LES METHODES D’ENSEMENCEMENT ET DE DENOMBREMENT EN MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE YOUCEFI. FatmaDénombrement 11. Général s Lors du controle de la qualité microbiologique et/ou de la sécurité microbiologique des aliments pour la consommation humaine et des aliments pour animaux, il n'est pas suffisant de connaitre quels sont les micro- organismes présents. Dans la plupart des cas, la quantité dans laquelle ils sont présents est également un facteur important, dou la nécessité de les dénombrer. Pour ce faire, il existe plusieurs maniéres de procéder: par exemple par examen direct (mieroscopie), en ensemengant des milieux solides ou liquides, par eytomeétrie en flux, par PCR en temps réel, ete Le dénombrement sur milieux solides se base sur la capacité qu’ont de nombreux micro- organismes a produire des colonies dans ou sur des milieux gélosés pouvant étre détectées ail nu ou & aide d'une simple loupe. Si la matrice contient un niveau élevé de particules interférentes, il convient tout cces demieres par sédimentation ou a Taide de sacs-filtes. ‘abord de séparer Sion s‘atend a ce que le niveau de bactéries soit trés faible (moins de 10 colonies dans ou sur une boite & la dilution la plus faible, il est recommandé de procéder au dénombrement a l'aide de milicux liquides (par exemple NPP) pour améliorer la fiabilité statistique des résultats. La concentration par filtration, immunoséparation ou centrifugation peut étre également utili 1.2. Dénombrement sur milieu solide laa. néralités, Il est recommandé d'étiqueter les boites de Petri avee le numéro det toute autre information utile tillon, fa dilution, ta date et Il est recommandé de sélectionner les dilutions pour garantir que les boites contenant le nombre approprié de colonies sont obtenues et pour remédier aux éventuelles propriétés inhibitrices Pour le transfert de chaque dilution, utiliser une pipette sterile différente, a moins de procéder par ordre décroissant. 1.2.2. Nombre de boites de Petri par dilution Pour les méthodes de dénombrement en microbiologie des aliments, une botte par dilution doit étre utilisée si au moins deux dilutions successives sont utilisées. Deux boites par dilution peuvent également étre uilisées pour améliorer la fiabilit Si une seule dilution est utiisée, alors deux boites pour cette dilution doivent étre utilisées pour améliorer la fiabilité des résultats. 1.2.3. Techniques de dénombrement en profondeur Prélever les volumes définis de ta dilution a examiner, en touchant 'embout de la pipette avec la paroi du tube afin d’dter les surplus de liquide adhérant a 'extérieur de cet embout. Soulever suffisamment le couvercle de la boite de Petri sterile pour y insérer la pipette, puis delivrer le contenu. Aprés avoir 6té du bain d'eau thermostaté le milieu gélosé refroidi, sécher le flacon avec un chiffon propre afin d’éviter que l'eau ne contamine les boites. En versant, éviter de répandre le milieu a lextérieur du récipient ou dans le couvercle de la boite. Pour éviter !a contamination des milieux, tenir ie flacon en position quasi horizontale. Eviter également de poser le flacon entre les étapes ducoulage, Verser le milieu gélosé fondu a une température comprise entre 44°C et 47°C dans chaque boite de Petri (généralement, de 18 ml 4 20 ml de gélose dans des boites de Petri de 90 mm, et de 45 ml a 50 il dans des boites de Petri de 140 mm, afin dobienir au moins 3 mm dépaisseur) dans les 15 min de ensemencement (pour éviter Tagrégation des colonies). Eviter de verser le milieu directement sur inoculum. Mélanger immédiatement et soigneusement le milieu en surfusion et inoculum, de fagon a obtenir une répartition homogéne des micro- organismes dans le milieu, par exemple en déplagant doucement la boite d'avant en arriére, d'un cété a l'autre et dans un sens circulaire. Laisser refroidir et se solidifier en posant les boltes de Petri sur une surface fraiche et horizontale (le temps de solidification de la gélose ne doit pas dépasser 10 min). ( Figure 1) Lorsque, dans le produit & examiner, la présence de micro-organismes donnant des colonies envahissantes est suspectée (par exemple Proteus spp.), couler sur les bottes solidifiées une ‘seconde couche de gélose non nutritive ou identique & celle du milieu de culture utilisé dans essai (eénéralement 5 ml de gélose dans des boites de Petri de 90 mm), afin de limiter voire diinhiber envahissement par ces micro-organismes. wt 10? «wt 10 10% a Ss Ss = - Fig 1 : isolement en profondeur 1.3, Ensemencement en surface 13.4, Généralités Les méthodes d'ensemencement congues pour produire uniquement des colonies en surface dans les boites gélosées présentent certains avantages par rapport a la méthode dans la masse. La morphologie des colonies en surface est facile a observer, ce qui augmente la capacité de l'analyste & distinguer les différents types de colonies. Les micro-organismes n'étant pas exposés a la chaleur du milieu gélosé en surfusion, il est done possible obtenir des résultats de dénombrement plus importants. Utiiser des boites précoulées, contenant un milieu gélosé d'au moins 3 mm d'épaisseur, de niveau constant, ne contenant aucune bulle dair ni humidité en surface. Afin de favoriser une répartition uniforme, il est recommandé de sécher Ia surface de Ia gélose solidifige pour que inoculum soit absorbé en 15 min1.3.2, Etalement/méthode a 'étaleur A taide d'une pipette sterile, transférer inoculum (habituellement 0,1 ml ou 0,6 