion m/z 310) which yields m/z 128 (Figure
S4c). This process requires higher collision energy due to its consecutive character and can only appear in
such conditions. The structure for this m/z 128 ion corresponds to the 2-pyrrolidone-5-carboxylate (Figure
S4c) which is characterized by the lowest CCS value. This ion appears also at lower energy due to the prompt
loss of water leading to formation of the m/z 310 and thus, its consecutive m/z 128 fragment ion can emerge
early at low energy (by rearrangement through proton transfer process) and late in high energy (by direct
cleavage) (Figure S4c), and thus it can be detected in the studied collision energy range.

Conclusion

The combination of the energy resolved mass spectrometry, ERMS, and ion mobility spectrometry,
IMS (associated to a new acronym from energy-resolved ion mobility spectrometry ERIMS) was applied to
the analysis of negative ions of lipoaminoacids. In this study we investigate the dissociation of the
deprotonated glutamic acid conjugated to lauric acid (C12Glu, Mw 328 Da), and demonstrate the importance
to scrutinize with details the ERMS breakdown based only the product ion abundances relative to the total
ionic current. Such a treatment allows a better appreciation of the complexity of dissociations thanks to the
reproducibility of shape of profile which is characteristic to each product ion. The shape of the signal profiles
representative to each product ion has never been scrutinized and described in detail to obtain information
on their mechanisms of formation. In this way, a reproducible breakdown curve attributed to a product ion
of the generated through one dissociation pathway can be characterized by a Gaussian-like profile shape
whose FWHM increases as the m/z ratio of the associated product ion decreases. This was interpreted as
resulting from dispersion of product ion, the smaller the m/z ratio of the product ion, the greater the
dispersion of the ions, which leads to a broadening of the signal. In addition, the position of the apex of this
signal in the ERMS could be attributed to the fragmentation mechanism (TS) leading to the considered
fragment ion. In addition, broad Gaussian-like and composite shapes can be respectively observed for
profiles related to the unexpected fatty acid carboxylate (m/z 199) and its complementary dehydrated
glutamate (m/z 128), occurring in competition. Based on the proposed fragmentation mechanisms it is
possible to rationalize their formation and proposed possible ion structures with some ambiguities due to
various possible isomeric structure for m/z 128. IMS analysis can "lift the veil" on assumptions made about
the proposed structures of the m/z 199 and m/z 128 ions produced depending on collision energy. On the
other hand, the significance of the experimental results on the shape of these particular profiles is obtained
thanks to the ER-IMS coupling consisting in the concomitant combination of ERMS and IMS analyses
possible for instruments having a collision cell in front of the drift tube. First, the m/z 199 ion presents a
single structure since the IMS signal is unique and constant whatever the collision energy, indicating that
two (or more) dissociation pathways lead to this single structure ion according to relatively close appearance

208
thresholds as indicated by the more or less symmetrical broad Gaussian shape. Alternatively, its
complementary m/z 128 ion presents a different behavior since two IMS signals appears to be associated to
this product ion meaning that two isomeric 6- and 5 membered structures contribute in the m/z 128 ion, in
accordance with the proposed mechanisms. The former is promoted only at low energy via an ionic-dipole
intermediate through inter-partner proton transfer and the latter is consecutively generated by direct cleavage
from the [(C12Glu-H)-H2O]¯ product ion, along the collision energy range used which seems to correlate
with the extracted signals of ion mobility analysis. Today, the IMS (and cIMS) analysis of product ions from
collisional spectra at one energy was used without the use of the collision energy variation [21], [42], [43]
to clarify some structural ambiguities. The ERMS/IMS(cIMS) coupling ERIMS analysis should be very
useful to study the fragmentation mechanisms of selected precursor ions, especially for the distinction of
isomeric and diastereomeric compounds that show very similar product ion spectra.

References

[1] Amandine Hueber, Yves Gimbert, Jean-Marie Galano, Alexandre Guy, Thierry Durand, Nicolas Cenac,
Justine Bertrand-Michel, Jean-Claude Tabet, « Identification of bacterial lipo-amino acids: origin of
regenerated fatty acid carboxylate from dissociation of lipo-glutamate anion », Aminoacids, 2021.
[2] J. H. Beynon, R. M. Caprioli, W. E. Baitinger, et J. W. Amy, « The ion kinetic energy spectrum and the
mass spectrum of argon », International Journal of Mass Spectrometry and Ion Physics, vol. 3, no 5, p.
313‑321, déc. 1969, doi: 10.1016/0020-7381(69)80077-X.
[3] K. R. Jennings, « Metastable Transitions in the Mass Spectrum of Benzene », The Journal of Chemical
Physics, vol. 43, no 11, p. 4176‑4177, déc. 1965, doi: 10.1063/1.1696663.
[4] J. H. Beynon, R. M. Caprioli, et T. Ast, « The effect of deuterium labeling on the width of a ‘metastable
peak’ », Org. Mass Spectrom., vol. 5, no 2, p. 229‑234, févr. 1971, doi: 10.1002/oms.1210050213.
[5] D. T. Terwilliger, J. F. Elder, J. H. Beynon, et R. G. Cooks, « The shapes of metastable peaks »,
International Journal of Mass Spectrometry and Ion Physics, vol. 16, no 3, p. 225‑242, mars 1975, doi:
10.1016/0020-7381(75)87022-7.
[6] E. G. Jones, J. H. Beynon, et R. G. Cooks, « Kinetic Energy Release in Unimolecular Ionic Reactions.
Thermochemical Aspects », The Journal of Chemical Physics, vol. 57, no 7, p. 2652‑2658, oct. 1972,
doi: 10.1063/1.1678646.
[7] J. Holmes, C. Aubry, P.M. Mayer, CRC;, Assigning structure to ions in mass spectrometry, vol. J. Chem.
Phys. 41, 1964, 117. Press, Boca Raton, 2007.
[8] John. L. Holmes et Johan. K. Terlouw, « Metastable ion studies. IV—thermochemistry and ion
structures among fragmenting [C3H6]+· ions », Org. Mass Spectrom., vol. 10, no 9, p. 787‑796, sept.
1975, doi: 10.1002/oms.1210100915.
[9] R. G. Cooks et J. H. Beynon, « Metastable ions and ion kinetic energy spectrometry: The development
of a new research area », J. Chem. Educ., vol. 51, no 7, p. 437, juill. 1974, doi: 10.1021/ed051p437.
[10] K. K. Murray, R. K. Boyd, M. N. Eberlin, G. J. Langley, L. Li, et Y. Naito, « Definitions of terms relating
to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013) », Pure and Applied Chemistry, vol. 85, no 7,
p. 1515‑1609, juin 2013, doi: 10.1351/PAC-REC-06-04-06.
[11] Y. X. Jiang, K. V. Wood, R. G. Cooks., « Characterization of and energy deposition in [C2H4O2]+• ions
using energyresolved mass spectrometry. », 1986.
[12] C. Bennaceur, C. Afonso, S. Alves, A. Bossée, et J.-C. Tabet, « Instrumental Dependent Dissociations
of n-Propyl/Isopropyl Phosphonate Isomers: Evaluation of Resonant and Non-Resonant Vibrational
Activations », J. Am. Soc. Mass Spectrom., vol. 24, no 8, p. 1260‑1270, août 2013, doi:
10.1007/s13361-013-0656-3.
[13] A. Schwarzenberg, H. Dossmann, R. B. Cole, X. Machuron-Mandard, et J.-C. Tabet, « Differentiation
of isomeric dinitrotoluenes and aminodinitrotoluenes using electrospray high resolution mass
spectrometry: Nitroaromatic isomers differentiation by ESI-HRMS », J. Mass Spectrom., vol. 49, no
12, p. 1330‑1337, déc. 2014, doi: 10.1002/jms.3471.

209
[14] E. Darii et al., « First Direct Evidence of Interpartner Hydride/Deuteride Exchanges for Stored
Sodiated Arginine/Fructose-6-phosphate Complex Anions within Salt-Solvated Structures », J. Am.
Soc. Mass Spectrom., vol. 32, no 6, p. 1424‑1440, juin 2021, doi: 10.1021/jasms.1c00040.
[15] P. B. Armentrout, K. M. Ervin, et M. T. Rodgers, « Statistical Rate Theory and Kinetic Energy-Resolved
Ion Chemistry: Theory and Applications », J. Phys. Chem. A, vol. 112, no 41, p. 10071‑10085, oct. 2008,
doi: 10.1021/jp805343h.
[16] C. Ruan, Z. Yang, N. Hallowita, et M. T. Rodgers, « Cation−π Interactions with a Model for the Side
Chain of Tryptophan: Structures and Absolute Binding Energies of Alkali Metal Cation−Indole
Complexes † », J. Phys. Chem. A, vol. 109, no 50, p. 11539‑11550, déc. 2005, doi: 10.1021/jp053830d.
[17] Amandine Hueber, Camille Petitfils, Pauline Le Faouder, Geoffrey Langevin, Alexandre Guy , Jean-
Marie Galano, Thierry Durand, Jean-François Martin, Jean-Claude Tabet, Nicolas Cenac, Justine
Bertrand-Michel, « Discovery and quantification of lipoamino acids in bacteria », Analytica Chimica
Acta, 2021.
[18] B. Tan et al., « Identification of endogenous acyl amino acids based on a targeted lipidomics
approach », Journal of Lipid Research, vol. 51, no 1, p. 112‑119, janv. 2010, doi: 10.1194/jlr.M900198-
JLR200.
[19] R. D. Hiserodt, S. M. Brown, D. F. H. Swijter, N. Hawkins, et C. J. Mussinan, « A study of b1+H2O and
b1-ions in the product ion spectra of dipeptides containing N-terminal basic amino acid residues », J
Am Soc Mass Spectrom, vol. 18, no 8, p. 1414‑1422, août 2007, doi: 10.1016/j.jasms.2007.04.018.
[20] A. G. Harrison et A. B. Young, « Fragmentation reactions of deprotonated peptides containing
aspartic acid », International Journal of Mass Spectrometry, vol. 255‑256, p. 111‑122, sept. 2006, doi:
10.1016/j.ijms.2005.12.037.
[21] K. Giles et al., « A Cyclic Ion Mobility-Mass Spectrometry System », Anal. Chem., vol. 91, no 13, p.
8564‑8573, juill. 2019, doi: 10.1021/acs.analchem.9b01838.
[22] Avogadro: an open-source molecular builder and visualization tool. Version 1.2.0.
http://avogadro.cc/.
[23] M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Robb, J. R. Cheeseman, G. Scalmani, V.
Barone, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, X. Li, M. Caricato, A. V. Marenich, J. Bloino, B. G. Janesko, R.
Gomperts, B. Mennucci, H. P. Hratchian, J. V. Ortiz, A. F. Izmaylov, J. L. Sonnenberg, D. Williams-
Young, F. Ding, F. Lipparini, F. Egidi, J. Goings, B. Peng, A. Petrone, T. Henderson, D. Ranasinghe, V. G.
Zakrzewski, J. Gao, N. Rega, G. Zheng, W. Liang, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota, R. Fukuda, J. Hasegawa,
M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda, O. Kitao, H. Nakai, T. Vreven, K. Throssell, J. A. Montgomery, Jr., J.
E. Peralta, F. Ogliaro, M. J. Bearpark, J. J. Heyd, E. N. Brothers, K. N. Kudin, V. N. Staroverov, T. A.
Keith, R. Kobayashi, J. Normand, K. Raghavachari, A. P. Rendell, J. C. Burant, S. S. Iyengar, J. Tomasi,
M. Cossi, J. M. Millam, M. Klene, C. Adamo, R. Cammi, J. W. Ochterski, R. L. Martin, K. Morokuma, O.
Farkas, J. B. Foresman, and D. J. Fox, Gaussian 16, Revision B.01. 2016.
[24] imospedia available on : http://www.imospedia.com/.
[25] M. F. Mesleh, J. M. Hunter, A. A. Shvartsburg, G. C. Schatz, et M. F. Jarrold, « Structural Information
from Ion Mobility Measurements: Effects of the Long-Range Potential », J. Phys. Chem., vol. 100, no
40, p. 16082‑16086, janv. 1996, doi: 10.1021/jp961623v.
[26] H. I. Kim et al., « Structural Characterization of Unsaturated Phosphatidylcholines Using Traveling
Wave Ion Mobility Spectrometry », Anal. Chem., vol. 81, no 20, p. 8289‑8297, oct. 2009, doi:
10.1021/ac900672a.
[27] H. Kim et al., « Experimental and Theoretical Investigation into the Correlation between Mass and
Ion Mobility for Choline and Other Ammonium Cations in N 2 », Anal. Chem., vol. 80, no 6, p.
1928‑1936, mars 2008, doi: 10.1021/ac701888e.
[28] I. Campuzano et al., « Structural Characterization of Drug-like Compounds by Ion Mobility Mass
Spectrometry: Comparison of Theoretical and Experimentally Derived Nitrogen Collision Cross
Sections », Anal. Chem., vol. 84, no 2, p. 1026‑1033, janv. 2012, doi: 10.1021/ac202625t.
[29] J.-C. Tabet, Y. Gimbert, A. Damont, D. Touboul, F. Fenaille, et A. S. Woods, « Combining Chemical
Knowledge and Quantum Calculation for Interpreting Low-Energy Product Ion Spectra of Metabolite
Adduct Ions: Sodiated Diterpene Diester Species as a Case Study », J. Am. Soc. Mass Spectrom., p.
jasms.1c00154, sept. 2021, doi: 10.1021/jasms.1c00154.

210
[30] P. Barbier Saint Hilaire et al., « Mechanistic study of competitive releases of H 2 O, NH 3 and CO 2
from deprotonated aspartic and glutamic acids: Role of conformation », Journal of Chromatography
B, vol. 1047, p. 64‑74, mars 2017, doi: 10.1016/j.jchromb.2016.08.036.
[31] R. B. Cole, Éd., Electrospray and MALDI mass spectrometry: fundamentals, instrumentation,
practicalities and biological applications, 2. ed. Hoboken, NJ: Wiley, 2010.
[32] A. Maquestiau et R. Flammang, « Studies of prototropy by mass spectrometric methods », Mass
Spectrom. Rev., vol. 1, no 3, p. 237‑255, 1982, doi: 10.1002/mas.1280010303.
[33] E. D. Raczyńska, J.-F. Gal, et P.-C. Maria, « The guanylated bioamine agmatine – A theoretical
investigation of its structure and exceptional high basicity in the gas phase », Computational and
Theoretical Chemistry, vol. 1109, p. 10‑18, juin 2017, doi: 10.1016/j.comptc.2017.03.032.
[34] J. Naban-Maillet et al., « Internal energy distribution in electrospray ionization: Internal energy
distribution in electrospray ionization », J. Mass Spectrom., vol. 40, no 1, p. 1‑8, janv. 2005, doi:
10.1002/jms.773.
[35] E. Darii, S. Alves, Y. Gimbert, A. Perret, et J.-C. Tabet, « Meaning and consequence of the coexistence
of competitive hydrogen bond/salt forms on the dissociation orientation of non-covalent
complexes », Journal of Chromatography B, vol. 1047, p. 45‑58, mars 2017, doi:
10.1016/j.jchromb.2016.09.038.
[36] McLuckey, S. A.; Goeringer, D. E, « Slow Heating Methods in Tandem Mass Spectrometry », 1997.
[37] Linda L. Lopez, Philip R. Tiller, Michael W. Senko and Jae C. Schwart, « Automated Strategies for
obtaining standardized collisionally induced dissociation spectra on a benchtop ion trap mass
spectrometer », 1998.
[38] A. Colorado et J. Brodbelt, « An empirical approach to estimation of critical energies by using a
quadrupole ion trap », J. Am. Soc. Mass Spectrom., vol. 7, no 11, p. 1116‑1125, nov. 1996, doi:
10.1016/S1044-0305(96)00077-3.
[39] P. Bayat, D. Lesage, et R. B. Cole, « TUTORIAL: ION ACTIVATION IN TANDEM MASS SPECTROMETRY
USING ULTRA-HIGH RESOLUTION INSTRUMENTATION », Mass Spec Rev, vol. 39, no 5‑6, p. 680‑702,
sept. 2020, doi: 10.1002/mas.21623.
[40] D. M. Fedor et R. G. Cooks, « Angle resolved mass spectrometry with a reversed geometry
spectrometer », Anal. Chem., vol. 52, no 4, p. 679‑682, avr. 1980, doi: 10.1021/ac50054a021.
[41] V. Gabelica et al., « Recommendations for reporting ion mobility Mass Spectrometry
measurements », Mass Spec Rev, vol. 38, no 3, p. 291‑320, mai 2019, doi: 10.1002/mas.21585.
[42] A. L. Rister et E. D. Dodds, « Ion Mobility Spectrometry and Tandem Mass Spectrometry Analysis of
Estradiol Glucuronide Isomers », J. Am. Soc. Mass Spectrom., vol. 30, no 10, p. 2037‑2040, oct. 2019,
doi: 10.1007/s13361-019-02272-w.
[43] S. Ollivier, M. Fanuel, H. Rogniaux, et D. Ropartz, « Molecular Networking of High-Resolution Tandem
Ion Mobility Spectra: A Structurally Relevant Way of Organizing Data in Glycomics? », Anal. Chem.,
vol. 93, no 31, p. 10871‑10878, août 2021, doi: 10.1021/acs.analchem.1c01244.

Acknowledgements: Valérie Steiner for her helpful discussion, Hanna Kulyk-Barbier for her helpful technic
help in the using LTQ/Orbitrap and Qq/TOF waters instrument for experimental repetitions; Geoffrey
Langevin of the Durand’s group for synthesis of C12Glutamate and C16Glutamate conjugates. Part of mass
spectrometry analysis were done on MetaToul (Toulouse metabolomics & fluxomics facilities,
www.metatoul.fr) which is part of the French National Infrastructure for Metabolomics and Fluxomics
MetaboHUB-ANR-11-INBS.

Abreviation: ATD: arrival time distribution; CCS: collision cross section; CID: collision induced dissociation;
cIMS: cyclic ion mobility spectrometry; DFT: density functional theory; FFR: field free region; FWHM : full
width at half maximum; IKE: ion kinetic energy; KER: kinetics energy release; LTQ: linear trap quadrupole;
MIKE: mass-analyzed ion kinetic energy; NCE: normalized collision energy; TIC: total ion current ; TS :
transition state.

211
 DISCUSSION GENERALE

Dans cette dernière partie du manuscrit, j’aborderai en premier temps certains points
concernant le workflow analytique spécifique aux lipopeptides. Dans un second temps, nous
discuterons de la fragmentation des lipoaminoacides en général, puis de certains cas
particuliers. Enfin, nous aborderons le cas du C12Glutamate, et des possibilités apportées par
la mobilité ionique pour la distinction d’ions fragments isomères.

I) Workflow analytique

Le développement analytique a été réalisé en deux temps, à l’aide d’un mélange de

standards de lipopeptides, de lipoaminoacides, d’acyl-serotonine, d’acides gras et de
composés nitrés. La première étape a été de développer une méthode d’extraction spécifique
à ces molécules, la seconde d’optimiser les conditions d’analyses sur le spectromètre de
masse hybride Qq/TOF Xevo G2-XS.

Choix de la matrice biologique : Une fois ce workflow développé et optimisé, nous avons
recherché les lipopeptides produits par le microbiote intestinal de souris. Dans ce type
d’approche, deux stratégies sont envisagées : la recherche de composés dans les côlons de
souris ou dans des bactéries du microbiote en culture. Notre première approche a été de les
rechercher dans les côlons de souris. Plusieurs quantités de tissus ont été testées allant de
20 mg jusqu’à la totalité du tissu (environ 90 mg). L’utilisation de 20 mg de côlon, n’a pas
permis l’identification de candidats potentiels. De plus, les lipopeptides et lipoaminoacides
couramment quantifiés93 sur un appareil triple quadripolaire Agilent 6460 (C12AsnGABA,
C12Asn et C14Asn) n’étaient pas retrouvés via l’analyse par LC-HRMS sur le Qq/TOF. Nous
avons supposé que l’analyse en LC-HRMS manquait de sensibilité pour détecter ces
lipopeptides retrouvés à quelques picogrammes/mg de protéines dans les côlons.
L’augmentation de la quantité de tissus conduisait à la perte totale du standard interne. Les
plaques SPE utilisées pour le protocole d’extraction étaient préconisées pour 20 mg de tissu
uniquement. Si nous avions voulu continuer avec une telle quantité de tissus, nous aurions dû
ré-optimiser le protocole d’extraction, en utilisant une plaque SPE appropriée, (60 mg de dépôt
de tissu). D’autres stratégies peuvent aussi être envisagées, comme plusieurs SPE

213
successives (interactions polaires puis apolaires). C’est le protocole expérimental utilisé par
Tan361, permettant l’identification de lipoaminoacides dans le cerveau.

Suite à ces premiers résultats, nous nous sommes focalisés sur des bactéries du
microbiote. En effet, s’affranchir de l’effet matrice notable du côlon permet un gain de
sensibilité important, pendant l’extraction et lors de l’ionisation en electrospray. Afin
d’augmenter nos chances de découvrir de nouveaux composés, nous avons sélectionné
plusieurs bactéries. Nous avons travaillé sur culot bactérien plutôt que sur surnageant
bactérien, pour détecter ces composés minoritaires plus facilement.

Dans un premier temps, nous avons continué les travaux sur Escherichia coli Nissle
1917, puis nous avons sélectionné d’autres bactéries, majoritaires du microbiote intestinal et
appartenant à des phylas différents, comme les Bacteroidetes, les Bifidobacterium Longum,
ou encore les Enterococcus faecalis. En parallèle, nous nous sommes intéressés à la souche
bactérienne Lactobacillus animalis car notre équipe a mis en évidence que l’abondance de
cette bactérie était diminuée dans le microbiote de souris soumise à un modèle de syndrome
de l’intestin irritable (SII) (données non publiées actuellement). De plus, l’abondance de cette
bactérie était inversement corrélée à l’hypersensibilité viscérale mécanique des souris. Dans
le but d’accroitre le nombre de composés conjugués au GABA, les Lactobacillus animalis ont
été cultivées dans un milieu de culture enrichi en GABA.

Identification et caractérisation de nouveaux lipopeptides : L’étude de la bactérie probiotique

Escherichia coli Nissle 1917, nous a permis d’identifier un premier LpAA jamais décrit, le
C13Asn et de quantifier toute sa famille. L’analyse des autres souches bactériennes,
notamment des bacteroidetes a démontré la présence de ce même composé. Ces deux
bactéries partagent donc la production de certains LpAA bien qu’elles soient extrêmement
éloignées d’un point de vu génétique. Ces quantifications de LpAA dans les bactéries
renforcent la notion de redondance fonctionnelle du microbiote110.

Concernant Lactobacillus animalis, nous avons émis l’hypothèse que cette bactérie
est capable de produire une molécule lipidique ayant une activité analgésique car la diminution
de son abondance dans notre modèle de SII était associée à l’augmentation de
l’hypersensibilité viscérale. L’application du workflow n’a pas permis de mettre en évidence la
présence de lipopeptide contenant du GABA dans cette bactérie. Comme L. animalis ne
possède les enzymes nécessaires à la synthèse du GABA à partir de la glutamine contenue
dans le milieu, nous avons cultivé cette bactérie en présence de GABA. Dans ces conditions,
nous avons pu identifier du C16PheGABA, du C12AsnGABA, du C16GluGABA, du

214
C14AsnGABA, du C12IleGABA, du C14IleGABA et du C12AlaGABA. Ces résultats vont être
utilisés dans un article en cours de rédaction auquel je suis associée.

Pour conclure, les premiers essais sur côlons murins n’ont pas permis l’identification
de nouveaux lipides bactériens. La seconde stratégie focalisée sur les bactéries a permis de
démontrer que plusieurs souches de bactéries, appartenant à des phylas différents sont
capables de produire des lipopeptides et des LpAA.

