oir

Savfaire

oir
Savfaire
Les marqueurs génétiques sont largement utilisés aujourd’hui pour estimer
le polymorphisme et prédire l’évolution des populations végétales. Au cours
de ces dernières années, l’avancée dans la connaissance du génome
des plantes a favorisé le développement de marqueurs moléculaires ciblant
une région de l’un des génomes - nucléaire, chloroplastique et mitochondrial.
Le développement de la génomique donne ainsi accès aux gènes contrôlant
des caractères adaptatifs, particulièrement importants
pour la gestion des ressources génétiques.
Si les arbres forestiers servent ici à illustrer les questions relatives
à la gestion des ressources génétiques en raison de leur importante
Analyse du génome
diversité et des menaces qui pèsent sur cette dernière, cet ouvrage
est d’intérêt beaucoup plus général et concerne aussi la génomique
et la génétique végétales.
et gestion des ressources
génétiques forestières

des ressources génétiques forestières

Les principales méthodes d’analyse du génome sont décrites,
ainsi que la plupart des marqueurs moléculaires et leurs caractéristiques :

Analyse du génome et gestion

région du génome ciblée, hérédité, reproductibilité. En fonction des objectifs,
des marqueurs sont proposés et leur utilisation discutée.
D. Prat, P. Faivre Rampant et E. Prado
Daniel Prat, professeur à l’université Claude-Bernard Lyon I où il utilise les outils
moléculaires pour retracer l’évolution des plantes, a mené des recherches à l’Inra
à l’aide de marqueurs génétiques dans le cadre de l’amélioration des arbres forestiers.
Patricia Faivre Rampant, chercheuse à l’Inra d’Évry, développe des outils d’analyse
du génome chez une espèce forestière modèle, le peuplier.
Emilce Prado, ingénieur à l’Inra de Colmar, a effectué divers travaux mettant en œuvre
des marqueurs génétiques chez des arbres forestiers.

En couverture : sous-bois sur la commune de Vignol (Nièvre), cliché Alain Fraval,

photothèque Inra ; représentation schématique de chromosomes après hybridation in situ ;
polymorphisme nucléotidique d’un gène ; polymorphisme entre individus d’un locus
microsatellite.

[Link]

Prix TTC : 59 €

ISBN 2-7380-1227-2
ISSN (en cours)
Réf. 01541
 Analyse du génome
et gestion des ressources
génétiques forestières

D. Prat, P. Faivre Rampant

et E. Prado

INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE

147, rue de l’Université, 75007 Paris
 Table des matières

L'évaluation des ressources génétiques : l'analyse du polymorphisme 1

Conservation des ressources génétiques forestières ................................ 1
Classification des arbres forestiers ......................................................... 4
Organisation des génomes des arbres forestiers ..................................... 6
Le génome nucléaire .............................................................................. 8
■ Caryotype et ploïdie ........................................................................... 10
■ Taille du génome ................................................................................ 12
■ Organisation et expression d'un gène ................................................. 12
■ Familles de gènes ................................................................................ 15
■ ADN répété ....................................................................................... 20
Le génome chloroplastique ................................................................... 25
Le génome mitochondrial ..................................................................... 32
L'évolution des génomes ....................................................................... 35
Variabilité génétique des arbres forestiers .............................................. 43
Ampleur de la variabilité ....................................................................... 43
Évolution de la variabilité au cours des générations ............................... 44
Flux de gènes ........................................................................................ 46
L'intérêt des marqueurs génétiques ....................................................... 47
Informations attendues des marqueurs .................................................. 47
Paramètres décrivant la variabilité génétique ......................................... 49
■ Structure intrapopulation ................................................................... 50
Paramètres de diversité ............................................................................ 50
Déséquilibre de liaison ............................................................................ 52
Régime de reproduction ........................................................................... 53
Structure spatiale ................................................................................... 55
Taille de population ............................................................................... 55
■ Structure interpopulation ................................................................... 56
Différenciation entre sous-populations ........................................................ 56
Flux géniques ........................................................................................ 60
Distances génétiques ............................................................................... 61
Phylogéographie ..................................................................................... 66
Relations entre marqueurs génétiques et caractères quantitatifs ............. 67
■ Carte génétique .................................................................................. 67

III
 ANALYSE DU GÉNOME ET GESTION DES RESSOURCES GÉNÉTIQUES FORESTIÈRES

■ Localisation des gènes majeurs ............................................................ 69

Les outils d’analyse .................................................................................. . 73

Les marqueurs génétiques ............................................................................. . 73
Principes et généralités ........................................................................... 73
Marqueurs morphologiques ................................................................... 74
Marqueurs biochimiques ........................................................................ 75
■ Produits du métabolisme secondaire .................................................... 75
■ Isoenzymes .......................................................................................... 76
■ Protéines totales .................................................................................. 77
Marqueurs moléculaires ......................................................................... 81
■ Mise en évidence du polymorphisme .................................................. 81
Restriction par des endonucléases ........................................................... 82
Hybridation ......................................................................................... 84
Amplification génique........................................................................... 85
Structure de l’ADN .............................................................................. 87
Séquence d’ADN .................................................................................. 90
■ Description des marqueurs moléculaires ............................................. . 92
RFLP .................................................................................................. 92
Marqueurs dérivés de la PCR ................................................................ 95
AFLPTM et techniques dérivées .............................................................. 113
Marqueurs semi-spécifiques ................................................................... 116
Autres marqueurs ................................................................................. 117
■ Marqueurs moléculaires de séquences exprimées ................................. 118
■ Polymorphisme de nucléotide unique (SNP)....................................... 121
Reproductibilité ..................................................................................... 124
■ Effet du prélèvement ou du tissu analysé ............................................. 124
■ Difficultés techniques .......................................................................... 125
■ Transfert entre laboratoires .................................................................. 128
Hérédité ................................................................................................. 129
■ Marqueurs du génome nucléaire ......................................................... 129
Déterminisme génétique........................................................................ 129
Dominance .......................................................................................... 133
■ Marqueurs des génomes cytoplasmiques .............................................. 135
Automatisation et analyses ..................................................................... 139
■ Extraction et électrophorèse ................................................................ 140
■ Lecture de gels : analyse d’images ........................................................ 144
■ Puces à ADN ...................................................................................... 146
Principe ............................................................................................... 146
Applications ......................................................................................... 148
■ Programmes d’analyse de la diversité ................................................... 151
Diversité et structure génétique .............................................................. 152

