Rapport de

stage M1
Rapport de
stage M1
 ENGAGEMENT
DE NON PLAGIAT
Je, soussigné(e) LE RUYET Amandine
déclare être pleinement conscient(e) que le plagiat de documents ou d’une
partie d’un document publiée sur toutes formes de support, y compris l’internet,
constitue une violation des droits d’auteur ainsi qu’une fraude caractérisée.
En conséquence, je m’engage à citer toutes les sources que j’ai utilisées
pour écrire ce rapport ou mémoire.

LE RUYET Amandine
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 Merci à l’ensemble de l’équipe EmerSys pour son accueil lors de mon stage et les conseils que tous ses
REMERCIEMENTS membres ont pu m’apporter. Merci plus particulièrement à Coralie Marais pour ses conseils au sujet du
séquençage et Anne Preveaux pour son soutien au cours de l’expérimentation. Je souhaite aussi
remercier Murielle Bahut et du plateau ANAN (SFR Quasav), Jérôme Caillon et Benjamin Navet du CHU
d’Angers pour leur assistance pour le séquençage ainsi que Brice Marolleau et Anthony Juillard pour
toute l’aide qu’ils ont pu apporter sur la partie concernant l’expression des gènes de défense. Et je
voudrais enfin remercier Matthieu Barret et Guillaume Chesneau pour tout le temps qu’ils m’ont
accordé, tous les conseils qu’ils m’ont donnés et la bienveillance dont ils ont fait preuve.
Glossaire
Adhésines : protéines permettant une liaison avec des glucides
Copiotrophe : organisme à la croissance rapide dans un milieu riche en nutriment
Déterminants génétiques : gènes avec une fonction importante pour un procédé
Endophyte : microorganisme vivant à l’intérieur des tissus de la plante
Epiphyte : microorganisme vivant en surface des tissus de la plante
Fitness : capacité d'une bactérie à prospérer dans un milieu ou dans certaines conditions
Gène de ménage : gène exprimé de manière constitutive au sein d'une cellule
Inoculum : échantillon de microorganismes mis en contact avec une cible
Kanamycine : antibiotique utilisé pour sélectionner des souches bactériennes
Outgrowth : fait de remettre en culture les bactéries isolées d’un échantillon afin d'augmenter la quantité
finale de bactéries
phiX : génome de phage qui présente 25 % de chaque nucléotide (A, C, G, T). Des échantillons d’ADN de ce
phage sont ajoutés au run de séquençage afin de maximiser la diversité des nucléotides à chaque cycle.
Rifamycine : antibiotique utilisé pour sélectionner des souches bactériennes
Spermosphère : zone d’influence du sol soumise à l’influence de la graine en germination
Système de sécrétion type III : système de sécrétion bactérien permettant la sécrétion de protéines
bactériennes (ou effecteurs) dans des cellules eucaryotes.
Liste des abréviations
13502 : Pseudomonas fluorescens CFBP 13502
13503 : Stenotrophomonas rhizophila CFBP 13503
13505 : Pantoea agglomerans CFBP 13505
13507 : Pseudomonas viridiflava CFBP 13507
13649 : Pseudomonas fluorescens CFBP 13649
ABA : Acide Abscissique
ACP : Analyse en Composantes Principales
CFBP : Collection Française de Bactéries Phytopathogènes
CFU : Colonie Formant Unité
DO : Densité Optique
EDS1 : Enhanced Disease Susceptibility 1
EF deg : Facteur d’Elongation alpha dégénérées
Ein3 : Ethylene INsensitive protein 3
EmerSys : Emergence, Systématique et écologie des bactéries associées aux plantes
ERS1 : Ethylene Response Sensor-1
Eth : Ethylène
ETI : Effector-Triggered Immunity
FNAMS : Fédération Nationale des Agriculteurs Multiplicateurs de Semences
INRAe : Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement
IRHS : Institut de Recherche en Horticulture et Semences
JA : Acide Jasmonique
LAR : Résistance Acquise Locale
MAMPS : Microbe Associated Molecular Pattern
MTI : MAMPs-Triggered Immunity
PCR : Polymerase Chain Reaction
PDF1-2 : Plant DeFensin gene
PR : Pathogenesis-Related
PRRs : Pattern Recognition receptors
qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction
Rb-TnSeq : Random barcode Transposon-site Sequencing
RESPOM : Résistance du pommier et du poirier aux bioagresseurs
SA : Acide Salicylique
SAR : Résistance Systémique Acquise
T0 : Témoin banque de mutants Xcc8004
TnSeq : Transposon mutagenesis with next-generation sequencing
TSA : Tryptone Soja Agar
TSB : Tryptone Soja Broth
Xcc : Xanthomonas campestris [Link]
Table des matières
IDENTIFICATION DES INTERACTIONS PLANTE-BACTERIES IMPLIQUEES DANS LA COLONISATION
DE LA PLANTULE

1. Introduction
1.1. Description du cadre
1.2. Contexte
1.3. Objectif du stage
2. Matériel et Méthodes
2.1. Souches bactériennes
2.2. Préparation des inocula
2.3. Inoculation des graines et récolte des échantillons
2.4. Etude de l’expression des gènes de défense de la plantule
2.5. Etude des déterminants bactériens nécessaires à la transmission
3. Résultats
3.1. Influence du microbiote des plantes sur les défenses des plantes
3.1.1. Induction différentielle des défenses des plantes selon le compartiment étudié
3.1.2. Variabilité des défenses induites selon les graines
3.1.3. Influence du microbiote de la semence sur les défenses des plantes
a) Cotylédons
b) Racines
3.1.4. Une communauté microbienne composé de Xcc et d’un taxon commensale du microbiote des graines
n’induit pas une induction des défenses des plantes plus importante
a) Cotylédons
b) Racines
3.2. Déterminants génétiques impliqués dans la transmission
3.2.1. Transmissibilité de Xcc à la plantule
3.2.2. Données obtenues du séquençage
4. Discussion
4.1. Influence du microbiote des plantes sur les défenses des plantes
4.1.1. Expression des défenses chez les plantules
4.1.2. Différence d’expression des défenses entre les cotylédons et les racines
4.1.3. Une variabilité des résultats
4.1.4. Absence d’induction des défenses des plantes après co-inoculation des graines avec Xcc et un
membre du microbiote des semences
4.2. Déterminants génétiques impliqués dans la transmission
4.2.1. Sélection des échantillons pour le séquençage
4.2.2. Complexité/Challenge de la méthodes Rb-TnSeq
4.2.3. Solutions
5. Conclusion et perspectives
6. Bibliographie
6.1. Articles
6.2. Livres
Table des figures
Figure 1 : Schéma du protocole expérimental
Figure 2 : Boite à moustache montrant l’expression relative de l’ensemble des gènes étudiés et de toutes les
conditions confondues dans les cotylédons et les racines
Figure 3 : ACP montrant la Variabilité des défenses induites selon les graines pour les cotylédons (A) et les
racines (B)
Figure 4 : Graphique montrant les coordonnées sur l’axe principal de l’ACP en fonction des inoculats pour les
échantillons cotylédons (A) et racines (B)
Figure 5 : Boites à moustache montrant la différence d’expression relative entre les échantillons témoins non
décontaminés et ceux inoculés avec Xcc par gène dans les cotylédons (A) et les racines (B)
Figure 6 : Boites à moustache montrant la différence d’expression relative entre les gènes chez échantillons
issus de plantules inoculées avec Xcc seule ou non
Figure 7 : Photo de gels d’agarose à 1,8% d’agarose sur lesquels on a fait migrer les échantillons obtenus à
la suite de la PCR d’amplification de barcodes (Q5)Figure 8 : Graphique montrant le log10 du nombre de
lectures pairées totales obtenues pour chaque échantillon séquencé
Liste des annexes
Annexe I : Tableau répertoriant les espèces bactériennes utilisées
Annexe II : Tableau listant l’ensemble des amorces utilisées et leur séquence
Identification des interactions plante-bactéries impliquées
dans la colonisation de la plantule

1. Introduction
1.1. Description du cadre
Dans le cadre de ma première année de master de biologie végétale, j’ai réalisé un stage de recherche.
J’ai choisi de réaliser ce stage au sein de l’institut de recherche en horticulture et semences (IRHS) d’Angers.
L’IRHS est une structure de recherche publique sous la tutelle de l’INRAe, de l’Université d’Angers et
d’Agrocampus-Ouest. Cette structure regroupe quatorze équipes couvrant une grande diversité de sujets de
recherche qui vont de l’architecture des plantes à la phytopathologie. J’ai réalisé mon stage dans l’équipe
Emergence, Systématique et écologie des bactéries associées aux plantes (EmerSys). L’un des axes de recherche
de cette équipe est l’étude de la transmission des bactéries à et par la semence. Ce sujet de recherche est d’autant
plus crucial que les semences sont produites dans le monde entier et sont susceptibles d’être le vecteur d’agents
pathogènes. Le sujet de mon stage porte sur l’un des agents pathogènes transmis par la graine étudié par l’équipe
EmerSys, Xanthomonas campestris [Link] (Xcc) et plus précisément sa transmission de la graine à la
plantule.

