Module : Culture Cellulaire

INTRODUCTION

Définitions de base :

La culture des cellules animales appartient à un ensemble technologique intitulé la

culture des tissus. La culture des tissus est constituée de 3 aspects essentiels : la culture
d’organes, la culture des tissus, et la culture cellulaire.

La culture d’organes (tissus) :

Elle correspond au maintien en dehors de l’organisme des tissus d’une manière qui
permettrait la conservation des fonctions spécifiques de chaque tissu.

La culture cellulaire :

Elle correspond au maintien en dehors de l’organisme des cellules non organisées en tissus,
cependant capables de se diviser et d’exprimer in vitro un métabolisme et une fonction
spécifique.

Historique :

Trois périodes importantes :

1) 1885 – 1900 : c’est la période d’initiation ou période des précurseurs.

2) Dés 1907 : période de la culture des tissus, elle a été initiée par Harrison et
développée par Alexis Carrel. Durant cette période ils ont beaucoup apporté à l’élaboration
des règles d’asepsie et à l’étude des besoins nutritionnels.

3) Dés 1952 : période de la culture cellulaire qui s’est caractérisée par l’introduction de
la Trypsination des tissus. A l’époque la Trypsination consistait à faire digérer un
fragment d’embryon de poulet dans une solution de trypsine. Les observations effectuées
1
après ont porté sur l’aptitude au développement in vitro de cellules isolées après action de
la trypsine.

Applications de la culture cellulaire :

 La culture cellulaire est très utilisée dans la biologie cellulaire, elle est utilisée par
exemple pour l’étude des phénomènes physiologiques tels que la division cellulaire, la
différentiation cellulaire, le vieillissement cellulaire et dans l’étude des processus
physiopathologiques.

 Dans le domaine de la santé, la culture cellulaire est utilisée pour le diagnostic des
maladies virales mais aussi dans le diagnostic pré et post natal des maladies génétiques
ainsi que dans la toxicologie.

 Dans le domaine de la biotechnologie, la culture cellulaire est un outil de base pour la

production des molécules à usage thérapeutique. Ex : Interférons α, β et γ.

L’interféron α est produit sur une culture de leucocytes sous l’action d’un agent viral ou un
ARN bi caténaire (traitement des hépatites B et C).

L’interféron β est produit sur une culture de fibroblastes sous l’action d’un virus ou un
ARN bi caténaire (traitement de la sclérose en plaques).

L’interféron γ est produit sur une culture de lymphocytes T sous l’action d’un antigène
spécifique ou d’agents pathogènes (traitement des infections parasitaires telle la
Leishmaniose).

Remarque :

Agent mitogène : induit une transformation lymphoblastique (activation + division des

cellules immunitaires).

2
 Définitions :

Primo culture : c’est une culture dérivant des cellules, des tissus ou d’organes prélevés
directement de l’organisme.

Repiquage, passage : c’est le transfert des cellules d’un plateau de culture à un ou plusieurs
flacons de culture. Le nombre de repiquage ou de repassage est le nombre de fois que la
culture a été transférée.

Lignée cellulaire : elle est dérivée d’une primo culture au moment du 1 er repiquage, si le
statu de la lignée est connu on dira que c’est une lignée continue ou une lignée à vie
limitée.

Souche cellulaire : elle est dérivée d’une primo culture ou d’une lignée cellulaire par
sélection ou par clonage des cellules possédant des propriétés ou des marqueurs
spécifiques.

Clone cellulaire : c’est une population de cellules dérivant d’une seule cellule par division.

3
 I) Méthodes de culture

Il y a deux types de cellules à distinguer :

 Cellules libres (circulantes) : ce sont les cellules du sang, exsudats, ascites et lymphe.

 Cellules en cohésion (en tissus).

Cette différence entre les deux types de cellules nécessite l’utilisation de méthodes
d’obtention différentes :

A) Méthodes d’obtention :

Pour les cellules circulantes, elles sont obtenues par les méthodes de prélèvement
habituelles (centrifugation…).

Pour les cellules organisées en tissus, leur isolement fera appel soit aux méthodes de
dissection soit aux méthodes enzymatiques.

