CM YBST6C1 - Développement et Régénération

DEVELOPPEMENT ET REGENERATION DU MEMBRE DE VERTEBRE

Epimorphose d’ensembles complexes de tissus différenciés

G. Rivière – UMR BOREA

[Link]@[Link]
Université de Caen Normandie - 2023
LA REGENERATION CHEZ L’AMPHIBIEN /

I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I-3. Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I-4. Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
I-5. Spécification de l’axe dorso-ventral du membre

II- La régénération d’un membre de Vertébré

est un phénomène épimorphique
II-1. Les 4 grands types de régénération
II-2. Régénération du membre de salamandre (épimorphose)
II-3. Formation du patron du blastème et acide rétinoïque
II-4. Nature de la valeur de position proximo-distale
II-5. Source des cellules pour la régénération
I- Le développement du membre de vertébré
I.1- La spécification cellulaire

La constitution de types cellulaires différents chez les organismes pluricellulaires est

appelée différenciation cellulaire. Un membre de vertébré est constitué de types cellulaires
distincts.

Avant que les changements biochimiques et fonctionnels ne deviennent évidents, la cellule

s’engage dans une voie donnée: un lignage; son destin est alors déterminé.

Le processus d’engagement passe par deux stades:

- Spécification
- Détermination

Trois modes principaux de spécification cellulaire:

- Autonome
- Syncytiale
- Conditionnelle
I- Le développement du membre de vertébré
I.1- La spécification cellulaire

1- Spécification cellulaire autonome

Un blastomère isolé du reste de l’embryon:

- donnera les mêmes cellules que s’il était resté en
place
- ces cellules manqueront à l’organisme définitif

La spécification autonome est responsable d’un type

de développement dit « en mosaïque ».

Exemple: chez de nombreux invertébrés tels les

mollusques, annélides et tuniciers, des «
déterminants morphogénétiques » (protéines ou
ARN messagers) sont placés dans des régions
définies de l’oeuf et seront répartis dans les cellules
filles au fur et à mesure des mitoses. Le destin d’une
cellule dépend de ces déterminants.
Embryon de tunicier
I- Le développement du membre de vertébré
I.1- La spécification cellulaire

2 - Spécification cellulaire conditionnelle

La spécification conditionnelle implique des

interactions entre la cellule et ses voisines.
Chaque cellule est initialement capable de donner
plusieurs types cellulaires; des interactions avec
d’autres cellules vont limiter ses possibilités
Embryon d’oursin
L’excision d’un blastomère n’empêche pas la
formation d’un individu complet car les blastomères
restants vont compenser cette perte. La
spécification conditionnelle conduit à
l’embryogenèse avec «régulation», caractéristique
des vertébrés.

Embryon de poulet
I- Le développement du membre de vertébré
I.1- La spécification cellulaire

3 - Spécification cellulaire Syncytiale

Plusieurs insectes utilisent un autre type de

spécification cellulaire: la spécification
syncytiale. Dans ce type de spécification, les
interactions n’ont pas lieu entre cellules mais
entre plusieurs parties d’une même cellule.

Embryon de drosophile
I- Le développement du membre de vertébré
I.1- La spécification cellulaire

Mais…
Aucun embryon n’utilise exclusivement les mécanismes autonome, conditionnel ou
syncytial pour spécifier ces cellules:

-Certains embryons à embryogenèse avec « régulation » présentent certains

événements de spécification autonome (exemple de l’oursin).

- Certains embryons à développement autonome comme le tunicier ont leur

développement qui dépend d’interactions entre cellules.

- Les insectes comme la drosophile utilise les trois modes de spécification pour engager
ses cellules vers des destins différents.

Concernant la spécification conditionnelle:

Le sort d’une cellule peut donc être modifié par la présence d’autres cellules dans le
voisinage, mail peut également dépendre de molécules solubles sécrétées à une
certaine distance.
Une telle molécule porte le nom de morphogène: autour de son site de sécrétion
s’établit un gradient de concentration de morphogène.
I- Le développement du membre de vertébré
I.1- La spécification cellulaire

Pour qu’une molécule diffusible soit

considérée comme un morphogène,
les cellules doivent

1- répondre directement à la
molécule

2- la différenciation de ces cellules

dépend de la concentration de cette
molécule.

