Milieux de culture et

Techniques d’ensemencement

Introduction
Avec la découverte des milieux de culture, on est passé du
simple examen microscopique à l’isolement des bactéries sur
des milieux permettant leur croissance et par la suite leur
identification biochimique et enfin l’étude de leur
sensibilité aux antibiotiques.

Définition et composition d’un

milieu de culture
Les milieux de culture utilisés en bactériologie sont des
milieux contenant les éléments nécessaires et en quantité
suffisante à la survie et à la multiplication des bactéries,
ils doivent par ailleurs posséder les propriétés physico-
chimiques convenant à une culture optimale (pH, Isotonie,
Potentiel d’oxydoréduction).

La composition d’un milieu de culture varie, elle est choisie

en fonction du but à atteindre et des besoins requis par la
bactérie, un milieu minimum doit comporter obligatoirement :

Une source d’eau (eau distillée).

Une source de carbone ou l’énergie (Glucose).
Une source d’azote et soufre.
Une source de potassium (K) et phosphore (P).
Une source de calcium (Ca) et magnésium (Mg).
Une source d’oligo-éléments (sels de cuivres de zinc, de
cobalt…etc.).
Un tampon pH pour maintenir la neutralité du milieu
Les facteurs de croissance et des Vitamines peuvent être
 rajoutés aux bactéries autotrophes.

Classification des milieux de

culture
Il existe différentes classifications des milieux de culture :

Classification selon la composition

a- Milieu complexe empirique (naturel) :

La composition de ce milieu n’est pas bien définie, c’est le

milieu naturel de la bactérie.

On retrouve des extraits de viande, des extraits de levure,

les peptones. Exemple : Milieu cœur cervelle BHIB (Brain Heart
Infusion Broth).

b- Milieu semi-synthétique :

Au milieu complexe sont rajoutées des substances chimiques

bien définit, ceci concerne les produits ayant un intérêt pour
la bactérie, comme les facteurs de croissance, Exemple :
Gélose enrichie au sang de mouton.

c- Milieu synthétique :

La composition est parfaitement définie tant en quantité qu’en

qualité,

Ce sont des milieux utilisés dans la mise en évidence d’une

réaction enzymatique précise, Exemple : Milieu de Ferguson.

Classification selon la consistance

a- Milieu liquide :

Exemple : Milieu de Clark et Lubs, Bouillon d’enrichissement.

b- Milieu solide ou gélosé :

C’est un milieu liquide solidifié par addition d’Agar à une
concentration de 1 à 1.7%

Agar : Substance extraite d’algues marines et qui possède la

propriété de fixer une grande quantité d’eau d’où la
gélification.

Exemple : Milieu de Chapman, TSI.

c- Milieu semi-liquide, semi-solide, ou faiblement gélosé :

La concentration en Agar est plus faible que celle du milieu

gélosé, elle est comprise entre 0,05- 0,075%

Exemple : Milieu Mannitol mobilité, MEVAG.

Classification selon l’utilisation

a- Milieux usuels ou de base :

Permettent la culture de bactéries non exigeantes

Exemple : Gélose nutritive et bouillon nutritif.

b- Milieux enrichis :

Contiennent les composants indispensables aux bactéries, mais

qu’elles ne peuvent synthétiser, on parle de bactéries
exigeantes.

Exemple : Gélose au sang simple, ou additionnée aux vitamines.

c- Milieux d’enrichissement :

Permettent de favoriser une croissance bactérienne à partir du

prélèvement paucibacillaire

Il s’agit de milieux liquides riches permettant le

développement d’un maximum de bactéries.

Exemple : Bouillon pour hémoculture, BGT (Bouillon Glucosé

Tamponné).
d- Milieux sélectifs :

Permettent la pousse d’un seul type bactérien, pour cela on

utilise des inhibiteurs pour réprimer les autres genres, ex :
Gélose Hektoen qui permet la culture des BGN, bacilles Gram
négatifs non exigeants, la gélose contient la bile inhibitrice
des BGP.

e- Milieux électifs :

Permet la pousse favorable d’un genre bactérien par rapport

aux autres sans leur destruction,

Exemple : Eau peptonée alcaline (EPA), dont l’alcalinité

favorise la pousse du vibrio (germe responsable du choléra)
(préfère un milieu alcalin).

f- Milieux d’identification :

Permettent l’étude du métabolisme biochimique des bactéries,

Exemple : TSI (Tri Sugar Iron.), Milieu de Ferguson.

g- Milieux de conservation :

Selon leur composition, on peut conserver aussi bien les

bactéries non exigeantes que les bactéries exigeantes :

-Pour les non exigeantes, on utilise un milieu solide qui est

une gélose profonde en capillaires que l’on conserve à
température ambiante.