1.2. Contexte
Le microbiote est important pour le bon développement et la bonne santé de la plante. Il se transmet
d’une génération de plante à l’autre en partie par l’intermédiaire de la graine (Shade et al., 2017). Les membres
du microbiote constituent donc la source d’inoculum* primaire pour la génération suivante de plante. Ces
microorganismes peuvent être bénéfiques à la croissance de la future plante mais aussi être néfastes à la santé
de la plante. En effet, les agents pathogènes peuvent être transmis d’une génération de plante à l’autre et en
dépit de leur relation avec la plante (relation hôte ou non hôte). Les graines peuvent donc constituer un vecteur
de dispersion pour les pathogènes. Le microbiote dans son ensemble impacte aussi un certain nombre de
caractères chez les plantes tels que la conservation de la graine, la sortie de dormance, le taux de germination,
l‘émergence de la plantule et les défenses cette dernière (Gebeyaw, 2020). Ces paramètres sont d’une grande
importance pour l’agriculture, notamment dans les phases précoces d’installation des cultures et font du
microbiote de la graine un objet de recherche d’importance capitale.

La transmission d’un microorganisme à et par la graine peut être divisée en deux étapes : (i) de la plante-
mère à la graine et (ii) de la graine à la plantule (Baker and Smith, 1966). Comprendre les voies et mécanismes
impliqués dans la transmission des microorganismes est nécessaire afin de cibler des stratégies permettant de
favoriser la transmission de microorganismes bénéfiques ou de limiter celle des agents pathogènes (Barret et al.,
2016). Il existe plusieurs voies permettant aux bactéries de transmettre de la plante mère à la graine : la voie
vasculaire, la voie florale ainsi que la voie externe (Maude, 1996). La voie vasculaire correspond à la transmission

Le Ruyet Amandine | Identification des interactions plante-bactéries impliquées dans la colonisation de la

plantule 1
de microorganismes par le xylème et concerne entre autres de nombreux agents pathogènes (Shade et al., 2017).
Cette voie de transmission permet une colonisation aussi bien de l’embryon que du tégument externe. La voie
florale permet elle aussi la colonisation de tous ces tissus. Les bactéries qui sont transmises par cette voie peuvent
être celles qui sont présentes dans le microbiote de la fleur mais, elles peuvent aussi être apportées par des
insectes pollinisateurs (Prado et al., 2020). Les défenses associées aux tissus végétaux limitent cependant la
transmission des micro-organismes par voie interne et florale. Une fois la graine récoltée, d’autres
microorganismes peuvent coloniser la graine de manière épiphyte* par la voie dite externe. Ceci explique une
plus grande diversité de la population bactérienne à la surface de la graine (population épiphyte*) (Barret et al.,
2016). Les études menées jusqu’ici ont montré que l’origine géographique de la graine et le génotype du porte-
graine sont importants dans la constitution du microbiote bactérien de la graine (Klaedtke et al., 2016; Rochefort
et al., 2019). Il semblerait également que l’ordre de colonisation de la graine par les bactéries est particulièrement
important. Effectivement, lorsque plusieurs bactéries utilisent la ou les mêmes ressources nutritives, c’est la
bactérie qui aura colonisé la graine en premier qui sera avantagée, cet avantage allant même jusqu’à
l’empêchement total de l’installation de bactéries concurrentes (Shade et al., 2017). En effet, il a été démontré
qu’une graine individuelle est associée à un unique taxon très abondant représentant plus de 70% de l’abondance
relative du microbiote de la semence (Chesneau et al., 2021).

Il faut néanmoins garder à l’esprit que ce n’est pas parce qu’une bactérie a été transmise à la graine
qu’elle sera nécessairement transmise à la plantule. Les modifications physico-chimiques de l’habitat lors de la
germination de la graine vont en effet sélectionner certains taxons (Barret et al., 2015). Les travaux de (Torres-
Cortés et al., 2018) ont notamment montré un enrichissement de taxa copiotrophes* (associés
phylogénétiquement à des Enterobacteriales et Pseudomonadales) pendant la germination et l’émergence. Les
taxons sélectionnés peuvent être associés à la graine mais également au sol environnant. La zone du sol soumise
à l’influence de la graine en germination s’appelle la spermosphère*. Les bactéries de la spermosphère* peuvent
avoir un impact (qui peut être aussi bien positif que négatif) sur la vitesse de germination et d’émergence de la
plantule (Rodríguez et al., 2020; Chesneau et al., 2021). Les déterminants génétiques* microbiens impliqués
dans la colonisation de la graine en germination ou plantule sont à ce jour encore majoritairement méconnus. Il
semble cependant que l’acquisition efficace des nutriments (Torres-Cortés et al., 2018), le système de sécrétion
type III* (Darsonval et al., 2008) et les adhésines* (Darsonval et al., 2009) soient des facteurs importants.

Du côté de la plante, il y a aussi une sélection des microorganismes (Bulgarelli et al., 2013). Les procédés
impliqués dans la sélection du microbiote par l’hôte reposent en partie sur les mécanismes de défenses de la
plante (Hassani et al., 2018). Le premier niveau de défense primaire s’appelle la MTI (MAMPs-Triggered
Immunity). La plante reconnaît les agents pathogènes par l’intermédiaire des motifs moléculaires présents à la
surface des microorganismes (MAMPS, « Microbe Associated Molecular Pattern »). Ce sont les récepteurs PRRs
(Pattern Recognition receptors) qui vont reconnaitre ces motifs moléculaires et induire une production d’hormones
de défense (Seyfferth and Tsuda, 2014). Les pathogènes virulents peuvent supprimer la MTI par l’injection
d’effecteurs qui vont interférer avec la voie de signalisation de ces hormones. Ces effecteurs peuvent aussi être
détectés par les plantes. Dans le cas où l’effecteur est reconnu, il y a induction d’un second niveau de défense

Le Ruyet Amandine | Identification des interactions plante-bactéries impliquées dans la colonisation de la plantule
2
appelé ETI (Effector-triggered immunity) qui à nouveau va induire une accumulation d’hormones importante pour
les défenses des plantes (Seyfferth and Tsuda, 2014).

En fonction de la nature du microorganisme, différentes voies de signalisations vont être induites pour
défendre la plante (Koornneef and Pieterse, 2008). Ainsi, la voie de signalisation impliquant l’acide salicylique
(SA) entrera en jeu chez la plante lors de la détection d’un pathogène biotrophe mais ce sont les voies de
signalisations impliquant l’éthylène (Eth) et l’acide jasmonique (JA) qui seront activées au cours une réponse à
un pathogène nécrotrophe. Bien que dans la majorité des cas les voies de l’acide jasmonique et de l’acide
salicylique soient antagonistes, la réponse de la plante à un pathogène correspond à un équilibre entre ces trois
principales voies de signalisation et quelques autres voies telle que celle de l’acide abscissique (ABA) (Koornneef
and Pieterse, 2008). Ces voies de défenses sont très complexes et font intervenir un grand nombre acteurs
moléculaires. Parmi ces acteurs on retrouve entre autres PR1, EDS1, PR4, PDF1-2, ERS1 et Ein3. Les protéines
et peptides antimicrobiens PR (Pathogenesis-related) sont un groupe de molécules de défense (Ali et al., 2018).
Les PR sont liés aux voies de signalisations de SA et JA. Les PR liés à la voie SA comme PR1 entrent en jeu dans
la résistance systémique acquise (SAR), tandis que ceux liés à la voie JA comme PR4 entrent eux en jeu dans la
résistance acquise locale (LAR). EDS1 (Enhanced Disease Susceptibility 1) intervient, lui, dans l’activation de la
voie SA et joue un rôle important dans protection de la plante contre des agents pathogène hôte ou non-hôte
(Wiermer et al., 2005). En effet, EDS1 est capable de former plusieurs complexes avec différentes molécules, ce
qui lui donne un rôle central dans les voies de défenses. Il est notamment capable d’interagir avec les récepteurs
TIR-NB-LRR (Toll-Interleukin-1 receptor-type nucleotide binding-leucine rich repeat) afin de promouvoir la
reconnaissance de pathogènes. ERS1 (Ethylene Response Sensor-1) et Ein3 ( Ethylene INsensitive protein 3),
eux, réagissent à l’éthylène (Alonso and Stepanova, 2004). ERS1 est un récepteur d’éthylène présent sur la
membrane du réticulum endoplasmique. En absence d’éthylène, il réprime activement la réponse à l’hormone.
Ein3 est quant à lui un facteur de transcription qui va permettre l’activation de gènes régulé par l’éthylène. Enfin,
PDF1-2 (Plant DeFensin gene) semble être inclus et dans la voie JA et dans la voie de l’éthylène (Penninckx et
al., 1998). Les voies de défenses (et donc leurs acteurs) ont été majoritairement étudiées lors des phases
autotrophes de croissance de la plante dans les tissus végétatifs. Cependant, la transposition de ces résultats aux
organes reproducteurs ou bien lors des phases hétérotrophes de croissance reste à être démontrée.