IV
 Les outils d’analyse

Taille de population .............................................................................. 157

Régime de reproduction......................................................................... 157
Simulation .......................................................................................... 158
Phylogénie ........................................................................................... 158
Cartographie génétique ......................................................................... 160
Détection et localisation de QTL ........................................................... 162
Cytologie....................................................................................................... 164
Cytométrie ............................................................................................. 164
■ Cytophotométrie ................................................................................. 165
■ Cytométrie en flux .............................................................................. 166
Cytogénétique ....................................................................................... 168
■ Hybridation in situ (HIS) .................................................................... 169
■ Hybridation de gènes (Fluorescent in situ hybridization, FISH) ............ 170
Structure chromosomique ..................................................................... 170
Gènes ribosomiques .............................................................................. 171
Gènes de séquence unique .................................................................... 171
Amorçage in situ ................................................................................. 172
■ Hybridation de génome (Genome in situ hybridization, GISH) .......... 172

Applications et choix des marqueurs ................................................... 175

Échantillonnage du génome .................................................................. 176
Transfert des marqueurs entre espèces ................................................... 177
Adéquation marqueur - objectif ............................................................. 181
Critères de choix .................................................................................... 182
Utilisations et choix des marqueurs ........................................................ 192
■ Identification génétique....................................................................... 197
■ Phylogénie ......................................................................................... 201
■ Analyse et structuration de la variabilité génétique ............................. 206
Structure et différenciation ....................................................................... 206
Flux de gènes ........................................................................................ 213
Phylogéographie ..................................................................................... 217
■ Cartographie génétique et ses applications ......................................... 217

L’apport des marqueurs dans la gestion des ressources génétiques 223

Systématique et phylogénie .................................................................... 223
Histoire des populations ........................................................................ 224
Introgression ......................................................................................... 225
Influence de grandes variations environnementales anciennes ................ 225
Gestion des ressources génétiques ......................................................... 229
Évaluation des ressources génétiques ..................................................... 230
■ Variabilité et adaptation ..................................................................... 230
■ Flux de gènes ..................................................................................... 235

V
 ANALYSE DU GÉNOME ET GESTION DES RESSOURCES GÉNÉTIQUES FORESTIÈRES

Gestion de réseaux de populations in situ ............................................. 238

■ Influence de la sylviculture ................................................................. 238
■ Constitution du réseau ....................................................................... 240
Choix des populations et contraintes climatiques ........................................... 240
Principes de gestion ................................................................................ 244
Illustrations .......................................................................................... 246
■ Espèces disséminées ............................................................................ 248
■ Espèces menacées ............................................................................... 249
Ressources génétiques ex situ ................................................................. 251
■ Échantillonnage ................................................................................. 252
■ Choix des sites ................................................................................... 253
■ Gestion ............................................................................................... 255

Conclusions .............................................................................................. 259

Annexes ...................................................................................................... 269

Références bibliographiques .................................................................. 341

Glossaire .................................................................................................... 433

Index ........................................................................................................... 453

VI
 Avant-propos

Cet ouvrage a été préparé à la demande de la Commission des ressources

génétiques pour lui apporter des informations aussi complètes que possible sur
l’utilisation des marqueurs moléculaires dans la gestion des ressources génétiques
forestières. Les arbres forestiers sont des espèces encore assez peu influencées par
l’homme. Leur caractère naturel en fait un matériel de choix pour la mise en
place de réseaux de protection des ressources génétiques. L’intérêt de ce document
déborde largement les espèces forestières bien qu’elles servent aussi souvent que
possible d’illustration.
Les arbres forestiers appartiennent à des groupes taxonomiques différents : les
Angiospermes et les Gymnospermes. Ces taxons ont divergé depuis longtemps
et possèdent des particularités de leur génome qui sont présentées en préambule
aux outils d’analyse du génome.
Les différents types de marqueurs génétiques en usage et d’utilisation prévisible
à ce jour sont décrits de façon à présenter leurs avantages et inconvénients
ainsi que leurs applications. Les techniques de marquage moléculaire évoluent
sans cesse, et aujourd’hui elles tendent à cibler au mieux le gène. Nous avons
également inclus les analyses à l’échelle du génome complet qui apportent aussi
des informations utiles. Le lecteur pourra ainsi choisir les marqueurs les mieux
appropriés à son objectif grâce aux analyses critiques des différents types de
marqueurs. Les choix proposés ne sont que des recommandations. Les auteurs
se sont attachés à faire le bilan des connaissances et des évolutions prévisibles au
moment de la rédaction.
Nous remercions la Direction de l’espace rural et de la forêt qui nous a fourni les
moyens d’initier cet ouvrage (convention 61.21.12/97). Nous tenons également
à rendre hommage à toutes les personnes qui ont contribué à la préparation de
cet ouvrage, en particulier Michel Arbez, Catherine Bodénès, Nathalie Frascaria-
Lacoste, Alain Ghesquière, Antoine Kremer, François Lefèvre, Marie-Claude
Lesage, Roseline Lumaret, Jean-Claude Mounolou, Rémy Petit, Bernard Romant-
Amat, Sylvain Santoni et Giuseppe Vendramin, pour leur soutien à ce projet, pour
les informations ou éléments qu’ils ont fournis et pour les améliorations qu’ils ont
suggérées. Nous sommes également très reconnaissants à Gerald Tuskan et Stephen
DiFazio qui nous ont fait part des données sur le génome de Populus trichocarpa,
dont le séquençage est achevé.