Analyse des lipopeptides par spectrométrie de masse à haute résoltion : Le mode d’ionisation
préférentiellement utilisé dans cette étude à été l’électro-nébulisation en mode négatif. Ce
mode a été sélectionné car les lipopeptides et lipoaminoacides sont des composés contenant
un groupement carboxylique facilement « déprotonable » en phase gazeuse, ainsi qu’un
groupement amide relativement acide. Contrairement aux nombreux sites qui peuvent être
protonés (chacun des hétéroatomes le sont) en mode positif, seuls trois ou quatre sites
peuvent être déprotonés en compétition. L’ionisation en mode négatif permet donc de limiter
les modes possibles de dissociation évitant la dispersion du courant ionique sur trop d’ions
fragments (comme cela arrive lors de dissociations des molécules protonées). Toutefois, les
composés de notre base de données constitués de sérotonine, s’ionisent uniquement en
mode positif362. Cela est la conséquence de la présence des sites relativement basiques
comme l’atome d’azote indolique, mais également du résidu NH2 de la chaine latérale363. En
parallèle les analyses des extraits bactériens ont été effectuées à l’aide deux modes
d’ionisation. Le mode négatif a permis l’identification du C13Asn, et du C14AsnGABA. Le
mode d’ionisation positif, cela a permis de valider les structures des composés identifiés en
mode négatif, cependant aucun composé constitué de sérotonine n’a été détecté. Ainsi,
seules les molécules déprotonées [LpAA-H]− ont été analysées en mode négatif, et leurs
dissociations sous collision de basse énergie ont été interprétées à l’aide du mode négatif
également.

Retraitement des données via des logiciels spécialisés : L’étape cruciale et la plus
chronophage de ce workflow a été le retraitement des données. Plusieurs logiciels de
retraitement ont été essayés et comparés afin d’optimiser nos chances de découvrir de
nouveaux lipopeptides. Le logiciel UNIFI, qui est difficile d’utilisation et sur lequel énormément
de tests ont été réalisés, a finalement été abandonné, car le « processing » des données
n’était pas adapté à nos exigences, nos conditions expérimentales et à nos composés
minoritaires. Le logiciel de quantification de Waters QuanLynx s’est finalement révélé le plus
efficace pour interroger nos données.

215
 Par exemple, pour l’analyse en négatif de l’extrait d’EcN 1917, 162 composés ont pu
être identifiés comme lipopeptides potentiel de notre base de données. Après vérification des
massifs isotopiques, 25 composés uniquement correspondaient aux molécules déprotonées.
Les MS² en spectrométrie de masse à haute résolution ont été réalisées, et 5 composés ont
finalement été validés et leurs élucidations structurales réalisées. Le même travail a été réalisé
avec le mode d’ionisation positif, où aucun nouveau lipopeptide supplémentaire n’a été
identifié.

Dans un second temps, le logiciel MZ-MINE2 a été utilisé, afin de comparer les
groupes entre-eux. Ce logiciel permet après le choix de plusieurs paramètres pas toujours
bien définis et difficiles à gérer, de générer des listes de rapports masse sur charge et de
comparer leur présence dans différents échantillons. De façon très visuelle, le logiciel attribue
un rond vert ou rouge pour chaque m/z de la liste s’il est présent ou absent de l’échantillon.
Ainsi, nous avons pu comparer des côlons de souris contrôles et ceux de souris gavées par
injection péritonéales de bactéries connues pour leur production accrue de GABA. La liste de
rapports masse-sur-charge des composés détectés uniquement dans les souris gavées a été
réalisée. Des analyses MS² ont été réalisées sur cette liste de composés, par LC-HRMS sur
un QqTOF et un QExactive Plus, en supposant qu’il s’agissait potentiellement de lipopeptides
ou d’aminolipides. Cependant, lors des analyses par LC-HRMS aucun composé n’a été
caractérisé ou identifié comme étant un lipopeptide.

Quel niveau d’identification pour les composés de notre étude ? L’utilisation du mode
d’acquisition SRM a permis d’étendre cette identification à vingt-deux nouveaux composés.
L’analyse des ions fragments réalisée, soit à l’aide d’un mode d’excitation résonante, soit d’un
mode d’excitation non résonante a été faite afin de mieux comprendre les mécanismes de
fragmentations impliqués. En effet, le mode non résonant permet de mettre en évidence les
processus consécutifs, alors que lors d’une excitation en mode résonant seuls les processus
compétitifs sont mis en évidence. Sous excitation résonante, seul l’ion précurseur est excité
par sa propre fréquence338,364.

Grâce à ces deux modes d’ionisation, la majorité des molécules ont pu être
caractérisées à l’aide d’un niveau d’identification 1 (c’est le cas pour seize molécules) selon
les règles appliquées pour la caractérisation de nouvelles molécules en métabolomique345.
Cependant, certaines structures d’ions fragments, et donc des ions précurseurs ne peuvent
être totalement élucidées : c’est le cas pour les lipoaminoacides où l’acide gras conjugué est
insaturé. En effet, il n’est pas possible de dissocier ces chaines pour localiser les insaturations
en collision de basse énergie, comme cela est possible avec des collisions de haute énergie

216
(au-delà du KeV)365. Néanmoins, des collisions par électron (EID ou EIEIO)366 ou par atome
métastable367 permettent ces processus à charge piégée, impliquant l’accès à des états
électroniques excités. Ces modes d’activation sont soit limités d’accès soit non commerciaux,
et n’ont donc pas pu être utilisés lors de ces travaux. Notons que l’utilisation de collision basse
énergie sur les lipides cationisés par du CuII conduisent aussi à la localisation d’insaturation,
mais la sensibilité de la méthode reste limitée368. Une autre méthode, par GC-MS permet
l’identification de la position des doubles liaisons après une dérivatisation par du réactif 4,4-
diméthyloxazoline369.

En ce qui concerne mon travail, la structure des LpAA ayant une chaine d’acide gras
insaturée n’a pas pu être définie : les composés C12:1Asn, C14:1Asn, C16:1Asn et C17:1Asn,
sont donc identifiés avec un niveau d’identification 3 correspondant car la position de la double
liaison n’est pas connue. Nous supposons néanmoins que celle-ci se situe en position w7
puisque que ce sont les AGI les plus abondants de nos profils d’acides gras totaux bactériens.
Cependant, il ne s’agit ici que d’une hypothèse puisque nous avons également pu doser de
faibles quantité l’acide gras C16:1w9, qui pourrait parfaitement être l’acide gras à l’origine de
la formation des lipoaminoacides. Ces interrogations pourraient, potentiellement être levées
en comparant les candidats aux différents isomères synthétisés en GC-MS avec un gradient
et une dérivatisation adaptée.
Les lipoaminoacides conjugués à la leucine et à l’isoleucine n’ont pas pu être identifiés
à un niveau 1. Les ions fragments générés en MS², à partir des deux standards synthétisés,
sont identiques pour les deux composés conjugués. De plus, il n’a pas été possible d’obtenir
une séparation chromatographique suffisante pour ces deux composés (∆Tr < 0.5 secondes)
dans nos conditions expérimentales. Ainsi, le C12Leu et le C12Ile ont été caractérisés avec
un niveau d’identification 2, correspondant à des annotations putatives, très probables. Pour
les caractériser complètement il faudrait être capable de les séparer chromatographiquement
en utilisant une colonne C18 plus longue, une colonne C30 ou des colonnes chirales.

Analyses par pertes de neutres : A l’aide de l’analyse de la fragmentation du C12AsnGABA

et du C14AsnGABA, nous avons identifié une perte de neutre systématique correspondant au
GABA (-103,0633). Les extraits bactériens ont été analysés en utilisant le mode de balayage
perte de neutre sur le spectromètre de masse triple quadripôlaire Agilent K6460 du laboratoire.
Cette stratégie consiste à fixer la perte de neutre constante à 103.0633 Da. Un grand nombre
de pics chromatographiques ont été détectés avec ce mode de balayage, et chacun d’entre
eux a été sélectionné et analysé en MS² en haute résolution (Qq/TOF). Cependant, les
composés identifiés par le QqQ, comme comportant hypothétiquement (car basse résolution)

217
un GABA au sein de leurs structures, étaient des faux positifs. Lors des analyses MS² sur le
Qq/TOF, aucun des m/z sélectionnés ne permettait d’identifier un lipopeptide, ni aucun des
composés de notre banque de données. Le manque de résolution de notre appareil de type
QqQ qui a plus de 10 ans et qui ne donne accès qu’aux masses nominales, n’est pas adapté
pour ce type d’approche.

Recherche de composés par chemins communs de fragmentation : Les connaissances

apportées par la caractérisation des C12AsnGABA, C14AsnGABA, C12Asn, C14Asn et
C13Asn permettent de prédire certains ions fragments attendus à partir de la dissociation
d’anions pour les molécules de notre banque de données théoriques. En effet, ces composés
vont se fragmenter après activation collisionnelle pour produire des spectres CID. Plusieurs
ions fragments sont générés : le lipoaminoacide déprotoné et déshydraté (perte H2O), l’amide
déprotoné de l’acide gras, ou encore l’aminoacide lui-même déprotoné. Ainsi, en suivant ce
chemin de fragmentation, et en le déclinant à l’ensemble des composés lipoaminoacides et
lipopeptides GABA de notre banque de données, nous avons imaginé des méthodes
d’analyse par QqQ avec une mode de balayage « précurseur ion ». Pour cela, nous avons
fixé les ions fragments attendus, déclinaison des pertes H2O pour tous les composés, des
acides gras aminés pour tous les composés, des acides aminés déprotonés et du
neurotransmetteur déprotoné. Par exemple, pour les lipoaminoacides ou lipopeptides
constitués de lysine, nous avons sélectionné l’ion fils correspondant au fragment [Lys-H]¯. Le
spectromètre de masse, ainsi paramétré recherche les rapports masse-sur-charge des ions
parents qui se dissocient en un ion fragment [Lys-H]¯. Lorsque l’un des pic semblait
correspondre à la masse d’une molécule déprotonée contenant de la lysine, nous les avons
analysés par LC-HRMS². Lors de chaque analyse de haute résolution sur le Qq/TOF, comme
pour les pertes de neutre, nous nous sommes aperçus que les correspondances annoncées
étaient surement liées à un manque de sensibilité du QqQ, puisqu’aucun des composés n’a
pu être caractérisé en utilisant cette méthode. Cependant, par cette méthode, nous sommes
parvenus à retrouver certains des composés ayant été identifiés préalablement à l’aide des
SRM théoriques. Finalement, les analyses dites de « SRM théoriques » nous ont permis
d’accroitre le nombre de lipoaminoacides identifiés.

Synthèse de lipoaminoacides et de lipopeptides : La caractérisation des candidats a pu être

validée dans certains cas par spectrométrie de masse en tandem (Qq/TOF). Dans d’autres
cas afin de lever certains doutes concernant les mécanismes de fragmentation, nous avions
réalisé des expériences de MSn en mode résonant sur le LTQ-VELOS-Orbitrap de la
plateforme MétaToul réseaux métaboliques de Toulouse. L’ensemble de ces données nous

218
ont permis de proposer des mécanismes de fragmentations pour chacun des composés
identifiés, et ainsi, de les caractériser avec différents niveaux d’identifications dont le niveau
1. Les composés néo-identifiés ont tous été comparés à des standards primaires identiques,
synthétisés spécifiquement. La synthèse des lipoaminoacides et des lipopeptides a été
réalisée à Montpellier, par le groupe de Thierry Durand. Celles-ci ont été fastidieuses, et ont,
dans certains cas nécessité un long travail d’optimisation. C’est notamment le cas pour les
lipopeptides GABA, les lipopeptides sérotonine, dopamine et histamine. Pour ces synthèses
spécifiques, de nombreux essais de résines ont été effectués, avec des rendements parfois
inférieurs à 10%. L’obtention de produits purs, essentielle à notre projet, a rajouté une
contrainte supplémentaire. A ce jour, les chimistes travaillent toujours pour essayer de
développer une méthode de synthèse efficace pour les dérivés de la dopamine et pour les
dérivés histamines. L’absence de ces standards nous a empêché de valider la méthode
d’extraction et d’analyse pour ces composés (dopamine, histamine). C’est peut-être l’une des
raisons pour lesquelles aucun lipopeptide contenant ces neurotransmetteurs n’a été détecté
à l’aide de notre stratégie expérimentale. Celui-ci mériterait peut-être une optimisation
spécifique pour ces composés aux propriétés chimiques différentes des lipoaminoacides et
des lipopeptides GABA.

II) Fragmentation des lipopeptides et lipoaminoacides

Mécanismes de fragmentation proposés pour les lipoaminoacides : Dans notre étude, de

nombreux chemin de fragmentation peuvent s’expliquer par l’apparition d’ions dipôles, c’est
notamment le cas pour le fragment le plus intense des lipoaminolipides qui correspond à la
perte d’H2O.

En présence d’un ou de deux groupements COOH, ou d’un groupement CO-NH2, le

mécanisme de la perte dH2O est toujours identique. Le cas des lipopeptides asparagine a été
développé dans l’article 1. Lorsque l’acide animé est différent, le mécanisme reste équivalent
mais différent car ce sont d’autres protons qui migrent (Schéma 3). En effet, quel que soit
l’acide aminé considéré, il s’agit toujours d’une attaque nucléophile d’un des atomes
d’oxygène chargés négativement a priori soit en alpha de l’amide, soit sur la chaine latérale
ou de l’amide lorsque l’acide aminé possède une chaine latérale non polaire. Il en résulte la
création d’un intermédiaire tétraédrique (résultant en un cycle à 6 chaînons dans le cas de la
glutamine). La libération de OHˉ et la formation d’un anhydride cyclique conduit à la formation
d’un ion dipôle. L’anion OH− libre, va arracher un proton pour éliminer H2O. Ce proton peut
provenir d’une position énolisable de l’anhydride ou à partir du groupement imine qui est acide

219
en phase gazeuse. De manière concomitante, le système à 6 chaînons s’ouvre afin de
produire un nitrile et de relibérer l’acide carboxylique. A partir de là, la perte consécutive de
CO2 se produit en impliquant le transfert d’un proton, permettant l’obtention d’un nitrile
déprotoné. Ces mécanismes sont cohérents avec les règles de la chimie organique. Cette
perte de CO2 est identique pour tous les lipoaminoacides.

La charge peut être localisée soit sur l’acide carboxylique, qui sera ainsi déprotoné ou en
position alpha de l’amide (Figure 99). Quand la charge se situe sur le groupement
carboxylique, la perte de CO2 attendue peut avoir lieu, c’est ce qui est observée pour
l’ensemble des composés asparagine, valine, leucine, isoleucine. Dans ce cas, la perte de
CO2 est induite par la charge impliquant le transfert d’un proton mobile de la position
énolisable. Le transfert de ce proton est obligatoire. Ce mécanisme mène à la formation d’un
ion m/z 283 dans le cas du C13Asn.

Figure 99 : Positions possibles de la charge sur les LpAA où la chaine latérale de

l’aminoacide conjugué est non-polaire, menant soit à la formation d’un cétène, soit à la perte
d’un groupement CO2
Notons qu’à partir des anions [LpAA-H]¯ où l’AA possède une chaine latérale non
polaire (Val, Leu ou Ile) qui conduit à une perte d’eau initiale réduite alors que celle du CO2
est renforcée. Ces deux pertes compétitives sont produites selon des mécanismes basés sur
le même principe que ceux décrits dans le Schéma 1 mais impliquant d’autres transferts de
proton ou de cyclisation par addition/élimination. En effet, la charge de l’anion [LpAA-H]¯ peut
être localisée ou sur le groupe carboxylate ou sur la position énolisable du groupe amide
(Figure 99). Dans le premier cas, c’est la perte de CO2 qui se produit alors qu’à partir de la
seconde forme (l’énolate) c’est la perte d’eau qui se produit par un processus par étape.
Notons que la formation de l’amide de l’acide gras déprotoné est fortement réduite ou absente.

220
 Schéma 3 : Mécanismes possibles de fragmentation par pertes directes compétitives A)
majeure de CO2 et B) mineure d’H2O à partir de [C12AA-H]¯ (avec AA=Val, Leu et Ile)

Le site de déprotonation de la phénylalanine conjuguée à l’acide gras tétradécanoïque

(C14Phe) étant le site énolisable de l’amide, il va induire une rupture benzylique assistée par
un transfert 1-5 de proton concerté conduisant à la formation d’un ion dipôle. Cette fois, cette
formation est rendue possible car le neutre libéré est l’acide cinnamique qui peut être
déprotoné. Cet intermédiaire peut se dissocier soit directement pour donner un amidure
(amide déprotoné) par la perte de l’acide cinnamique (C9H8O2), soit par transfert de proton de
l’acide cinnamique vers l’amide déprotoné de l’acide gras pour donner l’anion C9H7O2ˉ associé
à une perte de l’amide neutre (Schéma 4).

Schéma 4 : Proposition de mécanisme de fragmentation particulier de [C14Phe-H]¯, m/z

356, menant aux ions fragments m/z 226 et m/z 147 complémentaires.

221
 Cas de fragmentation des lipoaminoacides sans intermédiaires dipôlaires : Cependant, les
lipoaminoacides identifiés à l’aide du workflow analytique ne se décomposent pas tous selon
des mécanismes de fragmentation faisant appel à des intermédiaires de type ion-dipôle. C’est
le cas notamment du C12Tryptophane (C12Trp), qui présente un fragment inattendu, qui n’a
pas été abordé dans la publication 1.

Dans ce cas de figure, un autre site chargé négativement peut exister en compétition avec
d’autres comme par exemple un déprotomère où l’azote du noyau indole est déprotoné. A
partir de ce déprotomère, la charge négative peut alors basculer et délocaliser la double
liaison afin de rompre la liaison en alpha-béta de l’acide carboxylique. Cette rupture
benzylique est connue pour être favorisée. Comme la localisation de la charge négative sur
l’atome de carbone lié à l’atome d’azote de l’amide n’est pas autorisée selon les règles de
fragmentation définies, un transfert concerté de proton pour neutraliser le carbanion se fera à
partir de l’acide carboxylique voisin il en résulte la formation de l’anion [C12Trp-H]¯ (Schéma
5). Ici la formation d’un ion-dipôle intermédiaire n’est pas possible, car le partenaire neutre
C9H7N ne possède pas de site acide tel qu’il est requis pour neutraliser [C12Trp-H]¯.

Schéma 5 : Proposition de mécanisme de fragmentation particulier de l’ion [C12Trp-H]¯

menant au fragment de m/z 256, où R1 correspond à une chaîne alkyle C10H21de la partie
acide gras

Cas particuliers des lipoaminoacides conjugués au glutamate : Jusqu’à présent, nous n’avons
abordé ni les lipoaminoacides conjugués à l’acide glutamique ni ceux liés à l’acide aspartique
de façon délibérée, puisque ces deux LpAA présentent une fragmentation particulièrement
inattendue. Des analyses en mode MSn séquentiel avec un piège à ions (sous activation
collisionnelle en mode résonant) ainsi que les analyses de MS² sur l’hybride Qq/TOF ont été
nécessaires pour proposer des mécanismes de fragmentation. Celle-ci peut s’interpréter au
travers de la formation d’ions dipôles pouvant se dissocier en compétition afin de donner un
ion fragment acide aminé déshydraté et déprotoné et de régénérer le carboxylate de l’acide
gras (Figure 100), alors que les autres LpAA régénèrent les fragments amides de l’acide gras.

222
 Figure 100 : Structure des ions m/z 128 et m/z 255 produits en compétitions à partir
du [C16Glu-H]¯ et du [C12Glu-H]¯avec R1 = C14H29 pour le C16Glu et R1 =C10H21 pour
C12Glu

Malheureusement, dans le mécanisme que nous avons proposé dans la publication

n°2, il y avait une contradiction apparente qu’il fallait lever puisqu’étrangement, des différences
importantes ont été mises en évidence entre les formes déprotonées de LpAsn et LpAsp, et
entre celles des LpGln et LpGlu.

Dans les acides aminés conjugués avec chaine fonctionnalisée comme l’asparagine
et la glutamine, l’ion fragment correspondant à l’acide gras ne peut pas être mis en évidence
avec abondance. Cependant, en échangeant la fonction amide des acides aminés glutamine
et asparagine par une fonction acide carboxylique (donnant naissance aux LpAsp et LpGlu),
la rupture de type cˉ (amide déprotoné) devient alors très abondante (minimum 27%
d’abondance relative). Toutefois, il ne s’agit pas tout à fait un ion cˉ mais d’un ion [b+O]¯
inattendu dont la structure a été précisée par le mécanisme proposé dans la publication 2. La
formation de ces ions fragments impliquent la formation d’intermédiaires de type ion dipôle.
Les mécanismes de formation proposés pour ces ions particuliers ont été appuyés et
confirmés à l’aide de modélisation de type DFT réalisés par le Dr Yves Gimbert de l’Université
de Grenoble. Comme cela ne fait pas parti de notre spécialité, nous n’en donnerons pas les
aspects théoriques au cours de cette discussion.

En ce qui concerne les composés LpGlu et LpAsp, il s’agit d’un cas de figure particulier
ou la molécule déprotonée conduit à la formation de deux ions complémentaires [Lpb+O]¯ et
[y-H2O]ˉ. Le premier semble être favorisé à plus haute énergie d’excitation et le second à plus
basse énergie. Ce comportement est contraire à nos résultats d’expérience, ce qui ne veut
pas dire que la formation d’un ion dipôle intermédiaire n’a pas lieu. En réalité, l’acide
glutamique deshydraté et déprotoné est aussi produit par un processus de décomposition
consécutive, via une perte d’eau, donc à un seuil d’apparition plus élevé du processus
impliquant l’ion-dipôle qui est un mécanisme à multi-étapes.

223
 Le couple d’ions fragments complémentaires (m/z 255 ; m/z 128) correspondant aux
ions fragments de l’ion [C16Glu-H]¯ (m/z 384) et leurs comportements ont été détaillés dans
la publication 2. Celui-ci est également observé pour le [C12Glu-H]¯ (m/z 328) et les ions
fragments m/z 199 et m/z 128. Dans cette fragmentation par étapes multiples, suivant le
mécanisme présenté dans la publication, un ion dipôle est directement formé. Il est constitué
de l’acide gras déprotoné et de l’anhydride neutre de l’acide glutamique. Ce complexe peut
se dissocier directement en carboxylate de l’acide gras (m/z 255), ou peut s’isomériser par
transfert interne de proton, de l’anhydride vers le groupement carboxylate, conduisant à l’ion
fragment m/z 128 (acide glutamique déshydraté et déprotoné). Ainsi, il est possible de prédire
que ces deux constituants du complexe ont des acidités suffisamment proches pour avoir une
durée de vie augmentée permettant l’échange de proton entre partenaires. Si l’acidité de
l’anhydride est comparable à celle de l’acide gras alors, la présence de l’anhydride déprotoné
avec une abondance relative non négligeable peut être observée. Effectivement, l’abondance
de l’anhydride déprotoné est faible (<3%) alors que l’acide gras déprotoné a une abondance
relative aux alentours de 30% à 20eV. Si l’acidité de l’acide glutamique deshydraté était trop
faible l’ion fragment correspondant à l’anhydride ne serait pas détecté. Les calculs quantiques
montrent que l’acidité de l’anhydride est comparable à celle de l’acide carboxylique lui-même.
Toutes ces données nous amènent à conclure qu’il est normal d’observer l’anhydride de
l’acide glutamique.

Enfin, si tout apparait clair concernant les différents mécanismes inattendus des
LpGlu, nous nous attendions en augmentant l’énergie de collision à défavoriser davantage la
production des ions fragments anhydrides (m/z 128). L’ensemble des différents profils
d’évolution de l’abondance de chacun des ions fragments en fonction de l’énergie de collision
conduit au graphique ERMS (energy resolved mass spectrometry). La construction de cette
ensemble ERMS a été réalisé et associé à la spectrométrie de mobilité ionique pour lever en
partie l’ambiguité qui pouvait subsister.

224
 III) Les outils pour mieux comprendre les mécanismes
de fragmentation

Profils d’évolution des courbes d’abondance relative en fonction de l’énergie de collision : Cette
méthode d’analyse ERMS basée sur l’étude de la variation de l’abondance relative des ions
parents et des ions fragments en fonction de l’énergie de collision permet une approche plus
précise des processus de fragmentation qui paraissent ambigües. Cette méthode a souvent
été utilisée pour étudier l’effet de l’énergie interne des ions acquise lors de collisions370 afin
d’éclaircir certains mécanismes de fragmentation, et pour déterminer les seuils d’apparition
d’ions fragments371,372. Plus récemment cette méthode a été utilisée afin de comparer les
modes d’activation comme les collisions par gaz et les collisions sur surfaces373,374. D’un point
de vue analytique, cette méthode a surtout été employée pour distinguer des
isomères375,376,364,375,377. C’est pour les potentialités de ces profils ERMS permettant la
compréhension des mécanismes de fragmentions que nous l’avons utilisé pour étudier le
comportement des ions dipôles en fonction de l’énergie tel qu’employé pour l’études des
complexes ion-dipôle en mode ionisation négative353.