Xcc est l’agent pathogène responsable de la pourriture noire sur les Brassicacées et l’un des pathogène
causant parmi les plus grandes pertes économiques sur ces plantes (Vicente et al., 2001). Il peut être dispersé
par la graine à laquelle il peut être transmis par voie vasculaire ou florale. Plusieurs études (Rezki et al., 2018;
Torres-Cortés et al., 2019) ont cherché à voir l’impact de cette bactérie pathogène sur la structure du microbiote
de la graine de radis (Raphanus sativus var. Flamboyant5). Ces études ont aussi cherché à savoir si Xcc était en
compétition avec d’autres bactéries pour ses ressources nutritives. Cependant, très peu de bactéries du
microbiote de la graine de radis semblent avoir des ressources nutritives en commun avec Xcc, ce qui fait que
Xcc a très peu de compétition pour se transmettre. C’est donc un très bon modèle (outre sa pathogénicité) pour
étudier les facteurs importants pour la transmission des bactéries à la graine.

Le Ruyet Amandine | Identification des interactions plante-bactéries impliquées dans la colonisation de la plantule
3
1.3. Objectif du stage
L’objectif de mon stage est entre autres d’identifier les déterminants génétiques* impliqués dans la
transmission de Xcc de la graine à la plantule. Pour ce faire, je vais employer la méthode du Rb-TnSeq (Wetmore
et al., 2015). Cette méthode consiste à créer une banque de mutants en insérant des transposons et barcodes
dans le génome d’une souche bactérienne. Il s’agit de sélectionner des mutant avec un transposon seulement
dans un gène seulement et avec un barcode. Il faut alors identifier quel barcode est associé à quel gène afin de
pouvoir identifier les différents mutants. Une fois ces deux étapes réalisées, la banque peut être utilisée pour
déterminer l’importance de gènes dans certains procédés. Dans le cas présent il s’agit d’identifier les gènes
essentiels pour la transmission à la plantule. L’équipe Emersys possédant déjà une banque de mutants de la
souche 8004 de Xcc, j’ai au cours de mon stage inoculé des graines avec cette banque.

En plus de l’identification des déterminants génétiques* impliqués dans la transmission à la plantule, je

me suis aussi penchée sur l’activation des voies de défenses chez les plantules provenant de graines avec un
microbiote naturel, inoculées avec un agent bactérien pathogène ou inoculées avec une communauté microbienne
simplifiée composée d’un membre pathogène et d’un membre commensale du microbiote des graines. Pour cela
j’ai étudié l’activité des gènes clés des voies de signalisation de l’acide jasmonique, de l’acide salicylique et de
l’éthylène.

Une partie du stage a également porté sur l’identification de déterminants génétiques* impliqués dans la
transmission de Xcc de la plante-mère à la graine, via une approche Rb-TnSeq. Les résultats ne sont pas présentés
dans ce rapport car la dernière partie des expériences sera réalisée au cours de mon dernier mois de stage.

2. Matériel et Méthodes
2.1. Souches bactériennes
Au cours des expériences que nous avons réalisées, nous avons utilisé une banque de mutants Rb-TnSeq
de la souche Xcc8004 (Fourni par Alice Boulanger, LIPM, Toulouse) ainsi que 5 autres souches bactériennes
isolées à l’INRAe d’Angers par l’équipe EmerSys. Ces 5 autres souches : Pseudomonas fluorescens (CFBP 13502),
Stenotrophomonas rhizophila (CFBP 13503), Pantoea agglomerans (CFBP 13505), Pseudomonas viridiflava (CFBP
13507) et Pseudomonas fluorescens (CFBP 13649) sont des bactéries qui ont été isolées à partir de graines de
radis (Annexe 1). Elles ont été sélectionnées car elles sont représentatives, en terme d’abondance et de diversité,
des espèces bactériennes majoritairement retrouvées sur le microbiote des semences de radis.

2.2. Préparation des inocula

Chaque souche bactérienne étudiée ainsi que la banque de mutants Rb-TnSeq Xcc8004 ont été sorties 4
fois du congélateur -80°C afin de réaliser 4 réplicats biologiques indépendants. La banque de mutants a été
décongelée lentement sur glace afin de conserver un maximum de mutants différents le jour de l’inoculation. La
banque a ensuite été ravivée dans un milieu TSB 100% (Tryptone Soja Broth) avec 50µ[Link]-1 de kanamycine*

Le Ruyet Amandine | Identification des interactions plante-bactéries impliquées dans la colonisation de la plantule
4
Figure 1 : Schéma du protocole expérimental
Les graines ont été inoculées par macération puis placées dans des boites de culture dans un phytotron
programmé pour 16h de jour à 25°C et 8h de nuit à 22°C pendant 96h. Les plantules obtenues ont
ensuite été récoltées. Pour l’ensemble des conditions quatre échantillons biologiques ont été collectés.
Chaque échantillon est composé des cotylédons ou racines de 3 plantules. Après extraction des ARN,
l’expression relative des gènes PR1, EDS1, PDF1-2, PR4, Ein3 et ERS1 a été mesurée. Les gènes de
ménage que sont l’actine, la tubuline et le GAPDH ont servi de standard pour comparer l’expression
des gènes au sein de tous nos échantillons. L’ensemble des plantules des échantillons inoculés avec la
banque de mutants Xcc8004(*) ont été récoltées et macérées. L’ADN de ces échantillons a été extrait
et les barcodes contenus dans les transposons ont été amplifiés. Ces derniers ont ensuite été
séquencés grâce au séquenceur NextSeq 550 au CHU d’Angers. (Ce schéma a été réalisé avec
Biorender.)
et 50µ[Link]-1 de rifamycine* pendant 6h. Pour chaque réplicat de la banque, 1mL a été conservé afin de servir
de référence lors du séquençage (T0). Les autres souches bactériennes ont été sorties du congélateur -80°C sur
boîte de pétri TSA 100% (Tryptone Soja Agar) et entretenues sur du TSA 10% jusqu’à la veille de l’inoculation
où elles ont été mises en culture sur la nuit dans du TSB 10%. Les réplicats des banques bactériennes ont été
lavées dans du MgSO4 le jour de l’inoculation. La DO a été mesurée à 600nm afin de préparer des inocula à une
DO de 0,1 (108 CFU/mL environ). Six inocula bactériens différents ont été préparés pour chaque réplicat : la
banque de mutants Xcc8004 seule et la banque de mutants Xcc8004 en co-culture avec à chaque fois une des 5
autres souches (Figure 1).

Afin de mesurer l’impact de l’inoculation de souches bactériennes sur les défenses des plantes des
inocula* témoins ont aussi été préparés. Du MgSO 4 (témoin négatif de l’activation des défenses) et du Bion
(400mg/L témoin positif de l’activation de défenses. Le Bion est un analogue de l’acide salicylique) ont été utilisés.

Avant chaque inoculation, un échantillon des inocula a été prélevé afin de vérifier la concentration
bactérienne estimée avec la DO par dénombrement sur boite de Pétri. Les échantillons ont été dilués en cascade
jusqu’au 106éme et les dilutions ont été étalées sur TSA 10% pour les souches de co-culture et sur du TSA 100%
avec de la kanamycine* et de la rifamycine* pour la banque de mutants et stockées à 28°C 24h environ. Les
colonies obtenues pour la dilution à 105 ont ensuite été dénombrées et la concentration de l’inoculum a été
estimée en CFU/µL.