VII
V

01_Gen_AVPRO.indd IX 20/06/2006 [Link]

01_Gen_AVPRO.indd X 20/06/2006 [Link]
 L’évaluation
des ressources génétiques :
l’analyse du polymorphisme

Conservation des ressources génétiques forestières

La protection du patrimoine génétique des espèces végétales est reconnue comme
une priorité, soutenue par les instances politiques nationales et internationales,
dans un souci de conservation de la richesse génétique, mais aussi de protection
de la nature et de l’environnement. Les ressources génétiques ont suscité plusieurs
réunions ministérielles internationales. La première réunion gouvernementale
internationale importante à l’échelle européenne a été la conférence ministérielle
européenne pour la protection des forêts qui s’est tenue à Strasbourg en décembre
1990 et qui a réuni les délégations de 31 pays européens. La deuxième des 6 réso-
lutions porte sur les ressources génétiques forestières : L’ensemble des États d’Europe
qui veulent s’associer à une défense commune de la forêt et de son environnement et
souhaitent mobiliser les moyens nécessaires, s’engagent à mettre en œuvre dans leurs
pays, selon les modalités qui leur paraissent les plus appropriées, une politique de
conservation des ressources génétiques forestières.
La conférence des Nations-Unies sur l’environnement et le développement et la
forêt de Rio de Janeiro en juin 1992 a débouché sur une convention portant sur
la protection de la biodiversité. La conservation in situ de la diversité biologique
y est préconisée (Barthod, 1993). Les États, en fonction de leurs moyens, sont
chargés d’élaborer des stratégies, plans ou programmes pour assurer la conservation
et l’utilisation durable de la diversité biologique. Ces orientations sont confirmées
et précisées dans la résolution H2 de la conférence interministérielle d’Helsinki
de juin 1993 (Barthod et Touzet, 1994) et lors des réunions suivantes.
Les autorités politiques sont donc sensibles à la protection des ressources géné-
tiques forestières. En effet, les espèces forestières sont des espèces sauvages qui
recèlent encore l’essentiel de leur variabilité naturelle. Il est alors temps de protéger
cette ressource que les activités humaines menacent de plus en plus.
Sous la pression démographique l’homme a réduit la surface boisée au profit de
l’agriculture et de l’urbanisation. L’activité humaine exerce ainsi une pression sur

02_2Genome_Interieur.indd 1 22/06/2006 [Link]

 ANALYSE DU GÉNOME ET GESTION DES RESSOURCES GÉNÉTIQUES FORESTIÈRES

le milieu environnant qui s’est considérablement accrue au cours des dernières

décennies ; cette pression menace l’intégrité de la biodiversité et les ressources
génétiques forestières en particulier. L’homme est intervenu aussi sur le milieu
forestier par la sylviculture conduite au profit de la production de bois en favo-
risant souvent un nombre réduit d’espèces au détriment des autres. L’homme a
également occasionnellement déplacé des populations et modifié les structures
génétiques des massifs forestiers.
D’autres facteurs contribuent à la dégradation de la diversité génétique des
espèces forestières : les facteurs environnementaux et notamment les grands
changements climatiques, telles les périodes glaciaires qui ont contraint les
espèces à se restreindre en populations de faible effectif dans des zones refuges.
C’est à partir de ces zones que les espèces survivantes ont recolonisé leur aire
de répartition actuelle. Le réchauffement attendu de la planète laisse entrevoir
d’autres risques et menaces d’extinction pour diverses espèces vivantes dont
des arbres forestiers. Les conditions d’adversité exceptionnelles (pullulation
d’insectes ravageurs, prolifération de pathogènes, pollution atmosphérique, etc.),
favorisées ou non par l’activité humaine, font peser des menaces sur la survie des
populations et des espèces forestières.
L’objectif de la conservation des ressources génétiques forestières est de préserver
le potentiel d’adaptation des espèces ou des populations sur le long terme. Les
populations doivent donc pouvoir évoluer pour répondre et s’adapter aux change-
ments futurs de leur environnement. Ce ne sont pas tant les peuplements actuels
que les générations futures qu’ils engendreront qui sont visés par les mesures
de conservation des ressources génétiques. Nos choix doivent être guidés par le
succès des générations d’arbres à venir. L’objectif majeur de la conservation des
ressources génétiques forestières est de préserver des gènes qui permettront aux
populations de faire face aux aléas futurs et inconnus de leur environnement et
ainsi de contribuer au maintien des populations et espèces forestières (Arbez,
1994 ; Namkoong, 1995). Les caractères adaptatifs de ces espèces sont donc
particulièrement importants. En effet, la longévité de ces espèces expose les popu-
lations et les individus aux diverses fluctuations et variations de l’environnement.
Le potentiel adaptatif élevé des espèces forestières réside vraisemblablement dans
leur forte variabilité génétique (Behm et al., 1997). Cette variabilité doit être
préservée afin de maintenir ce potentiel (Gregorius, 1991).
Dans une première étape, les espèces concernées par la mise en place de réseaux
de conservation des ressources génétiques forestières sont des espèces de valeur
économique ou qui nécessitent des mesures d’urgence. À l’échelle française, les
quatre premières sont le sapin pectiné (Abies alba), le hêtre (Fagus sylvatica),
l’orme (Ulmus : menace de la graphiose) et le merisier (Prunus avium : risque
d’introduction de provenances étrangères appartenant parfois à une autre espèce).
Les réseaux européens EUFORGEN se sont focalisés au début sur le peuplier
noir (Populus nigra : risque d’introgression par les formes cultivées), des feuillus

