Techniques d’analyses des produits
pathologiques
Master II BPC
2021/2022
Enseignant. Ramzi LAMRAOUI
Analyses biologiques
Définition
Un ensemble d’étapes successives, allant du
prélèvement de l’échantillon biologique
(sang, urine, selle, LCR,……..) jusqu’à la
remise des résultats.
Produits pathologiques ?
Produits pathologiques
=
Produits biologiques contaminés
Produits pathologiques
Ce sont des produits biologiques où se sont
multipliés des micro-organismes
responsables de l’infection.
Diagnostic de
l’infection
Diagnostic
clinique
Diagnostic para
clinique
Examen Examens non
microbiologique microbiologiques
Analyses des produits pathologiques
Objectives
d'isoler et d'identifier les micro-organismes
pathogènes.
de mesurer leur sensibilité(s) aux antibiotiques
habituellement actifs sur cette ou ces bactérie(s).
« Antibiogramme »
Identification suivi épidémiologique
Règles générales concernant l’analyse bactériologique
Une analyse bactériologique ne doit pas se
résumer à une simple technique, mais doit être
orientée selon la demande du clinicien et selon
les renseignements cliniques qui accompagnent
le prélèvement.
Elle comprend 3 phases (pré-analytique,
analytique et post-analytique).
Phases analytiques des analyses de microbiologie médicale
Phase Définition
pré série d’étapes commençant chronologiquement par la
analytique prescription des analyses par le clinicien, comprenant la
demande d’analyse, la préparation du patient, le
prélèvement du spécimen, l’acheminement jusqu’au
laboratoire et au sein du laboratoire et finissant au début
de la procédure analytique.
analytique comprend tous les événements qui peuvent se produire
pendant l’analyse à proprement parlée.
post concerne tous les évènements qui peuvent se produire
analytique après l’analyse (remise des résultats,…..).
N.B. Les phases : pré-analytique et analytique sont les phases critiques
Démarche de l’examen bactériologique
Démarche de l’examen bactériologique
Le diagnostic bactériologique est un ensemble de
moyens permettant de confirmer telle ou telle étiologie
infectieuse d'origine bactérienne. Ces moyens
diagnostiques sont variés et caractérisent soit le
diagnostic direct soit celui indirect :
Démarche de l’examen bactériologique
Laboratory identification of microbial pathogens. The flowchart shows alternative paths for
identifying pathogens or pathogen exposure in the clinical laboratory.
Démarche de l’examen bactériologique
DIAGNOSTIC DIRECT : mise en évidence de la
bactérie elle-même, donc finalement de sa culture ou
isolement qui permettra l'identification ultérieure ainsi
que de préciser sa sensibilité aux antibiotiques
(antibiogramme).
Démarche de l’examen bactériologique
DIAGNOSTIC DIRECT
Ceci n’est pas toujours possible soit :
L’agent a disparu avant ou peu après l’apparition des
symptômes (ex : Rhumatisme articulaire aigu , brucellose) ou
a la suite d’un traitement antibiotique trop hâtif.
La bactérie de culture impossible, ex : agent de la syphilis
(tréponème)
La bactérie est de culture très lente ou nécessite des milieux de
culture spéciaux. Isolement fait par des laboratoires spécialisés
(ex : agent de pneumopathie atypiques : chlamydiae,
mycoplasmes).
Démarche de l’examen bactériologique
DIAGNOSTIC DIRECT
Ceci n’est pas toujours possible soit :
L’agent a disparu avant ou peu après l’apparition des
symptômes (ex : Rhumatisme articulaire aigu , brucellose) ou
a la suite d’un traitement antibiotique trop hâtif.
La bactérie de culture impossible, ex : agent de la syphilis
(tréponème)
La bactérie est de culture très lente ou nécessite des milieux de
culture spéciaux. Isolement fait par des laboratoires spécialisés
(ex : agent de pneumopathie atypiques : chlamydiae,
mycoplasmes).