De manière générale, les courbes ERMS à partir des ions précurseurs sélectionnés
sont très différentes entre le mode d’activation résonant et le mode d’activation non
résonant364,338. Les courbes ERMS construites à l’aide d’instruments où l’activation est
réalisée en mode non-résonant, sont caractérisées par des profils Gaussiens (Figure 101C,
m/z 198 et 101D, m/z 198). Par contre, l’ion précurseur a un profil de sigmoïde décroissante
(Figure 101A, m/z 328). Enfin, des courbes monotones croissantes vers la haute énergie
représentent les ions fragments qui n’atteignent pas encore leur maximum, ils correspondent
à une terminaison des décompositions consécutives (Figure 101B, m/z 102).

A l’inverse, à l’aide du mode d’activation résonant dans un piège utilisé comme une cellule de
collision, seuls les processus de première génération ou compétitifs sont détectés. La
caractéristique du mode résonant concerne les évolutions de l’abondance relative des ions
fragments qui dès la disparition de l’ion parent, deviennent toutes constantes. Cela signifie
que dès que l’ion parent subit une excitation résonante trop forte, son énergie cinétique
devient trop grande par rapport au puits de pseudo-potentiel et il est éjecté du piège. Ainsi les
ions fragments formés dans les derniers moments se trouvent piégés et leur abondance
relative devient constante. C’est le cas par exemple pour les ions m/z 310, m/z 128 et m/z 199
et m/z 284 issus du C12Glu m/z 328 (Figure 102).

225
Figure 101 : Profils d’évolutions de l’abondance des ions fragments m/z B) 102, C) m/z 310
et D) m/z 198 en fonction de l’énergie de collision à partir du précurseur [C12Glu-H]¯ m/z
328 sous activation résonante (QqTOF Waters Xevo G2-XS)

Figure 102 : Profils d’évolutions de l’abondance des ions fragments m/z 310, m/z
128, m/z 199 et m/z 284 fonction de l’énergie de collision à partir du précurseur [C12Glu-H]¯
m/z 328 sous activation non-résonante (LTQ, Thermo)

226
 Toutefois avant la disparition de l’ion parent, l’évolution des ions fragments suivent une
même tendance croissante, expliquée par le principe même du « chauffage lent ». C’est-à-
dire que tant que l’ion parent est présent il accumule de l’énergie interne, une fois le seuil
d’excitation atteint, l’ion précurseur décroit, comme pour les courbes ERMS générées à l’aide
d’un mode d’activation non résonant. Cependant, les courbes ERMS des ions fragments de
premières générations augmentent, jusqu’à un seuil, caractérisé par la disparition de l’ion
parent et leurs profils évoluent comme une sigmoïde croissante.

Profils d’évolution des courbes d’abondance relative en fonction de l’énergie de collision pour le
C12Glu : Les profils d’évolution de l’abondance des ions fragments en fonction de l’énergie
cinétique pour les ions produits m/z 199 et m/z 128 sont anormalement élargis ou composites
(Figure 103B, m/z 199 et Figure 103D m/z 128). Cela est vrai, lorsque les courbes ERMS sont
réalisées à l’aide d’une normalisation par le courant total ionique. Lorsque les courbes ERMS
sont réalisées à l’aide de l’abondance absolue de l’ion d’intérêt, alors nous ne retrouvons plus
ces courbes particulières (Figure 103A m/z 199 et Figure 103C m/z 128).

a) b)
40

1 .0  1 0 7
R e la tiv e a b u n d a n c e (% )
A b s o lu te a b u n d a n c e

8 .0  1 0 6 30

6 .0  1 0 6
20

4 .0  1 0 6

10
2 .0  1 0 6

0 0
10 20 30 40 50 10 20 30 40

eV C o llis io n e n e rg y (e V )

c)
6 .0  1 0 6
d)
A b s o lu te a b u n d a n c e

30
R e la tiv e a b u n d a n c e (% )

4 .0  1 0 6
20

2 .0  1 0 6

10

0
10 20 30 40 50 0
eV 10 20 30 40 50
C o llis io n e n e rg y (e V )

Figure 103 : Profils ERMS calculés en fonction de l’abondance absolue des ions (m/z 199 et
m/z 128, A et C), en comparaison avec les courbes ERMS normalisés par le courant ionique
total pour les ions m/z 199 et m/z 128 en B et D à partir du précurseur [C12Glu-H]¯ m/z 328
sous activation non-résonante (QqTOF Waters)

227
 L’apport de la mobilité ionique Ces courbes ERMS ont été transposées sur un appareil
de mobilité ionique couplée à la spectrométrie de masse, où nous avons pu détecter deux
valeurs de CCS pour l’ion fragment m/z 128 et une seule valeur de CCS pour l’ion fragment
m/z 199. Par les calculs quantiques et les expériences de recherche d’ions précurseurs, nous
avons pu mettre en évidence la présence de deux chemins de mécanismes de fragmentations
conduisant à deux ions fragments isomères pour le m/z 128, issus de l’ion précurseur
[C12Glu-H]¯ et de l’ion fragment [(C12-H2O)-H]¯.

Sur l’appareil cIMS les ions peuvent être fragmentés avant la cellule de mobilité
ionique, puis y être injectés. Lorsqu’ils sont séparés par la cellule de mobilité, les ions sont
transférés au détecteur. Ils passent consécutivement par une cellule de stockage d’ions
(« post array storage »), une cellule constituée d’une succession de lentilles permettant la
focalisation du faisceau d’ions (« ion guide ») qui va guider les ions, et d’une cellule de
transfert (« XS transfert device). Ensuite, les molécules atteignent le « pusher », c’est-à-dire
l’entrée du détecteur. Le passage des ions d’une zone à l’autre dans le spectromètre de masse
n’est possible que par une variation de tension. Entre la sortie de cellule de mobilité et l’entrée
du détecteur, un potentiel de tension est donc appliqué. Lorsque des ions précurseurs
perdurent à la sortie de la cellule de mobilité ionique, ce potentiel peut provoquer leurs
dissociations. Ainsi, il est possible de retrouver l’ensemble des ions fragments produits à partir
du précurseur à la même valeur de CCS que celle du parent. A l’inverse, si à la sortie de la
cellule de mobilité ionique, il n’y a plus d’ion précurseur, seul l’ion précurseur à sa valeur de
CCS, et aucun autre rapport masse-sur-charge, sera retrouvé.

L’analyse du mobilogramme à 20 eV lorsque l’ion parent est encore présent à la sortie

de la cellule de mobilité et qu’il peut encore être fragmenté post-IM a été réalisée. Lorsque
nous nous intéressons à l’ion m/z 128 trois valeurs de CCS apparaissent : celle de l’ion
fragment m/z 128, celle de l’ion fragment m/z 310 (perte de H2O à partir du précurseur) et
celle de l’ion précurseur m/z 328. L’analyse du mobilogramme à 40 eV montre la présence
d’une seule valeur de CCS pour l’ion fragment m/z 128 car les mesures correspondantes aux
ions (m/z 328 et m/z 310) issus d’une fragmentation post-IM sont absents. Par cette
expérience, nous confirmons qu’il est possible de produire l’ion fragment m/z 128 à partir de
deux composés. Ces données sont en corrélation avec la recherche d’ion précurseur
effectuée sur un appareil de type QqQ (Shimadzu TQ 8060), ou la recherche d’ions parents
pour l’ion fragment m/z 128 indique que celui-ci peut être formé à partir de l’ion précurseur,
ou bien de la perte d’H2O. Les calculs quantiques démontrent également qu’il est possible, à
partir de ces deux précurseurs, d’obtenir deux ions fragments m/z 128 isomères.

228
 A l’inverse, la même expérience pour l’ion m/z 199 montre qu’il est possible d’obtenir
cet ion fragment uniquement à partir de l’ion précurseur. Une fois encore, ces données sont
en adéquation avec nos hypothèses : la production de deux ions de structures identiques, à
partir d’un même précurseur, mais par deux voies de fragmentation différentes.

La dissociation d’un ion précurseur en un ion fragment, est toujours suivie d’une
conversion d’énergie interne en énergie cinétique. Celle-ci peut se disperser spatialement,
c’est-à-dire que l’on retrouvera des vecteurs ∆v dans toutes les directions possibles. C’est ce
phénomène qui est à l’origine de la formation de profils Gaussiens. Quand l’ion précurseur se
dissocie en un ion fragment et un neutre, les directions des vecteurs ∆v diffèrent. Pour les
particules légères, il existe une corrélation entre le rapport m/z et sa déviation. Plus le rapport
m/z est faible, plus la molécule aura une énergie cinétique dispersée spatialement. Dans ce
cas-là, le signal ERMS peut potentiellement s’élargir, sans pour autant perdre son profil
Gaussien. Cette interprétation n’est qu’un modèle proposé pour expliquer le profil atypique de
l’ion fragment m/z 199 et doit encore être démontré par des calculs physiques réalisés à l’aide
du logiciel SIM-ION. Cette interprétation semble corréler avec les expériences réalisées par
Cooks378 dans les années 1980, où il démontre que les ions de faibles m/z sont davantage
détectés, parce qu’ils s’éloignent davantage de l’axe, et sont donc davantage dispersés.

Ainsi quand le profil d’un signal lié à un ion produit donné, est dissymétrique comme
l’ion m/z 199, cela peut être expliqué en admettant que : (i) deux (ou plus) chemins de
dissociation peuvent mener à cet ion et que (ii) leurs seuils d’apparition diffèrent et (iii) donc
très probablement de même avec la dispersion de leurs excès d’énergie interne (après
conversion en énergie cinétique) alors chacun des chemins pourra être caractérisé par des
profils différents qui se chevauchent. Si les différences sont suffisantes et que la cellule de
collision est suffisamment discriminante en énergie cinétique, ces profils pourront être
distincts, et avoir un « dos de chameau ».

229
 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

L’ensemble de mes travaux de thèse ont permis de développer une stratéigie

expérimentale de chimie analytique spécifique aux lipopeptides. Celle-ci est composée de
plusieurs étapes cruciales et interconnectées, ayant été validées et optimisées
individuellement. Il contient notamment une extraction sur phase solide et une méthode
d’analyse de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution.
Chacune des étapes de ce workflow est essentielle pour permettre l’identification et la
caractérisation de nouveaux métabolites produits par le microbiote intestinal. Ainsi, lorsque
cette stratégie expérimentale de chimie analytique a été appliquée à des culots bactériens
d’Escherichia coli Nissle 1917 et de Lactobacillus animalis, 49 lipopeptides potentiels ont été
détectés. A l’aide d’expériences de fragmentation par mode d’excitation résonant et non
résonant, et de comparaison à des composés primaires synthétiques, nous avons pu identifier
et caractériser vingt-trois nouveaux lipoaminoacides (LpAA) et six lipopeptide. L’annotation de
vingt-deux composés a été réalisée avec un niveau 1 d’identification, deux composés à un
niveau 2 et dix-huit à un niveau 3. Le développement d’une méthode de quantification de ces
composés par LC-QqQ a été réalisée. Ces composés ont ainsi été quantifiés dans différentes
souches bactériennes. Nous avons pu démontrer que la production de LpAA et de
lipopeptides dans le microbiote intestinal est possible via des bactéries gram positives comme
Lactobacillus animalis, ou gram négatives comme Escherichia coli Nissle 1917. Ces résultats
démontrent la redondance fonctionnelle des bactéries du microbiote pour produire ces
molécules et l’importance de comparer la fonctionnalité du microbiote et pas seulement sa
taxonomie afin de déterminer son rôle dans les pathologies. Les lipopeptides identifiés
contenant du GABA sont en cours de développement thérapeutique pour être utilisé comme
analgésiques contre les douleurs viscérales dans certaines pathologies. Les lipopeptides
dopamine, sérotonine et histamine n’ont pas encore pu être identifiés à l’aide de ce workflow
analytique. Lorsque les standards seront terminés d’être synthétisés, il sera nécessaire de
réoptimiser certaines étapes du workflow, notamment les paramètres de détection en
spectrométrie de masse et la méthode d’extraction pour accroitre nos chances d’en découvrir.

La caractérisation et l’élucidation structurale de ces nouveaux composés a permis de

mettre en évidence la régénération d’ions fragments inattendus chez les lipoaminoacides
acides. Pour une meilleure compréhension et étude de ces fragmentations, nous avons mis
en place une nomenclature spécifique aux lipopeptides applicable en protéomique. L’étude
des courbes d’évolution ERMS a permis de mettre en évidence pour la première fois la
présence de courbes Gaussiennes élargies et de courbes composites. Les calculs quantiques

231
ainsi que la mobilité ionique cyclique ont permis de mettre en évidence la présence de deux
ions fragments isomères produits lorsque nous sommes en présence d’une courbe composite.
L’interprétation des courbes Gaussiennes élargies s’explique par la présence de deux
chemins réactionnels issus d’un même précurseur formant un seul et même ion fragment à
deux seuils différents d’énergie de collision, menant à deux chemins de fragmentation
différents.

Pour aller plus loin l’utilisation d’outils pour étudier les réseaux moléculaires serait
certainement pertinent. Grâce à ces outils où les fragmentations semblables sont regroupées
et mises en évidence, cela pourrait ici augmenter les probabilités de découvertes de nouvelles
molécules maintenant que les fragmentations de plus de vingt LpAA ont été déterminées. Au
cours de ma thèse nous avons pu faire quelques essais sur les logiciels MetGEM et GNPS
mais le mode de scan utilisé sur l’instrument Waters complique cette analyse. De plus, il n’est
pas encore possible de rechercher un ou plusieurs fragments d’intérêt dans le réseau
moléculaire sans en analyser l’ensemble, ce qui rend le processus chronophage. Ce travail
ouvre également tout un axe de recherche sur les lipoaminoacides acides qui se comportent
de manière inattendue et dont certaines courbes d’évolution ERMS sont des Gaussiennes
élargies, et dont nous avons surement encore beaucoup à apprendre. L’ER-IMS automatisée
pourrait être d’une grande utilité pour distinguer des ions fragments isomères dont les chemins
de fragmentation sont proches et dépendant de l’énergie de collision.

Nous sommes certainement très loin de connaitre la richesse de production de

métabolites spécialisés par les bactéries. Les activités biologiques de ces nouveaux
composés doivent encore être démontrées et les voies de biosynthèse impliquées dans leur
production également. Avec ce travail nous pouvons maintenant proposer la quantification
absolue de plus de quarante composés potentiellement impliqués dans certaines pathologies
intestinales sur des selles ou des biopsies intestinales de patients. Certains de ces composés
pourront peut-être être impliqués dans la prise en charge de ces pathologies en tant que
traitement ou comme biomarqueurs via leurs dosages.

232
 ANNEXE 1: La théorie du quasi-équilibre

La théorie dite du quasi-équilibre (quasi-equilibrium theory, QET), a été introduite par

Rosenstock379 dans les années 1950. Cependant, elle avait déjà été exprimée lors de la
théorie RRKM (Rice-Ramsperger-Kassel-Marcus) ou l’étude portait sur les constantes de
vitesse de dissociation des ions qui décrivent directement l’abondance des ions fragments
présents dans le spectre de masse. En d’autres termes ces constantes de vitesse k
permettent de mieux rendre compte des spectres de masses qui résultent de nombreuse
fragmentations des ions dans la source où la durée de résidence est courte (c’est-à-dire de
l’ordre de la microseconde en moyenne). Pour simplifier si on considère qu’approximativement
la moitié des espèces moléculaires se sont dissociées pendant la microseconde (temps de
demi-réaction t1/2) alors la constante de vitesse devra être k ≥ Ln2/t1/2 (soit 0,693x106 sˉ1).
Ainsi, qualitativement k devra être au moins de l’ordre de 106 sˉ1. Afin de rendre compte de
l’abondance relative des ions fragments, donc de leurs constantes de vitesse de formation
respectives, il faut connaître la température T des espèces ionisées qui se dissocient. Cette
donnée est nécessaire pour appliquer la loi macroscopique d’Arrhenius (k=AeˉE°/RTavec A le
facteur pré-exponentiel, E° l’énergie d’activation, et R la constante des gaz parfaits).
Malheureusement, les conditions d’ionisation en 1950 ne permettaient pas d’avoir accès à la
température T, puisque les ions étaient formés sous vide, par conséquence il n’était pas
possible, du point de vue thermodynamique, de définir une température T. En effet, les ions
dans ces conditions ne sont pas dans un état d’équilibre thermique résultant d’un grand
nombre de collisions avec le milieu ambiant. Ainsi il a fallu trouver une autre expression de la
constante de vitesse sans que la notion de température apparaisse. Il s’agit de la
QET/RRKM380 où c’est l’énergie interne (E) qui remplace la température. Cette théorie se base
sur le principe d’ergodicité. En résumé, cette théorie considère que toute l’énergie interne E
est distribuée « spontanément » sur l’ensemble des liaisons chimiques de l’ion parent, et que,
c’est la liaison la plus fragile dans ces conditions, qui sera rompue. La connaissance de
l’énergie interne (E) des ions qui se dissocient est importante afin de comprendre l’évolution
des réactions de fragmentation en fonction de E. Historiquement, les ions en question étaient
des ions moléculaires (M+•) produits en ionisation électronique et possédant une grande
distribution d’énergie vibrationnelle répartie dans l’état fondamental et dans les états excités.
Ces derniers états électroniques étaient atteints lors de l’ionisation par électron de grande
énergie cinétique. Les ions moléculaires étant des systèmes isolés (au sens
thermodynamique), excepté la perte d’énergie interne par radiation, une partie de l’énergie
vibrationnelle reste dans les états électroniques après que l’autre partie soit redistribuée dans

233
l’état fondamental. Ainsi l’énergie interne E correspond à cette large distribution d’énergie
vibrationnelle dans tous les états électroniques impliqués en plus de l’état fondamental.

C’est à partir de ces considérations que l’expression de k a été construite en fonction

de l’énergie interne E acquise par l’ion parent pendant l’étape d’ionisation. Cette constante de
vitesse dépend de l’excès d’énergie interne (vibrationnelle) au-dessus du niveau de l’état de
transition (noté ‡) (E0 étant l’énergie d’activation). Cet excès d’énergie normalisée par rapport
à E correspond à la différence (E-E0)/E (ou (1-E0/E)). Cet excès d’énergie normalisé est réparti
de manière inégal sur l’ensemble des liaisons chimiques n selon leurs propriétés respectives.
Toutefois pour faire un modèle simple, il est considéré que la répartition se fera sur l’ensemble
des liaisons sans compter la liaison rompue. Pour cela, il faut respecter le principe de
conservation de l’énergie. Ainsi on peut considérer que cet excès d’énergie sera distribué sur
(n-1) liaisons. L’expression qui répond au mieux à cette distribution d’énergie correspond à
l’équation de proportionnalité suivante (Eq. 5) :

E−E0 𝑛−1
Eq. 5 : 𝑘 𝛼 [ ]
E

Cette expression n’exprime que la partie énergétique, c’est-à-dire l’énergie liée au

second terme de l’équation d’Arrhenius (eˉE°/RT). Elle ne considère donc pas les propriétés
propres de l’état de transition qui implique des liaisons rompues et/ou créées (etat de transition
tendu pour un réarrangement : RR, ou lâche pour une rupture simple : RS). Ces propriétés de
transitions sont liées au terme pré-exponentiel A de l’équation d’Arrhénius. En d’autres
termes, cela correspond aux densité d’états (liées aux fréguences de vibration j‡)
caractérisant ces états de transitions : faibles dans le premier cas et grandes dans le second.
Ainsi, l’équation Eq :5 devient :

E−E0 𝑛−1 𝛱𝑗 𝜐j‡

Eq. 6 : 𝑘 = 𝜐 [ ] avec 𝜐= [ ]
E 𝛱𝑖𝜐i

Cette présentation de ce paramètre 𝜐 sera nommé facteur de fréquence. Ce facteur

de fréquence sera proportionel aux produits de ces différents états rapportés à ceux de l’état
initial.

En ce qui concerne l’étude menée dans ma thèse, les ions sont formés en électro-
nébulisation, leurs énergies internes sont donc distribuées seulement dans l’état fondamental
des formes protonées ou déprotonées. Cela procure comme avantage de ne pas avoir à
considérer les états électriques excités. En ESI, les spectres de masse sont dépendants de
l’instrument et des conditions de désorption des agrégats chargés et de leur désolvatation, ce
qui revient à dire que l’énergie interne est sensible aux conditions expérimentales. Tout
d’abord à pression atmosphérique les agrégats chargés sont caractérisés par une

234
température à l’équilibre avec son environnement. Cette température « macroscopique » de
la source337 ne correspondra pas à la température microscopique des ions issus de la
désolvatation381. Ce sera cette température qui pourrai être utilisée dans l’équation
d’Arrhenius (par approximation).

Cela a été montré en utilisant des « molécules thermomètres », comme par exemple
des sels de benzylpyridium, avec la méthode des ions précurseurs survivants337,382. Ainsi, il
est possible de connaître approximativement l’énergie interne des ions après leur
désolvatation. C’est ensuite, dès que la charge se situe sur un site, qu’elle induit le clivage
d’une (ou de plusieurs) liaison(s). Ce clivage sera observé dans les spectres de masse si k ≥
106 sˉ1 (dissociations promptes dans la source) et dans les spectres de collisions (où la fenêtre
temporelle pour se dissocier est de 10 μs) si k ≥ 105 sˉ1.

Toutefois, les mesures de températures n’étant pas si simples que cela pour les ions,
nous préférons largement travailler en considérant l’énergie interne. En ce qui nous concerne,
on ne raisonnera que qualitativement. Par exemple, un réarrangement sera plutôt favorisé en
basse énergie (faible facteur de fréquence 𝜐 et fable énergie d’activation), alors qu’une rupture
simple le sera en plus haute énergie (plus fortes valeurs de 𝜐 et d’E0). La théorie cinétique doit
nous amener à une telle conclusion, au contraire une forte énergie d’activation pour RR fera
que ce réarrangement ne sera jamais observé.

Ainsi lors d’un processus par étapes, passant par une isomérisation de la molécule
déprotonée en complexe ion-dipôle, alors sa dissociation directe sera le processus favorisé
en haute énergie. Par contre la réaction de transfert entre partenaires sera favorisée en basse
énergie. Il y a compétition entre ses deux processus. Si on admet qu’il y a uniquement ces
deux dissociations alors les courbes des ions fragments qui constitut l’ensemble ERMS,
l’évolution du processus direct apparaitra vers les hautes énergies alors qu’en basse énegie
se sera le transfert de proton qui sera observé pour disparaitre dès que l’énergie de collision
sera élevée.

235
 ANNEXE 2: Supplementary information publication 1

Solvents and reagents were used as obtained from the suppliers (Aldrich, Alfa Aesar,
Acros, Fluorochem, TCI, and Iris-Biotech for 2-chlorotrityl resin). For intermediate compounds,
reactions were monitored by TLC using plates precoated with silica gel 60 (Merck). Reaction
components were visualized by using a 254 nm UV lamp and treatment with basic KMnO 4
solution. For final compounds, TLC RP-18 (Merk) using plates precoated with silica gel 60
(typically ACN/Water 90/10 + 0.1 % TFA) were used instead, and they were visualized with
Hanessian’s blue stain (typically as a dark blue spot). Column chromatography in normal
phase were performed on Reveleris X2 by using Macherey-Nagel Chromabound® (40-64 μm)
or Interchim SIHP-PuriFlash® column (30 µm) for spherical column. In reversed phase,
Interchim PuriFlash® C4 or C18 (PT-15 µm, 12g or 55g) were used instead. Following
abbreviations are used: NMP = N-Methyl-2-pyrrolidone, DCM = dichloromethane, DMF =
dimethylformamide, TFA = trifluoroacetic acid, TIPS = triisopropyl silane, Cyc = cyclohexane,
HFIP = Hexafluoroisopropanol, Fmoc = fluorenylmethoxycarbonyl, HBTU = N,N,N′,N′-
Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate, HOBt = 1-
Hydroxybenzotriazole, NMM = N-Methylmorpholine, OxymaPure = Ethyl
cyano(hydroxyimino)acetate, DIC = N,N′-Diisopropylcarbodiimide. The 1H NMR spectra are
reported as follow: chemical shift in ppm [multiplicity, coupling constant(s) J in Hz, relative
integral]. The multiplicities are defined as follow: l = large, m = multiplet, s = singlet, d = doublet,
t = triplet, q = quadruplet, p = quintuplet, or combinations thereof. LCMS analyses were carried
out on a Waters Micromass with Alliance 2695 chain with a Chromolite HR C18 column (25 ×
4.6 mm, Merck Inc.) monitoring at 214 nm with positive ion mode for the ion m/z value
detection. Solvents for LCMS were water with 0.1% formic acid (solvent A) and acetonitrile
with 0.1% formic acid (solvent B). Compounds were eluted at a flow rate of 3mL min−1 by a
linear gradient of 0–100% solvent B over 2.5 min, and finally 100% solvent B for 1 min before
equilibrating the column back to 0% solvent B over 1 min.