02_2Genome_Interieur.indd 2 22/06/2006 [Link]

 L'évaluation des ressources génétiques : l'analyse du polymorphisme

précieux, le chêne liège (Quercus suber) et l’épicéa commun (Picea abies : menace
en Europe centrale) (Turok et Frison, 1995). Les actions de conservation des
ressources génétiques forestières se sont ensuite organisées autour de cinq réseaux
européens : les feuillus sociaux (Fagus, Quercus), les chênes méditerranéens, les
feuillus précieux, les peupliers européens et les conifères. Les réseaux préexistants
se sont élargis à d’autres espèces. Ces réseaux sont sous la tutelle d’organismes
internationaux (IPGRI, International Plant Genetic Resources Institute). D’autres
réseaux existent en Asie-Pacifique (APFORGEN) et en Afrique au sud du Sahara
(SAFORGEN, qui se préoccupe aussi d’arbres fruitiers). Pour la plupart de ces
espèces, la conservation des ressources génétiques est envisagée in situ, sauf en cas
de menace évidente des populations naturelles afin de maintenir sur une longue
période un nombre élevé de génotypes et aussi de soumettre ces génotypes aux
pressions évolutives naturelles.
La conservation des ressources génétiques a besoin d’une gestion adaptée, elle a
aussi un coût économique. Une gestion rationnelle se base sur la connaissance
de la diversité génétique de l’espèce, de sa distribution spatiale et dans la mesure
du possible, de l’influence des forces évolutives pouvant modifier cette structure
dans le temps.
La conservation in situ, qui consiste en la protection des populations dans leur
milieu naturel, est largement préconisée pour les espèces forestières en raison de la
longue durée de vie des individus, du maintien des pressions évolutives naturelles
et d’une plus grande facilité de gestion.
La conservation ex situ, qui consiste au maintien des ressources génétiques en
dehors du milieu naturel, prend des formes plus variées (collections d’individus,
banques de graines, banques de pollen, banques de tissus, etc.). Elle est conduite
lorsque la conservation in situ est trop difficile, comme chez l’orme (menace très
forte in situ en raison d’un problème sanitaire). Le renouvellement des généra-
tions est alors la principale difficulté. Les règles de gestion de ces collections sont
également difficiles à élaborer pour assurer leur entretien et leur pérennité.
Quels sont la taille et le nombre de populations à préserver pour assurer la
meilleure représentation de la variabilité génétique existante et garantir au mieux
la pérennité des populations ? Comment choisir les populations à préserver ?
Comment assurer la régénération de ces populations pour le très long terme ?
Telles sont les principales questions posées par la gestion des ressources généti-
ques. Pour espérer répondre même partiellement à ces questions, il est nécessaire
d’évaluer au mieux la variabilité des espèces considérées en s’intéressant aussi à la
répartition spatiale. Les pressions évolutives effectives et les menaces qui pèsent
sur les populations doivent également être identifiées et estimées.
Avant de décrire les outils permettant l’évaluation de la variabilité génétique et la
compréhension des mécanismes qui la régissent, nous présentons ici un état des
connaissances sur les génomes des arbres forestiers de façon à mettre en évidence
certaines de leurs particularités.

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 ANALYSE DU GÉNOME ET GESTION DES RESSOURCES GÉNÉTIQUES FORESTIÈRES

Classification des arbres forestiers

Les espèces forestières appartiennent à deux groupes taxonomiques différents,
les Gymnospermes et les Angiospermes. Les Gymnospermes sont d’origine plus
ancienne : elles se sont largement développées au Trias et sont probablement appa-
rues au Carbonifère, soit il y a près de 300 millions d’années (Meyer-Berthaud
et al., 1999), alors que les Angiospermes ne se sont répandues qu’au Crétacé
(Crane et al., 1995), les plus anciens fossiles trouvés datant du Jurassique, soit
il y a environ 150 millions d’années (Sun et al., 1998). Les diverses lignées des
Angiospermes se seraient différenciées dès l’émergence de ce groupe ; leur berceau
se situerait en région tropicale (Barale et Lemoigne, 2000). Les Monocotylédones
ont ensuite divergé et se sont diversifiées au début du Crétacé (Bremer, 2000). Les
Angiospermes et les Gymnospermes se différencient par de nombreux caractères
botaniques et génétiques.
La classification du monde vivant est établie à partir de divers caractères mor-
phologiques qui sont partagés par les espèces voisines. Une proximité génétique
est ainsi attendue entre espèces appartenant à des genres ou familles voisins.
Cette information sert donc aussi à prédire le transfert éventuel, d’une espèce
vers une autre, d’une information génétique telle que l’organisation du génome,
la possibilité d’analyser le polymorphisme avec un ensemble de marqueurs
génétiques, etc.
La plupart des Gymnospermes sont des plantes ligneuses à port arborescent et
produisent donc du bois. Les forêts de Gymnospermes se rencontrent surtout
sous un climat tempéré et boréal. Dans les régions tropicales, les Gymnospermes,
sont présentes essentiellement en altitude où elles sont fréquemment associées
aux Angiospermes. Les espèces forestières gymnospermes, souvent groupées sous
le terme de résineux ou de conifères, sont réparties dans quelques familles : les
Araucariacées, Céphalotaxacées, Cupressacées, Pinacées, Podocarpacées, Taxacées
et Taxodiacées (souvent considérées comme faisant partie des Cupressacées). La
famille des Pinacées, particulièrement importante, regroupe la majeure partie
des conifères utilisés pour la production de bois. Au sein de cette famille, les
données recueillies sur une espèce modèle sont plus facilement transférables aux
autres espèces.
Les espèces forestières angiospermes, souvent appelées feuillus par les forestiers,
constituent la presque totalité des forêts tropicales et sont aussi très abondantes
sous un climat tempéré. Les espèces forestières angiospermes, qui retiennent
l’attention de l’IUFRO (International Union of Forest Research Organizations),
appartiennent à 117 genres qui se répartissent dans 52 familles. La plupart de
ces familles appartiennent aux ordres des Rosales, Célastrales, Fabales, Fagales,
Malpighiales, Malvales, Myrtales et Sapindales qui sont classés au sein des
Rosidées (fig. 1). Les Rosidées constituent l’une des principales divisions des
Eudicotylédones et comportent la majorité des espèces forestières feuillues. Dans
ce groupe des Rosidées figurent les Brassicales qui comportent entre autres les