1. Les cellules circulantes : ex. préparation des lymphocytes T.

Protocole : sang + anti coagulant (héparine, EDTA) + glycérol ou dextran (accélération de

la sédimentation des hématies). Prélèvement des GB puis leur dépôt sur une colonne en
laine de nylon (elle élue sélectivement les lymphocytes T) + chlorure d’ammonium
(NH4Cl) 0,83% (lyse des GR contaminés). En suite, centrifugation et lavage par un tampon
physiologique (PH = 7), on aura alors les lym-T. On ajoute PHA ou Concanavaline + agent
mitogène (car les LT ne se multiplient pas tout seuls) + milieu de culture.

Pour éviter de passer par ces étapes, on peut mélanger le sang avec du Ficoll et on
centrifuge, il y aura formation d’un anneau de lymphocytes qui seront ensuite récupérées
par une chromatographie d’affinité (greffage d’un ligand : Ac. Monoclonal anti-CD3).

4
 Préparation des PBL

Centrifugation 12.000 rpm

pdt 10 min
Décantation Récupérer le plasma
+ 4°C
Procéder aux dosages
ou congeler à -45°C

Prélèvement sanguin

+ Dilution du culot dans +

du RPMI ou PBS (V/V)
Verser délicatement
le sang dilué sur le
Ficoll Hypaque
d=1119 à raison de :
Sérum 3ml Ficoll/5ml sang
PBL Centrifugation
Ficoll
Prélever l’anneau de PBL et GR+PN
procéder à un lavage par PBS-NH4Cl 2800 rpm/10 min

Agitation

Centrifugation
Refaire 2 autres lavages Le culot cellulaire est suspendu dans
du culot avec du PBS un volume minimum de RPMI-1640

1500 rpm/10 min

Test de viabilité
Prélever 25µl de la Le reste de la
Incuber 5 minutes suspension + 15µl suspension est
à T° ambiante Bleu de Trypan (0,2%) soumis à une
congélation
progressive

Comptage sur cellule Malassez

La cellule de Malassez comporte 100 champs,

chacun composé de 20 petits carreaux. Le
volume total des 100 champs est de 1µl.

Donc : Moyenne (5 champs)x105 =[Link]/ml)

Les cellules organisées en tissu : il existe 2 méthodes d’obtention :

1) La dissection : 3 types de méthodes peuvent être utilisés :

 Méthode de Carrel : consiste à prélever un morceau du tissu réduit en un très petit

rectangle, ceci étant fait, ce morceau sera déposé avec 2 gouttes de plasma de coq + 2

5
gouttes d’extrait embryonnaire. Après 24h d’incubation, on observera la migration des 1 ères
cellules appartenant à l’explant.

 Dissection proprement dite : dans ce cas le tissu est coupé en fragments de 1 à 4

mm2 de surface, ces fragments seront encore réduits avec une pince puis placés
dans un flacon de culture contenant le milieu nutritif. Après incubation, les
cellules vont migrer à partir des différents fragments.

N.B : il est nécessaire de mettre les explants dans un récipient ne contenant

qu’un très faible volume de milieu (afin d’éviter le phénomène de flottaison des explants),
en effet ce phénomène conduirait à l’incapacité de la migration cellulaire à partir des
explants isolés. Après quelques heures, quand l’explant a suffisamment adhéré au support,
une quantité convenable de milieu est ajoutée.

 Méthode de Jensen : dans ce cas, les fragments de tissu sont réduits à 1mm2 de
surface et alors placés sur un disque de papier filtre qui repose lui-même sur un support
métallique dans une boite de Pétri. La migration se fera sur le disque et le rendement est
très faible.

2) Méthode enzymatique : on utilise des enzymes protéolytiques qui digèrent la trame

protéique qui entoure la cellule. Dans ce cas, c’est la Trypsine qui est la plus couramment
utilisée, son action cellulaire a été apportée par Rous et Jones (1911) et Moscona (1952)
qui a décri en détail le protocole en but de l’obtention de cellules isolées à partir de tissus.

La trypsine brute ou cristallisée doit être utilisée à des concentrations allant de 0,5 à 2,5
g/l en solution de sel de Hanks ou de tampon PBS.

Les techniques utilisant la trypsine sont nombreuses dont celle de Fernandes (1958) qui
a le protocole suivant :

 Dissection du tissu (solution saline + ATB)

 Prétrypsination : (pendant quelques minutes) pour débarrasser le tissu de tous les

éléments sanguins et des cellules mortes.

 Trypsination : sous agitation lente pendant 3 à 5 min dans un récipient spécial.

6
 L’inactivation de la trypsine par plusieurs lavages PBS, puis centrifugation 1500 rpm/5 à
10 min en présence du milieu de culture, puis on ajuste à la concentration voulue. Pour
certains tissus riches en collagène, on utilise la collagénase.