Démarche de l’examen bactériologique
DIAGNOSTIC INDIRECT : mise en évidence de la
réponse de l'organisme à l'infection par la présence
d'anticorps spécifiques, le plus souvent sériques ou plus
rarement par une réponse d’hypersensibilité, dite
allergique.
Démarche de l’examen bactériologique
RETENIR : Le diagnostic direct est le seul diagnostic
de certitude, car il permet la mise en évidence de la
bactérie elle-même, donc finalement sa culture ou
isolement qui permettra l'identification ultérieure mais
aussi de préciser sa sensibilité aux antibiotiques
(antibiogramme).
Démarche de l’examen bactériologique
I- Les prélèvements (1ere étape du diagnostic)
Les prélèvements permettant de mettre en
évidence une bactérie responsable d'une
infection dépendent du site anatomique atteint,
mais peuvent correspondre à des liquides
biologiques dans lesquels la bactérie ou des
antigènes bactériens peuvent être détectés.
Les échantillons biologiques sont prélevés dans
des flacons stériles puis transmis au laboratoire
le plus rapidement possible.
Produits pathologiques
Monomicrobiens Polymicrobiens
Les monomicrobiens sont des Les polymicrobiens sont issus de
produits biologiques, qui est cavités naturelles qui sont
stérile à l’état normal. Par normalement septiques. Ce sont
exemple: Le LCR, le sang, les des produits riches en germes. Par
liquides pleuraux, les liquides exemple: Selles, Sécrétions
d’arthrite, les liquides buccales, vaginales,
Péricardes. rhinopharyngées.
En général, on isole qu’une Il y a de difficulté dans
seule bactérie responsable de l’interprétation des résultats
l’infection
I- Les prélèvements
sites normalement stériles
(liquide céphalorachidien, liquide articulaire, sang, biopsies, etc.)
contamination est très peu probable
si la désinfection a été correctement exécutée.
L'interprétation est relativement aisée.
I- Les prélèvements
site anatomique normalement stérile mais la
contamination par une flore endogène est
pratiquement obligatoire.
les prélèvements pulmonaires profonds comme les brossages distaux, même s'ils sont
protégés).
I- Les prélèvements
Enfin, lorsque la bactérie responsable de
l'infection est associée à une flore endogène.
(c'est le cas dans les infections digestives, les infections cutanées, les angines, etc.),
interférer avec l'isolement de la bactérie,
l'utilisation de milieux sélectifs.
Récapitulatif des lieux de prélèvements
Bons Bons
prélèvements résultats
I- Les prélèvements
I-1- Le préleveur
Il doit respecter les règles de soins et d’hygiène,
notamment en ce qui concerne (le port de gants,
blouse et dans certains cas de masques ou de
lunette de protection).
Tout produit pathologique doit être considéré
comme potentiellement infectieux
4 niveaux de sécurité biologique
BSL (Biosefty Laboratory Level 1, 2, 3, 4)
Tableau 1. Classification des micro-organismes infectieux par groupe
de risque
Groupe de risque 1 (risque faible ou nul pour les individus ou la collectivité)
Micro-organisme qui, selon toute probabilité, ne peut causer de maladie humaine ou animale.
Groupe de risque 2 (risque modéré pour les individus, faible pour la collectivité)
Germe pathogène capable de provoquer une maladie humaine ou animale mais qui ne présente
vraisemblablement pas un sérieux danger pour le personnel de laboratoire, la collectivité, le bétail
ou l’environnement. Une exposition en laboratoire est susceptible d’entraîner une infection grave,
mais qui peut être traitée ou prévenue efficacement; par ailleurs le risque de propagation
de l’infection est limité.
Groupe de risque 3 (risque important pour les individus, faible pour la collectivité)
Germe pathogène qui cause habituellement une grave maladie humaine ou animale, mais qui ne
se transmet généralement pas d’un individu à l’autre. Il existe un traitement et des mesures
préventives efficaces.
Groupe de risque 4 (risque important pour les individus comme pour la collectivité)
Germe pathogène qui cause habituellement une grave maladie humaine ou animale et peut se
transmettre facilement d’un individu à l’autre, soit directement, soit indirectement. Il n’existe
généralement ni traitement, ni mesures préventives efficaces.