2.3. Inoculation des graines et récolte des échantillons

Sept sous-échantillons d’environ 400 graines de radis (Raphanus sativus var. Flamboyant5) ont été faits
à partir d’un lot de graines issues d’une multiplication effectuée en 2014 sur une parcelle contrôle de la Fédération
Nationale des Agriculteurs Multiplicateurs de Semences (FNAMS, 47◦28’012.42’’N-0◦23'44.30’’W, Brain-sur-
l’Authion, France) à partir de graines déjà multipliées sur place. Chaque sous-échantillon a été désinfecté en
effectuant une sonication de 1 minute, un premier lavage à l’alcool à 96° de 1 minute, un lavage à la javel de 5
minutes, un second lavage à l’alcool à 96° de 30 secondes et enfin 3 lavages à l’eau. Les sous-échantillons ont
ensuite chacun été répartis en 4 sous-groupes d’environ 100 graines. Chacun de ces sous-groupes a constitué un
réplicat pour l’expérience. Les sous-groupes ont été macérés une demi-heure dans des pots de 40mL avec un
inoculat (voir partie « Préparation des échantillons »). Un autre sous-échantillon d’environ 100 graines a été
prélevé dans le même lot de graine mais n’a pas désinfecté. Ce sous échantillon a servi de témoin pour voir
l’expression des défenses des plantes et a lui aussi macéré une demi-heure dans du MgSO4. Après la macération,
les graines ont été séchées 10 minutes sous flux avant d’être réparties dans des boîtes de cultures contenant une
feuille de papier buvard stérile, un papier pli et 40mL d’eau. Ces boites ont ensuite été placées 96h dans un
phytotron programmé pour 16h de jour à 25°C et 8h de nuit à 22°C. Pour chacun de nos réplicats, les cotylédons
et racines de 3 plantules différentes ont été récoltés dans deux tubes Eppendorf différents. Les témoins n’ayant
pas de réplicats, le prélèvement a été effectué 4 fois dans la même boite. Une fois récoltés ces échantillons étaient
directement placés dans l’azote liquide avant d’être par la suite à -80°C. Pour les expérimentations de RB-TnSeq,
les plantules restant dans chacune de nos boites ont été récoltées et placées dans un erlenmeyer. Ces plantules
ont été macérées 15 minutes à 28°C 150RPM dans 40mL de MgSO 4 avant d’être stomachées 2 minutes à pleine

Le Ruyet Amandine | Identification des interactions plante-bactéries impliquées dans la colonisation de la plantule
5
Figure 2 : Boite à moustache montrant l’expression relative de l’ensemble des
gènes étudiés et de toutes les conditions confondues dans les cotylédons et les
racines

L’axe des ordonnées représente l’expression relative de l’ensemble des gènes de défense
et des modalités étudié. L’axe des abscisses représente les organes étudiés, les cotylédons
(rouge) et les racines (bleu). Chaque point représente un échantillon. La significativité a
été mesurée par un test de Wilcoxon (p-value = 7,73.10-14).
puissance. 30mL de filtrat issu du stomachage ont été centrifugés. Le culot obtenu a été resuspendu dans 4mL
de MgSO4. 2mL de cette suspension ont directement été stockés à -20°C tandis que les 2mL restants ont quant
à eux été remis en culture dans du TSB 100% afin de réaliser une culture sur la nuit (Outgrowth) afin d’amplifier
le nombre de mutants Xcc8004 présent dans l’échantillon over night. Le lendemain, les échantillons en outgrowth*
ont été lavés avec du MgSO 4 puis stockés à -20°C avec les autres échantillons.

2.4. Etude de l’expression des gènes de défense de la plantule

L’ARN de ces échantillons a été par la suite extrait en suivant le protocole du kit Macherey-Nagel ‘Total
RNA purification from plant’. L’ARN extrait a été dosé au nanodrop. La concentration en ARN de tous les
échantillons a été ajustée à 2µg avant qu’ils ne soient rétrotranscrits à l’aide de la M-MLV RTase de Promega.
L’accrochage des queues polyT s’est effectué pendant 5 minutes à 75°, puis les échantillons sont restés sur glace
au moins 5 minutes avant d’être placés 75 minutes à 42°C pour la rétrotranscription. Les échantillons ont ensuite
été stockés à -80°C. La pureté en ARN des échantillons a été estimée à l’aide d’une PCR avec des amorces
amplifiant le facteur d’élongation alpha dégénérées (EF deg) (Annexe II) (ces amorces dégénérées ont été mises
au point sur pommier par l’équipe Résistance du pommier et du poirier aux bioagresseurs (RESPOM) de l’IRHS
d’Angers, et sont valables sur une large gamme de plantes dont le radis). Un cycle de dénaturation à 95°C, 35
cycles constitués de 45 secondes de dénaturation à 95°C, 45 secondes d’hybridation à 50°C et 1 minute
d’élongation à 72°C puis un cycle de 15 minutes d’élongation à 72°C ont été réalisés. Cette PCR ciblant un gène
de ménage* (facteur d’élongation alpha) de la plante a permis de vérifier que l’intégralité de l’ADN avait bien été
dégradée et que seul de l’ADNc était présent dans nos échantillons. Ayant obtenu seulement une bande d’ADN,
la quantité d’ADNc a directement pu être dosée. Les niveaux de transcrits des gènes PR1 et EDS1 de la voie de
l’acide salicylique, PDF1-2, PR4 de la voie de l’acide jasmonique et Ein3 et ERS1 de l’éthylène ont été dosés et
ceux de l’actine, de la tubuline et du GAPDH qui sont des gènes de ménage ont servi de standards. Pour quantifier
l’expression des défenses de plantes le mix qPCR Mesa Blue (Eurogentech) a été utilisé. Un mélange de 3,75µL
du mix Mesa Blue et 3µL d’ADNc ont été déposés sur les plaques qPCR avec les amorces (Annexe II). Une
dénaturation à 95°C pendant 5 minutes a été effectuée puis 40 cycles avec 3 secondes de dénaturation à 95°C
et 1 minute à 60°C ont été effectués avant de finir par 30 secondes à 50°C. Les résultats obtenus ont été traités
sur Excel afin d’obtenir l’expression relative des gènes en log2(ratio). Pour calculer cette valeur, l’un des réplicats
de la condition témoin décontaminé (TD) a été utilisé comme calibrateur. La similarité des réplicats a été vérifiée
à l’aide d’analyses en composantes principales (ACP) (Figure 3) réalisées sur le logiciel StatBox et de graphiques
réalisés sur R (Figure 4). Ces deux figures nous ont permis de voir que les réplicats des échantillons et plus
particulièrement ceux issus des graines décontaminés (TD) étaient parfois assez peu proches les uns des autres.
Ce constat pose problème dans le cas précis de TD car l’un de ces témoins a servi de référence pour calculer les
valeurs d’expression relative des gènes (un pour les échantillons de racines et un pour ceux de cotylédons). Le
fait que les autres réplicats soient très différent de celui utilisé en tant que référence a obligé à l’ajustement
l’ensemble de nos valeurs. Pour ajuster les valeurs, une moyenne des résultats des 3 réplicats n’ayant pas servi
de référence pour l’expression relative a été effectuée et soustraite aux expressions relatives de tous les autres
échantillons. Un nouveau tableau a ainsi été obtenu et il a pu servir de base pour la construction des figures. Le
reste de l’analyse des résultats, et la production de graphiques a été effectuée sur R. Un seuil arbitraire a été fixé

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6
A.

B.

Figure 3 : ACP montrant la Variabilité des défenses induites selon les graines
pour les cotylédons (A) et les racines (B)

Les deux axes représentés sont les deux axes expliquant la plus grande variation entre
nos échantillons. La différence entre nos échantillons correspond à la somme de la
différence expliquée par les deux axes. Chaque modalité est représentée d’une couleur
différente.
pour étudier l’expression relative de nos gènes. Ce seuil a été établi à log2(ratio) de 2 (ou -2) soit quand le gène
est 4 fois plus exprimé que chez le témoin.