B) Méthodes de culture :

1) Méthode en suspension : le but de la technique est de maintenir les cellules en

suspension, il faut donc éviter l’adhésion au support et l’agrégation cellulaire.
L’élaboration de la technique a débuté en 1933 par Gey qui a réussi à faire croître des
cellules dans des tubes tournants à grande vitesse. Mais la grande vitesse et le choix du
verre ont fait que les cellules restaient fixées au verre ce qui a baissé le rendement.

Des améliorations ont été apportées en 1954 par Earl et al. qui ont changé le paramètre
de la vitesse de rotation des tubes (en le baissant), puis Cherry et ses collaborateurs 1956
ont amélioré la technique en instaurant un système d’agitation composé par des barreaux
magnétiques siliconés, ce système de culture est dit « SPINNER » qui est un appareil
permettant la cytoculture. Cela a permis dans le temps de fabriquer des appareils
d’agitation très perfectionnés qu’on appelle cytoculteurs et qui sont utilisés à l’échelle
industrielle.

Avantages : ils permettent la culture en masse avec le maintien des paramètres suivants :

- Densité cellulaire adéquate.

- Environnement gazeux constant.

- Recueil des milieux de culture usés.

- Renouvellement du milieu de culture.

Remarque : le SPINNER permet la survie des cellules et aussi

l’immortalisation des cellules immunitaires après hybridation avec
une cellule myélomateuse. Les cellules tissulaires ont une durée de vie continue
contrairement aux cellules à potentiel immunitaire.

2) Méthodes de culture stationnaire : correspondent aux cellules organisées en tissu, il

y a 3 systèmes : clos, semi clos et ouvert. Dans les trois cas, la nature du support est très
importante car le principe de ces cultures est basé sur l’affinité des cellules mises en
culture pour le support utilisé. Au début, le verre était très utilisé mais à l’heure actuelle les
matières plastiques traitées ont pris leur place. L’adhésion au support comporte 4 étapes :

 L’adsorption : instauration d’interactions type ionique entre la cellule et le support.

 Le contact.

7
 L’attachement : interaction cellule -cellule et cellule- support.

 L’étalement : au moment de la prolifération.

Cette adhésion des cellules au support nécessite l’intervention de facteurs d’attachement

protéiques (adhésines), exemple : fibronectine, vitronectine et collagène. Ces molécules
sont apportées par le milieu de culture ou secrétées par les cellules elles mêmes.

Ex : les fibroblastes sécrètent du collagène.

La matière plastique utilisée pour la culture cellulaire est traitée par des supports
physiologiques tels que le collagène, fibronectine et protéoglycanes.

Différents récipients utilisés en culture cellulaire :

 Boite Falcon.

 Boite de Pétri.

 Tubes Leighton.

 Microplaques à fonds plats (diamètres variables).

 Microporteurs : ce sont des microbilles en matière plastique traitée recouvertes de

support physiologique et placées dans un tube de type Erlène ce qui présente un gain de
surface. Ces microporteurs sont soumis à une agitation modérée de manière continue et
l’avantage de ces récipients est une augmentation de la surface d’adhésion.

Les systèmes clos (lignées résistantes à l’acidité, à la pression osmotique ….etc.) sont
constitués par des plateaux de différentes formes et tailles et qui son appelés Boites
Falcon. Ces flacons sont placés dans un étuve classique (étuves bactériologiques), le
système étant clos, l’environnement gazeux et le PH sont modifiés rapidement d’où la
nécessité d’apporter du CO2. On notera dans ce cas un appauvrissement progressif en
facteurs nutritifs ce qui engendre une baisse du PH (acidité ↗) d’où la nécessité du
renouvellement du milieu de culture de manière plus fréquente et ce malgré l’utilisation
d’un système tampon (PH constant), le plus utilisé est le HCO3Na.

Ex : lignée amniotique → système clos → étude bactériologique.

Systèmes semi-clos : (lignées non résistantes) les flacons utilisés sont :

- Des boites de Pétri.

- Des microplaques.

- Des boites Falcon mais qui ne sont pas fermées hermétiquement.

8
 Ce système nécessite l’utilisation d’une étuve à CO 2 (incubateur de cultures). Ce
système qui fait appel aux étuves à CO2 est en général utilisé pour la culture cellulaire par
hybridome mais aussi pour les cellules en cohésion. 5% CO2 pour le maintien de PH
constant et de l’intégrité du matériel génétique. C’est le système le plus utilisé.