I-1- Le préleveur
Chaque pays ou région devra établir une
classification nationale ou régionale, par groupe de
risque, des micro-organismes. Cette classification
devra reposer sur les critères suivants :
Pathogénicité du germe.
Mode de transmission et gamme d’hôtes, qui
peuvent dépendre de l’état immunitaire de la
population locale, de la densité et de la mobilité
des hôtes, de la présence de vecteurs appropriés
et du niveau d’hygiène de l’environnement.
I-1- Le préleveur
Possibilité de prendre localement des mesures
préventives efficaces, lesquelles peuvent comprendre
: une prophylaxie par vaccination ou administration
d’immunsérums (immunisation passive), des mesures
sanitaires concernant par exemple l’hygiène des
aliments et de l’eau, l’élimination des réservoirs
animaux ou des arthropodes vecteurs.
Possibilité de dispenser localement un traitement
efficace : immunisation passive, vaccination post-
exposition, utilisation d’anti-infectieux et d’agents
chimiothérapiques ou antiviraux, sans négliger le
risque d’apparition de souches pharmacorésistantes.
I-2- Le moment de prélèvement
Avant l’administration d’agents
antimicrobiens (ATB,….).
le début de processus infectieux (pic
fébrile).
N.B. Si la sévérité de l'évolution ne permet pas l'arrêt des antibiotiques pendant plus
de quelques heures, l'antibiothérapie en cours reste justifiée et des modalités
techniques particulières peuvent être proposées. L'ensemencement pourra par
exemple être pratiqué dans des milieux liquides permettant de diluer les
antibiotiques de l'échantillon, ou dans des milieux contenant des inhibiteurs
d'antibiotiques.
I-3- Le site de prélèvement
Le site de prélèvement Les plus proches du foyer
infectieux initial
Les localisations secondaires
La porte d’entrée
Les voies d’excrétion ou
d'évacuation de l’infection (fistule,
drainage).
1-4- Une quantité suffisante de matériel est
nécessaire pour une analyse complète
Une trop petite quantité de matériel ne permet
pas au laboratoire de réaliser les frottis et les
cultures appropriés. Le microbiologiste
privilégie alors les techniques permettant la
reconnaissance des bactéries les plus souvent en
cause.
1-4- Une quantité suffisante de matériel est
nécessaire pour une analyse complète
Ceci est particulièrement problématique pour les
lésions chroniques contenant un petit nombre de
micro-organismes qui risquent de ne pas être
détectés à l'examen microscopique d'un frottis,
ni même récupérés en culture. Des volumes
insuffisants peuvent donc donner lieu à des
résultats faussement négatifs.
1-4- Une quantité suffisante de matériel est
nécessaire pour une analyse complète
Comme les échantillons de sang, les produits de
ponction ou de biopsie contenant une faible
quantité de bactéries peuvent être ensemencés
directement dans un milieu de culture liquide. Il
faut alors réduire au maximum les risques de
contamination par des bactéries se multipliant
plus rapidement que l'agent pathogène.
I-5- Les méthodes de prélèvement
Dépendant des micro-organismes capable d’infecter différents
organes ou tissus. Elles dépendent également du type de lésion et
de l'enjeu du diagnostic étiologique, en limitant les indications
des prélèvements invasifs selon le bénéfice escompté et les
risques iatrogènes.
I-5- les méthodes de prélèvement
Dans tous les cas, les prélèvements seront
réalisés avec du matériel stérile à usage
unique, selon les règles d’hygiène et
d’asepsie appropriées.
I-5- Les méthodes de prélèvement
Ecouvillonnage
Faible volume Usage limité aux
d’échantillon recueilli, prélèvements des
Risque de dessiccation téguments ou des
et de contamination muqueuses
Specimens from the upper respiratory tract. (a) Throat swab. (b)
Nasopharyngeal swab passed through the nose. (c) Swabbing the
inside of the nose.
ponction
Suppurations d’une
séreuse, d’un organe creux cathétérisme
ou d’une cavité abcédée
chirurgie
I-6- Contamination des prélèvements
Bactéries de l’environnement (saprophyte)
Bactéries commensales (microbiote)
Ceci concerne en particulier les infections dont le site est
respiratoire, ORL, oculaire, intestinal, génito-urinaire,
cutané ou sous cutané.