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 L'évaluation des ressources génétiques : l'analyse du polymorphisme

Figure 1 − Position systématique des principales familles comportant des espèces forestières impor-
tantes dans la classification des plantes supérieures (d’après Bowe et al., 2000 ; Soltis et al., 2000 ;
The Angiosperm Phylogeny Group, 2003).

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 ANALYSE DU GÉNOME ET GESTION DES RESSOURCES GÉNÉTIQUES FORESTIÈRES

Brassicacées avec la plante de référence Arabidopsis thaliana, dont le génome a

été entièrement séquencé (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Malgré des
traits opposés à ceux des arbres forestiers comme son cycle court (1 mois), son
port herbacé, cette espèce au génome de petite taille peut servir de référence à
de nombreux arbres forestiers pour un certain nombre de caractéristiques grâce
à sa proximité systématique et phylogénétique.

Organisation des génomes des arbres forestiers

L’activité cellulaire des espèces végétales résulte de l’interaction de trois génomes :
le génome nucléaire, le génome chloroplastique et le génome mitochondrial.
Ces trois génomes sont caractérisés par leur localisation cellulaire. Chacun de
ces génomes possède aussi ses particularités : hérédité, taille, nombre de copies,
organisation des régions codantes et non codantes, expression et régulation des
gènes, mode d’évolution. Le génome nucléaire est le plus important par la taille
et la quantité d’informations. Il est porté par les chromosomes et est présent en
deux exemplaires dans les cellules somatiques diploïdes, en plusieurs exemplaires
dans les cellules polyploïdes et un seul exemplaire dans les cellules haploïdes
(gamétophytes et gamètes). Il est redistribué par recombinaison génétique lors
de la méiose. Les génomes chloroplastiques et mitochondriaux localisés respec-
tivement au sein des chloroplastes et des mitochondries sont beaucoup plus
petits, le nombre de copies par organite et donc par cellule peut être très élevé
(centaines ou milliers de copies par cellules).
Arabidopsis thaliana est la première espèce pour laquelle le génome nucléaire
comme les génomes chloroplastiques et mitochondriaux ont été complètement
séquencés (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). La comparaison des trois
génomes est possible : elle montre des différences importantes sur la taille des
trois génomes, leur contenu en gènes, les proportions de base G/C, la présence
de pseudogènes (tabl. 1). La proportion du génome occupée par des gènes codant
des protéines est faible pour le génome nucléaire (3,9 %) malgré le grand nombre
de gènes. C’est le génome chloroplastique qui possède la plus grande part de
séquences codantes des protéines (46,0 %). Le génome du riz, Oryza sativa, de
430.106 pb, est également très largement séquencé (Yu et al., 2002 ; Goff et al.,
2002). Des informations provenant des plantes herbacées sont utilisées dans cet
ouvrage pour compléter celles souvent moins abondantes venant des espèces
forestières.
Un arbre forestier est particulièrement bien connu, il s’agit de Populus trichocarpa
dont le génome est maintenant complètement séquencé et en cours d’analyse.
Le séquençage de son génome de 480.106 pb, soit environ quatre fois plus gros
que celui d’Arabidopsis, a été réalisé en moins de deux ans et s’est terminé fin
2004. Les premiers résultats concernant l’ensemble du génome de cette espèce
sont utilisés ici (Brunner et al., 2004 ; Sterky et al., 2004, DiFasio et al., 2005).
L’analyse des séquences et l’identification des gènes demandent encore du temps

02_2Genome_Interieur.indd 6 22/06/2006 [Link]

 L'évaluation des ressources génétiques : l'analyse du polymorphisme

Tableau 1 — Caractéristiques des trois génomes présents chez les plantes, exemple d’Arabidopsis
thaliana (d’après Unseld et al., 1997 ; Sato et al., 1999 et The Arabidopsis Genome Initiative,
2000).