Systèmes ouverts (système de perfusion) : ils sont applicables pour les cultures de petites
quantités de cellules, ils sont constitués par des chambres de culture et dans ce cas
l’environnement gazeux est intégré dans la chambre. Ces systèmes sont utilisés pour les
études nécessitant une observation au microscope photonique et plus particulièrement en
microcinématographie (filmer ce qui se passe sous le microscope) = (video imaging).

Le système le plus utilisé est le système semi-clos.

Dans le système semi-clos, les boites Falcon et les microplaques sont mises dans des
étuves spéciales (à CO2) où l’atmosphère est régulée avec une arrivée constante d’un
mélange gazeux fréquemment composé de 5% CO2 + 95% d’air et de vapeur d’eau. Dans
ce cas il assure une meilleure régulation de l’environnement gazeux et du PH.

Remarque : le CO2 intervient surtout dans la synthèse des bases puriques et pyrimidiques
et dans la régulation du PH.

3) Méthodes d’entretien des systèmes semi-clos :

 Changement du milieu : le milieu initial étant appauvri, il faut le remplacer par du

milieu frais.

 Le repiquage ou le passage : cette opération consiste à transférer la population cellulaire

d’un flacon de culture dont toute la surface est couverte à d’autres flacons neufs dont la
surface est libre, ce qui nécessite le détachement des cellules de leur support.

9
 II) Besoins nutritifs des cellules en culture

La trypsine doit être utilisée à une concentration de 0,01 à 0,02% préparée dans du
tampon PBS (PH=7,2) qui ne doit pas contenir du Ca2+ ni Mg2+ car en absence de ces
composés, les interactions cellule-cellule et cellule-support sont faibles ce qui facilite le
détachement.

Rôle du milieu de culture : c’est le vecteur des éléments nutritifs et à coté de ça il doit
jouer un rôle dans le maintien des constantes physico-chimiques (PH et osmolarité).

Un milieu de culture doit contenir tous les facteurs responsables du maintien de toutes
les fonctions cellulaires.

Actuellement, les milieux les plus utilisés sont tous synthétiques de composition plus ou
moins complexes alors que les premiers milieux étaient des liquides biologiques comme la
lymphe, le plasma ou les liquides d’ascites.

Un milieu de culture est constitué d’un milieu de base auquel on ajoute une certaine
concentration de sérum de veau fœtal (+ facteur de croissance) afin d’établir un
environnement optimal pour la survie des cellules.

A. Milieux synthétiques :

1) Comment maintenir les constantes biologiques : par apport de :

- Minéraux.

- Substances énergétiques (sucres, acides aminés et acides cétoniques).

- Vitamines.

Constituants minéraux : il y a 7 ions (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, PO42-, Cl- et CO3-). Les
minéraux constituent la base de toute solution saline physiologique (solution de Hanks).

Rôle : - maintien de la pression osmotique.

- Transport membranaire.

- Métabolisme.

Na+, K+, Ca2+, Mg2+ jouent un rôle fondamental dans le maintien des potentiels
membranaires.

Ca2+, Mg2+ → sont des cofacteurs de nombreuse réaction enzymatiques.

10
 → Dans la culture cellulaire : attachement et étalement des cellules sur leur
support.

Certains milieux contiennent des métaux à l’état de traces, ces derniers sont indispensables
à certaines réactions enzymatiques.

Molécules énergétiques :

- D-glucose est utilisé à une concentration physiologique de 1 g/l semblable à celle du

sérum humain sain.

- Autres sources énergétiques :

→ Acides cétoniques : acide α-cetoglutamique, acide pyruvique.

→ Acides aminés : 12 acides aminés (dont 8 essentiels + 4 autres : Lys, Tyr, Arg et His)
+ [Link] (Gln) qui agit comme un facteur limitant.

La biosynthèse des acides aminés ne se fait pas in vitro. Griffith et Put ont montré que
le [Link] était indispensable (cela était fait sur une culture cellulaire de poumon de souris).
Après 120h ils ont remarqué qu’il y avait disparition de [Link] d’où le rôle limitant de
[Link] (qui intervient dans le cycle de Krebs).

Le milieu de culture se compose d’un milieu de base + additifs.

Milieu de base : composé :

 D’acides aminés.

 De sucres (Glc).