2.5. Etude des déterminants bactériens nécessaires à la

transmission
Pour cette partie nous avons utilisé une approche Rb-TnSeq (Wetmore et al., 2015). Cette méthode
consiste à créer une banque de mutants à partir d’une souche bactérienne en insérant des transposons de manière
aléatoire dans le génome de la souche (dans notre cas, la banque a été construire au préalable par le laboratoire
d’Adam Arkin au Lawrence Berkeley National Laboratory (Ca, USA). Il s’agit ensuite de sélectionner les mutants
chez qui un seul transposon s’est inséré et donc chez qui un seul gène est éteint. Il faut ensuite associer à chacun
des mutant sélectionnés une séquence particulière, un barcode qui nous permettra de l’identifier. Pour que la
banque soit correcte, il faut que l’ensemble des mutants qui la composent soient mutées dans des gènes qui
soient uniformément répartis dans le génome de la bactérie. Une fois la banque obtenue et l’association barcode-
gène muté bien répertoriée, la banque peut servir à étudier les gènes impliqués dans une grande variété de
processus. Dans notre cas, on s’intéresse à la transmission bactérienne de la graine à la plantule. On a donc
inoculé la banque Xcc8004 pour voir quels mutants ne seraient pas transmis, et seraient donc muté dans un gène
nécessaire à sa transmission à la plantule. Xcc8004 est un agent bactérien connu pour se transmettre entre
générations de plantes via la semence, il est donc idéal à utiliser pour ce type d’approche (van der Wolf et al.,
2019). L’ADN des échantillons et des T0 a été extrait à l’aide du kit d’extraction kit Macherey-Nagel ‘Genomic
DNA from food’. Les échantillons obtenus à la suite de cette extraction ont été dosés au nanodrop et au qubit.
Afin de nous assurer de la présence d’ADN de Xcc8004 dans nos échantillons, nous avons réalisé une PCR avec
des amorces Zup (Annexe II) spécifiques de Xcc. Nous avons utilisé les amorces Zup 2309 et Zup 2310 ainsi
que la Taq Polymérase G2 Flexi (Promega) et réalisé une PCR avec une dénaturation de 3 minutes à 95°C suivie
de 35 cycles de 40 secondes de dénaturation à 95°C, 40 secondes d’hybridation à 58°C et 40 secondes
d’élongation à 72°C puis d’une élongation de 3 minutes à 72°C. Ayant bien obtenu une amplification, une PCR
avec la polymérase Q5 (High fidelity, NEB) afin d’amplifier les barcodes présents dans l’ADN extrait des mutants
Xcc8004 et d’y ajouter des adaptateurs illumina pour le séquençage a été effectuée. L’un des adaptateurs ajoutés
est commun à tous les échantillons. Il s’agit de P1 (Annexe II). Le second adaptateur (P2-IT…) lui est spécifique
à chaque échantillon et permettra l’identification de tous les échantillons lors du séquençage. La PCR a été réalisée
avec une dénaturation de 4 minutes à 98°C suivie de 25 cycles de 30 secondes de dénaturation à 98°C, 30
secondes d’hybridation à 55°C et 30 secondes d’élongation à 72°C puis d’une élongation de 5 minutes à 72°C.
La taille des fragments obtenus suite à cette PCR a été vérifiée sur un gel d’agarose à 1,8%. Des bandes au-
dessus et en dessous de la bande d’intérêt (200pb) ont été observées sur le gel. Les échantillons ont été purifiés
suivant le protocole ‘Instruction-NucleoMag-NGS-Clean-up-and-Size-Select’ de Macherey-Nagel de manière à
retirer les bandes d’une taille inférieure à 200pb puis revérifiés sur un gel à 1,8% d’agarose. Ce gel a permis de
sélectionner les échantillons non outgrowth* plutôt que les échantillons outgrowth* car aucune bande au-dessus
de la bande d’intérêt (500pb) n’était observée pour ces échantillons. Les échantillons sélectionnés ainsi que les
T0 ont ensuite été dosés au Qubit afin de pouvoir constituer un pool équimolaire pour le séquençage. Ce pool a
été stocké à -20°C jusqu’à l’avant-veille du séquençage où il a été dosé par qPCR (Kapa, ROCHE) afin d’optimiser
le volume à déposer sur la cartouche de séquençage. Le pool équimolaire a ensuite été rangé au frigo jusqu’au

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7
A.

Inoculat
s

B.

Figure 4 : Graphique montrant les coordonnées sur l’axe principal de l’ACP en

fonction des inoculats pour les échantillons cotylédons (A) et racines (B)

L’axe des ordonnées représente les coordonnées des échantillons sur l’axe principal de
l’ACP (explique 52% pour les cotylédons et explique 48% pour les racines). L’axe des
abscisses représente les différentes modalités testées. Les barres d’erreur correspondent
à l’écart type des 4 réplicats biologiques indépendant traités pour chaque modalité. A
chaque modalité correspond une couleur. On observe une différence significative entre la
modalité non décontaminé (TND) et les modalités inoculé avec Xcc et 13507 (p-value =
0,0380) et inoculé Xcc et 13649 (p-value = 0,0310).

TD = témoin décontaminé, TB = témoin Bion, TND = témoin non décontaminé

jour de séquençage où il a été préparé selon le protocole de séquençage NextSeq 550 (illumina) de l’INRAe. Le
pool a été préparé avec 10% de phiX*et 1,6 pM d’ADN ont été déposés dans la cartouche NextSeq 550 high
output sélectionnée pour le séquençage. Cette cartouche permet le séquençage de 400 millions de lectures
pairées. Le séquençage NextSeq a été effectué le 17/06 au CHU de Angers et a duré 18h.

3. Résultats
3.1. Influence du microbiote des plantes sur les défenses des
plantes
Dans cette partie, nous avons cherché à déterminer la façon dont les différentes conditions testées
(graine avec microbiote natif, graine inoculée avec Xcc, ou graine inoculée avec une communauté simplifiée)
affectaient l’expression relative des gènes PR1 et EDS1 de la voie de l’acide salicylique, PDF1-2, PR4 de la voie
de l’acide jasmonique et Ein3 et ERS1 de l’éthylène. Dans un premier temps, nous avons comparé l’expression
relative de l’ensemble de nos gènes dans les cotylédons et les racines, puis avons vérifié la variabilité de nos
réplicats. Nous avons ensuite comparé l’expression relative dans les plantules issues des graines inoculées avec
Xcc et celles dont le microbiote naturel avait été conservé. Puis nous avons comparé toutes les modalités incluant
Xcc et Xcc en interaction avec un membre du microbiote de semence (communauté simplifiée).

3.1.1. Induction différentielle des défenses des plantes selon le compartiment étudié
Lorsque l’on compare l’expression relative de l’ensemble des gènes ciblés par qPCR pour tous les inocula
confondus, on remarque une différence significative d’expression entre les cotylédons et les racines (Figure 2).
Effectivement, la médiane des valeurs d’expression (en log2 ratio) pour l’ensemble des gènes ciblés est de 3 ,95
pour les cotylédons contre 0,99 pour les racines (p-value = 7,73.10-14 d’après un test de Wilcoxon). Cette
différence significative ne permet pas de combiner les résultats d’expression pour ces deux compartiments. Ainsi
deux analyses séparées seront réalisées pour les cotylédons et les racines dans la suite de ce rapport. On notera
une plus forte induction des gènes de défense dans les cotylédons en comparaison aux racines.

3.1.2. Variabilité des défenses induites selon les graines

Une Analyse en Composantes Principales (ACP) a été réalisée afin d’estimer les variations d’expression
relative des gènes de défense entre nos quatre réplicats biologiques issus de nos différentes conditions (Figure
3). Dans le cas des cotylédons (Figure 3A), les deux axes principaux de l’ACP expliquent 69% de variation entre
les l’ensemble des réplicats tandis que pour les racines (Figures 3B) les axes principaux de l’ACP expliquent 68%
de variation. Pour les cotylédons comme pour les racines, ces deux axes séparent dans la majorité des cas les 4
réplicats d’une même condition. Cependant, une variation importante entre les réplicats associés aux témoins
désinfectés (TD) est observée dans les cotylédons (Figure 3A). Cette variation, bien que moins importante est
également retrouvée sur les échantillons TD dans les racines (Figure 3B). L’axe 1 de l’ACP représentant une
forte part de variation, nous avons projeté sous forme d’histogramme les données de l’axe 1 afin d’améliorer la
visualisation des différences d’expression des gènes de défenses entre nos conditions (Figure 4). Dans le cas
des cotylédons (Figure 4A), on remarque que les témoins et plus particulièrement le témoin non désinfecté
révèlent une différence au niveau de l’expression des gènes de défense par rapport aux autres échantillons. Les

Le Ruyet Amandine | Identification des interactions plante-bactéries impliquées dans la colonisation de la plantule
8
A.

B.

* *

Figure 5 : Boites à moustache montrant la différence d’expression relative entre

les échantillons témoins non décontaminés et ceux inoculés avec Xcc par gène
dans les cotylédons (A) et les racines (B)

L’axe de ordonnées représente l’expression relative en log2ratio des 6 gènes étudiés.

L’axe des abscisses représente les deux modalités étudiées (TND et Xcc). La couleur des
boites ainsi que celle des points représentant les échantillons représente la voie de
signalisation à laquelle appartient le gène. Les lignes horizontales rouges pointillées
représentent des seuils à une expression relative de -2 et 2. Les * représentent une p-
value significative à l’issue d’un test de Kruskal-Walis comparant les deux modalités.

Cotylédons : ERS1 p-value = 0,0209 ; Racines : PDF1-2 p-value = 0,0209 et ERS1 p-

value = 0,0209

TND = témoin non décontaminé

échantillons témoins désinfectés ont une grande erreur type ce qui nous montre que les réplicats de ce témoin
sont très différents les uns des autres. En accord avec ce premier résultat aucune différence d’expression des
gènes de défense n’est significativement observable à cette échelle. Dans le cas des racines (Figure 4 B) on
observe un graphique quelque peu différent mais on ne distingue toujours pas d’expression différentielle des
gènes de défense significative entre les témoins désinfectés et nos diverses conditions testées. On remarque
cependant une différence significative de l’expression des gènes de défenses entre les échantillons obtenus à
partir de graines non décontaminées (TND) et les échantillons obtenus à partir de graines inoculées avec Xcc et
13507 (p-value = 0,0380) et les graines inoculées avec Xcc et 13649 (p-value = 0,0310).