-Pour les bactéries exigeantes, on utilise un milieu liquide

qui est du BGT + Glycérol que l’on congèle à -80°C.

h- Milieux de transport :

Il existe plusieurs types en fonction de la bactérie à

transporter et de sa fragilité,

Exemple : TGV (milieu de transport de germes vivants)

Milieu au charbon pour les bactéries fragiles.

i- Milieux pour antibiogramme :

Exemple : Mueller Hinton simple ou enrichi au sang,

Dont la composition est proche de celle des liquides

biologiques, de ce faite l’activité des antibiotiques in vivo
est comparable à celle obtenue in vitro après diffusion sur la
gélose.

j- Milieux chromogènes ou milieux différentiels :

Permettent l’identification directe de certaines espèces

bactériennes sans avoir recourt à une galerie biochimique ou
l’orientation vers certains groupes bactériens, la gélose
renferme des substrats incolores dont la dégradation par les
enzymes respectives apportées par des bactéries conduit à des
colonies colorées.

Exemple : Milieu uriselect (BioMérieux), qui contient de

l’urée comme substrat pour l’uréase (enzyme apportée par le
proteus)

Remarque : Ces milieux peuvent également détecter certains

mécanismes de résistance aux antibiotiques en renfermant dans
leur composition un antibiotique spécifique du mécanisme
recherché à une concentration supérieure à la concentration
minimale inhibitrice (Cantibiotique > Cmin inhibitrice ).

Exemple : bêta-Lactamase à spectre élargi (BLSE) ou encore

Staphylococcus aureus résistant à la Méticilline (MRSA).

Classification selon le mode de

stérilisation
Il existe 02 types de milieux :

-Milieux autoclavables : milieu de culture dont les composants

ne sont pas détruits par la chaleur,

Exemple : milieu gélose nutritive, Mueller Hinton en flacons.

-Milieux non autoclavables : Milieux de culture qui

contiennent des produits labiles pouvant être détruit par la
chaleur,

Exemple : Loweinstein-Jensen (cultiver les mycobactéries ->

Tuberculose).

Présentation des milieux de culture

1)-Les milieux déshydratés :

C’est une poudre conditionnée en boites de 250 ou 500g.

2)-Les milieux solides :

Gélose en flacons
Gélose en boites de pétri
Gélose en tube incliné, ex : Citrate de Simmons.
Gélose en culot et pente inclinée, ex : TSI
Gélose profonde, ex : MEVAG
Gélose profonde en capillaire, ex : VF (viande foie) ou
milieu de conservation.

3)-Les milieux liquides :

Milieux liquides en flacons, ex : Bouillon

d’hémoculture.
Milieux liquides en tubes, ex : BGT.
Milieux liquides en ampoules, ex : AA (acides aminés).

Techniques de préparation des

milieux de culture :
La préparation d’un milieu de culture peut se faire soit à
partir d’une poudre lyophilisée, soit directement à partir
d’une gélose de base en flacons que l’on peut couler telle
quelle, ou l’enrichir en facteurs de croissance avant de la
conditionner en boites de pétri.

Milieu déshydraté
Peser la quantité adéquate de poudre du milieu à préparer, et
la diluer dans de l’eau distillée stérile dans une fiole
jaugée.

Conditionner le mélange liquide en flacons en verre stérile

ensuite les fermer afin de les autoclaver.

Après le cycle de stérilisation, le milieu liquide est coulé

en boites de pétri sur une hauteur de 4mm et laisser
solidifier sur paillasse, l’ajout de facteurs de croissance
(sang et complexe multivitaminé) au milieu de base doit se
faire après le cycle de stérilisation dans des conditions
d’asepsie rigoureuses.

Milieu gélosé en flacons

Mettre le flacon de gélose, ex : gélose nutritive ou Columbia,
dans un bain-marie bouillant (100°C) jusqu’à fusion complète.

Laisser refroidir le flacon à l’air libre ou sous un robinet

d’eau froide,

Couler dans des boites de pétri de 90mm de diamètre, sur une

hauteur (épaisseur) toujours de 4mm.

Laisser solidifier la gélose

Conserver les boites à 4°C en les mettant en réfrigérateur.

(!) – Si le milieu préparé doit être enrichi en sang, on peut

utiliser du sang (de mouton ou de cheval) selon les étapes
suivantes :

Faire fondre la gélose au bain-marie bouillante ex : Gélose

nutritive ou Columbia ou Muller Hinton (antibiogramme)

Laisser refroidir à 45°C à l’air libre dans un bain-marie

réglable.

Additionner 12,5 ml de sang dans le flacon de 250 ml de

gélose.

Homogénéiser délicatement jusqu’à obtention d’une couleur

rouge sang pour une GSF.