HPLC preparative purification: Samples were prepared in DMSO. The LC/MS autopurification
system consisted of a binary pump Waters 2525, an injector fraction collector Waters 2676,
coupled to a Waters Micromass ZQ spectrometer (electrospray ionization mode, ESI+).
Purifications were carried out using a Luna® 5 μm C18 100 Å, LC Column 100 × 21.2 mm,
AXIA™ Packed. A flow rate of 20 mL min−1 and a gradient of 40–60% B over 10 min were
used. Eluent A: water with 0.1% TFA; eluent B: acetonitrile with 0.1% TFA. Positive ion
electrospray mass spectra were acquired at a solvent flow rate of 204 μL min−1. Nitrogen was
used for both the nebulizing and drying gas. The mass spectrum data were obtained in a scan
mode ranging from 100 to 1000 m/z in 0.1 s intervals; 10 scans were summed up to get the
final mass spectrum. Collection control trigger is set on single protonated ion with a MIT
(minimum intensity threshold) of 7.105.

Example 1: Amide bond formation with HBTU coupling. To a solution of H-Leu(OtBu).HCl

(134 mg, 0.60 mmol, 1.0 eq.) and lauric acid (180 mg, 0.90 mmol, 1.5 eq.) in DCM (6 mL, [C]
= 0.1 M) were added HBTU (341 mg, 0.90 mmol, 1.5 eq.), HOBt (8 mg, 60 µmol, 0.1 eq.), and

237
NMM (251 µL, 2.28 mmol, 3.8 eq.). The reaction mixture was stirred overnight. Silica was
added and the solvent was evaporated. The crude was purified by flash chromatography on
Reveleris X2 (25g, dry sample), monitoring with ELSD detector. Cyc/EtOAc: 100/0 to 80/20
(15 CV) to obtain C12-Leu(OtBu) (221 mg, Y = 97%) was obtained as a colorless oil.

Example 2: Deprotection of trityl amide and terbutyl ester. To a solution of C12-Leu(OtBu).HCl

(197 mg, 0.533 mmol, 1.0 eq.) in DCM (1.1 mL, [C] = 0.5 M) was slowly added TFA (1.1 mL,
14.4 mmol, 27 eq.) at RT. Resulting yellow solution was stirred for 5h at RT. Reaction mixture
was evaporated under vacuum and coevaporated three times with ACN to remove traces of
TFA. The resulting solid was purified by flash chromatography on Reveleris X2 (12g, dry
sample), monitoring with ELSD detector. DCM/MeOH + 1% HCO2H: 100/0 to 93/7 (15 CV).
Product was coevaporated with toluene and Et2O, dried overnight under vacuum to give (123
mg, Y = 67 %) of C12-Leu-OH as a white solid.

Example 3: General procedure for Solid Phase Synthesis (SPS) of aminolipids. In a SPS
reactor, 2-chlorotrityl resin (max loading 1.6 mmol/g, 313 mg, 500 µmol, 2.5 eq.) was swollen
in DCM (5 mL, 5 min). Solvent was evacuated and DCM was added (5 mL). Appropriate Fmoc-
Amino Acid (200 µmol, 1.0 eq.) and NMM (800 µmol, 4.0 eq.) were added and reaction mixture
was stirred for 3h. Liquid was evacuated under vacuum and resin was capped with
DCM/MeOH/NMM (17/2/1) (3x5 mL, 5 min each), washed with DCM (3x5 mL, 1 min each),
DMF (3x5 mL, 1 min each), DCM (3x5 mL, 1 min each). Then, Fmoc group was removed with
piperidine/DMF (2/8) (2x5 mL, 10 min each). Resin was washed with DMF (3x5 mL, 1 min
each), DCM (3x5 mL, 1 min each), NMP (3x5 mL, 1 min each). Resin was swollen in NMP (5
mL), and the appropriate fatty acid (750 µmol, 5.0 eq.), HBTU (750 µmol, 5.0 eq.), HOBt (15
µmol, 0.1 eq.), NMM (7.5 mmol, 10.0 eq.) were added. Reaction mixture was stirred for 1h30
to overnight, monitoring with Kaiser’s test. Liquid was evacuated under vacuum and resin was
washed with NMP (3x5 mL, 1 min each), Pyridine (3x5 mL, 1 min each), MeOH (3x5 mL, 1
min each), DCM (6x5 mL, 1 min each). Resin was cleaved with TFA/TIPS/Water (95/5/2.5)
(2*5min). Resin was washed with DCM (3x5 mL, 1 min each). Filtrate was concentrated under
vacuum, coevaporated with ACN several times to remove residual TFA. The white residue
was then triturated two times in ACN and filtered to give the desired lipopeptide without further
purification (except specified).

Example 4: Synthesis of aminolipids containing a mono-unsaturated fatty acid. Steps were

identical to example 3, except that coupling reactions were carried out with OxymaPure (2.0
eq.)/DIC (2.0 eq.)/Fatty acid (2.0 eq.) (5 min of preactivation) during one night (> 16 h) instead
of HBTU/HOBt/NMM, starting with Fmoc-Asn-OH (53 mg, 150 µmol, 1.0 eq.). Resin was
cleaved with DCM/HFIP (7/3) for 1h30. After evaporation, the residue was then triturated two
times in Et2O and filtered to give the desired lipopeptide.

Example 5: Hydrolysis of methyl ester. A solution of C12-His(OMe) in THF/NaOH (3M) was

stirred overnight. pH was adjusted to 3-4 with HCl 1M and crude reaction mixture was
evaporated under vacuum. Residue was taken-up with MeOH, filtered on Celite®, washed
with MeOH. Celite® was added to the filtrate, concentrated under vacuum and purified by flash

238
chromatography on Reveleris X2 (C4 - 12 g, Celite deposite). Water/MeOH: 40/60 to 0/100
(15CV). C12-His-OH (68 mg, Y = 57 %) was obtained as white solid.

Example 6: Synthesis of GABA aminolipids. In a SPS reactor, flushed with argon, 2-chlorotrityl
resin (max loading 1.6 mmol/g, 1.0 g, 1.6 mmol, 3.0 eq.) was swollen in DCM (12 mL, 5 min).
Solvent was evacuated and DCM was added (12 mL). Fmoc-GABA-OH (1.07 g, 3.30 mmol,
3.0 eq.) - dissolved in a minimum of NMP -HgCl2 (358 mg, 1.32 mmol, 1.2 eq.), NMM (726 µL,
6.60 mmol, 6.0 eq.) were added. The pink mixture was stirred overnight (>16h). Resin was
capped, following example 3. Loading was determined by spectroscopy at 290 nm (Fmoc
deprotection: 1*15 min) and 1.35 g of Fmoc-GABA 2-chlorotrityl resin was obtained with a
loading of 0.75 mmol/g. Resin was dried overnight before use. GABA-aminolipids were
obtained following the steps described in example 3.

C12-Leu(OtBu):

Following the example 1: Y = 99 % (221 mg). Colorless oil.

Rf (Cyc/EtOAc 80/20) = 0.35.
1
H NMR (CDCl3, 300 Mhz): δ 5.84 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.53 (td, J = 8.5, 5.3 Hz, 1H), 2.19 (lt, J
= 8.2 Hz, 2H), 1.70 – 1.56 (m, 4H), 1.46 (s, 9H), δ 1.36 – 1.12 (m, 17H), 0.95-0.92 (m, 6H),
0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3, 75 Mhz): δ 172.9, 172.7, 82.0, 51.2, 42.3, 36.9, 32.1, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4,
28.1, 25.8, 25.1, 23.0, 22.8, 22.3, 14.3.
IR (neat) umax (cm-1): 3397-3250, 2962, 2923, 2855, 1737, 1646, 1536, 1460, 1368, 1250,
1146, 849.

C12-Leu-OH:

Following the example 2, starting with C12-Leu(OtBu) (197 mg, 533 µmol, 1.0 eq.) : Y = 67 %
(112 mg). White solid.
1
H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 5.84 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.59 (td, J = 8.5, 4.7 Hz, 1H), 2.24 (t, J
= 7.6 Hz, 2H), 1.79-1.55 (m, 4H), 1.37 – 1.11 (m, 17H), 0.96 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.95 (d, J =
6.3 Hz, 3H), 0.88 (t, 3H).
13
C NMR (CDCl3, 75 MHz,): δ 176.4, 174.3, 51.0, 41.1, 36.7, 32.1, 29.8, 29.6, 29.5, 29.3,
25.72, 25.02, 22.99, 22.84, 21.98, 14.28.
Mp (°C): 109.5-110.6.
IR (neat) umax (cm-1): 3324, 2957, 2922, 2853, 1695, 1615, 1554, 1467, 1272, 1238, 1168,
969.

239
C12-Ile(OtBu):

Following the example 1, starting with H-Ile-OtBu.HCl (134 mg, 0.60 mmol, 1.0 eq): Y = 73 %
(131 mg). Colorless oil.
Rf (Cyc/EtOAc 80/20) = 0.35.
1
H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 5.96 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.51 (dd, J = 8.5, 4.5 Hz, 1H), 2.21 (t,
J = 7.5 Hz, 2H), 1.91-1.81 (m, 1H), 1.69-1.54 (m, 3H), 1.53-1.37 (m, 1H), 1.46 (s, 9H), 1.37-
1.21 (m, 16H), 0.91 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 9.4 Hz, 3H), 0.86 (t, J = 6.9 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 172.9, 171.5, 82.2, 56.6, 38.5, 37.0, 32.1, 29.8, 29.7, 29.5, 29.4,
28.3, 25.9, 25.6, 22.9, 15.5, 14.3, 11.9.
IR (neat) umax (cm-1): 3397-3230, 2962, 2924, 2855, 1737, 1646, 1635, 1460, 1367, 1250,
1146, 848.

C12-Ile-OH:

Following the example 2, starting with C12-Ile(OtBu) (132 mg, 357 µmol): Y = 82 % (92 mg).
White solid.
1
H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 6.01 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.61 (dd, J = 8.4, 5.0 Hz, 1H), 2.25 (t,
J = 7.6 Hz, 2H), 2.02-1.89 (m, 1H), 1.63 (p, J = 7.1 Hz, 3H), 1.50-1.44 (m, 1H), 1.38-1.12 (m,
17 H), 0.96 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.94 (t, J = 7.7 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 175.5, 174.0, 56.6, 37.7, 36.8, 32.1, 29.8, 29.6, 29.5, 29.4, 25.8,
25.2, 22.8, 15.6, 14.3, 11.7.
Mp (°C): 106.7-107.4. IR (neat)
umax (cm-1): 3299, 2952, 2920, 2877, 2851, 1695, 1597, 1550, 1467, 1364, 1252, 1149, 1114,
1000, 975, 721, 692.

C12-Val(OtBu):

Following the example 1, starting with H-Val-OtBu.HCl (126 mg, 0.60 mmol, 1.0 eq.): Y = 99
% (213 mg). Colorless Oil.
Rf (Cyc/EtOAc 80/20) = 0.33.
1
H NMR (300 MHz, CDCl3): d 5.92 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 8.6, 4.5 Hz, 1H), 2.22 (lt,
J = 7.5, 2H), 2.17-2.07 (m, 1H), 1.69-1.55 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.35-1.18 (m, 16H), 0.89 (d,
J = 6.9 Hz, 3H), 0.92 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 173.1, 171.6, 82.1, 57.2, 37.0, 32.1, 31.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4,
28.2, 25.9, 22.8, 19.0, 17.8, 14.3.
IR (neat) umax (cm-1): 3400-3234, 2961, 2924, 2855, 1736, 1647, 1536, 1466, 1368, 1146, 848.

C12-Val-OH:

240
Following the example 2, starting with C12-Val(OtBu) (196 mg, 551 µmol): Y = 76 % (125 mg).
White solid.
1
H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 6.03 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.57 (dd, J = 8.7, 4.8 Hz, 1H), 2.29 –
2.17 (m, 3H), 1.64 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 1.37-1.18 (m, 16H), 0.98 (d, J = 9.9 Hz, 3H), 0.96 (d, J
= 9.9 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 175.5, 174.2, 57.2, 36.8, 32.1, 31.0, 29.8, 29.6, 29.5, 29.4, 25.9,
22.8, 19.2, 17.8, 14.3.
Mp (°C): 106.7-107.4.
IR (neat) umax (cm-1): 3325, 2963, 2920, 2852, 1694, 1616, 1548, 1468, 1248, 972, 664.

C12-His(OMe):

Following the example 1, starting with H-His-OMe.HCl (147 mg, 0.60 mmol, 1.0 eq.): Y = 57
% (120 mg). White wax. Crude was purified by Flash Chromatography on Reveleris X2 (40 g,
silica deposite). DCM/MeOH: 100/0 to 9/1 (15 CV).
With neutral alumina TLC, Rf (DCM/MeOH 9/1) = 0.52.
1
H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.56 (s, 1H), 7.02 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 4.815 (ddd,
J = 7.7, 5.2, 5.1, 1H), 3.69 (s, 3H), 3.14 (dd, J = 15.2, 5.4, 1H), 3.07 (dd, J = 15.2, 4.9 Hz, 1H),
2.23 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.62 (p, J = 7.5 Hz, 2H), 1.37-1.18 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.5 Hz, 3H).
13
C NMR (MeOD, 75 MHz): d 176.3, 173.5, 136.3, 134.6, 118.1, 53.9, 52.7, 36.7, 33.1, 30.8,
30.6, 30.49, 30.46, 30.2, 30.1, 26.9, 23.8, 14.4.
IR (neat) umax (cm-1): 3234, 2915, 2849, 1756, 1646, 1529, 1160, 817, 659.

C12-His-OH:

Following the example 5: Y = 57 % (68 mg). White solid.

1
H NMR (MeOD, 300 MHz): δ 8.41 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 4.54 (dd, J = 7.5, 5.2 Hz, 1H), 3.22
(dd, J = 15.1, 5.2 Hz), 3.02 (dd, J = 15.1, 7.5 Hz, 1H), 2.23-2.17 (m, 2H), 1.55 (p, J = 6.8 Hz,
2H), 1.40-1.20 (m, 16H), 0.90 (t, 6.7 Hz, 3H).
13
C NMR (MeOD, 75 MHz): d 176.0, 175.8, 134.8, 132.8, 118.3, 54.6, 37.1, 33.1, 30.8, 30.7,
30.6, 30.5, 30.3, 29.6, 26.9, 23.7, 14.4.
Mp (°C): 163-164.5.
IR (neat) umax (cm-1): 3333, 3122, 2919, 2850, 1635, 1598, 1544, 1514, 1470, 1382, 860, 844.

C12-Gln(OtBu):

Following the example 1, starting with H-Gln-OtBu.HCl (143 mg, 0.60 mmol, 1.0 eq.): Y = 99
% (200 mg). Crude was purified by flash Chromatography on Reveleris X2 (12g – C4, Celite

241
deposite®). Water/MeOH: 5/5 to 0/100 (15 CV) to obtain the desired product as a pale pink
solid.
With neutral alumina, Rf (DCM/MeOH 95/5) = 0.52.
1
H NMR (CDCl3, 300 MHz): d 6.60 (s, 1H), 6.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.39 (s, 1H), 4.48 (ddd, J
= 9.5, 7.8, 4.2 Hz, 1H), 2.33 – 2.12 (m, 5H), 1.93-1.82 (m, 1H), 1.67 – 1.57 (m, 2H), 1.46 (s,
9H), 1.36-1.20 (m, 16H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3, 75 MHz): 174.7, 174.0, 171.4, 82.9, 52.3, 36.8, 32.3, 32.1, 29.7, 29.6, 29.6,
29.5, 29.4, 28.1, 25.7, 22.8, 14.3. Mp (°C): 96-97.
IR (neat) umax (cm-1): 3394, 3333, 3205, 2917, 2850, 1727, 1648, 1523, 1415, 1392, 1365,
1159, 848.

C12-Gln-OH:

Following the example 2, starting with C12-Gln(OtBu) (189 mg, 491 µmol): Y = 60 % (97 mg).
Crude was purified by flash Chromatography on Reveleris X2 (12g – C4, Celite deposite®).
Water/MeOH: 70/30 to 20/80 (15 CV) to obtain the desired product as a white solid.
1
H NMR (MeOD, 300 MHz): δ 4.39 (dd, J = 9.1, 4.9 Hz, 1H), 2.34 – 2.11 (m, 5H), 2.00 – 1.88
(m, 1H), 1.62 (p, J = 6.8 Hz, 2H), 1.40 – 1.23 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
13
C NMR (MeOD, 75 MHz): d 177.7, 176.5, 175.0, 53.2, 36.8, 33.1, 32.8, 30.76, 30.65, 30.5,
30.3, 28.5, 26.9, 23.7, 14.4.
Mp (°C): 132.2.
IR (neat) umax (cm-1): 3427, 3353, 3311, 3202, 2958, 2917, 2850, 1730, 1673, 1650, 1622,
1546, 1523, 1463, 1443, 1211, 674.

C16-Glu-OH:

Following the example 3, starting with Fmoc-Glu(tBu).H2O (89 mg, 200 µmol, 1.0 eq.): Y = 69
% (53 mg). White solid.
1
H NMR (MeOD, 300 MHz): δ 4.43 (dd, J = 9.3, 4.9 Hz, 1H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.25 (t,
J = 7.5 Hz, 2H), 2.22 – 2.09 (m, 1H), 1.99-1.86 (m, 1H), 1.62 (p, J = 7.1 Hz, 2H), 1.28-1.18
(m, 24H), 0.90 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
13
C NMR (MeOD, 75 MHz): δ 176.5, 176.3, 175.0, 52.9, 36.8, 33.1, 31.2, 30.8, 30.7, 30.5,
30.3, 27.8, 26.9, 23.8, 14.5.
Mp (°C): 118.7-119.7.
IR (neat) umax (cm-1): 3329, 3076, 2917, 2850, 1728, 1673, 1643, 1593, 1542, 1471, 1454,
1409, 1319, 1272, 1210, 1176, 988, 852, 780, 719.

13
C16-Asn-GABA-OH:

242
See example 4, starting with Fmoc-GABA-2-chlorotrityl resin (see example 6) (107 mg, 75
µmol, 0.70 mmol/g, 2.5 eq.) and Asn(Trt) (45 mg, 75 µmol, 1.0 eq.): Y = 79 % (27.8 mg, 97.5
% purity LC). White solid.
1
H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d 12.05 (s, 1H), 7.92 (dd, J = 8.1, 4.0 Hz, 1H), 7.77 (t, J = 5.8
Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.86 (s, 1H), 4.56 – 4.38 (m, 1H), 3.03 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 2.45 (dd, J =
15.3, 6.1 Hz, 1H), 2.32 (dd, J = 15.3, 7.7 Hz, 1H), 2.18 (lt, 3JH-H = 7.5 Hz, 2H), 2.06 (dm, 1JC-H
= 118 Hz, 2H), 1.58 (lp, 3JH-H = 7.1, 3H), 1.23 (dm, 1JC-H = 118 Hz, 25 H), 0.86 (ddt, 1JC-H = 125
Hz, 2JC-H = 12.0 Hz, 3JH-H = 7.3 Hz, 3H).

Mp (°C): > 181, thermal degradation.

IR (neat) umax (cm-1): 3412, 3307, 2945, 2910, 2844, 1699, 1665, 1649, 1607, 1563, 1531,
1435, 1413, 1215, 718.

C14(n-7)-OH :

To a light brown suspension of (6-carboxyhexyl)triphenylphosphonium bromide (1.98 g, 4.2

mmol, 2.1 eq.), gently dried under vacuum with heatgun for 5 min, in degassed (bubbling for
10 min with a needle) dry THF (4.7 mL, [C] = 0.5 M) under Ar was added dropwise at 0°C
KHMDS (8.0 mL, 1 M in THF, 8.0 mmol, 4.0 eq.). Resulting brown solution was stirred at RT
for 1h at 0°C, and cooled at -8°C. A cooled solution (-78°C) of heptanal (282 µL, 2.00 mmol,
1.0 eq.) in dry degassed THF (2.0 mL, [C] = 1 M) under Ar was added dropwise to the ylide at
-78°C. Mixture was stirred at -78°C to RT for 2h. TLC (Cyc/EtOAc: 90/10 – KMnO4) showed
full conversion of SM. Reaction mixture was quenched with KH2PO4 (0.1 M), aqueous phase
was carefully acidified with HCl (1M) at pH= 2/3, and extracted with EtOAc (2x). Combined
organic phase was dried over MgSO4, filtered, concentrated under vacuum to give crude.
Crude was purified by flash Chromatography on Reveleris X2 (dry sample, 40g column).
Cyc/iPrOH: 100/0 to 95/5 (12CV). C14(n-7)-OH (305 mg, Y = 67 %) was obtained as a yellow
oil, in a mixture with (E) compound (< 5% by LCMS).
1
H NMR (CDCl3, 300 MHz): d 5.53 – 5.20 (m, 2H), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.02 (p, J = 6.8 Hz,
4H), 1.69-1.58 (m, 2H), 1.51 – 1.10 (m, 12H), 1.03 – 0.65 (m, 3H).
13
C NMR (CDCl3, 300 MHz): d 180.1, 130.4, 129.5, 34.2, 31.9, 29.9, 29.5, 29.1, 28.98, 28.8,
27.4, 27.1, 24.7, 22.8, 14.3.

IR (neat) umax (cm-1): 3004, 2924, 2856, 1706, 1458, 1412, 1278, 1226, 935, 724.

C14(n-7)-Asn-OH:

Following the example 4, starting with Fmoc-Asn-OH (53 mg, 150 µmol, 1.0 eq.), crude
reaction mixture was purified by flash Chromatography on Reveleris X2 (12 g - C4, Celite
deposite). Water/[ACN-iPrOH 1:1] + 0.1 % TFA, 70/30 to 40/60 (12 CV), to obtain C14(n-7)-
Asn-OH
(17 mg, Y = 33 %) as a white solid.

243
1
H NMR (MeOD, 500 Mhz): d 5.40-5.33 (m, 2H), 4.73 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 2.78 (dd, J = 16.0,
4.6 Hz, 1H), 2.74 (dd, J = 16.0, 6.8 Hz, 1H), 2.25 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.09-1.99 (m, 4H), 1.63
(p, J = 7.1 Hz, 2H), 1.44 – 1.24 (m, 12H), 0.90 (t, J = 6.2 Hz, 3H).
13
C NMR (MeOD, 125 MHz): d 176.0, 175.0, 174.4, 130.96, 130.66, 37.8, 36.8, 33.0, 30.9,
30.6, 30.1, 29.9, 28.16, 28.05, 26.8, 23.7, 14.5.
Mp (°C): > 126, thermal degradation

IR (neat) umax (cm-1): 3381, 3275, 3185, 2926, 2856, 1738, 1718, 1659, 1590, 1551, 1415,
1265, 1220, 1191, 1137, 968, 673.

C12(n-7)-Asn-OH

Following the example 4, starting with Fmoc-Asn-OH (53 mg, 150 µmol, 1.0 eq.): Y = 20 %
(9.3 mg).
Off-white solid.
1
H NMR (CDCl3 + eTFA, 500 MHz): d 7.14 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 5.57 – 5.34 (m, 2H), 5.39 –
5.21 (m, 2H), 4.93 – 4.73 (m, 1H), 3.13 – 2.95 (m, 2H), 2.35 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.07 (q, J =
7.3 Hz, 2H), 1.98 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.67 (p, J = 7.4 Hz, 2H), 1.49 – 1.06 (m, 8H), 0.87 (t, J
= 6.7 Hz, 3H).
13
C NMR (125 MHz, CDCl3 + eTFA): δ 176.7, 175.7, 174.2, 132.0, 127.6, 49.4, 36.4, 35.6,
31.9, 29.74, 29.71, 29.1, 27.39, 27.35, 26.5, 25.6, 22.81, 22.75, 14.2.
Mp (°C): > 121, thermal degradation
IR (neat) umax (cm-1): 3375, 3276, 3187, 2925, 2855, 1738, 1717, 1659, 1591, 1551, 1415,
1265, 1222, 1192, 1136, 947, 675.

