TD Biologie Moléculaire L2 GB ESGIB
Exercice 1 :
La séquence d’un ADN bicaténaire, correspondant à un gène, est partiellement reportée :
5’ ATACGGGATCCGAGCTCTCGATCGTCTGCAGAAATTCC 3’
1) On mélange ce brin d’ADN apparié avec son brin complémentaire à un autre fragment d’ADN
double brin. La solution est portée à une température supérieure à leurs Tm respectives, puis
refroidie. Que peut-on attendre?
2) Voici la séquence d’une amorce (ou primer) : 5’ - TTTCTGCA- 3’ Où cette amorce se fixera-
t-elle sur la séquence d’ADN ? Quelle séquence obtiendra-t-on après élongation par la DNA-
polymérase ?
Exercice 2 :
L'ADN d’un plasmide de 48,6 kpb a été hydrolysé par l'enzyme de restriction Sal I. Cet ADN est
analysé par électrophorèse sur gel d’agarose (pistes 2 et 4). Un marqueur de taille (l'ADN du
phage lambda hydrolysé par l'enzyme de restriction Hind III ) est déposé dans les puits 1 et 3. Ce
marqueur de taille est un mélange équimolaire de fragments d’ADN de tailles connues. La
quantité d’ADN total déposé dans les puits 1 et 2 est le double de celle des puits 3 et 4. Après
coloration par le bromure d’ethidium**, l’image suivante est
obtenue.
1) A l’aide du tableau 1, tracer la courbe étalon : Log taille(pb)
= f(distance de migration).
2) À partir de cette courbe, déduire la taille des fragments issus
de la digestion par l'enzyme de restriction Sal I de l'ADN du
plasmide recombinant (pistes 2 et 4).
3) La somme des tailles des fragments obtenus vous semble-t-
elle en accord avec la taille attendue de 48,6 kpb ?
4) Le bromure d’ethidium s'intercale entre les bases de l'ADN
de manière uniforme sur une molécule d'ADN linéaire. Étudiez
attentivement la photo du profil de restriction, que remarquez vous?
Qu’en déduisez-vous ?
Exercice 3 :
Un plasmide circulaire possède un site de coupure par l’enzyme XhoI et deux sites de coupures
pour l’enzyme SmaI. Ces deux sites pour l’enzyme SmaI sont situés de part et d’autre du site
XhoI, à égale distance de ce site. Lorsque vous effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose de
l’ADN de ce plasmide digéré par l’enzyme XhoI ou par SmaI en présence de bromure
d’éthidium, on estime la taille des fragments obtenus à 3 kb ou à 1.5 kb respectivement. Lorsque
vous effectuez la double digestion XhoI et SmaI, la somme des fragments obtenus fait 2.25 kb.
Tracer la carte de restriction de ce plasmide en positionnant les sites XhoI et SmaI.
Exercice 4 :
Un fragment d’ADN HindIII-HindIII de 1kb est digéré par l’enzyme EcoRI en un fragment de
300 pb et un fragment de 700 pb. Si le fragment de 300 pb est purifié et digéré par l’enzyme PstI,
il donne deux fragments : l’un de 100 pb et l’autre de 200 pb. Si le fragment de 700 pb est traité
de la même façon, il produit deux fragments : l’un de 500 pb et l’autre de 200 pb. Lorsque le
fragment HindIII-HindIII est digéré directement par l’enzyme Pst1 on obtient trois fragments :
100, 200 et 700 pb.
Expliquez ces résultats à l’aide de schémas. Qu’obtiendrait-on en effectuant la double digestion
EcoRI et PstI sur le fragment de 1kb ?
Exercice 5 :
Un chromosome linéaire de phage est marqué au 32P à ses deux extrémités et digéré par EcoRI.
Une électrophorèse sur gel d’agarose en présence de Bet permet de mettre en évidence des
fragments de 2.9 – 4.5 – 6.2 –7.4 et 8 kb. Après Southern blot et autoradiographie, seuls les
fragments de 6.2 et de 8 kb sont détectés. Avec l’enzyme BamHI la taille des fragments obtenus
est de 6.0 – 10.1 – 12.9 kb. Et, dans ce cas, le marquage est associé aux fragments de 6,0 et 10.1
kb. La double digestion EcoRI et BamHI permet d’obtenir les fragments de 1.0 – 2.0 – 2.9 – 3.5 –
6.0 – 6.2 et 7.4 kb.
Déterminer la carte de restriction de ce chromosome.
Exercice 6 :
Parmi les séquences oligonucléotidiques suivantes lesquelles vous paraissent susceptibles
d’hybrider avec le fragment d’ADN ci apres.
Oligo 1 : 5’ CGGGCACCCGGGTTA 3’
Oligo 2 : 5’ CCCGGGGATCCCGGG 3’
Oligo 3 : 5’ GACTGATCTGACATG 3’
Oligo 4 : 5’ GAGAAACTGACTGAC 3’
5’ATCGGTGATCTGCAGTCCCGATCGGGCACCCGGGTTAGCGATCGTTTAATGGGTCG
GCCCGGGGATCCCGGGCCTGGACTGA TCTGACATGGTGTCAGTCAGTTTCTC 3’
Vous réalisez un séquençage de ce fragment d’ADN par la méthode de Sanger avec l’amorce
oligonucléotidique simple brin suivante : 5’ TCAGATCAGTCCAGG 3’.
Schématisez l’autogradiographie du gel de séquençage que vous devriez obtenir
Exercice 7 : Séquençage
Vous disposez d’un brin d’ADN à séquencer (matrice), d’une amorce, d’ADN polymérase, des
quatre 2’-désoxyribonucléotides (dXTP) et d’un jeu des différents 2’,3’-didésoxyribo-nucléotides
(ddXTP). L’amorce est radiomarquée par du phosphore radioactif 32P.
L’ADN matriciel à séquencer ACGTAATCGC---- comporte, à son extrémité 3’, une séquence
supplémentaire (représentée ici par un segment de droite en pointillé) sur laquelle l’amorce va
s’hybrider, créant ainsi le site d’initiation de l’ADN polymérase.
1 - Résumez brièvement le principe de la méthode en indiquant le rôle du
didésoxyribonucléotide.
2- Compléter un tableau en indiquant la composition des différents milieux réactionnels et, pour
chaque milieu, le type et la taille des fragments néosynthétisés
3- Schématisez le résultat de la migration des produits obtenus pour chaque mélange réactionnel.
Utiliser une échelle un carreau pour une base.
4- Reporter, à droite, la séquence du brin synthétisé puis la séquence recherchée, en indiquant le
sens de lecture des séquences établies.