Les procédés de décontamination de surface comportent soit
le simple rinçage avec de sérum physiologique stérile ou
l’utilisation sur la peau une solution antiseptique.
I-7- Récipients contenant les échantillons
Identification de récipient
Nom, prénom et la date de naissance de
malade
La date, l’heure, la nature et le site de
prélèvement.
1-8- Délai de transport et conservation des échantillons
En règle générale, les bactéries ne résistent pas à la
dessiccation et au froid, en particulier lorsque de petits
volume d’échantillon sont prélevés.
La plupart des échantillons primaires peuvent être
transportés à température ambiante (22°C) s’ils sont
apportés rapidement au laboratoire (délai inférieur à
4h).
Les bactéries qui ne supportent pas de délai peuvent
être préservées dans des milieux de transport
(assurent la survie des germes sans provoquer de
multiplication).
1-9- Conservation des échantillons
Pour éviter la dessiccation des échantillons de
faible volume, notamment sur écouvillon, ceux-
ci peuvent être placés dans des tubes contenant
des milieux de transport.
La conservation à +4°C inhibent la
multiplication bactérienne.
Cependant les shigelles sont très sensibles au
froid et nécessitent un ensemencement
immédiat.
1-10- Milieux de transport
Ces milieux sont destinés à la conservation de
certains types de micro-organisme et à
l’inhibition des autres organismes de croissance
plus rapide.
Les milieux de stuart conviennent pour la
plupart des bactéries, y compris les anaérobies
strictes.
Conclusions
Ne prélever que si c ’est nécessaire
respecter les conditions de prélèvement
et de transport
analyser et interpréter en fonction de la
clinique
étudier à mauvais escient peut entraîner
des erreurs de diagnostic
un traitement antibiotique non
nécessaire peut être dangereux pour le
patient et/ou l’environnement
(population)
Diagnostique de labo de l’infection
Examen microscopique
bactériologique
Examen direct à l’état Après Après réaction
frais coloration d’immunofluorescence
Non différentielle
Différentielle
(simple)
Gram Ziehl-Neelsen Spéciale
II. Coloration Différentielle
II.1. Coloration de Gram
Coloration de gram
Chez les bactéries à Gram positif, la paroi
bloque l'extraction du violet de gentiane et
de l'iodure par l'alcool alors qu'elle ne bloque
pas cette extraction chez les bactéries à Gram
négatif.
Coloration de Gram
Retenir : La coloration de Gram ne permet pas une
identification mais une orientation.
Renseigne sur
la présence (ou absence) de bactéries.
leur forme (cocci ou bacille, cocobacille,
fusiforme).
leur groupement (amas, chaînettes, diplocoques)
leur gram (+ ou -) ⇒ très utile car oriente
l’antibiothérapie.
Coloration de Gram (Résultat)
Bactéries qui ne sont pas colorable par Gram
1. Bactérie avec une paroi très riche en lipide.
Exp: Mycobactérie
2. Bactérie qui ne possède pas une paroi Exp:
Mycoplasme
3. Bactérie à multiplication intracellulaire
obligatoire. Exp Chlamydia, Rickettsia
4. Bactérie très mince pour la visualiser. Exp
treponema
III Les milieux de culture en
bactériologie
III. Les milieux de culture en bactériologie
III.1. Introduction
L’examen direct d’un étalement biologique
contenant des bactéries n’est généralement
pas suffisant pour identifier l’espèce
bactérienne en cause;
seule la culture associée à une galerie
d’identification biochimique peut garantir
une identification précise.