Un gradient d’activine provoque l’activation de différents gènes dans les cellules de

l’hémisphère animal de l’embryon de xénope.
LA REGENERATION CHEZ L’AMPHIBIEN /

I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.2- La spécification des bourgeons des membres

Un membre de vertébré est une structure complexe comprenant des tissus hautement
différenciés issus des trois feuillets embryonnaires organisés selon trois axes de polarité
- Proximo/distal, dorso/ventrel, antéro/postérieur
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.1- La spécification des bourgeons des membres
Animaux modèles: le poulet, la souris -> facilité d’utilisation, phénotypes bien caractérisés

La croissance du membre commence par la formation d’un bourgeon

-> un renflement du mesoderme latéral (somatopleure)
poulet: 15-21 (aile) et 26-32 (patte)
souris (et tous les mammifères) pattes avant somites 8-12; pattes arrières 27-34
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.2- La spécification des bourgeons des membres
I.2.a- Identité antéro-postérieure du membre
➔ Les mbs se forment dans des régions appelées ‘champs appendiculaires’ Le niveau
d’expression des gènes hox, qui définissent la position selon l’axe A/P déterminent le lieu de
bourgeonnement des mbs (mécanisme conservé chez de nombreuses expèces)
Mb antérieur: entre les vertebres cervicales P et les vertébres thoraciques A
-> limite antérieure d’expression commune Hoxb8 et Hoxc6
Mb post: entre les vertèbre lombaire P et vertebre sacrée A (qques jours + tard).
-> limite ant Hoxc9

Expérience: expression FGF + implantation de billes de FGF

-> induction d’un membre ectopique
-> si près de l’aile: aile; si près de patte: patte -> Qu’est-ce qui définit l’identité
Ant/Post ??
Embryologie classique: c’est le mésoderme qui définit l'identité aile ou patte.
➔Mesoderme aile ≠ mesod. Patte au niveau moleculaire.
➔Recherche de molecules differentiellement exprimées dans l’aile et la patte.
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.2- La spécification des bourgeons des membres
I.2.a- Identité antéro-postérieure du membre
Identification de Tbx4, Tbx5 et Pitx
Gènes à ‘boite T’-> facteurs de transcription Cf Brachyury
mutations du gènes: pb dvpt bras chez l’homme.

-> hypothèse du rôle de Tbx:

Tbx5 -> aile; Tbx4-> patte
Expériences de KO conditionnals -> plus d’aile ni de patte
mais restauration ‘croisée’ partielle des phénotypes
➔ Tbx4 et 5 impliqués dans la phase précoce de la croissance,
mais pas dans l’identité Ant/Post

Pitx1: T-box+homeodomaine. Exprimé très tôt dans la région de la patte, inhibe Tbx5.
Double KO Tbx/Pitx -> Participe à l’identité Ant/ Post avec les gènes HoxC10 et HoxC11
mais pas seul.
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.2- La spécification des bourgeons des membres
I.2.a- Identité antéro-postérieure du membre

➔Quelle est l’origine des tissus qui forment le mb?

I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.2- La spécification des bourgeons des membres
I.2.b- Origine des types cellulaires du bourgeon
Les somites, le mésoderme de la lame latérale et les cellules de crête neurale contribuent
à la formation des différents constituants du membre

Les somites donnent les

progéniteurs
musculaires

Quelle organisation ?
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.2- La spécification des bourgeons des membres
I.2.b- Origine des types cellulaires du bourgeon
Les somites, le mésoderme de la lame latérale et les cellules de crête neurale contribuent
à la formation des différents constituants du membre

Quelle organisation ?
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.2- La spécification des bourgeons des membres
I.2.b- Origine des types cellulaires du bourgeon

Analyse moléculaire de la migration

des progéniteurs musculaires dans le
membre en formation
mutants souris "Splotch" (décrits
dans les années '60). Phénotype:
corps plus ou moins normal, mais
absence de muscles dans les
membres (pas de diaphragme,
phénotype létal à la naissance);
muscles abdominaux anormaux, mais
présents.