C16(n-7)-Asn-OH:

Following the example 4, starting with Fmoc-Asn-OH (53 mg, 150 µmol, 1.0 eq.): crude
reaction mixture was purified twice by flash Chromatography on Reveleris X2 (12 g - C4,
Celite deposite). Water/[ACN-iPrOH 1:1] + 0.1 % TFA, 70/30 to 40/60 (12 CV), to obtain
C16(n-7)-Asn-OH
(4.5 mg, Y = 8 %) as an off-white solid.
1
H NMR (CDCl3+ eTFA, 400 MHz): d 7.25 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 5.40 - 5.29 (m, 2H), 4.88 (td,
J = 9.0, 7.1 Hz, 1H), 3.20 (dd, J = 16.6, 4.3 Hz, 1H), 3.05 (dd, J = 16.6, 5.0 Hz, 1H), 2.38 (t,
J = 7.7 Hz, 2H), 2.01 (q, J = 6.4 Hz, 4H), 1.62 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 1.35-1.29 (m, 16H), 0.88
(t, J = 6.6 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3 + eTFA, 101 MHz): d 177.4, 175.7, 175.3, 130.3, 129.8, 49.4, 36.4, 36.1,
31.9, 29.9, 29.8, 29.2, 29.1, 29.1, 27.4, 27.2, 25.7, 22.8, 14.2.

Mp (°C): > 131, thermal degradation.

IR (neat) umax (cm-1): 3516-3035, 2926, 2855, 1662, 1608, 1429, 1189, 1138, 842, 800, 722.

244
C17(n-7)-Asn-OH:

Following the example 4, starting with Fmoc-Asn-OH (53 mg, 150 µmol, 1.0 eq.): Y = 29 %
(16.9 mg, LCMS purity > 91%), as an off-white solid.
1
H NMR (MeOD, 500 MHz): d 5.37-5.31 (m, 2H), 4.70 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 2.78 (dd, J = 15.9,
4.7 Hz, 1H), 2.72 (dd, J = 15.8, 7.1 Hz, 1H), 2.23 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.07-1.99 (m, 4H), 1.69
– 1.54 (m, 2H), 1.47 – 1.13 (m, 18H), 0.90 (t, J = 5.7 Hz, 3H).
13
C NMR (MeOD, 125 Mhz): d 176.1, 175.0, 174.5, 130.8, 50.5, 37.8, 36.9, 33.0, 30.88,
30.84, 30.54, 30.51, 30.4, 30.3, 30.1. 28.2, 26.9, 23.7, 14.5.
Mp (°C): > 128-130, thermal degradation.
IR (neat) umax (cm-1): 3453-3081, 2923, 2854, 1738, 1717, 1660, 1590, 1552, 1457, 1416,
1265, 1191, 967, 675.

C12-Asn-OH:

Following the example 3, starting with Fmoc-Asn(Trt)-OH (119 mg, 200 µmol, 1.0 eq.): Y =
quant (63 mg). White solid.
1
H NMR (CDCl3, 300 MHz): d 7.44 (s, 1H), 7.38 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 4.94 (dt, J
= 7.5, 4.5 Hz, 1H), 3.23 (dd, J = 16.9, 4.5 Hz, 1H), 3.11 (dd, J = 16.9, 4.7 Hz, 1H), 2.41 (t, J
= 7.7 Hz, 2H), 1.63 (p, J = 7.4 Hz, 2H), 1.30-1.18 (m, 16 H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 2H).
13
C NMR (CDCl3 + eTFA, 75 MHz): d 177.7, 175.9 (two C), 49.4, 36.3, 36.1, 32.0, 29.7,
29.49, 29.45, 29.2, 29.0, 25.7, 22.8, 14.2.
Mp (°C): > 145 °C, thermal degradation.

IR (neat) umax (cm-1): 3405, 3294, 2916, 2849, 1698, 1657, 1647, 1587, 1542, 1433, ,1347,
4583, 1272, 1252, 1195, 1125, 978, 701.

C13-Asn-OH:

Following the example 3, starting with Fmoc-Asn(Trt)-OH (119 mg, 200 µmol, 1.0 eq.): Y =
91 % (60 mg). White solid.
1
H NMR (CDCl3 + eTFA, 300 MHz): d 7.34 (s, 1H), 6.60 (s, 1H), 4.90 (dt, J = 8.1, 4.5 Hz,
1H), 3.21 (dd, J = 16.7, 4.3 Hz, 1H), 3.09 (dd, J = 16.7, 4.9 Hz, 1H), 2.39 (t, J = 7.7 Hz, 2H),
1.69 – 1.56 (m, 1H), 1.41 – 1.13 (m, 18H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3 + eTFA, 75 MHz): d 176.7, 175.5, 173.6, 49.4, 36.4, 36.2, 32.0, 29.7, 29.5,
29.2, 29.1, 25.7, 22.8, 14.2.

Mp (°C): > 143 °C, thermal degradation.

245
IR (neat) umax (cm-1): 3401, 3294, 3224, 2917, 2849, 2623-2377, 1698, 1651, 1542, 1586,
1543, 1473, 1463, 1429, 1343, 1281, 1268, 1247, 1198, 1127, 974, 896, 731, 719, 696.

C14-Asn-OH:

Following the example 3, starting with Fmoc-Asn(Trt)-OH (90 mg, 150 µmol, 1.0 eq.): Y = 62
% (35 mg). White solid.
1
H NMR (CDCl3 + eTFA, 500 MHz): d 7.43 (s, 1H), 7.32 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H),
4.92 (dt, J = 8.3, 4.6 Hz, 1H), 3.32 – 2.97 (m, 2H), 2.40 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.63 (p, J = 7.4
Hz, 2H), 1.39 – 1.15 (m, 20H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
13
C NMR (126 MHz, CDCl3) d 177.9, 176.2, 176.0, 162.6, 162.3, 161.9, 161.6, 117.7, 115.5,
113.2, 110.9, 77.4, 77.2, 76.9, 49.4, 36.2, 36.0, 32.1, 29.8, 29.82, 29.75, 29.5, 29.2, 29.0,
25.8, 22.8, 14.2.

Mp (°C): > 138-142 °C, thermal degradation.

IR (neat) umax (cm-1): 3408, 3297, 3206, 2954, 2920, 2851, 1699, 1664, 1639, 1563, 1539,
1471, 1435, 1410, 1323, 1254, 1213, 1191, 949, 909, 720, 681.

C15-Asn-OH :

Following the example 3, starting with Fmoc-Asn(Trt)-OH (119 mg, 200 µmol, 1.0 eq.): Y =
59 % (42 mg). White solid.
1
H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): d 7.98 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.33 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 4.47
(ddd, J = 7.9, 7.3, 5.8 Hz, 2H), 2.59 – 2.35 (m, 2H), 2.07 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.53 – 1.38 (m,
2H), 1.35 – 1.12 (m, 20H), 0.92 – 0.67 (m, 3H).
13
C NMR (DMSO-d6, 75 MHz): d 173.1, 172.1, 171.3, 48.7, 36.8, 35.1, 31.3, 29.1, 29.1, 29.0,
28.9, 28.8, 28.6, 25.3, 22.1, 14.0.

Mp (°C): > 141, thermal degradation.

IR (neat) umax (cm-1): 3404, 3294, 3216, 2916, 2849, 1699, 1656, 1588, 1542, 1473, 1462,
1430, 1345, 1273, 1257, 1198, 1128, 973, 730, 719, 699.

C16-Asn-OH:

246
Following the example 3, starting with Fmoc-Asn(Trt)-OH (119 mg, 200 µmol, 1.0 eq.) : Y =
65 % (48 mg). White solid.
1
H NMR (CDCl3 + eTFA, 300 MHz): d 7.42 (s, 1H), 7.36 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.77 (s, 1H),
5.03 – 4.82 (m, 1H), 3.22 (dd, J = 16.8, 3.3 Hz, 1H), 3.10 (dd, J = 16.8, 4.1 Hz, 1H), 2.41 (t, J
= 7.5 Hz, 2H), 1.68-1.59 (m, 2H), 1.39 – 1.17 (m, 24H), 0.87 (t, J = 5.8 Hz, 4H).
13
C NMR (CDCl3 + eTFA, 75 Mhz): d 178.1, 176.1, 176.0, 49.42, 36.3, 36.0, 32.11, 29.85,
29.77, 29.71, 29.5, 29.2, 29.1, 25.8, 22.9, 14.2.

Mp (°C): > 140, thermal degradation.

IR (neat) umax (cm-1): 3405, 3293, 2915, 2849, 1698, 1658, 1648, 1586, 1543, 1474, 1463,
1435, 1347, 1284, 1253, 1199, 984, 702.

C14-Lys(tBu)-OtBu:

Following the example 1, starting with H-Lys(Boc)-OtBu.HCl (169 mg, 0.50 mmol, 1.0 eq.): Y
= 72 % (185 mg). Crude reaction mixture was purified by flash Chromatography on Reveleris
X2 (40 g, silica deposite). DCM/iPrOH 100/0 to 97.5 (12CV) to obtain C14-Lys(tBu)-OtBu as
a colorless oil that partially crystallized at room temperature.

Rf (DCM/iPrOH 95/5) = 0.56

1
H NMR (CDCl3, 300 MHz): d 6.03 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.63 – 4.52 (m, 1H), 4.48 (td, J = 7.5,
5.1 Hz, 1H), 3.09 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 2.25 – 2.15 (m, 2H), 1.90 – 1.73 (m, 1H), 1.62 (t, J =
6.5 Hz, 5H), 1.46 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.26 (d, J = 8.6 Hz, 22H), 0.87 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3, 75 MHz): d 173.0, 172.0, 156.2, 82.3, 79.3, 52.4, 40.3, 36.8, 32.5, 29.8,
29.79, 29.75, 29.64, 29.49, 29.43, 28.6, 28.2, 25.8, 22.4, 14.3.

IR (neat) umax (cm-1): 3365, 2918, 2850, 1733, 1683, 1647, 1516, 1365, 1250, 1161, 1143,
1000, 943, 851, 729, 721.

C14-Lys-OH:

Following the example 2, starting with C14-Lys(tBu)-OtBu (165 mg, 322 µmol), using Et3SiH
(101 µL, 643 µmol, 2.0 eq.) as scavenger. Crude reaction mixture was purified by flash
Chromatography on Reveleris X2 (24 g Interchim® SIHP, Celite deposite). DCM/MeOH + 0.1
%: 90/10 to remove apolar impurities then MeOH 100 % (monitoring with ELSD) to obtain Y
= 84 % (96 mg) as a white powder.
1
H NMR (CDCl3 + eTFA, 300 MHz): d 6.83 (s, 1H), 6.74 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.74 (td, J = 8.6,
4.8 Hz, 1H), 3.17 (p, J = 6.3 Hz, 2H), 2.37 (m, 2H), 2.13 – 1.71 (m, 4H), 1.68 – 1.41 (m, 4H),
1.40 – 1.19 (m, 20H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3 + eTFA, 75 MHz): d 177.3, 175.1, 52.6, 40.3, 35.9, 32.0, 30.8, 29.80, 29.76,
29.71, 29.56, 29.47, 29.2, 26.4, 25.8, 22.8, 21.9, 14.2.

247
Mp (°C): > 178 °C, thermal degradation

IR (neat) umax (cm-1): 3362, 3314, 2918, 2850, 1937, 1598, 1522, 1473, 1465, 1400, 1015,
720.

C14-Phe-OH:

Following the example 3, starting with Fmoc-Phe-OH (200 µmol, 78 mg, 1.0 eq.): Y = 56 %
(42 mg). White solid.
1
H NMR (CDCl3, 300 MHz): d 7.37 – 7.12 (m, 5H), 5.90 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.86 (q, J = 6.4
Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 14.1, 5.6 Hz, 1H), 3.13 (dd, J = 14.1, 6.4 Hz, 1H), 2.21 – 2.14 (m, 2H),
1.55 (p, J = 6.6, 2H), 1.34-1.19 (m, 20 H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
13
C NMR (CDCl3, 300 MHz): d 174.5, 174.2, 135.7, 129.5, 128.8, 127.4, 53.3, 37.3, 36.6,
32.1, 29.8, 29.76, 29.60, 29.51, 29.44, 29.28, 25.7, 22.9, 14.3.
Mp (°C): 79.8-80.6

IR (neat) umax (cm-1): 3300, 2919, 2851, 1727, 1706, 1641, 1532, 1497, 1456, 1469, 1420,
1294, 1249, 1191, 1136, 925, 750, 720, 698.

C14-Asn(Trt)s-GABA(OtBu):

Following the example 1, starting with NH2-Asn(Trt)-GABA(OtBu) (714 mg, 1.39 mmol): Y =
74 % (744 mg). White solid. Purification: DCM/AcOEt, 90/10 to 60/40.

Rf (Cyc/AcOEt 50/50) = 0.2.

1
H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): d 8.53 (s, 1H), 8.01 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.78 (t, J = 5.8 Hz,
1H), 7.39 – 6.90 (m, 15H), 4.47 (q, J = 7.7 Hz, 1H), 3.03 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 2.58 – 2.52 (m,
2H), 2.24 – 2.07 (m, 4H), 1.58 (p, J = 7.5 Hz, 2H), 1.52 – 1.43 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.33-
1.18 (m, 20 H), 0.85 (t, J = 6.4 Hz, 4H).
13
C NMR (DMSO-d6, 75 MHz): d 172.1, 172.0, 171.1, 169.0, 144.8, 128.6, 127.4, 126.3,
79.5, 69.4, 50.1, 38.3, 37.9, 35.3, 32.1, 31.3, 29.08, 28.96, 28.90, 28.75, 27.8, 25.1, 24.7,
22.1, 14.0.

Mp (°C): 176-178.

IR (neat) umax (cm-1): 3286, 2922, 2852, 1724, 1652, 1636, 1519, 1493, 1448, 1367, 1251,
1148, 847, 764, 748, 697.

248
C14-Asn-GABA-OH:

Following the example 2, starting with C14-Asn(Trt)-GABA(OtBu) (428 mg, 590 µmol): Y =
21 % (53 mg). White solid. Purified by HPLC preparative.
1
H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): d 7.91 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.75 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.26 (s,
1H), 6.84 (s, 1H), 4.47 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 3.03 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.48 – 2.24 (m, 2H), 2.18
(t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.08 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.58 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 1.52 – 1.38 (m, 2H),
1.23 (ls, 20 H), 0.85 (t, J = 6.5 Hz, 3H).
13
C NMR (75 MHz, DMSO-d6): d 174.3, 172.1, 171.5, 171.1, 49.7, 38.0, 37.4, 35.3, 31.3,
31.0, 29.10, 29.01, 28.9, 28.8, 28.7, 25.2, 24.5, 22.1, 14.0.

Mp (°C): > 197, thermal degradation.

IR (neat) umax (cm-1): 3408, 3297, 3206, 2954, 2920, 2851, 1699, 1664, 1639, 1563, 1539,
1471, 1435, 1409, 1323, 1254, 1213, 1191, 950, 909, 720.

C12-Asn-GABA-OH:

For the synthesis of C12-Asn-GABA-OH, see Nat. Comm. 8, 1314 (2017).

249
ANNEXE 3 : Supplementary information, publication 2
Modelling has been performed at B3LYP/6-31+G(d,p) (Stephens, 1994) level using G16
package (Frisch , 2016) the nature of minima identified by the nature of their frequencies A
E(ZPE)= -742.942528
6 0.29636 1.11206 0.38202 8 0.500459 -1.628033 -0.894160
1 0.52596 0.96883 1.452 6 1.990088 -1.349469 0.978306
6 1.36572 2.11024 -0.13349 1 1.632789 -2.231197 1.526181
8 1.09597 3.2276 -0.53296 1 2.253369 -0.582862 1.717205
8 2.63017 1.68341 -0.05758 6 3.212425 -1.716675 0.133885
1 2.65739 0.72647 0.27111 1 2.947595 -2.475018 -0.608121
6 -1.12342 1.68048 0.24406 1 3.590712 -0.839853 -0.396948
1 -1.12307 2.65189 0.74837 1 4.009176 -2.116760 0.772138
1 -1.31747 1.88897 -0.81363
6 -2.2486 0.79607 0.82348 B E(ZPE)=-742.884861
1 -1.90299 0.30237 1.74497 6 -1.393647 0.042026 -0.216064
1 -3.0908 1.42818 1.12093 1 -1.293327 -0.057944 -1.313138
6 -2.83866 -0.31409 -0.10013 6 -2.713054 -0.748606 0.149827
8 -2.03424 -0.85547 -0.94433 8 -2.536670 -1.828354 0.777114
8 -4.03727 -0.60244 0.06765 8 -3.775066 -0.219277 -0.254166
7 0.3611 -0.19975 -0.27344 1 0.167790 -1.410239 -1.784689
1 -0.60478 -0.52633 -0.6613 6 -1.504003 1.533686 0.116713
6 1.3364 -1.08354 -0.06042 1 -2.418881 1.929261 -0.333063
8 2.40699 -0.81089 0.5517 1 -1.597204 1.628872 1.205117
6 1.11742 -2.4799 -0.62321 6 -0.291361 2.367362 -0.362103
1 1.82791 -2.60501 -1.45108 1 -0.317127 2.438369 -1.457515
1 0.10711 -2.5591 -1.03487 1 -0.327611 3.377671 0.056610
6 1.36572 -3.56874 0.4303 6 1.036751 1.743476 0.011125
1 2.36552 -3.46752 0.8619 8 1.338444 0.626793 -0.744062
1 0.63415 -3.49968 1.24283 8 1.823102 2.199842 0.813205
1 1.27468 -4.56398 -0.01863 7 -0.251701 -0.549319 0.495768
1 -0.594647 -1.430637 0.894186
TSA->B E(ZPE)= -742,877372 6 0.992374 -0.687965 -0.185677
6 -1.314794 0.227540 0.058753 8 0.993600 -1.558008 -1.302088
1 -0.873724 0.315579 -0.939059 6 2.091245 -1.170535 0.766296
6 -2.524797 -0.707286 -0.191687 1 1.745301 -2.116964 1.200175
8 -3.676303 -0.369566 0.134119 1 2.152154 -0.439808 1.577361
8 -2.130462 -1.780711 -0.773727 6 3.460481 -1.354184 0.107867
1 -0.531503 -1.753617 -0.933405 1 3.421271 -2.106195 -0.685504
6 -1.415873 1.658374 0.560071 1 3.805014 -0.412451 -0.330195
1 -1.998233 2.248970 -0.154228 1 4.199184 -1.674240 0.852368
1 -1.941891 1.720220 1.521492
6 0.024529 2.237548 0.697065 TSB->C E(ZPE)= -742.844254
1 -0.001536 3.329261 0.667903 6 -1.501893 0.269480 -0.386423
1 0.443506 1.964789 1.675407 1 -1.627205 0.728737 -1.371816
6 1.066009 1.825805 -0.378936 6 -2.903004 -0.281548 0.101192
8 1.464710 0.568916 -0.523087 8 -2.860222 -1.426543 0.634792
8 1.567887 2.714689 -1.066542 8 -3.863831 0.499116 -0.062716
7 -0.324455 -0.499404 0.892434 1 -0.147547 -1.567143 -1.477759
1 -0.108346 -0.036402 1.765000 6 -1.015260 1.316987 0.620783
6 0.802237 -0.857444 0.163638 1 -1.871708 1.968307 0.824016

251
1 -0.769199 0.822048 1.569250 1 -2.918344 0.193628 0.120270
6 0.144268 2.206607 0.156421 1 -1.788425 -0.113185 1.417742
1 -0.164086 2.723159 -0.765236 6 -3.302965 -1.649399 1.192386
1 0.352214 2.987843 0.894246 1 -3.876950 -2.136720 0.399955
6 1.480578 1.568724 -0.190626 1 -2.753731 -2.433094 1.722647
8 1.479984 0.393917 -0.862283 1 -3.999668 -1.177838 1.894479
8 2.527845 2.168459 -0.018221
7 -0.596233 -0.896348 -0.496358 A’+H2O E(ZPE)= -819.369259
1 -1.038815 -1.583955 0.145315 6 -0.451947 -0.540910 0.508094
6 0.916510 -0.914626 -0.395785 1 -0.438826 -0.272717 1.578931
8 1.128170 -1.829171 -1.350903 6 -1.946511 -0.517222 0.111671
6 1.495360 -1.227454 0.987438 8 -2.564771 -1.521178 -0.212912
1 0.983500 -2.129264 1.343688 8 -2.552179 0.663878 0.201821
1 1.247795 -0.422141 1.690759 1 -1.876585 1.393118 0.459064
6 3.009062 -1.460633 0.952249 6 0.163579 -1.937158 0.334121
1 3.246956 -2.256645 0.241034 1 -0.469990 -2.633610 0.891917
1 3.537468 -0.555462 0.640273 1 0.082735 -2.229008 -0.718624
1 3.374956 -1.752502 1.943885 6 1.626084 -2.073598 0.810213
1 1.781597 -1.478318 1.723216
C E(ZPE)= -742.911690 1 1.819656 -3.112435 1.093051
6 0.174305 0.812153 -0.224058 6 2.749051 -1.676515 -0.195766
1 0.953024 1.144653 -0.924657 8 2.484422 -0.716556 -1.012695
6 -0.832844 1.964769 -0.238044 8 3.819657 -2.301664 -0.118602
8 -1.616581 1.986772 -1.349439 7 0.358910 0.443623 -0.218222
8 -0.910701 2.848710 0.586268 1 1.272503 0.001922 -0.656499
1 0.431541 -0.894573 -1.300163 6 0.261526 1.758287 -0.034174
6 0.890409 0.553840 1.120003 8 -0.676004 2.308885 0.615266
1 0.624870 1.354871 1.819357 6 1.339367 2.616234 -0.676257
1 0.514994 -0.385847 1.542553 1 0.859712 3.169372 -1.494602
6 2.423641 0.476372 0.986057 1 2.109916 1.974978 -1.113566
1 2.800321 1.464402 0.678593 6 1.953410 3.611003 0.319014
1 2.865265 0.273850 1.967218 1 1.176709 4.231106 0.775189
6 3.011269 -0.559706 -0.029988 1 2.485656 3.085654 1.119518
8 4.125165 -1.039758 0.271126 1 2.672027 4.263603 -0.188492
8 2.331256 -0.774521 -1.086763 8 -5.336824 -0.684213 -0.500763
7 -0.367221 -0.382838 -0.895611 1 -5.066129 0.224221 -0.313938
1 -1.422279 1.164658 -1.843219 1 -4.483119 -1.157196 -0.466025
6 -1.372051 -1.197168 -0.407190
8 -1.519395 -2.340759 -0.834128
6 -2.348100 -0.603944 0.613831

252
 VALORISATION DES TRAVAUX DE RECHERCHE
Travaux acceptés :
Amandine Hueber, Yves Gimbert, Geoffrey Langevin, Jean-Marie Galano, Alexandre Guy, Thierry
Durand, Nicolas Cenac, Justine Bertrand-Michel, Jean-Claude Tabet.
New lipoamino acid from E.Coli Bacteria : origin of regenerated fatty acid carboxylate
from dissociation of lipo-glutamate anion, accépté dans le journal Aminoacids.

Amandine Hueber, Camille Petitfils, Pauline Le Faouder, Geoffrey Langevin, Jean-Marie

Galano, Jean-François Martin, Jean-Claude Tabet, Nicolas Cenac, Justine Bertrand-Michel,
Discovery and quantification of new lipoamino acids in bacteria, accepté Analytica
Chimica Acta journal.

Travaux en soumission :
Amandine Hueber, Martin Green, Jakob Ujma, Keith Richardson, Yves Gimbert, Jean-
François Martin, Geoffrey Langevin, Nicolas Cenac, Justine Bertrand-Michel, Jean-Claude
Tabet, Energy-Resolved Ion Mobility Spectrometry, a new concept : composite
breakdown curves for distinguishing isomeric product ions, en soumission dans le
journal Analytical Chemestry.

Présentations orales :
Mise en place d’un workflow analytique pour l’identification et la caractérisation de nouveaux
lipopeptides bactériens : une approche par chromatographie liquide couplée à la
spectrométrie de masse à haute résolution, une approche non ciblée-ciblée. (Club jeune de
la société française de spectrométrie de masse, CJ-SFSM, en ligne)

Identification et caractérisation des lipopeptides et aminolipides bactériens produits par le

microbiote intestinal (Journées de l’association francophone des sciences séparatives AFSEP
du sud ouest, en ligne)

Présentation poster :
Amandine HUEBER, Camille PETITFILS, Pauline LE-FAOUDER, Jean-Marie GALANO,
Alexandre GUY, Thierry DURAND, Nicolas CENAC and Justine BERTRAND-MICHEL,
Experimental strategy to discover new bioactive lipopeptides produced by gut
microbiota : unknown-known approach by LC-HRMS. (Réseau Francophone de
Métabolomique et de Fluxomique, Metabomeeting, Toulouse, France)

Amandine Hueber, Yves Gimbert, Martin Green, Jakub Ujma, Keith Richardson, Valérie
Steiner, Geoffrey Langevin, Jean-François Martin, Nicolas Cenac, Justine Bertrand-Michel,
Jean-Claude Tabet : Unexpected “camel back” shape of Energy Resolved breakdown
curves of lipo-glutamate : direct and consecutive channels evidenced by cyclic ion
mobility (American Society of Mass Spectrometry ASMS – Philadelphia, United States of
America, November 2021), online presentation.