 D’ions(en solution saline) pour le maintien du potentiel membranaire et de la pression

osmotique.

 D’oligoéléments (métaux) : sélénium, cadmium et lithium qui sont actuellement intégrés

pour leur rôle dans la dégradation des peroxydes toxiques (détoxification = inhibition du
vieillissement cellulaire) et donc le maintien de l’intégrité génétique et phénotypique des
cellules.

 De vitamines : les besoins en vitamines sont variables en fonction du type cellulaire.

Eagle considère que 8 vitamines sont nécessaires pour un bon milieu de culture (choline,
ac. folique, pyridoxal, riboflavine, thiamine, inositol, ac. nicotinique et l’ac.
Pantothénique).

Additifs : [Link] + sérum de veau fœtal + ATB.

11
 2) Comment maintenir les constantes physico-chimiques :

1. Le PH : doit être identique au PH sanguin mai l’optimum dépend de la lignée

cellulaire. Il faut intégrer au milieu de culture un indicateur de PH (ex : rouge de phénol →
violet (milieu basique), jaune (milieu acide). Donc le virage de la couleur exprime un
changement de PH. Si le milieu devient acide (jaune) donc prolifération des cellules, mais
une observation au microscope est nécessaire pour confirmer cette prolifération et exclure
une éventuelle contamination (trouble) par des microorganismes qui détournent les
nutriments à leur profit.

2. L’environnement gazeux : on utilise des systèmes tampons (HCO3- et Tris),

HCO3- est maintenue en équilibre avec 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée. Donc
le CO2 intervient sur le PH quand le système tampon est HCO3-, mais aussi sur la
prolifération cellulaire par son intervention dans la biosynthèse des bases puriques et
pyrimidiques. La vapeur d’eau prévient l’évaporation et intervient dans l’osmolarité du
milieu.

3. Le sérum : contient des facteurs nécessaires au déclanchement de la division

cellulaire (agents mitogènes : facteurs de croissance, hormones…..)ce qui se traduit par le
développement, la maturation et la fonctionnalité de la cellule. Le pourcentage de sérum
utilisé varie entre 2 et 20% selon le type cellulaire.

Remarque : - milieu de base = milieu de survie.

- sérum = division cellulaire.

Les origines du sérum : (animales) il doit provenir de donneurs jeunes car l’effet co-
stimulant est inversement proportionnel à l’âge du donneur. Les plus fréquemment utilisés
sont :

- Sérum de veau.

- Sérum de veau de nouveau-né.

- Sérum de veau fœtal.

Composition globale d’un sérum : facteur de croissance, vitamines, hormones,

fibronéctine.

On pense que tous ces éléments ont un effet synergique co-stimulant sur la croissance
globale des cellules en culture. Toute fois, la présence de sérum est un facteur limitant. En
effet, les concentrations d’hormones et de facteurs de croissance sont instables dans les
sérums et varient selon les individus. Ces 2 paramètres peuvent engendrer une instabilité
du pouvoir prolifératif attendu par le sérum en déstabilisant la régulation du métabolisme
cellulaire.

12
 Les sérums animaux peuvent être contaminés par des virus ou des champignons. En
effet, ces derniers peuvent perturber le métabolisme des cellules en culture.

Les milieux définis (sans sérums) contiennent :

Milieu de base + facteurs de croissance + hormones (nature et concentration connues) +

protéines de transport (Transferrine Albumine Bovine) + des facteurs d’attachement
(fibronéctine, poly L- Lysine).

B. Les facteurs de croissance : ce sont des molécules polypeptidiques qui contrôlent la

prolifération, la différenciation ou la survie des cellules eucaryotes. Ce sont des signaux
qui participent à toutes les étapes de la physiologie cellulaire depuis l’embryogenèse
jusqu’à la sénescence en incluant la pathologie (cancers).

Selon James (1984), un facteur de croissance doit répondre aux critères suivants :

 La majorité de sa structure doit être de nature polypeptidique.

 Son action sur les cellules cibles pour initier une réponse cellulaire ne s’effectue que si le
facteur de croissance (FC) s’attache sur le récepteur membranaire (RFC) d’où la formation
de complexes spécifiques [FC-RFC]. La formation de ce complexe engendre une réponse
hypertrophique (↗ de la taille cellulaire) et hyperplasique (↗ de la population cellulaire).