Génome Génome Génome

Caractéristique
nucléaire chloroplastique mitochondrial
Taille du génome (une copie) (pb) 125.106 154 478 366 924
Copies/cellule 2 > 400 > 20
Taux de redondance (%) 60 17 10
Proportion de bases G/C (%) 34,7 36,3 44,8
Proportion de bases G/C (séquences 44,1 36,9 44,3
codantesa) (%)
Gènes codant une protéine identifiée 25 498 67 30
Espace moyen occupé pour un gène (pb) 4 500 1 200 6 250
Taille moyenne de la séquence codante (pb) 1 900 900 860
Proportion du génome codant 3,88 46,0 13,6
des protéines (%)
Gènes possédant des introns (%) 79 18 12
Pseudogènes / gènes (%) 3 0 20-50
Transposons (% taille du génome) (%) 14 0 4
a : y compris les ORF.

pour être achevées. La transcription des gènes doit être confirmée par d’autres
analyses moléculaires. Des données sont également disponibles en particulier pour
Eucalyptus et Pinus. Les particularités des Populus et Eucalyptus (taille réduite du
génome, aptitudes à la multiplication végétative, aptitudes à la transformation
génétique, évaluation rapide due à une croissance rapide, intérêt économique) en
font un matériel de choix. Diverses informations sur le génome des arbres forestiers
sont disponibles sur le site internet Dendrome : [Link]
[Link]. Des séquences de gènes sont disponibles et peuvent être compareées
à d’autres par recherche d’homologie de séquences (site internet [Link]
[Link]/Database/[Link]). La taille des génomes chloroplastiques et mito-
chondriaux des arbres forestiers n’est connue que pour quelques espèces (tabl. 2).
Les études de variabilité génétique peuvent porter sur chacun des trois génomes,
mais les informations qu’ils apportent ne sont pas équivalentes.
Par convention, les noms des gènes sont écrits en italique, ceux des organites cyto-
plasmiques commencent par une minuscule, alors que ceux du génome nucléaire
commencent par une majuscule (Commission on Plant Gene Nomenclature,
1993).

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 ANALYSE DU GÉNOME ET GESTION DES RESSOURCES GÉNÉTIQUES FORESTIÈRES

Tableau 2 — Taille des génomes chloroplastiques et mitochondriaux de quelques espèces

forestières.

Taille du génome Taille du

Espèce chloroplastique génome Référence
(kpb) mitochondrial
Gymnospermes
Cryptomeria japonica 133 Tsumura et al., 1993
Ginkgo biloba 158 Palmer, 1985
Pinus contorta 121 Lidholm et Gustafsson, 1991b
Pinus koraiensis 117 Noh et al., non publié
Pinus radiata 120 Strauss et al., 1988
Pinus sylvestris 120 Karpinska et Karpinski, 1993
Pinus thunbergii 120 Wakasugi et al., 1994b
Pseudotsuga menziesii 121 Strauss et al., 1988
Angiospermes
Eucalyptus nitens 143 Steane et al., 1991
Eucalyptus nitens 151 Byrne et al., 1993
Eucalyptus regnans 143 Steane et al., 1991
Eucalyptus ovata 143 Steane et al., 1991
Populus trichocarpa 157 [Link]
poplar_chloroplast
Populus sp. 420 - 450 kpb Radetzky, 1990

Le génome nucléaire
La plupart des caractères génétiques sont codés par ce génome qui comporte la
presque totalité des gènes. L’information génétique est portée par les chromosomes
dont la forme et le nombre (caryotype) sont des caractéristiques de l’espèce. Les
locus ont une répartition identique sur les deux chromosomes de la même paire
chez les espèces diploïdes. Les deux formes occupant ces deux locus homologues
sont appelées allèles. Il a cependant été montré par analyse de séquences chez Zea
mays que des fragments homologues ne possèdent pas strictement les mêmes gènes
et que cela ne résulte pas simplement d’une inversion locale (Fu et Dooner, 2002).
La répartition des paires de bases AT et GC varie selon les espèces : le pourcen-
tage de GC est très stable chez les Gymnospermes (37-38 % : Miksche et Hotta,
1973) ; il est plus faible pour Populus deltoides (34 %, Dhillon, 1987) et plus
élevé chez des espèces du genre Quercus (38-40 % : Zoldos et al., 1998 ; 41-
42 % : Favre et Brown, 1996). Chez Arabidopsis thaliana, les bases GC représen-
tent de 33,4 à 35,5 % du génome selon le chromosome, leur pourcentage atteint
44,3 % dans les séquences codantes (tabl. 1) : les séquences codantes sont plus

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 L'évaluation des ressources génétiques : l'analyse du polymorphisme

riches en paires de bases GC que les séquences non codantes. La proportion des
paires de bases AT et GC change aussi le long du chromosome. Les régions cen-
tromériques, constituées surtout d’hétérochromatine, renferment des séquences
répétées diverses. Les séquences codantes y sont rares, elles sont localisées surtout
dans l’euchromatine et sont réparties le long des bras chromosomiques, mais plus
abondantes vers les extrémités des chromosomes (Schwarzacher, 2003 ; fig. 2a,
voir planche 1).
Le génome nucléaire comporte les séquences codantes de quelques dizaines de
milliers de gènes : 25 500 pour Arabidopsis (The Arabidopsis Genome Initiative,
2000), 42 000 pour Populus (les premières estimations faisaient état de plus de
58 000 gènes, [Link] 45 000 chez
Oryza ([Link] 59 000 chez Zea (Messing et al., 2004). Populus ne
se distingue donc pas par le nombre de gènes. Pour une large majorité de gènes
(près de 80 %, tabl. 1), les séquences codantes, appelées exons, sont entrecou-
pées de séquences non codantes dénommées introns. Chez Arabidopsis, les gènes
comportent en moyenne 5 exons d’une longueur de 250 pb et les introns sont
plus courts. Les séquences codantes n’occupent qu’une faible part de ce génome
(moins de 4 %, tabl. 1).
Le génome nucléaire le mieux connu est celui d’Arabidopsis thaliana qui a été
intégralement séquencé et dont l’analyse a commencé depuis quelques années
(The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Son génome de 125.106 pb, l’un des
plus petits du règne végétal, est réparti sur 5 chromosomes et comporte environ
25 500 gènes. La fonction d’un peu plus de la moitié des gènes est déterminée.
Une part équivalente des EST (Expressed Sequence Tags, séquences du génome tra-
duites en protéines identifiées à partir des ARN messagers) de Populus est identifiée
(Sterky et al., 2004). Les gènes sont classés en différentes catégories. La catégorie de
gènes la plus abondante concerne le métabolisme cellulaire : 22 % chez Arabidopsis,
25 % chez Oryza (Goff et al., 2002), 32 % chez Populus (Sterky et al., 2004). Ceci
est observé chez divers organismes. Les gènes impliqués dans la transcription du
génome représentent environ 17 % des gènes identifiés chez Arabidopsis ; cette
part est plus faible chez d’autres organismes dont Oryza et Populus (9 %, Sterky et
al., 2004). Les gènes de la croissance et de la division cellulaire représentent près
de 12 % des gènes d’Arabidopsis, et 9 % des EST identifiés de Populus. Les gènes
de défense, mort cellulaire et vieillissement sont légèrement moins abondants
chez Arabidopsis (11 %). Les gènes d’adressage de protéines et de communication
cellulaire représentent environ 10 % ; les derniers sont moins abondants chez
Populus (environ 6 %). Les autres catégories de gènes sont moins abondantes chez
Arabidopsis (transport intracellulaire : 8 %, transport : 5 %, synthèse protéique :
4 %) et Populus, excepté les gènes impliqués dans le métabolisme énergétique
qui représentent 12 % des EST identifiés de Populus. Les gènes des différentes
fonctions (métabolisme cellulaire, transcription, gènes de défense, transport…)
sont portés dans des proportions très semblables par les cinq chromosomes, il n’y
a donc pas de répartition des fonctions entre chromosomes.