253
Curriculum vitæ

255
 BIBLIOGRAPHIE
1. Van Meer, G., Voelker, D. R. & Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they
behave. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 112–124 (2008).
2. Christie, W. W. & Han, X. Lipids: their structures and occurrence. in Lipid Analysis 3–19 (Elsevier,
2012). doi:10.1533/9780857097866.3.
3. Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N. & Cuadros-Rodríguez, L. From lipid analysis towards
lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid
analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry 28, 263–278 (2009).
4. Fahy, E. et al. A comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research 46, 839–861
(2005).
5. LIPID MAPS Lipidomics Gateway : Lipidomics Resources. Available at:
http://www.lipidmaps.org/data/classification/LM_classification_exp.php.
6. Kihara, A. Very long-chain fatty acids: elongation, physiology and related disorders. Journal of
Biochemistry 152, 387–395 (2012).
7. Maier, T. Architecture of Mammalian Fatty Acid Synthase at 4.5 A Resolution. Science 311, 1258–1262
(2006).
8. Guillou, H., Zadravec, D., Martin, P. G. P. & Jacobsson, A. The key roles of elongases and desaturases
in mammalian fatty acid metabolism: Insights from transgenic mice. Progress in Lipid Research 49,
186–199 (2010).
9. Shrago, E., Glennon, J. A. & Gordon, E. S. Comparative aspects of lipogenesis in mammalian tissues.
Metabolism 20, 54–62 (1971).
10. Subramanian, V., Dubini, A. & Seibert, M. Metabolic Pathways in Green Algae with Potential Value for
Biofuel Production. in The Science of Algal Fuels (eds. Gordon, R. & Seckbach, J.) vol. 25 399–422
(Springer Netherlands, 2012).
11. Zhang, J. Y., Kothapalli, K. S. D. & Brenna, J. T. Desaturase and elongase-limiting endogenous long-
chain polyunsaturated fatty acid biosynthesis: Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care
19, 103–110 (2016).
12. Bendsen, N. T. et al. Effect of industrially produced trans fat on markers of systemic inflammation:
evidence from a randomized trial in women. Journal of Lipid Research 52, 1821–1828 (2011).
13. Bassett, C. M. C. et al. trans-Fatty acids in the diet stimulate atherosclerosis. Metabolism 58, 1802–
1808 (2009).
14. Llorente-Cortés, V., Martínez-González, J. & Badimon, L. LDL Receptor–Related Protein Mediates
Uptake of Aggregated LDL in Human Vascular Smooth Muscle Cells. ATVB 20, 1572–1579 (2000).
15. Bassett, C. M. C. et al. Dietary Vaccenic Acid Has Antiatherogenic Effects in LDLr−/− Mice. The Journal
of Nutrition 140, 18–24 (2010).
16. Buczynski, M. W., Dumlao, D. S. & Dennis, E. A. Thematic Review Series: Proteomics. An integrated
omics analysis of eicosanoid biology. Journal of Lipid Research 50, 1015–1038 (2009).
17. Nicolaou, A., Mauro, C., Urquhart, P. & Marelli-Berg, F. Polyunsaturated Fatty Acid-Derived Lipid
Mediators and T Cell Function. Front. Immunol. 5, (2014).
18. Nicolaou, A. Eicosanoids in skin inflammation. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids
88, 131–138 (2013).
19. Nakamura, M. T. & Nara, T. Y. Essential fatty acid synthesis and its regulation in mammals.
Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 68, 145–150 (2003).
20. Bou Khalil, M. et al. Lipidomics era: Accomplishments and challenges: LIPIDOMICS ERA:
ACCOMPLISHMENTS AND CHALLENGES. Mass Spectrom. Rev. 29, 877–929 (2010).
21. Blée, E. Impact of phyto-oxylipins in plant defense. Trends in Plant Science 7, 315–322 (2002).
22. Needleman, P., Truk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R. & Lefkowith, J. B. Arachidonic Acid Metabolism.
Annu. Rev. Biochem. 55, 69–102 (1986).
23. Wenk, M. R. Lipidomics: New Tools and Applications. Cell 143, 888–895 (2010).
24. Funk, C. D. Prostaglandins and Leukotrienes: Advances in Eicosanoid Biology. Science 294, 1871–1875
(2001).

257
25. Gabbs, M., Leng, S., Devassy, J. G., Monirujjaman, M. & Aukema, H. M. Advances in Our Understanding
of Oxylipins Derived from Dietary PUFAs. Advances in Nutrition 6, 513–540 (2015).
26. Markworth, J. F. et al. Divergent shifts in lipid mediator profile following supplementation with n-3
docosapentaenoic acid and eicosapentaenoic acid. FASEB j. 30, 3714–3725 (2016).
27. Noverr, M. C., Erb-Downward, J. R. & Huffnagle, G. B. Production of Eicosanoids and Other Oxylipins
by Pathogenic Eukaryotic Microbes. Clin Microbiol Rev 16, 517–533 (2003).
28. Di Marzo, V. Endocannabinoids: synthesis and degradation. in Reviews of Physiology Biochemistry and
Pharmacology vol. 160 1–24 (Springer Berlin Heidelberg, 2006).
29. Tan, B. et al. Identification of endogenous acyl amino acids based on a targeted lipidomics approach.
Journal of Lipid Research 51, 112–119 (2010).
30. Carrasco, S. & Mérida, I. Diacylglycerol, when simplicity becomes complex. Trends in Biochemical
Sciences 32, 27–36 (2007).
31. Yamashita, A. et al. Acyltransferases and transacylases that determine the fatty acid composition of
glycerolipids and the metabolism of bioactive lipid mediators in mammalian cells and model
organisms. Progress in Lipid Research 53, 18–81 (2014).
32. Holthuis, J. C. M. & Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature
510, 48–57 (2014).
33. Wood, P. L. et al. Targeted Lipidomics of Fontal Cortex and Plasma Diacylglycerols (DAG) in Mild
Cognitive Impairment and Alzheimer’s Disease: Validation of DAG Accumulation Early in the
Pathophysiology of Alzheimer’s Disease. JAD 48, 537–546 (2015).
34. Horn, P. J. et al. Visualization of Lipid Droplet Composition by Direct Organelle Mass Spectrometry.
Journal of Biological Chemistry 286, 3298–3306 (2011).
35. Quehenberger, O. et al. Lipidomics reveals a remarkable diversity of lipids in human plasma. Journal
of Lipid Research 51, 3299–3305 (2010).
36. Himms-Hagen, J. Brown adipose tissue thermogenesis: interdisciplinary studies. FASEB J 4, 2890–2898
(1990).
37. Yen, C.-L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C. & Farese, R. V. Thematic Review Series: Glycerolipids.
DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research 49, 2283–2301 (2008).
38. Frisardi, V., Panza, F., Seripa, D., Farooqui, T. & Farooqui, A. A. Glycerophospholipids and
glycerophospholipid-derived lipid mediators: A complex meshwork in Alzheimer’s disease pathology.
Progress in Lipid Research 50, 313–330 (2011).
39. Hishikawa, D., Hashidate, T., Shimizu, T. & Shindou, H. Diversity and function of membrane
glycerophospholipids generated by the remodeling pathway in mammalian cells. Journal of Lipid
Research 55, 799–807 (2014).
40. Farooqui, A. A., Ong, W.-Y. & Farooqui, T. Lipid mediators in the nucleus: Their potential contribution
to Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids
1801, 906–916 (2010).
41. Nagan, N. & Zoeller, R. A. Plasmalogens: biosynthesis and functions. Progress in Lipid Research 40,
199–229 (2001).
42. Petrosino, S., Iuvone, T. & Di Marzo, V. N-palmitoyl-ethanolamine: Biochemistry and new therapeutic
opportunities. Biochimie 92, 724–727 (2010).
43. da Silva, T. F., Sousa, V. F., Malheiro, A. R. & Brites, P. The importance of ether-phospholipids: A view
from the perspective of mouse models. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of
Disease 1822, 1501–1508 (2012).
44. Lee, T. Biosynthesis and possible biological functions of plasmalogens. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA) - Lipids and Lipid Metabolism 1394, 129–145 (1998).
45. Jiménez-Rojo, N. & Riezman, H. On the road to unraveling the molecular functions of ether lipids.
FEBS Lett 593, 2378–2389 (2019).
46. Boudière, L. et al. Glycerolipids in photosynthesis: Composition, synthesis and trafficking. Biochimica
et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1837, 470–480 (2014).
47. Chen, J., Feng, L. & Prestwich, G. D. Asymmetric Total Synthesis of Phosphatidylinositol 3-Phosphate
and 4-Phosphate Derivatives. J. Org. Chem. 63, 6511–6522 (1998).
48. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 99–
111 (2008).

258
49. Vicinanza, M., D’Angelo, G., Di Campli, A. & De Matteis, M. A. Function and dysfunction of the PI
system in membrane trafficking. EMBO J 27, 2457–2470 (2008).
50. Hübscher, G., Dils, R. R. & Pover, W. F. R. Studies on the biosynthesis of phosphatidyl serine.
Biochimica et Biophysica Acta 36, 518–528 (1959).
51. Ridgway, N. D. Interactions between metabolism and intracellular distribution of cholesterol and
sphingomyelin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids 1484, 129–
141 (2000).
52. Kolter, T. A view on sphingolipids and disease. Chemistry and Physics of Lipids 164, 590–606 (2011).
53. Hla, T. & Dannenberg, A. J. Sphingolipid Signaling in Metabolic Disorders. Cell Metabolism 16, 420–
434 (2012).
54. Honke, K. Biosynthesis and biological function of sulfoglycolipids. Proc. Jpn. Acad., Ser. B 89, 129–138
(2013).
55. Slotte, J. P. Biological functions of sphingomyelins. Progress in Lipid Research 52, 424–437 (2013).
56. Eyster, K. M. The membrane and lipids as integral participants in signal transduction: lipid signal
transduction for the non-lipid biochemist. Advances in Physiology Education 31, 5–16 (2007).
57. Schnaar, R. L., Suzuki, A. & Stanley, P. Glycosphingolipids. in Essentials of Glycobiology (eds. Varki, A.
et al.) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009).
58. Yamashita, T. et al. A vital role for glycosphingolipid synthesis during development and differentiation.
Proceedings of the National Academy of Sciences 96, 9142–9147 (1999).
59. Morgan, A. E., Mooney, K. M., Wilkinson, S. J., Pickles, N. A. & Mc Auley, M. T. Cholesterol metabolism:
A review of how ageing disrupts the biological mechanisms responsible for its regulation. Ageing
Research Reviews 27, 108–124 (2016).
60. Payne, A. H. & Hales, D. B. Overview of Steroidogenic Enzymes in the Pathway from Cholesterol to
Active Steroid Hormones. Endocrine Reviews 25, 947–970 (2004).
61. Tsai, M. & O’Malley, B. W. Molecular Mechanisms of Action of Steroid/Thyroid Receptor Superfamily
Members. Annu. Rev. Biochem. 63, 451–486 (1994).
62. Kousteni, S. Reversal of Bone Loss in Mice by Nongenotropic Signaling of Sex Steroids. Science 298,
843–846 (2002).
63. Girod, J. & Brotman, D. Does altered glucocorticoid homeostasis increase cardiovascular risk?
Cardiovascular Research 64, 217–226 (2004).
64. Priego Capote, F., Jiménez, J. R., Granados, J. M. M. & de Castro, M. D. L. Identification and
determination of fat-soluble vitamins and metabolites in human serum by liquid
chromatography/triple quadrupole mass spectrometry with multiple reaction monitoring. Rapid
Commun. Mass Spectrom. 21, 1745–1754 (2007).
65. Feldman, D., Krishnan, A. V., Swami, S., Giovannucci, E. & Feldman, B. J. The role of vitamin D in
reducing cancer risk and progression. Nat Rev Cancer 14, 342–357 (2014).
66. Garabédian, M. et al. Prévention de la carence en vitamine D chez l’enfant et l’adolescent. II.
Validation d’un abaque décisionnel non invasif prenant en compte l’exposition solaire et les apports
exogènes de vitamine D. Archives de Pédiatrie 12, 410–419 (2005).
67. Tissandié, E., Guéguen, Y., A.Lobaccaro, J.-M., Aigueperse, J. & Souidi, M. Vitamine D : Métabolisme,
régulation et maladies associées. Med Sci (Paris) 22, 1095–1100 (2006).
68. G. Popjak, J.W. Cornforth. The biosynthesis of cholesterol.
69. Poupon, R., Chignard, N., Rosmorduc, O., Barbu, V. & Housset, C. La fonction biliaire et sa régulation.
Med Sci (Paris) 20, 1096–1099 (2004).
70. Jonas, A. Lecithin cholesterol acyltransferase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and
Cell Biology of Lipids 1529, 245–256 (2000).
71. Hur, E.-M. & Kim, K.-T. G protein-coupled receptor signalling and cross-talk. Cellular Signalling 14,
397–405 (2002).
72. Li, Q., Han, Y., Dy, A. B. C. & Hagerman, R. J. The Gut Microbiota and Autism Spectrum Disorders.
Front. Cell. Neurosci. 11, 120 (2017).
73. Mangiola, F. Gut microbiota in autism and mood disorders. WJG 22, 361 (2016).
74. Landman, C. & Quévrain, E. Le microbiote intestinal : description, rôle et implication
physiopathologique. La Revue de Médecine Interne 37, 418–423 (2016).
75. Eckburg, P. B. Diversity of the Human Intestinal Microbial Flora. Science 308, 1635–1638 (2005).

259
76. MetaHIT Consortium et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic
sequencing. Nature 464, 59–65 (2010).
77. Palmer, C., Bik, E. M., DiGiulio, D. B., Relman, D. A. & Brown, P. O. Development of the Human Infant
Intestinal Microbiota. PLoS Biol 5, e177 (2007).
78. Koenig, J. E. et al. Succession of microbial consortia in the developing infant gut microbiome.
Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 4578–4585 (2011).
79. Rodríguez, J. M. et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on
early life. Microbial Ecology in Health & Disease 26, (2015).
80. O’Hara, A. M. & Shanahan, F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Rep 7, 688–693 (2006).
81. Dethlefsen, L., Eckburg, P. B., Bik, E. M. & Relman, D. A. Assembly of the human intestinal microbiota.
Trends in Ecology & Evolution 21, 517–523 (2006).
82. Neish, A. S. Microbes in Gastrointestinal Health and Disease. Gastroenterology 136, 65–80 (2009).
83. Ley, R. E., Peterson, D. A. & Gordon, J. I. Ecological and Evolutionary Forces Shaping Microbial Diversity
in the Human Intestine. Cell 124, 837–848 (2006).
84. Whitman, W. B., Coleman, D. C. & Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the
National Academy of Sciences 95, 6578–6583 (1998).
85. Mahowald, M. A. et al. Characterizing a model human gut microbiota composed of members of its
two dominant bacterial phyla. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 5859–5864
(2009).
86. Gérard, P. Microbiote intestinal et lipides : impact sur la santé humaine. OCL 19, 223–227 (2012).
87. De La Cochetière, M. F. et al. Resilience of the Dominant Human Fecal Microbiota upon Short-Course
Antibiotic Challenge. J Clin Microbiol 43, 5588–5592 (2005).
88. O’Mahony, L. et al. Lactobacillus and bifidobacterium in irritable bowel syndrome: Symptom
responses and relationship to cytokine profiles. Gastroenterology 128, 541–551 (2005).
89. Kekkonen, R. A. et al. Probiotic intervention has strain-specific anti-inflammatory effects in healthy
adults. WJG 14, 2029 (2008).
90. Isolauri, E., Sütas, Y., Kankaanpää, P., Arvilommi, H. & Salminen, S. Probiotics: effects on immunity.
The American Journal of Clinical Nutrition 73, 444s–450s (2001).
91. Motevaseli, E., Dianatpour, A. & Ghafouri-Fard, S. The Role of Probiotics in Cancer Treatment:
Emphasis on their In Vivo and In Vitro Anti-metastatic Effects. Int J Mol Cell Med 6, (2017).
92. Ait Seddik, H., Bendali, F., Cudennec, B. & Drider, D. Anti-pathogenic and probiotic attributes of
Lactobacillus salivarius and Lactobacillus plantarum strains isolated from feces of Algerian infants and
adults. Research in Microbiology 168, 244–254 (2017).
93. Pérez-Berezo, T. et al. Identification of an analgesic lipopeptide produced by the probiotic Escherichia
coli strain Nissle 1917. Nat Commun 8, 1314 (2017).
94. Biagi, G., Cipollini, I., Pompei, A., Zaghini, G. & Matteuzzi, D. Effect of a Lactobacillus animalis strain
on composition and metabolism of the intestinal microflora in adult dogs. Veterinary Microbiology
124, 160–165 (2007).
95. Kaźmierczak-Siedlecka, K., Roviello, G., Catalano, M. & Polom, K. Gut Microbiota Modulation in the
Context of Immune-Related Aspects of Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. in Gastrointestinal
Cancers. Nutrients 13, 2674 (2021).
96. Park, S. H. & Itoh, K. Species-specific oligonucleotide probes for the detection and identification of
Lactobacillus isolated from mouse faeces. Journal of Applied Microbiology 99, 51–57 (2005).
97. Wassenaar, T. M. Insights from 100 years of research with probiotic E. coli. European Journal of
Microbiology and Immunology 6, 147–161 (2016).
98. Kono, T. et al. Epithelial transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1)-dependent adrenomedullin
upregulates blood flow in rat small intestine. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and
Liver Physiology 304, G428–G436 (2013).
99. Ochman, H. & Selander, R. K. Standard reference strains of Escherichia coli from natural populations.
J Bacteriol 157, 690–693 (1984).
100. Hsiao, E. Y. et al. Microbiota Modulate Behavioral and Physiological Abnormalities Associated with
Neurodevelopmental Disorders. Cell 155, 1451–1463 (2013).

260
101. Nowrouzian, F. L., Adlerberth, I. & Wold, A. E. Enhanced persistence in the colonic microbiota of
Escherichia coli strains belonging to phylogenetic group B2: role of virulence factors and adherence
to colonic cells. Microbes and Infection 8, 834–840 (2006).
102. Massot, M. et al. Phylogenetic, virulence and antibiotic resistance characteristics of commensal strain
populations of Escherichia coli from community subjects in the Paris area in 2010 and evolution over
30 years. Microbiology 162, 642–650 (2016).
103. Philippe Gérard, Annick Bernalier-Donadille. Les fonctions majeures du microbiote intestinal.
104. LeBlanc, J. G. et al. Bacteria as vitamin suppliers to their host: a gut microbiota perspective. Current
Opinion in Biotechnology 24, 160–168 (2013).
105. Gérard, P. Le microbiote intestinal: composition et fonctions. Phytothérapie 9, 72–75 (2011).
106. Nicholson, J. K., Holmes, E. & Wilson, I. D. Gut microorganisms, mammalian metabolism and
personalized health care. Nat Rev Microbiol 3, 431–438 (2005).
107. Cebra, J. J. Influences of microbiota on intestinal immune system development. The American Journal
of Clinical Nutrition 69, 1046s–1051s (1999).
108. Guarner, F. & Malagelada, J.-R. Gut flora in health and disease. The Lancet 361, 512–519 (2003).
109. Wostmann, B. S. The Germfree Animal in Nutritional Studies. Annu. Rev. Nutr. 1, 257–279 (1981).
110. Smith, K., McCoy, K. D. & Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of
mammals to their commensal intestinal microbiota. Seminars in Immunology 19, 59–69 (2007).
111. Gensollen, T., Iyer, S. S., Kasper, D. L. & Blumberg, R. S. How colonization by microbiota in early life
shapes the immune system. Science 352, 539–544 (2016).
112. de Vos, W. M. & de Vos, E. A. Role of the intestinal microbiome in health and disease: from correlation
to causation. Nutrition Reviews 70, S45–S56 (2012).
113. Ducrotté, P. Flore et syndrome de l’intestin irritable. Gastroentérologie Clinique et Biologique 34, 56–
60 (2010).
114. Holtmann, G. J., Ford, A. C. & Talley, N. J. Pathophysiology of irritable bowel syndrome. The Lancet
Gastroenterology & Hepatology 1, 133–146 (2016).
115. Chassard, C. et al. Functional dysbiosis within the gut microbiota of patients with constipated-irritable
bowel syndrome. Aliment Pharmacol Ther 35, 828–838 (2012).
116. Jailwala, J. Pharmacologic Treatment of the Irritable Bowel Syndrome: A Systematic Review of
Randomized, Controlled Trials. Ann Intern Med 133, 136 (2000).
117. Allison, S. D. & Martiny, J. B. H. Resistance, resilience, and redundancy in microbial communities.
Proceedings of the National Academy of Sciences 105, 11512–11519 (2008).
118. Pouteau, E., Meirim, I., Métairon, S. & Fay, L.-B. Acetate, propionate and butyrate in plasma:
determination of the concentration and isotopic enrichment by gas chromatography/mass
spectrometry with positive chemical ionization: SCFA concentration and isotopic enrichment in
plasma. J. Mass Spectrom. 36, 798–805 (2001).
119. Pujo, J. et al. Bacteria-derived long chain fatty acid exhibits anti-inflammatory properties in colitis.
Gut 70, 1088–1097 (2021).
120. Shaw, N. Lipid Composition as a Guide to the Classification of Bacteria. in Advances in Applied
Microbiology vol. 17 63–108 (Elsevier, 1974).
121. Meinwald, J. & Eisner, T. Chemical ecology in retrospect and prospect. Proceedings of the National
Academy of Sciences 105, 4539–4540 (2008).
122. Myrron and Sasser. Identification of Bacteria by Gas Chromatographyof Cellular Fatty Acids.
123. Lambert, P. A. Cellular impermeability and uptake of biocides and antibiotics in Gram-positive
bacteria and mycobacteria: ANTIMICROBIAL PENETRATION OF WALLS. Journal of Applied
Microbiology 92, 46S-54S (2002).
124. Macfarlane, G. T. & Macfarlane, S. Bacteria, Colonic Fermentation, and Gastrointestinal Health.
Journal of AOAC INTERNATIONAL 95, 50–60 (2012).
125. Zhang, G., Meredith, T. C. & Kahne, D. On the essentiality of lipopolysaccharide to Gram-negative
bacteria. Current Opinion in Microbiology 16, 779–785 (2013).
126. Galanos, C. & Freudenberg, M. A. Bacterial endotoxins: biological properties and mechanisms of
action. Mediators of Inflammation 2, S11–S16 (1993).
127. Kotani, S. et al. Synthetic lipid A with endotoxic and related biological activities comparable to those
of a natural lipid A from an Escherichia coli re-mutant. Infect Immun 49, 225–237 (1985).