ml) de 'échantillon liquide pour essai, ou de la suspension mere sil s'agit d'autres échantillons, dans la bolle gélosée (respectivement dun diamétre de 90 mm ou de 140 mm). Répéter celle étape Pour la dilution décimale suivante (les colonies dénombrer seront alors présentes a I’étape 10" sil s‘agit d'un échantiion liquide et 10 sil s'agit d'un autre échantillon) puis, le cas échéant, répéter lopération pour des dilutions décimales supplémentaires. La limite de dénombrement peut étre diminuée d'un facteur de 10 en ensemengant 1,0 mi de échantilon pour essai sil s'agit de liquide, ou 1,0 ml de la suspension mere pour les autres produits, sur la surface dune grande boite de gélose (140 mm) ou sur la surface de trois petites boites de gélose (90 mm), Dans chaque cas, si une seule dilution est utlisée, doubler les boites pour cette dilution en Utiisant deux grandes boites ou six petites boites. A aide d'un étaleur en verre, en plastique ou en acier (composé, par exemple, d'une tige en verre en forme de crosse de hockey, d'un diametre d'environ 3,6 mm et longue d'environ 20 cm, coudée a environ 3 cm de lextrémité et aplatie aux extrémités par chauffage), répartir tuniformément inoculum aussi rapidement que possible sur la surface gélosée, sans toucher les parois de la boite de Petri. Laisser sécher les bortes, avec les couvercies en place, pendant environ 15 min & température ambiante.(figure 2) Fig 2 : ensemencement méthode a étaleur1.4, Méthodes spirales 14.1. Généralités La méthode spirale pour la détermination du niveau de micro-organismes a 616 soumise & des essais interlaboratoires sur ddu lait, des produits laitiers et dautres produits alimentaires. 1.4.2. Préparation de la boite gélosée Pour ta préparation des boites gélosées, il est recommandé dutiliser un répartiteur automatique avec un systéme de distribution sterile afin de garantir que les boites ont une épaisseur réguliére, ne contiennent aucune bulle dlair et sont stériles, Verser la méme quantité de gélose dans toutes les boites, de sorte que la méme hauteur de gélose soit présentée la pointe du stylet de lensemenceur spiral, afin de maintenir 'angle de contact. ‘Sécher les boites avant utilisation et s'assurer qu'aucune gouttelette d'eau n'est visible a la surface du milieu 1.4.3. Mode opératoire d'ensemencement et comptage Décontaminer la pointe du stylet et le tuyau flexible en faisant passer une solution d'hypochiorite de sodium (voir 5.24.4) puis de l'eau stérile dans le systéme avant de faire passer Iéchantilion liquide dans le stylet. Sinon, remplacer la micro-seringue @ usage unique dans l'appareil qui en utilise. Placer une boite de Petri précoulée sur le plateau tournant et abaisser le stylet. L'échantillon est déposé de facon différentielle lorsque la pointe du stylet parcourt la surface de la boite gélosée en rotation. Oter la boite ‘ensemencée et déplacer le stylet a sa position de départ. Décontaminer le stylet ou remplacer la mioro- seringue et lela remplir pour ensemencement d'une autre boite, Laisser sécher les boites, avec les couvercles en place, pendant environ 15 min a température ambiante, puis, incuber Apres incubation, centrer la grille de comptage de ensemenceur spiral. Utiiser la régle de comptage de 20 pour déterminer le nombre de colonies. Choisir un secteur et commencer le comptage des colonies depuis le bord extérieur du premier segment vers le centre, jusqu’a ce que 20 colonies aient ét8 comptées. Continuer par le comptage des colonies restantes dans le segment qui contient la vingtiéme colonie. Compter une zone correspondante du cété opposé de la boite et diviser le nombre de colonies comptées des deux cétés par le volume d'échantillon déposé dans ces deux zones. Les volumes d'échantillon associés & chaque portion de la grille de comptage sont indiqués dans le manuel d'utilisation four avec chaque ensemenceur spiral. (figure 3) D.Sc escent Fig 3: ensemencement méthode spirale1.4.4. Incubation ‘auf spécification contraire dans les normes spécifiques, retourner les boites aprés leur ensemencement et les placer rapidement dans 'étuve régiée a la température appropriée. Si une déshydratation excessive se produit (par exemple a 55 °C ou dans le cas d'une forte circulation dair), envelopper les boites, sans les serrer, dans des sacs en matiére plastique, avant incubation, ou utiliser tout systéme similaire d'efficacité équivalente, Pendant la période dincubation, de légéres variations de température sont invitables et tolérées, par exemple au moment de charger ou de décharger "étuve, mais lest important que ces périodes soient réduites le plus possible. Il est ecommandé de controler la durée de ces variations pour s'assurer qu'elles n'ont pas effet significatif sur le résulta lI peut étre utile parfois, pour le fonctionnement du laboratoire, de réfrigérer les boites ensemencées avant incubation pendant une durée maximale de 24 h. Dans ce cas, le laboratoire doit s'assurer que cette pratique est sans incidence sur le nombre de colonies obtenues, Généralement, il est recommandé que les piles ne dépassent pas six boites de Petri pour incubation en aérobiose et qu'elles soient séparées l'une de l'autre et des parois de Iincubateur par une distance d'au moins 25 mm. Toutefois, des piles plus hautes et moins espacées peuvent étre tolérées pour les étuves équipées de systémes de circulation de lair; dans ce cas, il est recommandé de s'assurer de thomogénéité de la répartition de la température, ‘Aprés