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 ANALYSE DU GÉNOME ET GESTION DES RESSOURCES GÉNÉTIQUES FORESTIÈRES

Beaucoup de gènes réalisent la même fonction. Ils existent en un nombre variable

de copies plus ou moins dispersées dans le génome, il s’agit de familles de gènes.
Le nombre de copies de ces gènes et leur répartition dans le génome varient entre
espèces. Les gènes ribosomiques sont un cas particulier dont les duplications très
nombreuses sont distribuées en tandem (les unes à la suite des autres).
Une partie de cette redondance du génome a une autre origine. Le génome
d’Arabidopsis montre une duplication d’origine ancienne (fig. 2b, voir planche 1).
De grandes régions du génome sont retrouvées avec une organisation similaire à
un autre endroit du génome. Les zones dupliquées peuvent être portées par un
même chromosome ou un autre. Des parties du chromosome 1 d’Arabidopsis sont
équivalentes à des portions des chromosomes 2, 3, 4 ou 5. À part les chromosomes
2 et 5 qui ne partagent pas de régions semblables, les autres chromosomes ont
tous des portions en commun, parfois plusieurs, même éventuellement d’orien-
tation différente et plus ou moins distantes. Cette redondance est distribuée en
mosaïque. Bien que ce génome soit l’un des plus petits génomes végétaux, il
présente une redondance importante. Ceci n’est pas une particularité d’Arabidopsis
thaliana, une situation similaire a été observée pour des céréales.
Cette redondance structurelle du génome est particulièrement marquée chez
Populus trichocarpa (Difazio et al., 2005). Il s’agit encore de portions d’un chro-
mosome qui sont retrouvées de façon similaire sur un chromosome d’une autre
paire. Les parties homologues représentent une part importante du chromo-
some ; un chromosome donné ne présente d’homologie généralement qu’avec
un seul autre chromosome, toutefois les chromosomes I et IV ont des régions
homologues avec 4 autres chromosomes. Les chromosomes VIII et X sont très
semblables. Cette structure correspond vraisemblablement à une autopolyploï-
disation ou à une allopolyploïdisation impliquant des génomes proches qui a eu
lieu anciennement et qui a ensuite évolué avec des redistributions de fragments
chromosomiques. Populus trichocarpa semble donc être un polyploïde ancien,
avec un fonctionnement actuel diploïde. Les régions communes aux paires de
chromosomes actuels correspondent probablement, au moins pour les plus
importantes, aux chromosomes ancestraux.
De très nombreuses plantes ont une origine polyploïde, cette situation n’est
donc pas exceptionnelle. Ces duplications de génome, par autopolyploïdisation
ou allopolyploïdisation conduisent à des séquences très semblables qui sont dis-
tribuées sur des chromosomes différents. Quand les gènes dupliqués ont gardé
la même fonction et sont exprimés, le fonctionnement observé est identique à
celui d’un polyploïde.
Caryotype et ploïdie
Le nombre de chromosomes est très stable dans des familles comme celle des
Pinacées (Annexe 1), alors qu’il varie très largement dans certains genres comme
le genre Alnus, voire dans certaines espèces. Les Gymnospermes ont de grands
chromosomes, ce qui facilite les études de cytogénétique. Ainsi, le caryotype des

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 L'évaluation des ressources génétiques : l'analyse du polymorphisme