261
128. Raetz, C. R. H. et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid
Research 50, S103–S108 (2009).
129. Tzeng, Y.-L., Datta, A., Kolli, V. K., Carlson, R. W. & Stephens, D. S. Endotoxin of Neisseria meningitidis
Composed Only of Intact Lipid A: Inactivation of the Meningococcal 3-Deoxy- D -Manno-Octulosonic
Acid Transferase. J Bacteriol 184, 2379–2388 (2002).
130. Schumann, R. et al. Structure and function of lipopolysaccharide binding protein. Science 249, 1429–
1431 (1990).
131. Raetz, C. R. H. & Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71, 635–700
(2002).
132. Wei, J. H., Yin, X. & Welander, P. V. Sterol Synthesis in Diverse Bacteria. Front. Microbiol. 7, (2016).
133. Koppel, N. & Balskus, E. P. Exploring and Understanding the Biochemical Diversity of the Human
Microbiota. Cell Chemical Biology 23, 18–30 (2016).
134. Wikoff, W. R. et al. Metabolomics analysis reveals large effects of gut microflora on mammalian blood
metabolites. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 3698–3703 (2009).
135. Sokol, H. Microbiote, ce qu’il faut savoir. Colon Rectum 8, 136–140 (2014).
136. Schoeler, M. & Caesar, R. Dietary lipids, gut microbiota and lipid metabolism. Rev Endocr Metab
Disord 20, 461–472 (2019).
137. Gérard, P. Gastrointestinal tract: microbial metabolism of steroids. In:Timmis, Kenneth. N. (Ed).
‘Microbiology of Hydrocarbons, Oils, Lipids ans Derivated Compounds’.
138. Ridlon, J. M., Kang, D.-J. & Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria.
Journal of Lipid Research 47, 241–259 (2006).
139. McGarr, S. E., Ridlon, J. M. & Hylemon, P. B. Diet, anaerobic bacterial metabolism, and colon cancer:
a review of the literature. J Clin Gastroenterol 39, 98–109 (2005).
140. Guarino, M. P. L. Ursodeoxycholic acid therapy in gallbladder disease, a story not yet completed. WJG
19, 5029 (2013).
141. Kovatcheva-Datchary, P., Zoetendal, E. G., Venema, K., de Vos, W. M. & Smidt, H. Review: Tools for
the tract: understanding the functionality of the gastrointestinal tract. Therap Adv Gastroenterol 2,
S9–S22 (2009).
142. Roy, C. C., Kien, C. L., Bouthillier, L. & Levy, E. Short-Chain Fatty Acids: Ready for Prime Time? Nutr
Clin Pract 21, 351–366 (2006).
143. Cook & Sellin. Review article: short chain fatty acids in health and disease: REVIEW: SCFAs IN HEALTH
AND DISEASE. Alimentary Pharmacology & Therapeutics 12, 499–507 (1998).
144. Cummings, J. H. Short chain fatty acids in the human colon. Gut 22, 763–779 (1981).
145. Ganapathy, V., Thangaraju, M., Prasad, P. D., Martin, P. M. & Singh, N. Transporters and receptors for
short-chain fatty acids as the molecular link between colonic bacteria and the host. Current Opinion
in Pharmacology 13, 869–874 (2013).
146. Charney, A. N., Micic, L. & Egnor, R. W. Nonionic diffusion of short-chain fatty acids across rat colon.
American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 274, G518–G524 (1998).
147. Stumpff, F. A look at the smelly side of physiology: transport of short chain fatty acids. Pflugers Arch
- Eur J Physiol 470, 571–598 (2018).
148. Wong, J. M. W., de Souza, R., Kendall, C. W. C., Emam, A. & Jenkins, D. J. A. Colonic Health:
Fermentation and Short Chain Fatty Acids: Journal of Clinical Gastroenterology 40, 235–243 (2006).
149. Cummings, J. H. & Macfarlane, G. T. Collaborative JPEN-Clinical Nutrition Scientific Publications Role
of intestinal bacteria in nutrient metabolism. JPEN J Parenter Enteral Nutr 21, 357–365 (1997).
150. Ragsdale, S. W. & Pierce, E. Acetogenesis and the Wood–Ljungdahl pathway of CO2 fixation.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics 1784, 1873–1898 (2008).
151. Park, J. et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of
histone deacetylases and regulation of the mTOR–S6K pathway. Mucosal Immunol 8, 80–93 (2015).
152. Hetzel, M. et al. Acryloyl-CoA reductase from Clostridium propionicum: An enzyme complex of
propionyl-CoA dehydrogenase and electron-transferring flavoprotein. European Journal of
Biochemistry 270, 902–910 (2003).
153. Chirakkal, H. et al. Upregulation of BAK by butyrate in the colon is associated with increased Sp3
binding. Oncogene 25, 7192–7200 (2006).

262
154. Hinnebusch, B. F., Meng, S., Wu, J. T., Archer, S. Y. & Hodin, R. A. The Effects of Short-Chain Fatty Acids
on Human Colon Cancer Cell Phenotype Are Associated with Histone Hyperacetylation. The Journal
of Nutrition 132, 1012–1017 (2002).
155. Andoh, Mitsue Shimada, Yoshio Araki, A. Sodium butyrate enhances complement-mediated cell injury
via down-regulation of decay-accelerating factor expression in colonic cancer cells. Cancer
Immunology, Immunotherapy 50, 663–672 (2002).
156. Sauer, J., Richter, K. K. & Pool-Zobel, B. L. Physiological concentrations of butyrate favorably modulate
genes of oxidative and metabolic stress in primary human colon cells. The Journal of Nutritional
Biochemistry 18, 736–745 (2007).
157. B. Gowda, S. G. et al. Chemical Labeling Assisted Detection and Identification of Short Chain Fatty Acid
Esters of Hydroxy Fatty Acid in Rat Colon and Cecum Contents. Metabolites 10, 398 (2020).
158. Cao, Y. & Zhang, X. Production of long-chain hydroxy fatty acids by microbial conversion.
doi:10.1007/s00253-013-4815-z.
159. Kim, K.-R. & Oh, D.-K. Production of hydroxy fatty acids by microbial fatty acid-hydroxylation enzymes.
Biotechnology Advances 31, 1473–1485 (2013).
160. Cohen, L. J. et al. Functional metagenomic discovery of bacterial effectors in the human microbiome
and isolation of commendamide, a GPCR G2A/132 agonist. Proc Natl Acad Sci USA 112, E4825–E4834
(2015).
161. Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B. & Séror, Simone. J. Comparative Analysis of the
Development of Swarming Communities of Bacillus subtilis 168 and a Natural Wild Type: Critical
Effects of Surfactin and the Composition of the Medium. J Bacteriol 187, 65–76 (2005).
162. Götze, S. & Stallforth, P. Structure, properties, and biological functions of nonribosomal lipopeptides
from pseudomonads. Nat. Prod. Rep. 37, 29–54 (2020).
163. Sorensen, K. N., Kim, K.-H. & Takemoto, J. Y. PCR Detection of Cyclic Lipodepsinonapeptide-Producing
Pseudomonas syringae pv. syringae and Similarity of Strains. Appl Environ Microbiol 64, 226–230
(1998).
164. Sorensen, K. N., Kim, K. H. & Takemoto, J. Y. In vitro antifungal and fungicidal activities and erythrocyte
toxicities of cyclic lipodepsinonapeptides produced by Pseudomonas syringae pv. syringae.
Antimicrob Agents Chemother 40, 2710–2713 (1996).
165. Tsukamoto, T., Murata, H. & Shirata, A. Identification of Non-Pseudomonad Bacteria from Fruit Bodies
of Wild Agaricales Fungi That Detoxify Tolaasin Produced by Pseudomonas tolaasii. Bioscience,
Biotechnology, and Biochemistry 66, 2201–2208 (2002).
166. Nougayrede, J.-P. Escherichia coli Induces DNA Double-Strand Breaks in Eukaryotic Cells. Science 313,
848–851 (2006).
167. Vizcaino, M. I., Engel, P., Trautman, E. & Crawford, J. M. Comparative Metabolomics and Structural
Characterizations Illuminate Colibactin Pathway-Dependent Small Molecules. J. Am. Chem. Soc. 136,
9244–9247 (2014).
168. Cane, D. E., Walsh, C. T. & Khosla, C. Harnessing the Biosynthetic Code: Combinations, Permutations,
and Mutations. Science 282, 63–68 (1998).
169. Marahiel, M. A., Stachelhaus, T. & Mootz, H. D. Modular Peptide Synthetases Involved in
Nonribosomal Peptide Synthesis. Chem. Rev. 97, 2651–2674 (1997).
170. Cane, D. E. & Walsh, C. T. The parallel and convergent universes of polyketide synthases and
nonribosomal peptide synthetases. Chemistry & Biology 6, R319–R325 (1999).
171. Putze, J. et al. Genetic Structure and Distribution of the Colibactin Genomic Island among Members
of the Family Enterobacteriaceae. Infect Immun 77, 4696–4703 (2009).
172. Manzoni, C. et al. Genome, transcriptome and proteome: the rise of omics data and their integration
in biomedical sciences. Briefings in Bioinformatics 19, 286–302 (2018).
173. Holčapek, M., Liebisch, G. & Ekroos, K. Lipidomic Analysis. Anal. Chem. 90, 4249–4257 (2018).
174. Wenk, M. R. The emerging field of lipidomics. Nat Rev Drug Discov 4, 594–610 (2005).
175. Zehethofer, N. & Pinto, D. M. Recent developments in tandem mass spectrometry for lipidomic
analysis. Analytica Chimica Acta 627, 62–70 (2008).
176. Capolupo, L. et al. Sphingolipid Control of Fibroblast Heterogeneity Revealed by Single-Cell Lipidomics.
http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/2021.02.23.432420 (2021) doi:10.1101/2021.02.23.432420.

263
177. Carter, J. A., O’Brien, L. M., Harville, T., Jones, B. T. & Donati, G. L. Machine learning tools to estimate
the severity of matrix effects and predict analyte recovery in inductively coupled plasma optical
emission spectrometry. Talanta 223, 121665 (2021).
178. Trufelli, H., Palma, P., Famiglini, G. & Cappiello, A. An overview of matrix effects in liquid
chromatography-mass spectrometry: AN OVERVIEW OF MATRIX EFFECTS IN LC-MS. Mass Spectrom.
Rev. 30, 491–509 (2011).
179. Le Faouder, P. et al. LC–MS/MS method for rapid and concomitant quantification of pro-inflammatory
and pro-resolving polyunsaturated fatty acid metabolites. Journal of Chromatography B 932, 123–133
(2013).
180. Le Faouder, P. et al. Untargeted Lipidomic Profiling of Dry Blood Spots Using SFC-HRMS. Metabolites
11, 305 (2021).
181. Charged Aerosol Detection for Liquid Chromatography and Related Separation Techniques. (John
Wiley & Sons, Inc., 2017). doi:10.1002/9781119390725.
182. Yang, L. et al. Recent advances in lipidomics for disease research: Liquid Chromatography. J. Sep.
Science 39, 38–50 (2016).
183. Bligh, E. G. & Dyer, W. J. A RAPID METHOD OF TOTAL LIPID EXTRACTION AND PURIFICATION. Can. J.
Biochem. Physiol. 37, 911–917 (1959).
184. Yu, Z. et al. Global lipidomics identified plasma lipids as novel biomarkers for early detection of lung
cancer. Oncotarget 8, 107899–107906 (2017).
185. Wolf, C. & Quinn, P. J. Lipidomics: Practical aspects and applications. Progress in Lipid Research 47,
15–36 (2008).
186. Riols, F. & Bertrand-Michel, J. Analysis of Oxysterols. in Clinical Metabolomics (ed. Giera, M.) vol. 1730
267–275 (Springer New York, 2018).
187. Folch, J., Lees, M. & Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total
lipides from animal tissues. J Biol Chem 226, 497–509 (1957).
188. Cajka, T. & Fiehn, O. Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography-
mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry 61, 192–206 (2014).
189. Löfgren, L. Liquid Extraction: BUME. in Encyclopedia of Lipidomics (ed. Wenk, M. R.) 1–5 (Springer
Netherlands, 2016). doi:10.1007/978-94-007-7864-1_98-1.
190. Ulmer, C. Z., Jones, C. M., Yost, R. A., Garrett, T. J. & Bowden, J. A. Optimization of Folch, Bligh-Dyer,
and Matyash sample-to-extraction solvent ratios for human plasma-based lipidomics studies.
Analytica Chimica Acta 1037, 351–357 (2018).
191. Dupuy, A. et al. Simultaneous quantitative profiling of 20 isoprostanoids from omega-3 and omega-6
polyunsaturated fatty acids by LC–MS/MS in various biological samples. Analytica Chimica Acta 921,
46–58 (2016).
192. www.agilent.com/.
193. Habib, A. et al. Inhibition of monoacylglycerol lipase, an anti-inflammatory and antifibrogenic strategy
in the liver. Gut 68, 522–532 (2019).
194. Schwudke, D., Liebisch, G., Herzog, R., Schmitz, G. & Shevchenko, A. Shotgun Lipidomics by Tandem
Mass Spectrometry under Data-Dependent Acquisition Control. in Methods in Enzymology vol. 433
175–191 (Elsevier, 2007).
195. Han, X. & Gross, R. W. Shotgun lipidomics: Electrospray ionization mass spectrometric analysis and
quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples. Mass Spectrom.
Rev. 24, 367–412 (2005).
196. James, A. T. & Martin, A. J. P. Gas-liquid partition chromatography: the separation and micro-
estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid. Biochemical Journal 50, 679–
690 (1952).
197. Principe de la chromtographie gazeuse.
198. Ichihara, K. et al. Fatty acid analysis of triacylglycerols: Preparation of fatty acid methyl esters for gas
chromatography. Analytical Biochemistry 495, 6–8 (2016).
199. Řezanka, T. & Řezanková, H. Characterization of fatty acids and triacylglycerols in vegetable oils by
gas chromatography and statistical analysis. Analytica Chimica Acta 398, 253–261 (1999).
200. Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y. & Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry
in lipidomics. Anal Bioanal Chem 399, 243–249 (2011).

264
201. O. Berdeaux, P. Juanéda et J.L. Sébédio. Analyse des acides gras conjugués et trans après dérivation.
ANALUSIS MAGAZINE (1998).
202. Christie, W. W. Gas chromatography-mass spectrometry methods for structural analysis of fatty acids.
Lipids 33, 343–353 (1998).
203. Blaško, J. et al. Chemometric deconvolution of gas chromatographic unresolved conjugated linoleic
acid isomers triplet in milk samples. Journal of Chromatography A 1216, 2757–2761 (2009).
204. Teo, C. C. et al. Advances in sample preparation and analytical techniques for lipidomics study of
clinical samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry 66, 1–18 (2015).
205. Phenomenex - brochure colonnes LC.
206. Li, M., Yang, L., Bai, Y. & Liu, H. Analytical Methods in Lipidomics and Their Applications. Anal. Chem.
86, 161–175 (2014).
207. Holmes, E., Wijeyesekera, A., Taylor-Robinson, S. D. & Nicholson, J. K. The promise of metabolic
phenotyping in gastroenterology and hepatology. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 12, 458–471 (2015).
208. Patti, G. J., Yanes, O. & Siuzdak, G. Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nat Rev Mol Cell
Biol 13, 263–269 (2012).
209. Barbier Saint Hilaire, P. et al. Mechanistic study of competitive releases of H 2 O, NH 3 and CO 2 from
deprotonated aspartic and glutamic acids: Role of conformation. Journal of Chromatography B 1047,
64–74 (2017).
210. Fenn, J., Mann, M., Meng, C., Wong, S. & Whitehouse, C. Electrospray ionization for mass
spectrometry of large biomolecules. Science 246, 64–71 (1989).
211. Whitehouse, C. M., Dreyer, R. N., Yamashita, Masamichi. & Fenn, J. B. Electrospray interface for liquid
chromatographs and mass spectrometers. Anal. Chem. 57, 675–679 (1985).
212. Karas, Michael., Bachmann, Doris. & Hillenkamp, Franz. Influence of the wavelength in high-irradiance
ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Anal. Chem. 57, 2935–2939
(1985).
213. Dumas, M.-E. et al. Analyzing the Physiological Signature of Anabolic Steroids in Cattle Urine Using
Pyrolysis/Metastable Atom Bombardment Mass Spectrometry and Pattern Recognition. Anal. Chem.
74, 5393–5404 (2002).
214. Murray, K. K. et al. Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations
2013). Pure and Applied Chemistry 85, 1515–1609 (2013).
215. Lin, I.-H. & Thomson, R. Cleavage, dislocation emission, and shielding for cracks under general loading.
Acta Metallurgica 34, 187–206 (1986).
216. Kim, H. S., Yu, M. L., Thomson, M. G. R., Kratschmer, E. & Chang, T. H. P. Energy distributions of Zr/O/W
Schottky electron emission. Journal of Applied Physics 81, 461–465 (1997).
217. Hoover, H. & Washburn, H. A Preliminary Report on the Application of the Mass Spectrometer to
Problems in the Petroleum Industry. Transactions of the AIME 142, 100–106 (1941).
218. Gohlke, R. S. & McLafferty, F. W. Early gas chromatography/mass spectrometry. Journal of the
American Society for Mass Spectrometry 4, 367–371 (1993).
219. Tabet, J. Claude. & Cotter, R. J. Laser desorption time-of-flight mass spectrometry of high mass
molecules. Anal. Chem. 56, 1662–1667 (1984).
220. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U. & Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet laser desorption of non-
volatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 78, 53–68 (1987).
221. Bruins, A. P. Atmospheric-pressure-ionization mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry
13, 37–43 (1994).
222. Tanaka, K. et al. A new rapid and comprehensive peptidome analysis by one-step direct transfer
technology for 1-D electrophoresis/MALDI mass spectrometry. Biochemical and Biophysical Research
Communications 379, 110–114 (2009).
223. Tabet, J.-C. et al. Combining Chemical Knowledge and Quantum Calculation for Interpreting Low-
Energy Product Ion Spectra of Metabolite Adduct Ions: Sodiated Diterpene Diester Species as a Case
Study. J. Am. Soc. Mass Spectrom. jasms.1c00154 (2021) doi:10.1021/jasms.1c00154.
224. Cooks, R. G. & Beynon, J. H. Metastable ions and ion kinetic energy spectrometry: The development
of a new research area. J. Chem. Educ. 51, 437 (1974).
225. McLafferty, F. W. Tandem mass spectrometry (MS/MS): a promising new analytical technique for
specific component determination in complex mixtures. Acc. Chem. Res. 13, 33–39 (1980).

265
226. McLafferty, F. W., Bente, P. F., Kornfeld, R., Tsai, S.-C. & Howe, I. Collisional activation spectra of
organic ions. J. Mass Spectrom. 30, 797–806 (1995).
227. McLafferty, F. Tandem mass spectrometry. Science 214, 280–287 (1981).
228. Beynon, J. H., Cooks, R. G., Amy, J. W., Baitinger, W. E. & Ridley, T. Y. Design and Performance of a
Mass-analyzed Ion Kinetic Energy (MIKE) Spectrometer. Anal. Chem. 45, 1023A-1031A (1973).
229. Maquestiau, A. et al. The gas-phase pinacol rearrangement and related reactions in organic cations
generated by chemical ionisation. Tetrahedron 36, 1993–1998 (1980).
230. Yost, R. A. & Enke, C. G. Triple quadrupole mass spectrometry for direct mixture analysis and structure
elucidation. Anal. Chem. 51, 1251–1264 (1979).
231. Stafford, G. C., Kelley, P. E., Syka, J. E. P., Reynolds, W. E. & Todd, J. F. J. Recent improvements in and
analytical applications of advanced ion trap technology. International Journal of Mass Spectrometry
and Ion Processes 60, 85–98 (1984).
232. Berger, C. Compensator role of the electrostatic mirror in time of flight mass spectrometry.
International Journal of Mass Spectrometry and Ion Physics 46, 63–66 (1983).
233. Loboda, null, Krutchinsky, null, Bromirski, null, Ens, null & Standing, null. A tandem
quadrupole/time-of-flight mass spectrometer with a matrix-assisted laser desorption/ionization
source: design and performance. Rapid Commun Mass Spectrom 14, 1047–1057 (2000).
234. Makarov, A. Electrostatic Axially Harmonic Orbital Trapping: A High-Performance Technique of Mass
Analysis. Anal. Chem. 72, 1156–1162 (2000).
235. Wang, Y., Shi, S. D.-H., Hendrickson, C. L. & Marshall, A. G. Mass-selective ion accumulation and
fragmentation in a linear octopole ion trap external to a fourier transform ion cyclotron resonance
mass spectrometer. International Journal of Mass Spectrometry 198, 113–120 (2000).
236. Nguyen, V. H., Afonso, C. & Tabet, J.-C. Concomitant EDD and EID of DNA evidenced by MSn and
double resonance experiments. International Journal of Mass Spectrometry 301, 224–233 (2011).
237. Cooper, H. J., Håkansson, K. & Marshall, A. G. The role of electron capture dissociation in biomolecular
analysis: ELECTRON CAPTURE DISSOCIATION. Mass Spectrom. Rev. 24, 201–222 (2005).
238. Kalli, A. & Håkansson, K. Preferential cleavage of SS and CS bonds in electron detachment dissociation
and infrared multiphoton dissociation of disulfide-linked peptide anions. International Journal of
Mass Spectrometry 263, 71–81 (2007).
239. Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C. Y., Baker, PaulR. S. & Ikeda, K. Quantitative structural multiclass
lipidomics using differential mobility: electron impact excitation of ions from organics (EIEIO) mass
spectrometry. Journal of Lipid Research 59, 910–919 (2018).
240. Gelpí, E. Interfaces for coupled liquid-phase separation/mass spectrometry techniques. An update on
recent developments: Interfaces for coupled liquid-phase separation/MS. J. Mass Spectrom. 37, 241–
253 (2002).
241. Hiraoka, K., Fujimaki, S., Kambara, S., Furuya, H. & Okazaki, S. Atmospheric-pressure Penning
ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 18, 2323–2330 (2004).
242. Gronert, S. Mass Spectrometric Studies of Organic Ion/Molecule Reactions. Chem. Rev. 101, 329–360
(2001).
243. Becker, L., Bunch, T. E. & Allamandola, L. J. Higher fullerenes in the Allende meteorite. Nature 400,
227–228 (1999).
244. Biemann, K. et al. Search for Organic and Volatile Inorganic Compounds in Two Surface Samples from
the Chryse Planitia Region of Mars. Science 194, 72–76 (1976).
245. Donahue, T. M., Hoffman, J. H. & Hodges, R. R. Krypton and xenon in the atmosphere of Venus.
Geophys. Res. Lett. 8, 513–516 (1981).
246. Niemann, H. B. et al. The Galileo Probe Mass Spectrometer: Composition of Jupiter’s Atmosphere.
Science 272, 846–849 (1996).
247. Abell, P. I. et al. Organic Analysis of the Returned Lunar Sample. Science 167, 757–759 (1970).
248. Hersant, F., Gautier, D., Tobie, G. & Lunine, J. I. Interpretation of the carbon abundance in Saturn
measured by Cassini. Planetary and Space Science 56, 1103–1111 (2008).
249. Biemann, K. Organic Analysis. Appl. Opt. 9, 1282 (1970).
250. Horning, E. C., Horning, M. G., Carroll, D. I., Dzidic, I. & Stillwell, R. N. New picogram detection system
based on a mass spectrometer with an external ionization source at atmospheric pressure. Anal.
Chem. 45, 936–943 (1973).

266
251. Lundström, S. L. et al. HPLC/MS/MS-Based Approaches for Detection and Quantification of
Eicosanoids. in Lipidomics (ed. Armstrong, D.) vol. 579 161–187 (Humana Press, 2009).
252. Kolakowski, B. M., Grossert, J. S. & Ramaley, L. Studies on the positive-ion mass spectra from
atmospheric pressure chemical ionization of gases and solvents used in liquid chromatography and
direct liquid injection. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 311–324 (2004).
253. Meot-Ner, M., Elmore, D. E. & Scheiner, S. Ionic Hydrogen Bond Effects on the Acidities, Basicities,
Solvation, Solvent Bridging, and Self-Assembly of Carboxylic Groups. J. Am. Chem. Soc. 121, 7625–
7635 (1999).
254. Chang, T. M., Prell, J. S., Warrick, E. R. & Williams, E. R. Where’s the Charge? Protonation Sites in
Gaseous Ions Change with Hydration. J. Am. Chem. Soc. 134, 15805–15813 (2012).
255. Sunner, Jan., Nicol, Gordon. & Kebarle, Paul. Factors determining relative sensitivity of analytes in
positive mode atmospheric pressure ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 60, 1300–1307
(1988).
256. Covey, T. R., Thomson, B. A. & Schneider, B. B. Atmospheric pressure ion sources. Mass Spectrom.
Rev. 28, 870–897 (2009).
257. Wu, J., Liu, J. & Cai, Z. Determination of triclosan metabolites by using in-source fragmentation from
high-performance liquid chromatography/negative atmospheric pressure chemical ionization ion trap
mass spectrometry: In-source fragmentation of triclosan and its metabolites. Rapid Commun. Mass
Spectrom. 24, 1828–1834 (2010).
258. Carrier, D. J., Eckers, C. & Wolff, J.-C. ‘In-source’ fragmentation of an isobaric impurity of lamotrigine
for its measurement by liquid chromatography tandem mass spectrometry after pre-concentration
using solid phase extraction. J Pharm Biomed Anal 47, 731–737 (2008).
259. Tian, Q., Duncan, C. J. G. & Schwartz, S. J. Atmospheric pressure chemical ionization mass
spectrometry and in-source fragmentation of lutein esters. J. Mass Spectrom. 38, 990–995 (2003).
260. Damont, A. et al. Proposal for a chemically consistent way to annotate ions arising from the analysis
of reference compounds under ESI conditions: A prerequisite to proper mass spectral database
constitution in metabolomics. J Mass Spectrom 54, 567–582 (2019).
261. Körner, R., Wilm, M., Morand, K., Schubert, M. & Mann, M. Nano electrospray combined with a
quadrupole ion trap for the analysis of peptides and protein digests. J Am Soc Mass Spectrom 7, 150–
156 (1996).
262. Takáts, Z., Wiseman, J. M. & Cooks, R. G. Ambient mass spectrometry using desorption electrospray
ionization (DESI): instrumentation, mechanisms and applications in forensics, chemistry, and biology.
J. Mass Spectrom. 40, 1261–1275 (2005).
263. Chen, H., Venter, A. & Cooks, R. G. Extractive electrospray ionization for direct analysis of undiluted
urine, milk and other complex mixtures without sample preparation. Chem. Commun. 2042 (2006)
doi:10.1039/b602614a.
264. Li, H., Ha, E., Donaldson, R. P., Jeremic, A. M. & Vertes, A. Rapid Assessment of Human Amylin
Aggregation and Its Inhibition by Copper(II) Ions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass
Spectrometry with Ion Mobility Separation. Anal. Chem. 87, 9829–9837 (2015).
265. Charles Bossut. Traité élementaire hydrodynamique. (1775).
266. Abbé NOLLET. Essai sur l’électricité des corps. (1774).
267. Yamashita, M. & Fenn, J. B. Electrospray ion source. Another variation on the free-jet theme. J. Phys.
Chem. 88, 4451–4459 (1984).
268. Cech, N. B. & Enke, C. G. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization
fundamentals. Mass Spectrom. Rev. 20, 362–387 (2001).
269. Thomson, B. A. & Iribarne, J. V. Field induced ion evaporation from liquid surfaces at atmospheric
pressure. The Journal of Chemical Physics 71, 4451–4463 (1979).
270. Iribarne, J. V. On the evaporation of small ions from charged droplets. J. Chem. Phys. 64, 2287 (1976).
271. Felitsyn, N., Peschke, M. & Kebarle, P. Origin and number of charges observed on multiply-protonated
native proteins produced by ESI. International Journal of Mass Spectrometry 219, 39–62 (2002).
272. Kebarle, P. & Verkerk, U. H. Electrospray: From ions in solution to ions in the gas phase, what we know
now. Mass Spectrom. Rev. 28, 898–917 (2009).
273. Fernandez de la Mora, J. Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole’s
charged residue mechanism. Analytica Chimica Acta 406, 93–104 (2000).