-> gène Pax3 (1994)

Homeodomaine + domaine Paired (cf
segments droso 1/2: Engrailed, Fushi-
Tarazu)

KO Pax3 (flèches) absence de tous les progéniteurs Musculaires

migratoires (progeniteurs de la langue, des membres…)
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I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I-3. Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I-4. Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.3-Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I.3.a- Les axes de polarité

La croissance des bourgeons de membres chez les vertébrés

Embryon humain à 34 jours de vie embryonnaire

Développement des membres antérieurs de souris et de poulet

s'effectue selon 3 axes: proximo-distal, dorsoventral et antéro-postérieur

cf asymétries du membre;

requiert une signalisation par des molécules déterminant la position des

différents éléments des membres.
➔spécification des axes?
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.3-Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I.3.b- L’AER: la crête ectodermique apicale

L’AER est la marge externe du bourgeon qui forme un renflement

induite précocement
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.3-Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I.3.b- L’AER: la crête ectodermique apicale
Expériences d’ablation de l’AER (Saunders): arrêt de le croissance du mb.
Plus cette ablation est tardive, moins le membre sera raccourci. Il existe donc dans
l’AER une substance permettant la croissance du membre.
Rq. Le membre est tronqué, pas réduit.
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.3-Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I.3.b- L’AER: la crête ectodermique apicale

Transplantation transpécifique (souris-poulet) ->

croissance normale.

Greffe hétérochronique (“vieille” AER sur mb

jeune) -> normal: même facteur présent pendant
une bonne partie de la croissance des membres.

Greffe hétérotopique AER sur ectoderme du

membre induit la poussée d’un membre dédoublé.

Greffe mésenchyme de mb post à la place du

mésenchyme de mb ant -> croissance d’un mb
post.
Mésoderme autre que celui d’un mb-> AER
dégénère , mb tronqué.

➔L’AER joue donc un rôle déterminant dans la

croissance du membre. L’AER est nécessaire au
patterning P-D du membre. L'AER permet donc la
croissance du membre selon l'axe proximo-distal.
Mais l’identité du mésenchyme sous-jacent est
importante
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.3-Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I.3.c- Le mésenchyme sous-jacent l’AER est la Progess Zone (PZ)
Rôle de la PZ

PZ de jeune bourgeon
greffé sur vieux bourgeon
-> formation de structures proximales

PZ de vieux bourgeon
greffé sur un jeune bourgeon
-> formation de structures distales

Conséquence de greffe de PZ à différents stade sur des bourgeons d’ailes d’embryons de poulets.
(incluant le mésoderme + AER).

➔ La PZ (mésenchyme sous-jacent de l’AER) Contrôle de la spécification de

l’identité proximo-distale (=la valeur de position)
Quelle(s) modalités ?
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.3-Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I.3.d- Modèle du patron de spécification du patron proximo-distal
3 modèles pour la spécification du patron proximo-distal des membres :
- Temps
- Espace
(Towers and Sickle2009)
(X = mort cellulaire)

Quelle(s) modalités ?
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.3-Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I.3.e- Le FGF spécifie les valeurs de position distales

Données génétiques en faveur du modèle d’intercalation: antagonisme entre

- FGF8 qui diffuse depuis l’AER
- l’acide rétinoïque (RA) depuis la region proximale

… et les autres axes ?

I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.3-Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I.3.e- Le FGF spécifie les valeurs de position distales
Résumé sur l’induction de la croissance du membre
Avt début du bourgeon: expression de FGF10 se restreint ds mesenchyme mésoderme
des plaques latérales en prolif qui devient mésenchyme du bourgeon.
Wnt2b et 8c stabilisent cette expression de FGF10 dans les mbs A et P resp.
L’expression de FGF10 stimule Wnt3 dans les cellules ectodermiques adjacentes
➔Formation AER + induction FGF8
➔FGF8 maintient les cellules de la PZ en mitose active et entretient FGF10.
➔Boucle positive PZ/AER -> formation du mb entier …..