3.1.3. Influence du microbiote de la semence sur les défenses des plantes

Dans un premier temps nous avons comparé l’expression relative des gènes ciblés dans les témoins non
désinfectés par rapport aux témoins désinfectés, afin d’estimer l’impact du microbiote des semences sur
l’expression des défenses des plantes.

a) Cotylédons

Au sein des cotylédons (Figure 5A), le ratio d’expression médian des gènes EDS1, PR4, PDF1-2 et Ein3
est supérieur à 2 après transformation en log2. Ce résultat indique que l’expression de ces gènes est induite par
les membres du microbiote des graines. Lors de l’inoculation de la souche Xcc8004, une induction (log2 > 2) de
l’expression relative de l’ensemble des gènes ciblés est observée sauf pour le gène PDF1-2 qui présente des
variations importantes d’expression entre réplicats. Ainsi la souche phytopathogène Xcc8004 induit l’expression
des gènes dont les produits sont impliqués dans les voies de défense de l’acide salicylique (SA), acide jasmonique
(JA) et éthylène (Eth).

Est-ce que la présence de Xcc au sein des graines provoque des changements d’expression des gènes
différents de ceux mesurés pour l’ensemble du microbiote ?

Lorsque l’on effectue un test de Kruskal-Wallis pour chacun pour voir si il y a une différence entre
l’expression des gènes ciblés dans les échantillons de ces deux conditions (TND et Xcc), seule une des p-value
obtenues est inférieure à 0,05 (p-value = 0,0209). Cette p-value est celle du test effectué pour le gène ERS1.
Ainsi, l’expression relative de ce gène est significativement induite par Xcc. On a donc bien un impact de l’agent
pathogène sur les voies de défenses de la plantule dans les cotylédons, cependant, cette activation ne semble
pas concerner l’ensemble des acteurs des voies de défenses ni l’ensemble des voies. Il est donc difficile de dire
si cette différence d’expression se traduit par une plus grande résistance de la plantule à l’agent pathogène au
niveau des cotylédons.

b) Racines

Lorsque l’on compare les niveaux d’expression médians des gènes au niveaux des racines (Figure 5 B)
et des cotylédons, on remarque une expression globalement moins forte dans les racines. En effet, dans le cas
des échantillons non décontaminés (TND) aucun gène n’est induit (log2 >2) par rapport aux échantillons graines
décontaminées (TD). L’expression relative du gène PR1 se retrouve même réprimée fortement dans les racines
des échantillons TND (médiane de -6,397)

Le Ruyet Amandine | Identification des interactions plante-bactéries impliquées dans la colonisation de la plantule
9
A.

B.

Figure 6 : Boites à moustache montrant la différence d’expression relative entre

les gènes chez échantillons issus de plantules inoculées avec Xcc seule ou non

L’axe de ordonnées représente l’expression relative en log2ratio des 6 gènes étudiés.

L’axe des abscisses représente les deux modalités étudiées (Xcc, Xcc + 13502, Xcc +
13503, Xcc + 13505, Xcc + 13507, Xcc + 13649). La couleur des boites ainsi que celle
des points représentant les échantillons représente la voie de signalisation à laquelle
appartient le gène. Les lignes horizontales rouges pointillées représentent des seuils à
une expression relative de -2 et 2. Un test de Kruskal-Walis comparant les modalités a
été effectué pour chaque gène dans les cotylédons et les racines.

Cotylédons : aucune p-value significative ; Racines : PDF1-2 p-value = 0,0221 et ERS1 p-

value = 0,0155

Test de Dunn :

ERS1 : pas de de p-values significatives ; PDF1-2 : p-value obtenue en comparant la Xcc

+ 13505 et Xcc + 13649 (p-value = 0.0343262) significative
 Suite à l’inoculation de Xcc8004, on retrouve une induction (log2 ratio >2) de l’expression des deux gènes
impliqués (PR1 – EDS1) dans la voie de l’acide salicylique. Cependant ces modifications d’expression ne sont pas
significativement différentes de celles obtenues avec les échantillons TND. En revanche, l’expression des gènes
PDF1-2 (p-value = 0,0209) et ERS1 (p-value = 0,0209) est significativement plus importante dans les échantillons
inoculés avec Xcc. Ces deux gènes n’appartiennent pas à la même voie de signalisation. On observe que dans
ces deux cas le second gène étudié pour la voie ne semble pas être activé. Il est donc comme dans les cas des
cotylédons difficile de dire quel est l’impact de l’activation de ces gènes sur les défenses de la racine de la plantule
dans leur ensemble.

Si on compare les résultats obtenus pour les cotylédons dans ces deux cas, on peut voir que les gènes
de défenses semblent moins exprimés dans les racines que dans les cotylédons comme constaté dans la première
partie de ces résultats. On peut aussi constater que dans les deux cas on observe une expression plus forte du
gène ERS1 en présence de l’agent pathogène.

3.1.4. Une communauté microbienne composé de Xcc et d’un taxon commensale du microbiote
des graines n’induit pas une induction des défenses des plantes plus importante

a) Cotylédons

Quand on regarde la différence dans l’expression relative des différent gènes cette fois-ci chez les
échantillons issus de plantules inoculées avec Xcc seule ou en co-culture (Figure 6A), on remarque une induction
de l’expression relative pour l’ensemble des gènes ciblés, à l’exception de Ein3 pour l’échantillon inoculé avec Xcc
et 13502. Cependant, nous n’observons aucune différence significative d’expression relative entre les échantillons
inoculés avec Xcc et les échantillons co-inoculés (p-value > 0.05, tests de Kruskal-Walis). Les cocultures ne
semblent donc ni amplifier les réponses de défense des plantes ni les atténuer dans les cotylédons.

b) Racines

Au sein des racines (Figure 6B), on observe la même tendance que précédemment reportée sur la
Figure 4B, à savoir une expression relative des gènes moins importante que pour les cotylédons. Seule
l’expression du gène EDS1 est systématiquement induite par l’ensemble des co-cultures (log ratio > 2). On
observe seulement deux différences significatives entre les modalités. Effectivement, les tests de Kruskal-Walis
effectués pour PDF1-2 (p-value = 0,0221) et pour ERS1 (p-value = 0,0155) sont significatifs. Dans le cas de
PDF1-2, la comparaison des modalités unes à unes avec un test de Dunn permet d’établir que l’expression relative
de ce gène est significativement différente pour la modalité Xcc + 13505 et les modalités Xcc + 13507 et Xcc +
13649 (Xcc + 13505 Vs Xcc + 13507 : p-value = 0,3217 et Xcc + 13505 Vs Xcc + 13649 : p-value = 0,0343).
Cependant, la comparaison des modalités unes à unes avec un test de Dunn ne permet de relever aucune
différence significative. On n’a donc aucune différence significative d’expression observable entre Xcc et les autres
modalités mais une différence significative entre trois des modalités dans le cas du gène PDF1-2.

Le Ruyet Amandine | Identification des interactions plante-bactéries impliquées dans la colonisation de la plantule
10
Figure 7 : Photo de gels d’agarose à 1,8% d’agarose sur lesquels on a fait migrer
les échantillons obtenus à la suite de la PCR d’amplification de barcodes (Q5)

Amplification a environ 200 bases correspondant aux barcode.

Absence de bande pour l’échantillon 13502_2.

Sur certains échantillons (majoritairement outgrowth) seconde bande à environ 500 bases
correspondant à une amplification non spécifique de Xcc.

Utilisation d’un ladder 1kb.

3.2. Déterminants génétiques impliqués dans la transmission
Nous avons ici essayé d’identifier les déterminants génétiques* impliqués dans la transmission de Xcc à
la plantule à l’aide de la méthode de Rb-TnSeq. Dans un premier temps il s’agissait de confirmer la transmission
de notre banque de mutants Xcc de la graine à la plantule. Nous avons ensuite préparé les échantillons pour le
séquençage et sélectionné les échantillons à utiliser. Nous avons ensuite pu vérifier la qualité de notre séquençage
pour chaque échantillon. Le filtrage des données est actuellement réalisé par nos collaborateurs du Lawrence
Berkeley National Laboratory (CA, USA). Par faute de temps les résultats de l’approche Rb-TnSeq ne pourront
pas être retranscrits dans ce rapport.