 Pour distinguer les FC des hormones on se base sur leur nature et leur mode de
production (FC : endo, auto et paracrine. Hormones : endocrines), tandis que pour
différencier les FC des cytokines, il faut noter que les cytokines sont synthétisées de
manière INDUCTIVE alors que les FC sont produits de manière CONSTITUTIVE.

Les principaux facteurs de croissance caractérisés jusqu’à ce jour :

EGF : (epidermal growth factor) (Cohen 1959). L’EGF est mitogène pour les cellules
épithéliales et épidermiques in vivo et in vitro. Il a été caractérisé à partir de la glande sous-
maxillaire et à partir d’urine humaine. C’est un polypeptide de 53 aa dont le pH i = 4,5.

IGF : (insuline-like growth factor). Il a des effets similaires à l’insuline sur les tissus
adipeux in vivo et in vitro. Il est non neutralisable par les anticorps anti-insuline. Son
activité spécifique est 60 fois plus faible que celle de l’insuline, il a une activité mitogène
sur les fibroblastes. Il existe 2 sous types (IGF1 et IGF2) faisant chacun 5800 Da et dont le
pHi est basique, ils ont une homologie de séquence de 70%.

NGF : (nerve growth factor). C’est un facteur qui augmente la survie et la différenciation
des cellules gliales sensorielles embryonnaires. Le NGF a été isolé à partir des glandes
sous-maxillaires de souris adultes mâles et de différents venins de serpents.

C’est un complexe formé de 3 molécules distinctes (α, β, γ) dont le PM=140000 Da, ce

complexe est favorisé à pH neutre et il est modulé positivement par les atomes de zinc
(Zn).
13
PDGF : (platelet derived growth factor). Isolé à partir des plaquettes, c’est une
glycoprotéine de 27 000 < PM < 31 000, pHi = 9,7 et de structure dimérique. Plusieurs
types cellulaires expriment le récepteur du PDGF et les récepteurs qui possèdent une
activité tyrosine kinase.

TGF : (platelet derived growth factor). C’est un facteur de croissance transformant présent
en 2 sous types :

- TGFα isolé d’une lignée métastasique de mélanome humain. C’est un polypeptide de 68

aa et présentant 30% d’homologie avec l’EGF. Son récepteur a été caractérisé comme étant
un monomère de 60 kDa.

- TGFβ isolé de plusieurs tissus d’origine normale ou néoplasique, son 23 < PM < 25 kDa
et constitué de 2 chaînes (dimérique).

Dans les 2 cas, les TGF α et β sont capables de conférer un phénotype transformé aux
fibroblastes normaux de rat. A travers cette propriété du TGF, on a pu mettre en évidence
une lignée cellulaire NRK (sous l’action des 2 TGF).

Le TGF β a un rôle d’inhibition de la prolifération cellulaire et on l’identifie dans ce cas

au TIF (tumor inhibition factor) ou facteur d’inhibition des tumeurs. Ceci a été montré
dans les cellules tumorales du cartilage.

FGF : (fibroblast growth factor). Il stimule in vitro la croissance des cellules d’origine
mésodermique, ectodermique, épithéliale et les myoblastes. Il a une affinité assez étroite
pour l’héparine. Le récepteur membranaire du FGF a été partiellement caractérisé sur les
cellules de rein d’hamster. Ceci a permis de mettre en évidence 2 types de récepteurs de
FGF différents sur le plan de la taille (145 000 et 125 000).

Modulation de l’activité des FC par les facteurs de l’environnement cellulaire :

L’activité des FC sur les cellules dépend de l’accessibilité des récepteurs et de la

capacité des mécanismes de transduction du signal initié par les FC.

Les mêmes cellules placées sur des supports différents peuvent répondre de manière
différente aux facteurs de croissance, cela est dû à l’engagement des récepteurs dans
d’autres interactions (avec le support).

Un facteur de croissance peut jouer le rôle d’inhibiteur pour un autre FC. On a observé
que le PDGF régulait négativement les récepteurs de l’EGF (régulation post
transcriptionnelle). Donc il est indispensable de connaître les interactions possibles entre 2
FC mis ensemble dans un même milieu de culture. Dans certains cas on a montré que
l’EGF régulait négativement son propre récepteur.

14
Conclusion : on dira que la stabilité des facteurs de croissance dans un milieu de culture
détermine leur efficacité d’action.