incubation, il est normalement recommendé d'examiner les boites immédiatement. Elles peuvent cependant étre conservées, sauf spécification contraire dans les normes spécifiques, jusqu'a 48 h au réfrigérateur. La conservation en réfrigérateur peut étre tolérée uniquement s'il a été démontré que cela n'a aucune incidence sur le dénombrement, 'apparence ou la confirmation ullérieure des colonies. Pour certains mmilieux contenant des indicateurs colorés, il est recommandé de laisser les boites réfrigérées s'équilibrer & température ambiante avant leur examen, pour s'assurer de la récupération correcte de la couleur. Calcul et expression des résultats sur mi 11. Comptage des colonies ‘Aprés la période diincubation mentionnée dans la norme spécifique, procéder au comptage des colonies (colonies en tolalité, colonies caractéristiques ou colonies caractéristiques présumées) pour chaque boite contenant jusqu'a et y compris 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique). Dans le cas du comptage des colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées, la description des Colonies doit étre celle indiquée dans la norme spécifique. Dans certains cas, les colonies peuvent étre difficiles compter (par exemple en présence de micro- organismes envahissants). Considérer les colonies envahissantes comme des colonies uniques. Si moins d'un quart de la bolte est envahi, compter les colonies sur la partie non affectée de la bolte et calculer par extrapolation le nombre théorique de colonies correspondant a la boite entiére. Si plus d'un quart de la boite est envahi, ne pas prooéder au comptage. Considérer une chaine de colonies comme une unité formant colonie. NOTE _ Ilpeut étre utile, dans certains cas, de prévoir des bottes ensemencées supplémentaires, qui sont conservées a (3 # 2) °C pour les comparer, lors du comptage, avec les boites ensemencées incubées, afin de ne pas confondre les particules du produit examiné avec les colonies. Pour pouvoir faire la différence entre les particules du produit et les colonies, une loupe binoculaite peut également étre utilisée Les différents modes de calcul doivent tenir compte des boites ne contenant aucune colonie, lorsque celles-ci ont été rotenues, car elles sont significatives lors du calcul d'une moyenne pondérée.12. Expression des résultats 12.1. Généralités Dans le présent paragraphe, les cas traités comespondent aux cas généraux: — ensemencement d'une boite de Petri d'un diametre de 90 mm par dilution et au moins deux dilutions successives sont réalisées; — nombre maximal dénombrable pour Ia totalité des colonies présentes: 300 par botte; — nombre maximal de ensemble des colonies (caractéristiques et non caractéristiques) présentes dans une boite dans le cas de comptage de colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées: de préférence 300 par boite; — nombre maximal dénombrable pour les colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées: 150 par boite: — nombre de colonies caractéristiques présumées ensemencées pour identification ou confirmation & partir de chaque boite retenue: en général 5, Ces nombres sont définis dans les normes spécifiques. Pour les micro-organismes produisant de grandes colonies, le nombre maximal de colonies dans une boite est spécifié dans la norme spécifique. En cas diutlisation de boites d'un diamatre autre que 90mm, le nombre maximal de colonies doit étre augmenté ou diminué proportionnellement a la surface des boites (ou des membranes), EXEMPLE — Pour les boites ensemencées dans la masse de 55 mm de diamétre, le nombre maximal de colonies dénombrables doit étre 110 (équivalent a un nombre total de 300 ufe sur une boite de Petri de 90 mm). — Pour les boites de 140 mm de diamétre, le nombre maximal de colonies dénombrables doit étre de 730 (équivalent & un nombre total de 300 ufc sur une botte de Petri de 90 mm). Les modes de calcul définis c-aprés prennent en compte les cas apparaissant le plus fréquemment lorsque les, essais sont réalisés conformément a la bonne pratique de laboratoire. De rares cas particuliers peuvent apparaltre (par exemple un rapport trés différent de celui du facteur de dilution entre les bottes de deux dilutions successives); il est alors nécessaire que les résultats de comptage obtenus soient examinés, interprétés ou éventuellement rejetés par un microbiologiste qualifié. 112.2. Mode de calc caractéristiques) I: cas gf Pour qu'un résultat soit valable, on estime en général qui est nécessaire de compter les colonies sur au moins une boite contenant au mains 10 colonies [colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies répondant aux critéres d'identification Calculer le nombre NV de micro-organismes présents dans 'échantilon pour essai, en tant que moyenne pondérée a partir de deux dilutions successives, a l'aide de la Formule (1): y-_2¢ a) Voted ou, EC estla somme des colonies compiées sur les 2 boites retenues de deux dilutions successives et dont au moins une contient au moins 10 colonies; V este volume de inoculum appliqué a chaque botte, en miliitres;desta dilution correspondant 4 la premiére dilution retenue [d= 1 pour un produit liquide non dilué (Gchantillon pour essai)) Si plus dune dilution est utlisée, on sattend & ce que Te rapport entre Te comptage des colonies de la dilution do et Ie comptage des colonics de la dilution ch soit égal 10%. Il convient que ls limites supérieure et inféricure soient spéciiges parle laboratoire pour le