Sinon il faut remettre le flacon dans le bain-marie en

surveillant le virage de la couleur rouge vers le marron
chocolat (GSC) ensuite

Couler en boite de pétri comme précédemment

Laisser solidifier la gélose

Conserver à +4°C.

Contrôle de qualité des milieux de

culture
C’est une étape réalisée juste après la préparation des
milieux de culture. Avant de les conserver au réfrigérateur à
+4°C il faut réaliser 02 tests :

Test de stérilité : incuber les boites dans une étuve à 35°C

pendant 18 à 24h, même haut de là, l’absence de culture
bactérienne valide le test

Test de fertilité : Ensemencer sur les milieux préparés une

souche qui croit habituellement (souche de contrôle) et
incuber pendant 18 à 24h il ne faut pas dépasser ce délai
(sinon le milieu ne sera pas bon), à 35°C une culture positive
de cette même souche valide le test.
Ensemencement et techniques
d’ensemencement

Figure 1. Schéma : 1ere variante : But : 4e quadrant :

Distinguer les colonies en appréciant leur aspect. (1),
(2)=Stries très serrées → (Incubation) → (3), (4)= aérées.

L’ensemencement doit être effectué dans des conditions

d’asepsie rigoureuses à partir d’un prélèvement d’une colonie
ou d’un bouillon bactérien avec une anse de platine ou une
pipette de pasteur, peut être réalisé sur un milieu liquide ou
solide.

Ensemencement sur un milieu solide

a)-Milieu en boite de pétri :

Il existe plusieurs techniques d’ensemencement sur boites :

1er Isolement ou épuisement :

-C’est la technique des 4 quadrants qui consiste à disperser

le microorganisme à la surface d’un milieu solide afin
d’obtenir des colonies séparées, ainsi permet de retrouver
tous les microorganismes d’un mélange, mais aussi de vérifier
la pureté d’une souche bactérienne.

Technique :

Sur boite de pétri préalablement séchée sur laquelle on a

dessiné des quadrants, déposer le produit à analyser sur le 1er

quadrant, réaliser des stries très serrées ensuite passer au 2e

sans toucher le 1 er , ou stériliser la pipette ou l’anse et

reprendre du 1 er quadrant, les stries doivent être toujours

serrées ensuite passer au 3e et au 4e quadrant en desserrant

légèrement les stries, la culture se traduit par des colonies
sur les stries.

-Sur ce milieu, on pourra définir l’aspect des colonies, mais

aussi la présence ou non de l’hémolyse complète ou incomplète
lorsqu’il s’agit d’une GSF.

Figure 2. 2e variante d’ensemencement

2ème-Beurrage :

-Technique d’écouvillonnage qui consiste à réaliser un

ensemencement très riche (pour les bactéries exigeantes et
fragiles).

3ème-Antibiogramme :
-à partir d’une suspension bactérienne d’une opacité ou
densité optique bien définie, on réalise des stries serrées à
l’aide d’un écouvillon.

4ème-Dénombrement :

-Ensemencement par étalement au râteau d’un volume connu d’une

suspension bactérienne.

b)-Milieu incliné en pente :

Ensemencer toujours du bas en haut par des stries serrées,

Résultat : la culture se traduit par apparition de colonies ou

virage de la couleur de l’indicateur pH.

c)-Milieu en culot :

Ensemencement par piqure centrale, même résultat

d)-Milieu en culot + pente :

Commencer par ensemencer la pente par des stries serrées

ensuite culot par piqûre centrale, même résultat.

e)-Milieu d’ensemencement en masse :

Se réalise en tube ou en boite, consiste à déposer le produit

à analyser (eau ou nutriments) et rajouter la gélose dessus
refroidie à 45°C, laisser se solidifier et incuber.

Technique surtout utilisée en bactériologie alimentaire et

contrôle des eaux, le lendemain il y aura apparition des
colonies lenticulaires à l’intérieure de la gélose

Ensemencement sur milieu liquide

On peut ensemencer un milieu liquide :

-soit à partir d’un produit liquide, on met quelques gouttes

dans le milieu à ensemencer avec pipette de pasteur,
-soit à partir d’un produit solide, écraser la colonie
prélevée à l’aide d’une anse de platine ou pipette de pasteur
sur la paroi du tube, pour obtenir une suspension homogène.

Culture cellulaire
Certaines bactéries sont à multiplication intracellulaire et
nécessitent pour leur culture des milieux à base de cellules
dans lesquelles on rajoute des facteurs de croissance et
indicateurs de pH, ensuite on injecte la bactérie qui va se
multiplier dans les cellules et la croissance bactérienne est
mise en évidence par des techniques colorimétrique ou
immunologique,

Exemple : MGG ou immunologique avec des Anticorps monoclonaux

marqués par une enzyme ou immunofluorescence ex : Chlamydia.