…. Mais également d’un centre organisateur crucial dans la partie postérieure du bourgeon…
LA REGENERATION CHEZ L’AMPHIBIEN /

I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I-3. Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I-4. Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.4- Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre

La zone d’activité polarisante (ZPA)

Une greffée de ZPA dans la région antérieurs du mésoderme du bourgeon de membre

de poulet a pour conséquence une duplication en miroir des doigts.
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.4- Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
1.4.a- Shh (Sonic Hedgehog) est l’agent actif de la ZPA
Shh: Protéine secrétée, puis clivage auto-
protéolytique, dependant du cholesterol.
Liaison covalente post-traductionnelle au
cholestérol.nécéssaire pourtant Shh n’est pas
tjs associé à la membrane cellulaire externe. ,
Shh modifié est secrétée dans le milieu
extracellulaire-> action à longue distance. Droso Mutation Hh (Hedrehog: hérisson)

Pb de Shh: syndactylie

Veaux cyclopes et Veratrum californicum

Autres molécules à part Shh?

I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.4- Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
1.4.a- Shh (Sonic Hedgehog) est l’agent actif de la ZPA

Axe DV ?
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.4- Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
1.4.b- La voie Shh

Axe DV ?
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.4- Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
1.4.c- Signalisation Shh dans le developpement du membre

A) L'axe (PD) est défini par la direction de la croissance du membre et l'axe (AP) est défini par la séquence
des doigts 1 (pouce) à 5 (auriculaire) ; (B) Dans la région AER, la signalisation FGF est initiée de manière
postéro-antérieure, formant la zone AER-FGF. La signalisation de l'acide rétinoïque (AR) régule le
développement proximal du membre, tandis que la région distale (zone de progression) est contrôlée par
de multiples facteurs de signalisation. La signalisation FGF initie la signalisation HH dans la région
postérieure du bourgeon du membre et l'expression de la signalisation HH est maintenue par l'expression
des gènes HOX, Tbx et Fgf8. La signalisation HH inhibe la transformation constitutive de Gli3 en sa forme
répressive (Gli3-rep) ; (C) La région postérieure contient beaucoup de Gli3A et peu de Gli3-rep, alors que
l'inverse est observé dans la région antérieure. Après l'activation, les fonctions de Grem1 (antagonisme
BMP) sont nécessaires pour relayer les signaux HH à l'AER afin de maintenir la signalisation FGF, formant
ainsi une boucle de rétroaction HH-Grem1-FGF dans le bourgeon de membre en développement.
Axe DV ?
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I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I-3. Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I-4. Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
I-5. Spécification de l’axe dorso-ventral du membre
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.5- Spécification de l’axe dorso-ventral du membre
1.5.a- Position de l’AER à la frontière D/V: le rôle de radical fringe
AER: pattern proximo distal, mais également frontiere D/V du mb !
Mise en place de cette bordure: Engrailed et Radical Fringe (r-fng: glycosyl-transférase associée au
RE/Golgi qui modifie le récepteur Notch
Au moment de la formation de l’AER: R-Fng -- ds ectoderme dorsal et augmente dans l'AER.
En m temps: expression de Notch dans l’AER, d’Engrailed dans l’ectoderme ventral.
Surexpression de R-fng: -> pas d'AER ni de mb
-> l’AER se forme à la barrière entre une zone exprimant R-Fng et une zone ne l’exprimant pas..
En-1 inhibe fng -> délimitation nette de la zone de l’AER.
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.5- Spécification de l’axe dorso-ventral du membre
1.5.b- Wnt7a spécifie l’axe dorso-ventral

Les souris Wnt7a -/- ont

des poils et des griffes
sur la face antérieure des pattes
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I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I-3. Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I-4. Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
I-5. Spécification de l’axe dorso-ventral du membre
I-6. Coordination des trois axes
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.6- Coordination des trois axes
Les principales interactions moléculaires qui initient et maintiennent la formation des membres
dépendent notamment du FGF… mais pas seulement