complage des colonies de la dilution dz, Ces limites peuvent étre celles proposées dans TSO 14461-2182, par exemple. Lorsque ees limites ne sont pas suvies il convient dinterpréter les résultats avee précaution EXEMPLE Si le comptage des colonies de Ia dilution d est de 250, il convient que le comptage des colonies de la dilution ds ne soit pas inférieur a 13 (5.2 %) et pas supérieur & 39 (15,6 %). Voir ISO 14461-2) Arrondir le résultat calculé deux chiffres significatifs. Pour cela, si le troisiéme chiffre est inférieur & 5, ne pas modifier le chiffre précddent; si le troisiéme chiffre est supérieur ou égal a 5, augmenter le chiffre précédent dune unite, Exprimer le résultat comme, de préférence, un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par la puissance appropriée de 10, ou un nombre entier avec deux chiffres significatifs. Exprimer le résultat comme le nombre NV de micro-organismes par millitre (produits liquides) ou par gramme (autres produits) EXEMPLE Un comptage a donné les résultats suivants: — Alla premidre dilution retenue (10-2): 168 colonies; la deuxiéme dilution retenue (10+): 14 colonies. Ye N 168214 182 _ gus VoAded tA.tt0 0,011 En arrondissant le résulta tel que spécifié ci-dessus, le nombre de micro-organismes est de 17 000 ou 1,7 x 10 par mililitre ou par gramme de produtt 1.2.3. Mode de calcul: cas aprés identification (iconfirmation) Lorsque la méthode utiisée nécessite une identification (/confirmation), un nombre déterminé 4 (en général 5) de colonies caractéristiques présumées est identfié (Iconfirmé) a partir de chacune des boites retenues pour le comptage des colonies. Apres identification (Iconfirmation), calculer, pour chacune des boites, le nombre a de colonies répondant aux critéres diidentification (/confirmation), & tide de Formule (2): bee @ a best le nombre de colonies répondant aux critéres d'identification (/ de confirmation) parmi les colonies identifiées; C__estle nombre total de colonies caractéristiques présumées comptées sur la botte. Arrondir les résultats calculés au nombre enter le plus proche. Pour cela, si le premier chiffre apres la virgule est inférieur & 5, le chiffre précédent n'est pas modifié; sile premier chiffre aprés la virgule est supérieur ou égal 85, le chiffre précédent est augmenté d'une unite Calculer le nombre NV, Ng ou N’ de micro-organismes identifiés ou confirmés présents dans I'échantillon pour essai, en remplagant EC par Ea dans la formule indiquée ou en remplagant C par a dans les formules. Arrondir les résultatsEXEMPLE Un comptage a donné les résultats suivants: la premiére dilution retenue (10%): 68 colonies; — la deuxiéme dilution retenue (10-*): 4 colonies. Des colonies sélectionnées ont été soumises aux essais d'dentfication (/ de confirmation) — des 66 colonies, 8 colonies ont été soumises essai, dont 6 ont répondu aux erittras; dol « — des 4 colonies, les 4 ont toutes répondu aux critéres; dot a= 4 ye 2" soe 9.090 Vdd teito% 4,nao% En arrondissant le résultat tel que spécifié en 10.3.2.2, le nombre de micro-organismes est de 49 000 ou 4,9 x 10¢ par rlitro ou par gramme de produ 11.2.4, Mode de calcul: estimation des petits nombres Cas d'une boite (échantillon pour essai ou suspension moins de 10 colonies ‘ou premiére dilution) contenant Les comptages compris entre 10 et la limite supérieure de chaque méthode correspondent a 'étendue de fidélité optimale. La fidélité diminue rapidement lorsque le nombre de colonies diminue au-dessous de 10. Toutetois, selon la finalité de Tessai, une limite inférieure de détermination peut étre définie comme ci-dessous our un nombre inférieur & 10. Conformément a 'ISO/TR 13843"), la definition de la limite de détermination est: «concentration de particules moyenne la plus faible x par prise analytique, lorsque lincertitude type relative prévue est égale a une valeur spécifiée », Le coefficient de variation, Cy, est calculé en divisant estimation de I'écart-type s d'une population, obtenue a partir d'un échantillon de cette population, par la moyenne x de cet échantilon. Par conséquent, Cy =slx. Dans le cas d'une distribution de Poisson, x est calculé a aide de la Formule (3): @) Cc Sin Cy-de 50 % est défini comme étant Ia limite acceptable de fidélité relative (ce qui paral étre raisonnable fen microbiologie), la limite inférieure de détermination sera le nombre de colonies donné par: _ 0.50% 4 Aisi, il est recommandé de traiterIes résultats fondés sur les comptages inférieurs & quatre comme une simple dé de la présence de micro-organismes. En résumé Sila bolte contient moins de 10 colonies, mais au moins 4, calculer le résultat & V'aide de la formule: c Ved Ne et 'exprimer comme le nombre estimé Nz de micro-organismes par mililitre (produits liquides) ou par gramme (autres produits). NOTE expression «nombre estimé» signif une estimation moins précise de la valeur vale, 8Si le total est compris entre 3 et 1, la fidélité des résultats est si faible que fon doit exprimer le résultat comme suit Le micro-organisme est présent, mais avec moins de 4/Vd par gramme ou par mb. 1.2.5. Cas d'une boite (échantillon pour essai ou suspension contenant aucune colonie ou premiére dilution) ne Si la boite contenant 'échantillon pour essai (produits liquides), ou la suspension mére (autres produits) ou la premiere dilution ensemencée ou retenue, ne contient aucune colonie, reporter le résultat comme suit moins de 11d micro-organismes par mililitre» (produits liquides) ou «moins de 1/Y'd micro-organismes par gramme» (autres produits) dest le taux de dilution de la suspension mare ou de la premiére dilution ensemencée ou retenue [d= 10° = 4 pour un produit liquide non dilué (échantillon pour essai); V estle volume de inoculum appliqué & chaque botte, en mililitres, Cas particuliors Généralités. Ces cas concement le comptage des colonies caractéristiques ou caractéristiques présumées & confirmer. Cast Si le nombre de colonies caractéristiques ou non caractéristiques dans la boite contenant une premiére dilution dy est supérieur 4 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), avec des colonies caractéristiques visibles ou des colonies identifi¢es/confirmées et si la boite contenant la dilution suivante dz contient moins de 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), et aucune colonie caractéristique ou identifige/confirmée n'est visible, reporter le résultat comme suit: aanoins de 1/242 et plus de 1/¥dy micro-organismes par mililitre» (produits liquides) ou moins de 1/V2dp ¢t plus de 1/4, micro-organismes par grammes (autres produits) dy etd, — sontles taux de dilution correspondant aux dilutions d; et da, vs est le volume de inoculum utilisé dans la botte de la premiére dilution di, en millilitres; Ve est le volume de inoculum utilisé dans la boite de la dilution ultérieure dz, en millilitres. EXEMPLE —_Un comptage a donné les résultats suivants: — 4 la premidre dilution retenue (10%): plus de 300 colonias sur fa boite, avec des colonies caractéristiques ou Identinéesiconfimées présentes; — lla deuxiéme dilution retenue (10°): 33 colonies, sans colonie caractéristique ou identifée/confimée présente, Le résultat, exprimé on micro-organismes, est moins de 1 000 et plus de 100 par mililire ou par gramme de produit.cas2 Sile nombre de colonies caractéristiques ou non caractéristiques dans la botte contenant une premiére dilution dh est supérieur & 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), ne comprenant aucune colonie caractéristique visible ou identifige/confirmée et sila botte contenant la dilution suivante d contient jusqu’a et y compris 300 colonies (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), et aucune colonie caractéristique ou identiiée/confirmée n'est visible, reporter le résultat comme suit: emoins de 1/2 micro-organismes par mililitre» (produits liquides): ou «moins de 1/Vad2 micro-organismes par gramme» (autres produits) oa dle estle taux de dilution correspondant a la dilution de Va estle volume de inoculum utilisé dans la boite de la dilution ultérieure da, en mililitres; EXEMPLE Un comptage a donné les résultats suivants: — la premi@re dilution retenue (10-2): plus de 300colonies sur la botte, sans colonie caractéristique ou Identiigesiconfimées présentes; — la douxiéme dilution retenue (10°): 33 colonies, sans colonie caractéristique ou identiiée/confirmée présente; Le résultat, exprime en micro-organismes, est inférieur a 1 000 par miliitre ou par gramme de produit. 2.6. Mode de calcul: cas particuliers Sie nombre de colonies comptées (colonies en totalité, colonies caractéristiques ou colonies caractéristiques présumées) est supérieur au nombre maximal comptable (300 ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique) pour la boite contenant la premiére dilution ds, avec un nombre de colonies (colonies en totalité, colonies caractéristiques ou répondant a des critéres d'identification) inférieur & 10 (limite de estimation des petits nombres) pour la boite contenant la dilution suivante dz, exprimer les résultats comme suit: a) Si le nombre de colonies pour la boite contenant la dilution d: est compris dans lintervalle [nombre maximal comptable + 1, limite supérieure de lintervalle de confiance du nombre maximal comptable] (par exemple 301-334) et que le comptage des colonies de la dilution d2 est au moins égal a la limite inférieure spécifiée, utliser la méthode de calcul pour les cas généraux 10EXEMPLE 1 Un complage (dans le cas d'un nombre maximal fixé & 300 pour le comptage des colonies) a donné les résultats suivants: — 4 la premiére dilution retenue (10): 310 colonies (comptage inférieur 2 334, limite supérieure de Tintervalle de confiance pour 300) — lla douxiame dilution retenue (10°: 8 colonies. La limite inférieure pour le comptage des colonies a la dilution (10°) est de 18 colonies, obtenve partir des 310 colonies de la dilution (10-2). Le résultat de ce comptage de colonies n'est pas acceptable. EXEMPLE 2 Un comptage (dans le cas d'un nombre maximal fixé & 150 pour le comptage des colonies) a donné les. reésullats suivants: — 41la premiére dilution retenue (10-2): 160 colonies (comptage inférieur & 174, limite supérieure de Tintervalle de confiance pour 150); 2 la deuxiéme dilution retenue (10): 8 colonies. La limite inférieure pour le comptage des colonies a la dilution (10-2) est de 7 colonies, obtenue & partir des 160 colonies de la dilution 10°* Ubliser le mode de calcul pour les cas généraux (10.3.2.2) & parti dos boites contenant las deux dilutions retenues, b) Si le nombre de colonies pour la boite de fa dilution d: est supérieur @ la limite supérieure de fintervalle de confiance du nombre maximal comptable (par exemple 334) et que le comptage des colonies de la dilution d2 est au moins égal a la limite inférieure spécifiée et calculée & partir de la limite supérieure de lintervalle de confiance du nombre maximal comptable, ne retenir que le résultat du comptage de