3.2.1. Transmissibilité de Xcc à la plantule

Une PCR a été réalisée afin d'amplifier les barcodes présents dans les transposons insérés dans le
chromosome de la souche Xcc. En effet chaque transposon présente une séquence unique de 20 nucléotides qui
permet de l’identifier. Le site d’insertion de chaque transposon a été préalablement identifié par un séquençage
complet des populations de mutants (Figure 7). En plus de permettre l’amplification des barcodes, cette PCR
nous a permis de vérifier si la banque de mutants Xcc s’était bien transmise de la graine à la plantule. Le fait que
l’on puisse observer des bandes à 200 bases dans tous nos échantillons indique la population de Xcc inoculée a
été transmise aux plantules. On remarque cependant dans certains échantillons une amplification secondaire d’un
fragment situé à environ 500 bases. Ce fragment correspondrait à une amplification aspécifique sur la souche
Xcc. On a donc discriminé les échantillons outgrowth* qui ont tous ce fragment.

3.2.2. Données obtenues du séquençage

La cartouche de séquençage qui a été utilisé est optimisée à une densité de 170k cluster par mm2. Nous
avons obtenu une densité 165k cluster par mm2 sur notre cartouche ce qui veut dire que nous avons réussi à
bien l’optimiser et que la quantité d’ADN que nous avons déposée était optimale.

Quand on regarde le nombre de lectures pairées obtenues pour chaque condition (Figure 8), on remarque que
5 échantillons ont un nombre de lectures inférieurs aux autres. Ces 5 échantillons sont les quatre échantillons T0
et le réplicat 2 de la condition Xcc 13503. Ce faible nombre de données de séquences ne nous permet
malheureusement pas de continuer nos analyses. En effet, la fitness* de chaque mutant est estimé en comparant
le nombre de séquences dans la condition plantule à celle de la condition T0. La banque de mutant de Xcc8004
étant composé d’environ 600 000 mutants, 35 657 lectures en moyenne (min = 13878, max = 44686) ne
permettent pas d’avoir une couverture satisfaisante. Ces échantillons vont être reséquencés ultérieurement.

Le Ruyet Amandine | Identification des interactions plante-bactéries impliquées dans la colonisation de la plantule
11
Figure 8 : Graphique montrant le log10 du nombre de lectures pairées totales
obtenues pour chaque échantillon séquencé

L’axe des ordonnées représente le log10 du nombre de lectures pairées. L’axe des
abscisses représente les différents inoculats des différents échantillons séquencés.
4. Discussion
4.1. Influence du microbiote des plantes sur les défenses des
plantes
4.1.1. Expression des défenses chez les plantules
L’ensemble des résultats obtenus pour la partie influence du microbiote des plantes sur les défenses des
plantes semble montrer que les plantules qu’elles soient issues de graines naturelles constituées de leur
microbiote originel ou inoculées avec un agent pathogène présentent une induction des gènes de défenses par
rapport à des graines désinfectées. Ceci peut être expliqué par la présence sur les graines non désinfectées d’un
microbiote naturel qui est sélectionné par la plantule lors de son développement. Cette sélection pourrait être
expliquée par l’induction de défenses par la plante.

La désinfection des graines permet d’éliminer une grande part des microorganismes sur les tissus
externes de la graine mais ces graines peuvent encore contenir des microorganismes endophytes*
(Figueiredo dos Santos et al., 2021). Ces derniers sont déjà sélectionnés par la plante car ils se retrouvent dans
les tissus internes (embryon ou endosperme). Il est supposé que les microorganismes résidant dans ces tissus
internes ont un avantage pour être transmises ensuite à la plantule par rapport à ceux associés uniquement aux
téguments externes (Shade et al., 2017). Ces microorganismes endophytes* sembleraient donc pouvoir
contourner les défenses des plantes pour se transmettre entre les générations de plantes. En effet, il a été montré
que les microorganismes commensaux aux plantes ont la capacité de supprimer la MTI et ainsi de coloniser des
tissus (Teixeira et al., 2021). Dans le cas des graines non désinfectées, possédant un microbiote naturel, la
plantule semblerait réaliser une sélection de son microbiote en induisant l’expression de gène de défenses. Cette
sélection du microbiote par les voies immunitaires de la plante a été montrée dans de nombreuses études
(Teixeira et al., 2019).

Globalement, l’expression relative des gènes de défense dans les plantules provenant de graines non
désinfectées (TND) et celles provenant de graines désinfectées puis inoculées avec Xcc (Xcc) était similaire. Ce
résultat complémente les travaux réalisés sur plantule de haricot, où aucune induction des voies de défenses
n’est observée suite à l’inoculation avec l’agent phytopathogène Xanthomonas citri pv. fuscans (Darrasse et al.,
2010). Cependant, dans cette étude les graines inoculées ont été comparées à des graines non désinfectées or
dans notre cas les différentes conditions ont été comparées à des graines désinfectés. On peut donc conclure que
l’inoculation d’un agent pathogène sur les plantules de radis induit une activation des défenses des plantes. Cette
activation ne dépasse cependant pas celle provoquée par le microbiote natif de la graine. On peut donc émettre
l’hypothèse que l’inoculation des graines par une voie externe (macération) ou une graine en présence d’un
microbiote externe induit inévitablement une activation des défenses de plantes.

Nous avons tout de même remarqué en étudiant les gènes de défense que certains gènes (PDF1-2 et
ERS1 impliqués respectivement dans la voie de l’acide jasmonique et l’éthylène) pouvaient être significativement
plus exprimés en présence d’un agent pathogène (Xcc) que chez TND. Ce résultat pourrait être expliqué par le
fait que Xcc est un agent pathogène nécrotrophe. En effet, la plante induit un signal de défense via l’acide

Le Ruyet Amandine | Identification des interactions plante-bactéries impliquées dans la colonisation de la plantule
12
jasmonique et l’éthylène en présence d’un agent pathogène nécrotrophe (Mur et al., 2013). Ces résultats sont à
prendre avec précaution car Pr4 et ein3 qui sont aussi impliqués dans les voies de défenses des plantes ne sont
pas significativement plus exprimés dans les plantules après inoculation des semences avec Xcc.

4.1.2. Différence d’expression des défenses entre les cotylédons et les racines
Les résultats que nous avons obtenus montrent une différence dans l’expression des défenses au sein de
la plantule. Effectivement, l’expression des défenses est moins élevée dans les racines que dans les cotylédons.
Comme dit précédemment, les défenses de la plantule sont impliquées dans la sélection de son microbiote or les
parties aériennes et racinaires d’une plante n’ont pas le même microbiote (Turner et al., 2013). Une étude a déjà
démontré que cette différence de microbiote entre racines et parties aériennes est visible/perceptible dès/même
chez la plantule (Abdelfattah et al., 2021). Cette étude établit un lien entre la localisation des microorganismes
au sein de la graine et pour ceux qui sont transmis leur localisation dans la plantule. Ce lien s’expliquerait à priori
par différentes voies de transmission. Il semblerait possible au vu de nos résultats que l’expression différentielle
des voies de défenses entre les racines et cotylédons de la plantule joue aussi un rôle dans cette sélection précoce
du microbiote des deux principales parties de la plante.

4.1.3. Une variabilité des résultats

La réponse des plantules aux différentes modalités est cependant variable au sein des réplicats d’une
même modalité. Cette variabilité peut s’expliquer en partie par le fait que la variété de radis utilisée pour cette
étude Raphanus sativus var. Flamboyant5 est une variété population et qu’elle est donc composée de plusieurs
génotypes. Il y a donc de fait une certaine diversité dans les individus de cette population, qui va impacter
directement le microbiote de la graine. Effectivement, le génotype de la plante est connu pour impacter le
microbiote de la semence (Rochefort et al., 2020). Pour homogénéiser nos résultats, il faudrait augmenter le
nombre de réplicats (et donc d’échantillons traités). De plus, plusieurs études ont montré (Rezki et al., 2018;
Chesneau et al., 2020) que le microbiote du radis présente un faible taux d’héritabilité et peut varier grandement
d’une plante à l’autre. La différence de réponse au sein d’une modalité pourrait donc aussi en partie être due à
ce paramètre.

4.1.4. Absence d’induction des défenses des plantes après co-inoculation des graines avec Xcc et
un membre du microbiote des semences
A l’échelle d’une communauté très simple de 2 individus, constituée de Xcc un agent pathogène et d’un
membre commensale du microbiote de la graine, nous n’observons pas de différence d’expression des gènes de
défense par rapport à l’inoculation de Xcc seul. C’est ici la première étude portant sur l’influence des membres de
la communauté microbienne des graines sur les défenses des futures plantules. Il est donc difficile de discuter
ces résultats car il n’y a pas d’études complémentaires disponibles. Cependant, des études sur d’autres organes
comme les racines ont été menées et montrent des résultats contrastés. En effet, il a été montré sur racines
qu’une communauté de commensaux pouvaient supprimer les défenses de la plante et qu’une large gamme de
ces commensaux pouvait supprimer individuellement les défenses de la plante (Teixeira et al., 2021). Sur la
graine avec notre approche il a été impossible de montrer une diminution des défenses des plantes par
l’inoculation de microorganismes commensaux. En perspective, une multitude d’interactions pourront être testées

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13
et mises en place afin d’obtenir une meilleure connaissance de l’impact du microbiote des semences sur l’induction
des défenses chez la plantule.