Les milieux de culture en bactériologie
III.2. Définition
Un milieu de culture est composé d’un
mélange de substrats nutritifs (acides aminés,
peptides, bases nucléiques, sucres, etc), d’un
système tampon pour éviter les variations
importantes du pH, de sels minéraux et de
vitamines. Il est possible d’ajouter d’autres
facteurs de croissance (sang, protéines,
hémoglobine, vitamines). Ils sont de nature
solide, semi-solide ou liquide.
Les milieux de culture en bactériologie
III.2. Définition
Les bactéries d'intérêt médical les plus
fréquemment responsables d'infection arrivent
à se développer sur des milieux de culture.
Ces milieux de culture sont indispensables à la
multiplication bactérienne, ce qui permet par la
suite une identification bactérienne ainsi que
l'étude de la sensibilité aux antibiotiques
lorsque la bactérie est isolée en culture pure.
Mobilité
Morphologie
facteurs
intrinsèques à la Capsule (+ ou -)
bactérie
Pigmentation
Apparence des
colonies
Fimbriae
facteurs
Milieu de culture
extrinsèques
N.B. L’aspect des colonies est le caractère primaire utilisé pour orienter
le diagnostic effectué par le bactériologiste
Morphologies des colonies bactériennes
III.3. Différents type de milieux de culture bactérien
• permet la croissance d'espèces non ou peu exigeantes.
Base
• enrichis par l'addition de diverses substances (sérum, œuf,
sang, vitamines, etc.) qui autorisent la croissance de bactéries
Enrichissement plus exigeantes (fastidieuse).
• Contient des facteurs qui permettent la croissance des
Différentiel différentes espèces bactériennes sur le même milieu.
• Par addition d'antibiotiques, d'antiseptiques ou de colorants qui
Sélectif vont inhiber les bactéries sensibles à ces composés.
IV. Techniques d’isolement et de purification
des bactéries pathogènes
IV. Isolement et purification des bactéries
IV. 1. Définition
L'isolement est une technique qui permet de séparer les
bactéries d'un échantillon. Il permet d'obtenir des
colonies différentes, espacées les unes des autres.
Les milieux d'isolement sont des milieux solides qui
permettent d'obtenir des colonies isolées permettant
d'effectuer les tests d'identification ou d'étudier la
sensibilité aux antibiotiques des bactéries d'intérêt
médical.
IV. Isolement et purification des bactéries
IV. 2. Principe
Une bactérie se multiplie en des millions d’exemplaires
identiques qui forment une colonie visible à l’œil nu.
Cela permet l'isolement des bactéries en culture pure parce
que la colonie est supposée provenir d'un seul organisme.
IV. Isolement et purification des bactéries
Attention: 2 bactéries l’une à coté de l’autre
peuvent donner une seule colonie visible à l’œil
nu.
IV. Isolement et purification des bactéries
Une colonie peut alors dénommée UFC pour
unité formant colonie.
Une colonie = UFC « unité formant colonie »
IV. Isolement et purification des bactéries
Si l’on sépare physiquement des bactéries en les
déposant sur un milieu de culture gélosé
(ensemencement) on a des chances de séparer
suffisamment les bactéries pour qu’une colonie
correspond à une seule bactérie.
IV. Isolement et purification des bactéries
Culture mixte Culture pure
Contient Plusieurs Contient une seule
espèces bactériennes espèce bactérienne.
IV. Isolement et purification des bactéries
IV. Isolement et purification des bactéries
Stérilisation
Culture
pure
Isolement
IV.3. Réussir un isolement
Pour bien
épuiser le
contenu
Séparer les
stries serrés bactéries du
mélange
Répartir ensuite
Bon isolement les bactéries
déposées
Ne pas abimer la
Geste souple
gélose
IV. 4. Méthodes d'isolement
Technique d’isolement par épuisement
(méthode des cadrants)
technique d’ incorporation dans la gélose
Ensemencement par la technique du râteau
IV. 5. Qu’est-ce qu’un bon isolement ?
La présence d’un nombre suffisant de colonies
isolées dans la dernière partie de l’isolement.
La présence d’un gradient décroissant et
régulier de colonies.
