CHAPITRE II:
LES TECHNIQUES DE
PREPARATION DE L’ADN
I- L’ADN GENOMIQUE
Destruction des membranes: SDS et/ou broyage
ds de l’azote liquide
Purification: élimination des protéines cellulaires
par la protéinase K+ EDTA (inhibiteurs des
nucléases cellulaires)
Extraction au phénol/ chloroforme:
↓ ↓
dénature élimine les traces
les protéines de phénol
L’AN est ds la phase aqueuse
Précipitation avec l’éthanol froid → récupération
de la méduse d’ADN
II- L’ADN PLASMIDE
La mini préparation plasmide (la mini prép.)
La 1ere étape du s/s clonage est l’isolement de
l’ADN plasmide
Les plasmides (+pt que l’ADN chr) peuvent etre
séparés par techniques physico-chimiques
Méthode alcaline
Méthode d’ébullition
Méthode de chlorure de césium
↓
isoler une quantité suffisante d’ADN plasmide :
E. coli abritant le plasmide requis est inoculé ds
qlq ml de Bouillon de culture → croissance et
atteinte de la phase stationnaire →
centrifugation → pastille cellulaire
II- 1 La lyse alcaline
La pastille cellulaire suspendue ds une sol tampon
(qui peut contenir les lysozymes → ?)
La sol de lyse contenant le SDS (?) et NaOH (?) est
ajoutée
Neutralisation par l’acétate de potassium à pH 5 → ?
Centrifugation → le surnageant (le lysat) contient
l’ADN plasmide , ARN, qlq protéines
Extraction par de phénol chloroforme
Précipitation par l’ éthanol
(avec l’ajout de l’acétate de sodium )
Centrifugation → pastille d’ADN → suspendue ds une
solution de stockage(Tris-EDTA pH8)
On peut ajouter la RNase
II- 2 Gradient de chlorure de césium CsCl
Pour le stockage (méthode pénible mais la meilleure
pr obtenir de l’ADN pur)
Même étapes que la lyse alcaline:
Le lysat est fractionné avec un gradient de CsCl en
présence de bromure d’éthidium (BET)
↓
les ≠ constituants sont séparés par centrifugation
↓
la solution contenant le plasmide est prélevée
Précipitation à l’éthanol
Pourquoi on ajoute le BET?
III- la digestion
la digestion de l’ADN plasmide ou génomique
pour des fins analytiques
préparatifs
Elle se fait avec les enzymes de restriction
Pr l’obtention d’activité optimale → utilisation de
solution tampon(Mg2++, pH,NaCl,…)
L’ADN incubé avec la solution tampon appropriée
à une T° optimale (généralement 37°) ds un volume
de 20µl
IV- L’ELECTROPHORESE SUR GEL D’AGAROSE
L’agarose =
polysaccharide dérivant d’une algue
Forme purifiée de l’agar
Il forme un gel solide ds une solution Aqueuse
Les prélèvements d’ADN sont placés ds des puits à
la surface du gel d’agarose
un champs électrique est appliqué au gel en
présence d’une solution tampon conduisant
l’électricité
↓
Migration des fragments d’ADN vers l’électrode +
à une vitesse qui dépend de leurs tailles et de
leurs formes
L’ADN étant coloré par le BET → il apparait en
bande orange à l’UV
V- ISOLEMENT DES FRAGMENTS
Gel d’agarose peut être utilisé également de
manière préparatoire
↓
Isoler des fragments spécifiques
↓
Ligation ou expérience de clonage
Les fragments sont excisés du gel
↓
Purifier l’ADN de l’agarose et du BET
VI- LIGATION DE L’ADN
Insertion d’un fragment d’ADN cible ds un vecteur
L’enzyme utilisée: l’ADN ligase T4
Utilisation de l’enzyme de restriction suivie par la
ligase ↓
ADN recombinant (vecteur + insert)
condition:
le vecteur et l’insert sont coupés avec le même
enzyme de restriction
Le vecteur doit posséder un seul site de
restriction
↓
≠ produits de ligation (recombinaison ou
autoligation)
Comment résoudre le pb d’autoligation?
VII- TRANSFORMATION
Les produits de ligation (recombinants +
autoligaturés) doivent être isolés l’un de l’autre et
répliqués par leur transfert dans une ¢ hôte
(généralement E. coli )
Ces ¢ sont traitées par Ca++ → ¢ compétente = ¢
susceptibles de capter l’ADN exogène → C’est la
transformation (une solution de plasmides est
combinée à des ¢ compétentes pr une période
donnée → choc thermique)
La technique?
IIX- DEPISTAGE DE TRANSFORMATION
= criblage= connaitre le clone qui contient le
plasmide recombinant
Par électrophorèse sur gel d’agarose après
digestion:
Des colonies individuelles → culture sur m liquide
(avec ATB) → extraction d’ADN → digestion →
électrophorèse → stockage
Culture
bactérienne
extraction
transformation
d’ADN
électrophorèse digestion