Pinacées comporte 24 chromosomes métacentriques ou submétacentriques sauf

chez Pseudotsuga menziesii (22 chromosomes métacentriques ou submétacentri-
ques et 4 télocentriques) et chez Pseudolarix kaempferi (40 chromosomes télocen-
triques et 4 submétacentriques) (Hizume, 1988). Les chromosomes télocentriques
proviennent vraisemblablement de la fission des deux bras de chromosomes
métacentriques mais les analyses d’Hizume et Kondo (1992) n’en ont pas apporté
les preuves. Un nombre chromosomique plus élevé n’est donc pas nécessairement
associé à une plus grande redondance de l’information génétique.
Quelques espèces forestières sont dioïques. Toutefois, le déterminisme du sexe
est rarement lié au caryotype. Chez Podocarpus macrophyllus, les arbres mâles
ont un chromosome en moins (2n = 37) que les arbres femelles (2n = 38) : c’est
un rare cas de déterminisme chromosomique du sexe chez un arbre (Hizume et
al., 1988b). L’hérédité même du déterminisme sexuel d’une espèce dioïque est
parfois difficile à comprendre, comme c’est le cas chez Salix (Alstrom-Rapaport
et al., 1997).
Des chromosomes surnuméraires ou chromosomes B ont été observés chez quel-
ques espèces forestières dont : Cupressus glabra (Hunziker, 1961), Picea glauca
(Teoh et Rees, 1977), Picea glehnii (Hizume et al., 1988a), Picea sitchensis (Fox,
1987), Salix sp. (Büchler, 1986), Quercus petraea, Q. robur et Q. rubra (Ohri et
Ahuja, 1990).
Des variations du niveau de ploïdie (nombre de copies du nombre haploïde n
de chromosomes) sont observées au sein d’une même espèce ou entre espèces
proches. De telles séries polyploïdes sont décrites dans les genres Alnus, Betula,
Salix : dans le genre Alnus le nombre de chromosomes varie de 2n = 14 chez
A. inokumae (Chiba, 1962) à 2n = 112 chez A. firma (Kodama, 1967). À
l’intérieur de l’espèce Alnus glutinosa des variations du niveau de ploïdie sont
aussi rapportées : 2n = 28, 3n = 42, 4n = 56 ; le caryotype diploïde est cependant
très largement répandu (Kammacher et Zygomala, 1986 ; Zygomala 1987). Les
Gymnospermes présentent de rares cas de polyploïdie : Sequoia sempervirens est
hexaploïde, mais son origine autopolyploïde ou allopolyploïde n’est pas élucidée
(Schlarbaum et Tsuchiya, 1984 ; Rogers, 1997).
De nombreuses espèces végétales résultent de croisements interspécifiques
(Rieseberg, 1997 ; Rieseberg et Carney, 1998) qui conduisent à l’association de
deux génomes différents et donc à une redondance de l’information génétique. La
méiose des hybrides ne donne généralement de gamètes viables qu’après double-
ment chromosomique. Les espèces tétraploïdes qui résultent de ce doublement du
stock chromosomique après spéciation alloploïde sont alors des amphidiploïdes et
se comportent finalement souvent comme des diploïdes. Les éventuels croisements
en retour avec des individus des espèces parentes aboutissent à des situations
plus complexes présentant des triploïdes ; leur stérilité n’est pas absolue (Ramsey
et Schemske, 1998). L’évolution ultérieure du génome chez les allopolyploïdes
peut conduire à une redistribution des génomes initiaux entre les chromosomes,
comme chez le maïs (Wilson et al., 1999).

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 ANALYSE DU GÉNOME ET GESTION DES RESSOURCES GÉNÉTIQUES FORESTIÈRES

Plusieurs génomes définis par une organisation et un caryotype sont parfois

décrits dans un même genre pour caractériser des espèces ou groupes d’espèces.
Ainsi, Liljefors (1955) a identifié quatre génomes dans le genre Sorbus. Beaucoup
d’espèces d’origine hybride associent, selon ces observations, des génomes
différents.

Taille du génome
La taille du génome haploïde, exprimée en nombre de paires de bases (pb) ou en
masse d’ADN (pg), montre des fluctuations importantes entre espèces forestières
et aussi une très nette différence entre les Gymnospermes (10-100.109 pb) et les
Angiospermes (0,2-1.109 pb ; Annexe 1). Les Gymnospermes ont des tailles de
génome parmi les plus grandes connues (Dhillon, 1987). Chez les Angiospermes,
ce sont les Liliales et en particulier certains genres comme Fritillaria qui présen-
tent les plus gros génomes nucléaires (Soltis et al., 2003). La taille de génome
de ces monocotylédones dépasse parfois largement celle des Gymnospermes. La
grande taille du génome n’est donc pas une caractéristique des arbres forestiers
ni des Gymnospermes.
La taille du génome montre aussi des variations intraspécifiques. Des fluctuations
importantes sont observables d’une publication à une autre pour la même espèce.
Les estimations en masse d’ADN et en nombre de paires de bases ne sont pas
toujours concordantes. Même si les techniques utilisées et les erreurs expérimen-
tales sont sources de fluctuations importantes, certaines variations intraspécifiques
sont dues aussi au matériel végétal analysé (génotype et tissu).
Des tailles de génome plus grandes sont observées aux latitudes et altitudes les plus
élevées chez Picea glauca et Pinus banksiana (Miksche, 1968), chez Pseudotsuga
menziesii (El-Lakany et Sziklai, 1971). Les variations observées sont supérieures
à un facteur 2. Chez Pinus resinosa, la latitude n’est pas corrélée aux fluctuations
de taille de génome (Dhir et Miksche, 1974).
La taille du génome peut être considérée comme un élément de régulation de
l’activité mitotique et de la taille des cellules pour Cavalier-Smith (1978). Les
fluctuations observées sont donc susceptibles d’avoir une signification adaptative
à des facteurs environnementaux. Les corrélations entre les variations de taille
du génome de plusieurs espèces de Pinus et des paramètres écologiques (tempé-
rature, précipitation, sécheresse) sont en faveur de cette signification adaptative
(Wakamiya et al., 1993; 1996). La taille du génome semble fluctuer également
en fonction du tissu, de l’âge de l’arbre, de la date de prélèvement pour un même
tissu végétal aussi bien pour des cellules interphasiques que pour des cellules en
mitose (Mellerowicz et al., 1989 ; Zhong et al., 1995 ; Wyman et al., 1997).

Organisation et expression d’un gène

Un gène est un segment de la molécule d’ADN qui occupe un emplacement
déterminé sur le chromosome, appelé locus. Il assure une fonction précise en

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