4.2. Déterminants génétiques impliqués dans la transmission

4.2.1. Sélection des échantillons pour le séquençage
Pour faire notre choix entre les échantillons ayant été soumis à une outgrowth* ou non, nous nous
sommes basés sur les résultats PCR après amplification des codes-barres. Les bandes non spécifiques observées
à 500pb sur la Figure 7 ont été un facteur des deux facteurs qui ont influencé la sélection de la série d’échantillons
à séquencer. En effet, cette bande à 500pb doit provenir d’une amplification aspécifique chez Xcc. Nous allons
pouvoir, par la suite, séquencer cette bande à 500pb pour connaitre son origine. Le second facteur qui a poussé
à ne pas sélectionner les échantillons outgrowth* est le fait que la diversité des mutants peut être diminué suite
à la phase de culture dans un milieu synthétique. En effet, les échantillons outgrowth* étant remis en culture
liquide, les abondances des différents mutants peuvent changer au cours du temps. Ceci est un facteur pouvant
potentiellement biaiser nos résultats et rendre d’autant plus compliquée leur interprétation. Ayant obtenue des
amplifications avec les échantillons sans outgrowth* nous les avons donc sélectionnés pour la suite de la
préparation de la librairie d’amplicons.

4.2.2. Complexité/Challenge de la méthodes Rb-TnSeq

La complexité de la méthode Rb-TnSeq ne réside cependant pas seulement dans la sélection des
échantillons à séquencer. En effet, même si elle permet de révéler l’importance de certains gènes, cette méthode
a un défaut majeur, l’effet de complémentarité. Cet effet est dû au fait que les mutants sont tous inoculés
ensemble et ils peuvent donc échanger des composés. Ces échanges peuvent alors masquer l’importance de
certains gènes si un mutant fournit à un autre le composé essentiel qu’il n’est pas capable de produire. Afin de
palier à ce problème, on pourrait recourir à l’utilisation de la méthode du droplet Rb-TnSeq (Thibault et al., 2019)
qui consiste à diluer la banque afin d’isoler chaque mutant et de les inoculer seuls. Cependant cette méthode est
compliquée d’utilisation quand on a un grand nombre de mutants et surtout lorsque l’on expérimente sur des
plantes par exemple. De plus, les résultats obtenus avec la méthode Rb-TnSeq seuls ne sont pas suffisants pour
tirer des conclusions solides sur l’implication des gènes impliqués dans le procédé étudié. Effectivement, suite
aux résultats obtenus avec cette méthode, il faut vérifier les résultats par mutagénèse ciblée afin d’éviter les
effets polaires induits par l’insertion des transposons. Ainsi, pour chaque gène identifié comme d’intérêt dans la
transmission à la plantule, il sera nécessaire de créer un mutant de Xcc éteint dans ce gène puis de tester sa
transmission in planta et ensuite de valider notre phénotype en re-complémentant notre mutant.

4.2.3. Solutions
Il nous est cependant pour le moment impossible d’identifier les gènes qui sont susceptibles d’être
essentiels à la transmission à la plantule de Xcc. Effectivement, notre manque de données pour les échantillons
témoins (T0) de la banque nous rend pour le moment impossible toute analyse. En effet, pour poursuivre notre
analyse il faudrait redoser les échantillons concernés car le faible nombre de lectures pourrait s’expliquer par un
problème de quantification avant la formation du pool équimolaire. Cependant, notre banque (T0) a déjà été re-
séquencée lors de précédentes expérimentations au laboratoire. Nous allons donc pouvoir les utiliser pour

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14
analyser les données et comparer l’abondance des mutants entre le T0 et les conditions testées. La qualité des
séquences et les différentes étapes de filtrations des données sont actuellement réalisées par des collaborateurs
de l’équipe EmerSys appartenant au Lawrence Berkeley National Laboratory (Ca, USA).

5. Conclusion et perspectives
Notre étude a pu démontrer qu’il y avait une activation des défenses dans la plantule en présence d’un
microbiote naturel et donc une sélection du microbiote par la plantule. Le même niveau de défense induite a été
observé après inoculation sur graines désinfectées d’un agent pathogène seul ou associé avec un taxon natif du
microbiote de semence, démontrant une activité basale des défenses de la plante quelles que soient les souches
bactériennes inoculées. Compte tenu de la variabilité de l’induction des gènes de défense selon les réplicats il
semble essentiel de réaliser cette étude à une échelle plus grande avec un nombre d’individus plus important,
pour contourner à la fois l’effet de la variabilité génotypique des graines de radis et la variabilité naturelle du
microbiote des semences.

Le séquençage des échantillons a pu être réalisé dans l’optique d’identifier les déterminants génétiques*
bactériens impliqués dans la transmission à la plantule. Les résultats obtenus étaient globalement de bonne
qualité et le nombre de lectures obtenues pour la majorité des conditions est très satisfaisante. Cependant, nous
n’avons pas pu aller au bout de l’identification des déterminants génétiques* et du travail reste encore à effectuer.
Effectivement, nous avons choisi d’utiliser les données issues d’un précédent séquençage pour traiter nos
résultats, il faudra une fois les résultats récupérés faire la synthèse des mutants non transmis et ainsi identifier
les gènes qui sont possiblement impliqués dans la transmission. Il faudra ensuite identifier la fonction de tous ces
gènes en se renseignant dans la bibliographie et dans le cas où la fonction n’est pas connue éventuellement
chercher à identifier la fonction du gène.

6. Bibliographie
6.1. Articles
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17
Annexes
RÉSUMÉ Les graines sont vectrices bactéries bénéfiques, néfastes ou commensaux pour la plante qui contribuent
à la santé et au développement de la future plante. Il est nécessaire de comprendre la façon dont ces
bactéries se transmettent à la plantule. Cette transmission repose sur une interaction complexe entre
les bactéries et la plante, il est dans ce cadre important d’étudier (i) les défenses de la plante qui vont
moduler la transmission d’agents microbiens et (ii) les déterminants génétiques qui vont permettre aux
microorganismes de se transmettre. Dans ce rapport, nous avons mesuré par qPCR l’expression des
défenses des plantules de radis après inoculation sur les semences de Xanthomonas campestris pv.
campestris et de bactéries natives du microbiote des graines. Puis nous avons tenté d’identifier les
déterminants génétiques bactériens nécessaires à la colonisation de la plantule par une approche Rb-
TnSeq. Nous avons pu mettre en évidence que les plantules expriment des défenses lorsqu’elles sont
confrontées uniquement au microbiote naturel de la graine. Cependant, la présence d’un pathogène ne
semble globalement pas provoquer une augmentation des défenses chez la plantule. Une différence
dans l’expression des voies de défenses dans les cotylédons et le racines des plantules a aussi été
observé. L’identification des déterminants génétiques bactériens impliqués dans la transmission n’a
quant à elle pas pu être menée à son terme. Beaucoup de choses restent encore à découvrir afin d’aider
à favoriser un microbiote bénéfique et limiter la transmission d’agents pathogènes à la plantule.

mots-clés : Xanthomonas campestris pv. campestris, graine, plantule, transmission, Rb-TnSeq, gènes
de défense

Seeds transmit beneficial, harmful, and commensal bacteria which all contribute to the health and
ABSTRACT

development of the next plant generation. It is, therefore, of great importance to understand the way
bacteria are transmitted to seedlings. The transmission process relies on a complex interaction taking
place between bacteria and plants. Thus, (i) plant defenses limiting bacterial transmission and (ii)
bacterial genetical factors enabling transmission should be studied. For this assignment, qPCR was used
to assess seedling defense system activation with seeds inoculated by Xanthomonas campestris pv.
Campestris or seedborne bacteria. Rb-TnSeq method was used in order to identify essential genes
involved in seedling colonization by bacteria. We showed that seedling defense system was active even
when confronted with only natural seed microbiota. However, pathogen inoculation did not seem to
further trigger seedling defense system. We also observed that the defense system was differentially
activated in roots and cotyledons of all seedlings. Identification of the genetical factors enabling
bacterial transmission could, however, not be carried to an end. Research still needs to be caried in
order to promote beneficial microbes and limit pathogen transmission.

keywords : Xanthomonas campestris pv. campestris, seed, seedling, transmission, Rb-TnSeq, defense
genes