la dilution d puis calculer un nombre estimé. EXEMPLE 1 Un comptago (dans le cas d'un nombre maximal fixé & 300 pour le comptage des colonies) a donné les resullats suivants: 8 la premiére dilution retenue (10): plus de 334 colonies dans la boite: 2 la deuxieme dilution retenue (10°): 9 colonies. La limite inférieure pour le comptage des colonies a la dilution (10°) est de 20 colonies, obtenue a partir des 334 colonies de la dilution 10-2 Le résultat de ce comptage de colonies n'est pas acceptable. EXEMPLE 2 Un comptage (dans le cas d'un nombre maximal ixé & 150 pour le comptage des colonies) a donné les resultats suvants: — Alla promiare dilution retenue (10°): plus de 174 colonies dans fa botte; — lla douxiéme dilution retenue (10): 9 colonies. La limite inférioure pour le comptage des coloni est de 8 colonies, obtenue & partir des 174 colonies de la dilution 10 * la dilution (10%) Etablir un nombre estimé sur la base des colonies compiées dans ia boite de la dilution 10 ° EXEMPLE 3 Un comptage (dans le cas d'un nombre maximal fixé & 150 pour le comptage des colonies) a donné les resullats suivants: 8 la premiére dilution retenue (10°): plus de 174 colonies dans la boite:, — lla deuxiéme dilution retenue (10°) 5 colonies. La limite inférieure pour le comptage des colonies a la dilution (10) est de 8 colonies, obtenue & partir des 174 colonies de la dilution 10°* Le résultat de ce comptage n'est pas acceptable. "1Lorsque le comptage des colonies (colonies en totalité, caracteristiques ou caractéristiques présumées) de chacune des boites pour toutes les dilutions ensemencées donne un nombre supérieur 4 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique), reporter le résultat comme suit: «plus de 300/rd» (cas de colonies en totalité ou caractéristiques); ou «plus de (300/1/d) x (b/4)» (cas de colonies confirmées), exprimé en micro-organismes par mililitre (produits liquides) ou en micro-organismes par gramme (autres produits) ou. d__ estla dilution correspondant a la derniére dilution ensemenoée; Vestle volume de inoculum appliqué a chaque boite, en millitres; este nombre de colonies répondant aux critéres didentification parmi les 4 colonies ensomencées. Lorsque seule la boite de la demiére dilution ensemencée peut étre comptée et contient plus de 10 et moins de 300 (ou tout autre nombre indiqué dans la norme spécifique) colonies (colonies en totalité, caractéristiques ou caractéristiques présumées), calculer le nombre N’ de micro-organismes présents en utilisant la Formule (4) 4) Vad ou. © estle nombre de colonies comptées dans la boite;, V estilo volume de linoculum appliqué a chaque boite, en millilitres; desta dilution correspondant a la dilution retenue. Arrondir les résultats Exprimer le résultat comme le nombre N’ de micro-organismes par milllitre (produits liquides) ou par gramme (autres produits). EXEMPLE Un comptage a donné les résultats suivants: — la domiére dilution ensemencée (10°): 120 colonies, Par conséquent "= 2°. 1200 000 10 En arrondissant le résultat tel que spécifié en 10.3.2.2, le nombre N’ de micro-organismas est de 1 200 000 ou 1,2 x 10° pear miliitre ou par gramme de produit 12Ill Dénombrement des levures et moisissures lL.1. Généralités est recommandé généralement de toujours dénombrer les levures et moisissures soit par la technique dans la masse, qui permet un dénombrement plus aisé, soit par la technique densemencement en surface, avec laquelle les cellules sont soumises a une exposition optimale & loxygene atmosphérique et qui évite le stress thermique de la gélose en surfusion. 1 est recommandé de sécher les boites gélosées précoulées avant de les ensemencer (voir ISO 11133), Certaines levures et moisissures peuvent &ure pathogénes ou peuvent provoquer des réactions allergiques, parfois méme chez des personnes en bonne santé. C'est pourquoi, il est important dtre raisonnablement prudent en travaillant avec les, champignons. Idéalement, il est recommandé de conserver les boites dans une étuve, et non dans une piece ouverte Il est recommandé douvrir les boites le moins possible, normalement uniquement dans un objectif critique tel que la préparation une lame pour un examen au microscope. Il est recommandé de refroidir les aiguillestraitées 1a flamme avant d'effectuer des repiquages, afin c'éviter la dispersion de conidies et d'autres cellules, 1] est recommandé de désinfecter les plans de travail et les etuves réguligrement. Etant donné que tout mouvement peut entrainer un relargage de conidies ou de spores de moisissures pouvant provoquer le développement de colonies satellites susceptibles de fausser les résultats en donnant une surestimation de la population, il est recommandé dincuber les boites de Petti en position non retoumnées et stables, jusqu' ce qu‘eles soient prétes pour le comptage, 11.2. Comptage des colonies pour les levures et moisissures Les boites contenant de 10 a 150 colonies sont généralement comptées. Si la mycoflore est essentiellement composée de moisissures, sélectionner des bottes parmi celles contenant la population la plus faible; si elle est essentiellement compasée de levures, il est possible de sélectionner des boites atteignant la limite supérieure pour le comptage. Siil existe un doute sur lidentité des colonies, examiner les états frais ou les colorations des cellules d'au moins 5 colonies par échantillon afin de confirmer l'absence de bactéries. 