267
274. Pascoe, R., Foley, J. P. & Gusev, A. I. Reduction in Matrix-Related Signal Suppression Effects in
Electrospray Ionization Mass Spectrometry Using On-Line Two-Dimensional Liquid Chromatography.
Anal. Chem. 73, 6014–6023 (2001).
275. Marshall, A. G. & Hendrickson, C. L. High-Resolution Mass Spectrometers. Annual Rev. Anal. Chem. 1,
579–599 (2008).
276. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V. & Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight
mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 36, 849–865 (2001).
277. Schmid, D. G., Grosche, P., Bandel, H. & Jung, G. FTICR-mass spectrometry for high-resolution analysis
in combinatorial chemistry. Biotechnol Bioeng 71, 149–161 (2000).
278. Jennings, K. R. Metastable Transitions in the Mass Spectrum of Benzene. The Journal of Chemical
Physics 43, 4176–4177 (1965).
279. Haddon, W. F. & McLafferty, F. W. Metastable ion characteristics. VII. Collision-induced metastables.
J. Am. Chem. Soc. 90, 4745–4746 (1968).
280. McLafferty, F. W. & Schuddemage, H. D. R. Minimization of rearrangement reactions in mass spectra
by use of collisional activation. J. Am. Chem. Soc. 91, 1866–1868 (1969).
281. Beynon, J. H. & Cooks, R. G. Ion kinetic energy spectrometry. International Journal of Mass
Spectrometry and Ion Physics 19, 107–137 (1976).
282. Beynon, J. H., Caprioli, R. M., Baitinger, W. E. & Amy, J. W. The ion kinetic energy spectrum and the
mass spectrum of argon. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Physics 3, 313–321
(1969).
283. Liehr, J. G., Kingston, E. E. & Beynon, J. H. Collision-induced dissociation-mass-analysed ion kinetic
energy (CID-MIKE) analysis of ions generated by fast atom bombardment of isomeric bile salts. Biol.
Mass Spectrom. 12, 95–99 (1985).
284. Paul, W. & Steinwedel, H. Notizen: Ein neues Massenspektrometer ohne Magnetfeld. Zeitschrift für
Naturforschung A 8, 448–450 (1953).
285. Dawson, P. H., French, J. B., Buckley, J. A., Douglas, D. J. & Simmons, D. The use of triple quadrupoles
for sequential mass spectrometry: 1—The instrument parameters. Org. Mass Spectrom. 17, 205–211
(1982).
286. Ferguson, R. E., McCulloh, K. E. & Rosenstock, H. M. Observation of the Products of Ionic Collision
Processes and Ion Decomposition in a Linear, Pulsed Time-of-Flight Mass Spectrometer. The Journal
of Chemical Physics 42, 100–106 (1965).
287. Wolff, M. M. & Stephens, W. E. A Pulsed Mass Spectrometer with Time Dispersion. Review of Scientific
Instruments 24, 616–617 (1953).
288. Wiley, W. C. & McLaren, I. H. Time-of-Flight Mass Spectrometer with Improved Resolution. Review of
Scientific Instruments 26, 1150–1157 (1955).
289. Guilhaus, M., Selby, D. & Mlynski, V. Orthogonal acceleration time-of-flight mass spectrometry. Mass
Spectrom Rev 19, 65–107 (2000).
290. Della-Negra, Serge. & Le Beyec, Yvon. New method for metastable ion studies with a time of flight
mass spectrometer. Future application to molecular structure determinations. Anal. Chem. 57, 2035–
2040 (1985).
291. Kingdon, K. H. A Method for the Neutralization of Electron Space Charge by Positive Ionization at Very
Low Gas Pressures. Phys. Rev. 21, 408–418 (1923).
292. Garnier, N., Rolando, C., Høtje, J. M. & Tokarski, C. Analysis of archaeological triacylglycerols by high
resolution nanoESI, FT-ICR MS and IRMPD MS/MS: Application to 5th century BC–4th century AD oil
lamps from Olbia (Ukraine). International Journal of Mass Spectrometry 284, 47–56 (2009).
293. Holguin, F. O. & Schaub, T. Characterization of microalgal lipid feedstock by direct-infusion FT-ICR
mass spectrometry. Algal Research 2, 43–50 (2013).
294. Knight, R. D. Storage of ions from laser-produced plasmas. Appl. Phys. Lett. 38, 221–223 (1981).
295. A. Makarov. United States Patent : Mass spectrometer. U.S Patent 5,886,346,1999.
296. Scigelova, M. & Makarov, A. Orbitrap Mass Analyzer – Overview and Applications in Proteomics.
Proteomics 6, 16–21 (2006).
297. Makarov, A., Denisov, E., Lange, O. & Horning, S. Dynamic range of mass accuracy in LTQ orbitrap
hybrid mass spectrometer. J Am Soc Mass Spectrom 17, 977–982 (2006).

268
298. Makarov, A. et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer.
Anal. Chem. 78, 2113–2120 (2006).
299. Makarov, A. & Denisov, E. Dynamics of ions of intact proteins in the Orbitrap mass analyzer. J Am Soc
Mass Spectrom 20, 1486–1495 (2009).
300. Makarov, A., Denisov, E. & Lange, O. Performance evaluation of a high-field orbitrap mass analyzer. J
Am Soc Mass Spectrom 20, 1391–1396 (2009).
301. Langevin, P. Mesure de la valence des ions dans les gaz. Radium (Paris) 10, 113–118 (1913).
302. The speed of positive ions in nitrogen. Proc. R. Soc. Lond. A 146, 911–921 (1934).
303. Cravath, A. M. The Rate of Formation of Negative Ions by Electron Attachment. Phys. Rev. 33, 605–
613 (1929).
304. Van De Graaff, R. J. The Mobility of Ions in Gases. Nature 124, 10–11 (1929).
305. Bradbury, N. E. & Nielsen, R. A. Absolute Values of the Electron Mobility in Hydrogen. Phys. Rev. 49,
388–393 (1936).
306. Edward A. Mason, Earl W. McDaniel. Transport Properties of Ions in Gases. (2005).
307. Smith, D. & Adams, N. G. The Selected Ion Flow Tube (Sift): Studies of Ion-Neutral Reactions. in
Advances in Atomic and Molecular Physics vol. 24 1–49 (Elsevier, 1988).
308. McFarland, M., Albritton, D. L., Fehsenfeld, F. C., Ferguson, E. E. & Schmeltekopf, A. L. Flow-drift
technique for ion mobility and ion-molecule reaction rate constant measurements. III. Negative ion
reactions of O − with CO, NO, H 2 , and D 2. The Journal of Chemical Physics 59, 6629–6635 (1973).
309. Cohen, M. J. & Karasek, F. W. Plasma Chromatography --A New Dimension for Gas Chromatography
and Mass Spectrometry. Journal of Chromatographic Science 8, 330–337 (1970).
310. Karasek, F. W. & Fong, I. Analysis of Chlorinated Benzene Compounds by Gas Chromatography.
Journal of Chromatographic Science 9, 497–499 (1971).
311. Karasek, F. W., Hill, H. H. & Kim, S. H. Plasma chromatography of heroin and cocaine with mass-
identified mobility spectra. Journal of Chromatography A 117, 327–336 (1976).
312. Eiceman, G. A. & Karpas, Z. Ion Mobility Spectrometry. (CRC Press, 2005).
doi:10.1201/9781420038972.
313. Dodds, J. N. & Baker, E. S. Ion Mobility Spectrometry: Fundamental Concepts, Instrumentation,
Applications, and the Road Ahead. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 30, 2185–2195 (2019).
314. Gabelica, V. & Marklund, E. Fundamentals of ion mobility spectrometry. Current Opinion in Chemical
Biology 42, 51–59 (2018).
315. Mason, E. A. & Schamp, H. W. Mobility of gaseous lons in weak electric fields. Annals of Physics 4,
233–270 (1958).
316. Delvaux, A., Rathahao-Paris, E. & Alves, S. Different ion mobility-mass spectrometry coupling
techniques to promote metabolomics. Mass Spec Rev mas.21685 (2021) doi:10.1002/mas.21685.
317. Guntner, A. S., Thalhamer, B., Klampfl, C. & Buchberger, W. Collision cross sections obtained with ion
mobility mass spectrometry as new descriptor to predict blood-brain barrier permeation by drugs. Sci
Rep 9, 19182 (2019).
318. Eiceman, G. A., Krylov, E. V., Krylova, N. S., Nazarov, E. G. & Miller, R. A. Separation of Ions from
Explosives in Differential Mobility Spectrometry by Vapor-Modified Drift Gas. Anal. Chem. 76, 4937–
4944 (2004).
319. Lindinger, W., Hansel, A. & Jordan, A. On-line monitoring of volatile organic compounds at pptv levels
by means of proton-transfer-reaction mass spectrometry (PTR-MS) medical applications, food control
and environmental research. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 173, 191–
241 (1998).
320. Shaffer, S. A., Prior, D. C., Anderson, G. A., Udseth, H. R. & Smith, R. D. An Ion Funnel Interface for
Improved Ion Focusing and Sensitivity Using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem.
70, 4111–4119 (1998).
321. Odenkirk, M. T. & Baker, E. S. Utilizing Drift Tube Ion Mobility Spectrometry for the Evaluation of
Metabolites and Xenobiotics. in Ion Mobility-Mass Spectrometry (eds. Paglia, G. & Astarita, G.) vol.
2084 35–54 (Springer US, 2020).
322. Buryakov, I. A., Krylov, E. V., Nazarov, E. G. & Rasulev, U. Kh. A new method of separation of multi-
atomic ions by mobility at atmospheric pressure using a high-frequency amplitude-asymmetric strong
electric field. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 128, 143–148 (1993).

269
323. Lambertus, G. R. et al. Silicon Microfabricated Column with Microfabricated Differential Mobility
Spectrometer for GC Analysis of Volatile Organic Compounds. Anal. Chem. 77, 7563–7571 (2005).
324. Purves, R. W., Guevremont, R., Day, S., Pipich, C. W. & Matyjaszczyk, M. S. Mass spectrometric
characterization of a high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometer. Review of Scientific
Instruments 69, 4094–4105 (1998).
325. Guevremont, R. & Purves, R. W. Atmospheric pressure ion focusing in a high-field asymmetric
waveform ion mobility spectrometer. Review of Scientific Instruments 70, 1370–1383 (1999).
326. Giles, K. et al. Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.
Rapid Commun. Mass Spectrom. 18, 2401–2414 (2004).
327. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G. & Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions:
Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Anal. Chem. 84, 7124–7130 (2012).
328. Giles, K. et al. A Cyclic Ion Mobility-Mass Spectrometry System. Anal. Chem. 91, 8564–8573 (2019).
329. Clemmer, D. E., Hudgins, R. R. & Jarrold, M. F. Naked Protein Conformations: Cytochrome c in the Gas
Phase. J. Am. Chem. Soc. 117, 10141–10142 (1995).
330. Paglia, G., Kliman, M., Claude, E., Geromanos, S. & Astarita, G. Applications of ion-mobility mass
spectrometry for lipid analysis. Anal Bioanal Chem 407, 4995–5007 (2015).
331. Groessl, M., Graf, S. & Knochenmuss, R. High resolution ion mobility-mass spectrometry for
separation and identification of isomeric lipids. Analyst 140, 6904–6911 (2015).
332. Comisarow, M. B. & Marshall, A. G. Fourier transform ion cyclotron resonance spectroscopy. Chemical
Physics Letters 25, 282–283 (1974).
333. Comisarow, M. B., Grassi, V. & Parisod, G. Fourier transform ion cyclotron double resonance. Chemical
Physics Letters 57, 413–416 (1978).
334. Scott A. McLuckey, Douglas E. Goeringer. SPECIAL FEATURE:TUTORIAL Slow Heating Methods in
Tandem Mass Spectrometry. vols 32, Issue 5 (1998).
335. E. March. SPECIAL FEATURE: TUTORIAL An Introduction to Quadrupole Ion Trap Mass Spectrometry,
JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY.
336. Darii, E. et al. First Direct Evidence of Interpartner Hydride/Deuteride Exchanges for Stored Sodiated
Arginine/Fructose-6-phosphate Complex Anions within Salt-Solvated Structures. J. Am. Soc. Mass
Spectrom. 32, 1424–1440 (2021).
337. Naban-Maillet, J. et al. Internal energy distribution in electrospray ionization: Internal energy
distribution in electrospray ionization. J. Mass Spectrom. 40, 1–8 (2005).
338. Ichou, F. et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the
CID, PQD and HCD excitation modes: Theoretical comparison of CID, PQD and HCD. J. Mass Spectrom.
49, 498–508 (2014).
339.https://www.waters.com/webassets/cms/library/docs/local_seminar_presentations/GE_Events/ge_2
014_ms%20tech%20days_Xevo%20G2-XS%20QTof_Matthias%20Hofmann.pdf.
340. Watson, A. D. Thematic review series: Systems Biology Approaches to Metabolic and Cardiovascular
Disorders. Lipidomics: a global approach to lipid analysis in biological systems. Journal of Lipid
Research 47, 2101–2111 (2006).
341. Colsch, B., Seyer, A., Boudah, S. & Junot, C. Lipidomic analysis of cerebrospinal fluid by mass
spectrometry–based methods. J Inherit Metab Dis 38, 53–64 (2015).
342. Taguchi, R. et al. Focused lipidomics by tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B
823, 26–36 (2005).
343. Harkewicz, R. & Dennis, E. A. Applications of Mass Spectrometry to Lipids and Membranes. Annu. Rev.
Biochem. 80, 301–325 (2011).
344. Humbert, L. et al. Bile acid profiling in human biological samples: Comparison of extraction
procedures and application to normal and cholestatic patients. Journal of Chromatography B 899,
135–145 (2012).
345. Salek, R. M., Steinbeck, C., Viant, M. R., Goodacre, R. & Dunn, W. B. The role of reporting standards
for metabolite annotation and identification in metabolomic studies. GigaSci 2, 13 (2013).
346. Lipidomics Standards Initiative Consortium. Lipidomics needs more standardization. Nat Metab 1,
745–747 (2019).
347. Liebisch, G. et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-
derived lipid structures. Journal of Lipid Research 61, 1539–1555 (2020).

270
348. Raczyńska, E. D., Gal, J.-F. & Maria, P.-C. The guanylated bioamine agmatine – A theoretical
investigation of its structure and exceptional high basicity in the gas phase. Computational and
Theoretical Chemistry 1109, 10–18 (2017).
349. Jones, J. W., Thompson, C. J., Carter, C. L. & Kane, M. A. Electron-induced dissociation (EID) for
structure characterization of glycerophosphatidylcholine: determination of double-bond positions
and localization of acyl chains: Electron-Induced Dissociation of Glycerophosphatidylcholine. J. Mass
Spectrom. 50, 1327–1339 (2015).
350. Cook, S. L., Collin, O. L. & Jackson, G. P. Metastable atom-activated dissociation mass spectrometry:
leucine/isoleucine differentiation and ring cleavage of proline residues: Metastable atom-activated
dissociation mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 44, 1211–1223 (2009).
351. Longevialle, P. & Botter, R. Electron impact mass spectra of bifunctional steroids. The interaction
between ionic and neutral fragments derived from the same parent ion. Org. Mass Spectrom. 18, 1–
8 (1983).
352. Debrauwer, L., Paris, A., Rao, D., Fournier, F. & Tabet, J.-C. Mass spectrometric studies on 17β-
estradiol-17-fatty acid esters: Evidence for the formation of anion-dipole intermediates. Org. Mass
Spectrom. 27, 709–719 (1992).
353. Bowen, R. D. & Williams, D. H. Non-concrted unimolecular reactions of ions in the gas-phase: The
importance of ion-dipole interactions in carbonium ion isomerizations. International Journal of Mass
Spectrometry and Ion Physics 29, 47–55 (1979).
354. Convert, O. et al. Reactions of Estradiol-2,3-quinone with Deoxyribonucleosides: Possible Insights in
the Reactivity of Estrogen Quinones with DNA. Chem. Res. Toxicol. 15, 754–764 (2002).
355. Johnson, R. S., Martin, S. A., Biemann, Klaus., Stults, J. T. & Watson, J. Throck. Novel fragmentation
process of peptides by collision-induced decomposition in a tandem mass spectrometer:
differentiation of leucine and isoleucine. Anal. Chem. 59, 2621–2625 (1987).
356. Roepstorff, P. & Fohlman, J. Letter to the editors. Biol. Mass Spectrom. 11, 601–601 (1984).
357. Harrison, A. G. Characterization ofα- andγ-glutamyl dipeptides by negative ion collision-induced
dissociation. J. Mass Spectrom. 39, 136–144 (2004).
358. Kind, T. & Fiehn, O. Seven Golden Rules for heuristic filtering of molecular formulas obtained by
accurate mass spectrometry. BMC Bioinformatics 8, 105 (2007).
359. Colsch, B., Fenaille, F., Warnet, A., Junot, C. & Tabet, J.-C. Mechanisms governing the fragmentation
of glycerophospholipids containing choline and ethanolamine polar head groups. Eur J Mass Spectrom
(Chichester) 23, 427–444 (2017).
360. Colsch, B., Damont, A., Junot, C., Fenaille, F. & Tabet, J.-C. Experimental evidence that electrospray-
produced sodiated lysophosphatidyl ester structures exist essentially as protonated salts. Eur J Mass
Spectrom (Chichester) 25, 333–338 (2019).
361. Tan, B. et al. Identification of endogenous acyl amino acids based on a targeted lipidomics approach.
Journal of Lipid Research 51, 112–119 (2010).
362. Moriarty, M. et al. Development of an LC-MS/MS method for the analysis of serotonin and related
compounds in urine and the identification of a potential biomarker for attention deficit
hyperactivity/hyperkinetic disorder. Anal Bioanal Chem 401, 2481–2493 (2011).
363. Asakawa, D., Mizuno, H., Sugiyama, E. & Todoroki, K. Fragmentation study of tryptophan-derived
metabolites induced by electrospray ionization mass spectrometry for highly sensitive analysis.
Analyst 146, 2292–2300 (2021).
364. Bennaceur, C., Afonso, C., Alves, S., Bossée, A. & Tabet, J.-C. Instrumental Dependent Dissociations of
n-Propyl/Isopropyl Phosphonate Isomers: Evaluation of Resonant and Non-Resonant Vibrational
Activations. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1260–1270 (2013).
365. Cheng, C. & Gross, M. L. Applications and mechanisms of charge-remote fragmentation. Mass
Spectrom Rev 19, 398–420 (2000).
366. Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C. Y. & Baker, P. R. S. Distinguishing Cis and Trans Isomers in Intact
Complex Lipids Using Electron Impact Excitation of Ions from Organics Mass Spectrometry. Anal.
Chem. 89, 7307–7315 (2017).
367. Li, P., Hoffmann, W. D. & Jackson, G. P. Multistage mass spectrometry of phospholipids using collision-
induced dissociation (CID) and metastable atom-activated dissociation (MAD). International Journal
of Mass Spectrometry 403, 1–7 (2016).

271
368. Afonso, C., Riu, A., Xu, Y., Fournier, F. & Tabet, J.-C. Structural characterization of fatty acids cationized
with copper by electrospray ionization mass spectrometry under low-energy collision-induced
dissociation. J. Mass Spectrom. 40, 342–349 (2005).
369. Fay, L. & Richli, U. Location of double bonds in polyunsaturated fatty acids by gas chromatography-
mass spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. Journal of Chromatography A 541, 89–
98 (1991).
370. McLuckey, S. A. et al. Energy-resolved tandem and fourier-transform mass spectrometry.
International Journal of Mass Spectrometry and Ion Physics 44, 215–229 (1982).
371. Loh, S. K., Hales, D. A., Lian, L. & Armentrout, P. B. Collision-induced dissociation of Fe + n ( n =2–10)
with Xe: Ionic and neutral iron binding energies. The Journal of Chemical Physics 90, 5466–5485
(1989).
372. Armentrout, P. B. & Beauchamp, J. L. Experimental and theoretical studies of the reaction Ba+(D2,
D)BaD+: sequential impulse model for endothermic reactions. Chemical Physics 48, 315–320 (1980).
373. Wysocki, V. H., Kenttämaa, H. I. & Cooks, R. G. Internal energy distributions of isolated ions after
activation by various methods. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 75, 181–
208 (1987).
374. Laskin, J. & Futrell, J. H. Collisional activation of peptide ions in FT-ICR mass spectrometry. Mass
Spectrom. Rev. 22, 158–181 (2003).
375. Carlesso, V., Fournier, F. & Tabet, J.-C. Stereochemical Differentiation of Four Monosaccharides Using
Transition Metal Complexes by Electrospray Ionization/Ion-Trap Mass Spectrometry. Eur J Mass
Spectrom (Chichester) 6, 421–428 (2000).
376. Daikoku, S., Widmalm, G. & Kanie, O. Analysis of a series of isomeric oligosaccharides by energy-
resolved mass spectrometry: a challenge on homobranched trisaccharides: Analysis of structural
isomers of branched trisaccharides. Rapid Commun. Mass Spectrom. 23, 3713–3719 (2009).
377. Menicatti, M. et al. The power of energy-resolved tandem mass spectrometry experiments for
resolution of isomers: the case of drug plasma stability investigation of multidrug resistance
inhibitors: Liquid chromatography/energy-resolved MS/MS for resolution of isomers. Rapid Commun.
Mass Spectrom. 30, 423–432 (2016).
378. Fedor, D. M. & Cooks, R. G. Angle resolved mass spectrometry with a reversed geometry
spectrometer. Anal. Chem. 52, 679–682 (1980).
379. Rosenstock, H. M., Wallenstein, M. B., Wahrhaftig, A. L. & Eyring, H. Absolute Rate Theory for Isolated
Systems and the Mass Spectra of Polyatomic Molecules. Proceedings of the National Academy of
Sciences 38, 667–678 (1952).
380. Baercor, T. & Mayerfn, P. M. Statistical Rice-Ramsperger-Kassel-Marcus quasiequilibrium theory
calculations in mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8, 103–115 (1997).
381. Pak, A., Lesage, D., Gimbert, Y., Vékey, K. & Tabet, J.-C. Internal energy distribution of peptides in
electrospray ionization : ESI and collision-induced dissociation spectra calculation. J. Mass Spectrom.
43, 447–455 (2008).
382. Drahos, Heeren, Collette, De Pauw E, & Vekey. Thermal energy distribution observed in electrospray
ionization. J Mass Spectrom 34, 1373–1379 (1999).

272