15
 III) Contrôles fonctionnels des cellules en culture

L’objectif de la culture cellulaire est de produire des cellules par prolifération et de

préserver leurs fonctions spécialisées. Nous devons donc prendre en considération les
critères suivants afin d’assurer la bonne marche de la culture :

1) Le contrôle de mise en route :

 Il faut assurer les conditions d’asepsie du travail de dissection en ajoutant la quantité

adéquate d’ATB dans la solution de rinçage.

 Il faut effectuer un test de viabilité (bleu de Trypan) pour déterminer l’état de départ des
cellules. Si on est en présence de quelques cellules mortes, il est nécessaire de les éliminer
par centrifugation. Le % de viabilité nécessaire pour démarrer une culture doit être > 90%.

 Comparer la croissance des cellules en fonction des types de supports utilisés et en

choisissant le plus rentable.

 Vérifier la morphologie des cellules soit par observation au microscope inversé (dans
certains cas on a recours au microscope électronique) soit à l’immunofluorescence dirigées
contres les marqueurs phénotypiques (CD4, CD3 …etc.).

2) Le contrôle de routine : effectués quand la culture est en route. Son objectif est d’établir
des conditions pour le maintien en vie des cellules en culture, il repose sur le changement
de milieu. La fréquence de changement de milieu dépend des cellules et ne doit jamais
excéder 5 jours. Le renouvellement du milieu doit se faire même quand les cellules ne sont
plus en phase de prolifération car elles continuent à métaboliser des molécules.

3) Quand et comment faut-il changer le milieu : le paramètre à contrôler est le pH (les

cellules vivantes exigent un pH neutre). A pH < 6,5, la viabilité des cellules est menacée.

La modification du pH est indiquée par des indicateurs que contiennent les milieux de
culture. La forte concentration des cellules tend à l’acidification du pH du milieu. Le
contrôle de l’état de confluence des cellules doit être effectué tous les 2 jours.

On peut observer des modification morphologiques qui traduisent des changements en

constantes physico-chimiques (ex : pH). C’est l’état de souffrance.

Deux paramètres sont à prendre en considération :

- Vacuolisation des cellules.

- Granules autour du noyau.

16
 IV) Contrôle de contamination des cultures cellulaires

La baisse du pH + l’opacification du milieu de culture traduisent une contamination

d’ordre bactériologique ou fongique. La contamination par les mycoplasmes est difficile à
détecter, la suspicion a lieu lors des modifications de l’aspect du milieu et de la
morphologie cellulaire. Néanmoins, la confirmation de ces contaminations fait appel à
plusieurs techniques.

1) Origine des contaminations : la contamination peut venir de l’air, de l’eau, des

mains, du matériel, du milieu, du sérum ou des cellules elles mêmes.

L’addition d’ATB peut entraîner également une sélection des microorganismes

résistants ce qui peut engendrer des infections latentes et évolutives. Ces microorganismes
peuvent survivre longtemps avant d’être détectés, d’où la nécessité d’alterner entre les
différents ATB pour éviter les mutations.

Le sérum de veau fœtal est une source majeure de contamination.

Les mycoplasmes sont les germes les plus représentatifs dans la contamination des
cultures cellulaires.

Le 1er geste à faire pour détecter une contamination est l’ensemencement et l’incubation
(virage + opacification).

Pour les mycoplasmes il existe 2 voies de détection :

a) Voie directe : Cette détection peut se faire par PCR en amplifiant spécifiquement le
matériel génétique des mycoplasmes. Une PCR positive serait le reflet de la présence des
mycoplasmes.

b) Voie indirecte : on utilise l’hôte eucaryote des mycoplasmes (la lignée fibroblastique
3T6). Cette lignée est utilisée comme cellule indicatrice à cause de sa grande sensibilité à
la prolifération des mycoplasmes. On incube la lignée durant 24h puis on ajoute le milieu
suspicieux, s’il y a contamination par les mycoplasmes, il y aura formation d’agrégations
cellulaires formant des colonies (UFC : unités formant colonies). C’est une méthode
quantitative.

17
 Une autre méthode indirecte porte sur la coloration de l’ADN à l’aide de substances
fluorescentes (fluorochromes) telles que le DAPI (diamidine phényle indole). Les cellules
non infectées présentent une fluorescence du noyau, par contre si elles sont infectées, on
aura une fluorescence extra nucléaire traduisant la présence de mycoplasmes.

2) Conséquences de la présence des mycoplasmes :

 La viabilité des cellules est menacée.

 Effet sur le titre des virus (variation due à la contamination).

 Effet sur le niveau d’interférons (par rapport à l’agent inducteur utilisé).