11.2.1, Dénombrement en milieu liquide a Principe Les prises dessai sont ensemencées dans un milieu liquide, concu pour favoriser la croissance d'un micro- organisme ou d'un groupe particulier de micro-organismes, et, le plus souvent, pour inhiber la prolifération d'autres types de micro-organismes. Pour déterminer sil y a eu croissance des micro-organismes recherchés, il existe différents critéres, tals que apparition de turbidite, la production de gaz, les changements de couleur, et isolement des micro- organismes sur un milieu de culture gélosé sélectif avec une atmosphere et une température diincubation déterminges. La composition des milieux de culture et les critéres permettant de distinguer un résultat positf d'un résultat négatif sont définis dans les normes afférentes. En utilisant cette approche, seule une valeur qualitative peut étre attribuée & chaque prise d'essai, c'est-a-dire un résultat positif ou négatif. Pour obtenir une estimation de la quantité de micro-organismes présente, il est nécessaire d'examiner les diverses prises d'essai, la suspension mére et les différentes dilutions et dutiliser des procédures statistiques pour déterminer le nombre le plus probable (NPP). Si le NPP est utilisé pour analyse des échantilons solides (y compris les poudres), une seule prise dessai doit tre prélevée pour préparer la suspension mere. A partir de cette suspension mére, il est recommandé «utiliser des aliquotes pour les examens 13b- Ensemencement = Généralités Si un milieu de culture sélectif est wilisé, il est recommandé que V'ajout de la prise d'essai ne réduise pas ses propriétés sélectives (ce qui permetiait la croissance de micro-organismes autres que les micro-organismes recherchés). Dans la plupart des notmes, la compatibilité d'une matrice spécifique avec le milieu liquide est déerite dans le domaine application. II est recommandé cependant de prendre des précautions pour certaines matrices telles que les épices, le cacao, le bouillon, ete., car elles contiennent des substances inhibant la croissance, nécessitant Vajout de composés neutralisants, V'application de taux de dilution plus importants, une centrifugation, une filtration ou une séparation ‘immunomagnétique pour séparer les micro-organismes cibles de la matrice, méme si ce n'est pas toujours spéeifié dans les normes correspondantes. Lincompatibilité peut également étre due i la composition biologique de la matrice: les Echantillons environnementaux fortement contaminés, les produits fermentés ou les produits contenant des bacteties probiotiques représentent manifestement un défi plus important pour la microbiologic analytique que pour les échantillons qui ne contiennent qu'un petit nombre de micro-organismes. Pour ces matrices qui posent probleme, il est recommandé effectuer des expériences de contamination artificielle avec des micro-organismes représentatifs, pour valider que la méthode est bien compatible avec la matrice. = Mode opératoire ‘Sauf indication contraire dans les normes correspondantes, des volumes de prise d'essai inférieurs ou égaux a 1'ml sont normalement ajoutés & cing a dix fois le volume du milieu & concentration simple. Les prises essai comprises entre 1 mi et 100 mi sont normalement ajoutées a un volume égal de milieu double concentration. Pour les volumes supéricurs @ 100 ml, un milieu plus concentré peut étre utilisé. Pour des besoins spéeifiques, les milieux déshydratés stériles peuvent étre dissous dans léchantillon froid (ou préchauffé & 30 °C) pour V'analyse. Sauf spécification contrare, il est recommandé que le laps de temps entre 1a préparation de la suspension mére d'un Echantillon et lensemencement du dernier tube, des microplaques ou du flacon, soit infétieur a 30 min.(Figure 4) a Jf Prenat Tmt pe a eat nmap JUG Fig 4: Dénombrement en milieu liquide 4c Choix du systéme d’ensemencement Le principe de la méthode NPP est la dilution d'un échantillon a un niveau tel que les inoculats contiennent, la plupart du temps mais pas toujours, des micro-organismes cibles viables. Le «résultat», cesta-dire le nombre dinoculats produisant une croissance a chaque dilution, permettra une estimation de la concentration initiale des bactéries dans l'échantillon. Afin d'obtenir des estimations sur une large gamme de concentrations possibles, les microbiologistes utilisent des dilutions en série en incubant plusieurs tubes (ou boite, etc.) & chaque dilution. Le NPP de micro-organismes présents dans Téchantillon intial, ainsi que Ia fidéité de estimation, peuvent étre calculés par des procédures statistiques, sur la base des nombres de tubes posits et négaifs observés aprés incubation. Choisir parmi les différentes configurations de NPP disponibles, selon — le nombre escompté de micro-organismes dans 'échantillon examiné:; — les exigences réglementaires; — la fidélté requise; et — toute autre considération pratique. Lincerfitude de mesure dépend du nombre de prises d'essai positives observées dans des conditions similaires, tout comme lincertitude de mesure d'un dénombrement de colonies dépend du nombre de colonies sur une boite. Lincertitude de mesure varie en fonction de la racine carrée du nombre de tubes ulisés, car la fidélité augmente avec Taugmentation du nombre de répétition des essais; mais il est nécessaire de multiplier le nombre de tubes par quatre pour diviser par deux \'incertitude de mesure. L'incertitude de mesure relative est élevée lorsque les systémes ne comportent qu'un petit nombre de tubes par dilution. 1516 En fonction de leur taille, les prises d'essai peuvent étre ensemencées dans des tubes ou des flacons contenant la quantits requise de milieu liquide. Pour les prises d'essai de petite taille, des microplaques peuvent également Ge utilisées. d- Systéme de dilution simple Lorsque la concentration prévue en micro-organismes est faible ou peu variable, le systéme d'ensemencement le plus approprié est une seule série de prises d'essai égales. Lorsque le rapport attendu entre le nombre maximal et minimal de micro-organismes est inférieur environ 25, il est prévu au moins dix prises d'essai paralléles pour fournir des informations utiles; avec 50 tubes en paraliéle, le rapport est limité & 200. Si la concentration réelle est proche de \'extréme des valeurs NPP possibles, alors la chance que tous les tubes montrent une croissance ou une absence de croissance est probablement trop élevée. Des exemples de dilution unique des NPP e- systéme de dilution multiple Lorsque la concentration des micro-organismes dans I'échantillon est inconnue ou présumée trés variable, i peut étre nécessaire d'ensemencer des séries de tubes a partir de différentes dilutions. Ensemencer un nombre Suffisant de dilutions afin de garantir un systmo obtenant des résultats positifs et négatifs. Le nombre de dilutions & utliser dépend également de la méthode de calcul utlisée pour estimer la valeur NPP. Sil est nécessaire dlutliser les tables NPP, alors les configurations des systémes sont limitées a celles disponibles dans les tables. Si des programmes informatiques sont utisés, le nombre de dilutions et de tubes paralléles nest pas limité, ce qui est important pour l'utilisation de nouveaux kits commerciaux d'analyse utilisant le NPP. f Systéme de dilution symétrique Le systéme NPP symétrique le plus fréequemment appliqué utilise trois ou cing tubes paralléles par dilution. La fidélité de ce systéme avec un petit nombre de tubes par dilution est trés faible, Les résultats & partir d'un systéme a trois tubes donnent a peine plus qu'un ordre de grandeur de la concentration, Pour une plus grande fidélitg, il est recommandé de choisir cing tubes paralléles ou plus, g- Systéme de dilution asymétrique Les systémes de dilution asymétrique ont différents nombres de tubes a différents niveaux de dilution et il convient de ne les utiliser que pour estimer le nombre de micro-organismes présents dans une gamme bien définie (voir par exemple ISO $199). Un tube peut parfois étre perdu ou brisé, ce qui conduit @ un systeme asymétrique Toutefois, certains kits commerciaux d'essai sont basés sur des systémes asymétriques. Il est recommandé Glévaluer les données issues de ces systémes a l'aide d'un logiciel informatique approprié 1- Incubation Incuber les tubes, flacons ou bouteilles ensemencés dans une étuve ou un bain d'eau. Les microplaques sont placées dans une étuve, Choisirla durée et la température d'incubation apres s'étre référé a une méthode normalisée spécifique, puisque ces parameétres sont fonction du micro-organisme ou du groupe de micro-organismes recherché. Certains micro-organismes peuvent nécessiter une procédure d'incubation en deux étapes et/ou une étape de confirmation, Pour des informations détaillées, consulter les normes spécifiques, mais noter que cela peut ajouter un degré de complication supplémentaite la déduetion des valeurs NPP. 1.2.3. Interprétation des résultats Les critéres permettant de distinguer les résultats positifs des résultats négatifs varient en fonction de chaque micro-organisme ou groupe de micro-organismes et sont définis dans les normes correspondantes. En utilisant ces critéres, compter et enregistrer le nombre de résultats positifs obtenus avec toutes les prises d'essai provenant de léchantilon.13. Détermination des valeurs NPP Il existe trois méthodes différentes de détermination de la valeur NPP: le calcul avec des formules mathématiques, la consultation des tables NPP ou Ttilsation de programmes informatiques spécifiques. Etant donné que ces méthodes sont basées sur des considérations statistiques identiques, elles ont une validité équivalente. Ces trois méthodes sont détaillées ci-dessous. 113.1. Formules mathématiques . Formule approximative pour tous les cas Les valeurs NPP approximatives (/M) pour tout nombre de dilutions et de tubes paralldles peuvent tre dérivées de lapplication de la Formule (5): Zz Mik 8 6) almgmy ou Zp est le nombre de tubes positifs; ng est la masse totale, en grammes, de l'échantillon dans tous les tubes présentant une réaction négative; m_estla masse totale, en grammes, de chantillon dans tous les tubes. EXEMPLE A supposer que fon soumet a essai 10 prises dessai de chacune 0,1 9, 0,01 g et 0,001 g et que Ton trouve 10, 4 et 2 résultats positfs, alors pour les réponses fractionnaires uniquement (c'est-a-dire 4 et 2,) le nombre total de tubes posits est Zp= 6. La masse totale soumise a essai est m= 10 x 0,01 + 10 x 0,001 = 0,11 g: et la masse totale dans les tubes, négatifs est m,= 6 x 0,01 + 8 x 0,001 = 0,088. mig--p—8§__ 88 (68x01 0,086 5 urs Ce résutt est comparable la vleurtabulée pour 10 4 2, qui comespond & un NPP par gramme de 70. b. Solution «exacte» pour une série de tubes La valeur NPP (11) dune seule série de tubes est derivée de la Formule (6): ty 5 MI © m \nh od 1m estla masse, en grammes, de 'échantillon dans chaque tube de la série; In este logarithme népérien; Nestle nombre de tubes de a série; S'_ estle nombre de tubes présentant une réaction negative. 7