 Aberrations chromosomiques.

 Mitogenèse (parasite) des lymphocytes en plus de celle induite par les agents mitogènes
utilisés.

18
 Conservation des cellules

Intérêt :

- Constitution d’une réserve

- Protection des cellules contre : les modifications de leur patrimoine génétique,

vieillissement in vitro, contaminations

La conservation doit être de longue durée. Pour cela, la température instaurée doit
être la lus basse possible.

La cryoconservation :
Elle se fait à – 180°C sous azote liquide. Le matériel nécessaire :

Matériel de conditionnement : il doit être étanche :

- Ampoule ou cryo-tubes en polypropylène

Deux containers de différentes capacités :

- Un container d’alimentation en azote liquide

- Un container de stockage

Réactifs :

- Azote liquide : source de froid

- -cryo-protecteurs : ceux qui sont utilisés sont le DMSO (Di-Méthyl SulfOxyde) et le

glycérol. Leur efficacité est sensiblement différente :

Le premier est plus cryo-protecteur mais plus cytotoxique

Le deuxième est moins cytotoxique et moins cryo-protecteur

Méthode de congélation :

Elle doit être progressive et non brutale.

1) Déterminer la viabilité de la population cellulaire.

19
 Attendre la fin de la phase exponentielle de croissance pour entamer la
conservation.

2) Centrifuger afin d’éliminer toute trace d’enzymes utilisée pour le détachement

3) Bien disperser les cellules dans leur milieu de culture à une densité de 106-107
cellules/ml. Ajouter 5 à 10% d’agent cryo-protecteur.

4) Maintenir toujours la suspension tout en répartissant les cellules dans les cryotubes
qui doivent porter les caractéristiques suivantes :

- Type cellulaire

- Nombre de passage ou étape de la culture

- Date de la congélation

5) Remplacer l’air par un mélange d’air contenant 5% de CO 2 et les cryotubes sont

fermés

6) Procéder à un abaissement progressif de la température : +4°C---> -29°C- -70°C- -

100°C.

A cette température, les cellules sont transférées rapidement dans l’azote liquide à
une température de -180°C.

Cette méthode est très efficace. Elle permet la conservation des cellules et de leurs
fonctions pendant de nombreuses années. En effet, il a été montré que si on abaisse
la température au delà de -180°C, la viabilité peut être altérée.

La décongélation :

Contrairement à la congélation, la décongélation doit être rapide. Le principe

consiste à placer l’ampoule ou le tube à 37°C pendant 1min jusqu’à décongélation
complète.

 Stérilisation du tube

 Transfert de la suspension cellulaire dans un tube contenant du milieu de culture

approprié.

 Dispersion

 centrifugation pour éliminer les traces d’agents cryo-protecteurs

20
 le culot est alors remis en suspension dans le milieu de culture et les cellules sont
placées dans un flacon de culture de 25 cm² à 37°C (95% d’air, 5% CO 2)

A ce stade, il est impératif de suivre l’évolution de la culture, surtout son adhérence

au support toute les deux à quatre heures.

Le milieu de culture est remplacé après 24 heures.

Remarque:

 Un test de viabilité est effectué systématiquement

 Le démarrage après décongélation nécessite une plus grande quantité de sérum qu’au
cours de la culture.

Incidences dues à une mauvaise congélation ou décongélation :

 Formation de cristaux de glace intracellulaires

 Variation de la pression osmotique

 Diminution du rendement

 Déviation des activités métaboliques du lot congelé qui ne sera pas représentatif
du type cellulaire à étudier.

21
 Transport cellulaire

Ce transport est fréquent car il est pratique lors :

- Des échanges entre laboratoires

- Lors de la fourniture d’une souche par une banque spécialisée

Le transport en flacon de culture est plus sur que le transport en cryotubes car on
évite:

- les incidents lors du transport

- l’étape de congélation

- gain de temps

Transport en flacon de culture :

C’est une pratique très courante en dépit des écarts de température (lors du
transport). Le conditionnement plastique est plus sur.

On utilise des boites Falcon de 25cm² de volume contenant la culture adhérente. Les
boites avec les cellules sont remplies de milieu de culture afin d’éviter le maximum
de détachement cellulaire dû à l’agitation.

A la suite du transport, il est nécessaire de procéder à la réadaptation de la culture.

Elle consiste à replacer les cellules dans leur environnement adéquat :

- Quantité de milieu

- Température, CO2, vapeur d’eau

22