Et après l’initiation?
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.6- Coordination des trois axes
Rappel – Les gènes Hox

Les gènes Hox sont une famille de

gènes
facteurs de transcription
HLH très conservés
colinéarité spatiale et
temporelle
spécifient l’axe A/P de
l’emb.
Très conservés/dupliqués
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.6- Coordination des trois axes
1.6.a- Le code Hox est impliqué dans la spécification des membres
Spécification de l’identité proximo-distale et antéro-postérieure par les facteurs de
transcription Hox sous l’influence du FGF et RA
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.6- Coordination des trois axes
1.6.a- Le code Hox est impliqué dans la spécification des membres
Travaux Denis Duboule
Délétion Hoxd1 à 9

-> ordre Hoxd10 à 13 respecté : expression symétrique dans

Le bourgeon.
-> symetrie de la patte externe et interne
-> symetrie de l’expression de Shh
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.6- Coordination des trois axes
1.6.a- Le code Hox est impliqué dans la spécification des membres
Le rôle des gènes Hox Mais autres travaux de la même équipe montrent
Travaux Denis Duboule que l’expression
des gènes Hox dépend de Shh plus tard dans le
développement du membre !!
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
I.6- Coordination des trois axes
1.6.b- Le Triple rôle des gènes Hox
-> déterminent l’axe A/P de l’embryon.
-> participent à la régulation dynamique du dvpmnt du mb même après mise en place de
l’AER et ZPA.
Communication complexe FGFs de l’AER et Shh de la ZPA -> régulation expression gènes Hox
ds bourgeon.
Bcp de choses encore inconnues, mais le profil d’expression des gènes Hox peut être divisé
en 3 phases cf trois niveaux d’organisation P/D du mb: (stylopode/zeugopode/autopode):
- Phase I -> induction bourgeon (ant: Hoxb8+Hoxc6 / post: Hoxc9)
- Phase II -> induction Shh de la ZPA
- Phase III -> reponse Hox du mésenchyme distal à gradient de Shh pour
formation des doigts.
➔Shh signalisation nécéssaire, mais effets dépendent du temps cf réponse du mésoderme
➔ Implications évolutives: ‘sélection naturelle’ indépendante de modifs des 3 segments du
mb correpondent aux duplication de genome (donc des cluster hox) chez vertébrés ?!
➔ 4 clusters Hoxa, Hoxb, Hoxc, Hoxd et colinearité (position cf lieu et moment
d’expression.
Ex. Chez poulet: Genes Hoxc 3’ (HOXC4, HOXC5) -> ailes seulement vs. genes Hoxc 5’
(HOXC10, HOXC11) -> pattes seulement. Intermédiares: (Hoxc6, c8): les deux.
Situation semblable pour axe A/P dans le mb (ex HoxB9 3’ près de l’AER, diminue A vers P,
inversement corrélé à Shh ds la ZPA qui active gènes HOXA et HOXD ….
I- Le développement embryonnaire du membre de vertébré
LA REGENERATION CHEZ L’AMPHIBIEN /

I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I-3. Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I-4. Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
I-5. Spécification de l’axe dorso-ventral du membre

II- La régénération d’un membre de Vertébré

est un phénomène épimorphique
II-1. Les 4 grands types de régénération
II- La régénération chez l’Amphibien
II.1- Les 4 types de régénération

1- Utilisation de cellules souches (= stem cell-mediated regeneration)

-Remplacement des cellules sanguines à partir des cellules souches hématopoïétique
de la moelle osseuse.

2- Dédifférenciation des cellules différenciées pour former une masse de cellules

indifférenciées et reprogrammation au niveau de la lésion.
(= epimorphosis) – Membre de la salamandre.

3- Réorganisation des tissus existants (= morphallaxie) – Hydre.

4- Division de cellules différenciées qui gardent leur propriétés

(= régénération compensatrice) – Foie des mammifères.

Dans tous les cas « Spécification cellulaire conditionnelle »

II- La régénération chez l’Amphibien
II.1- Les 4 types de régénération
Phénomène de régénération chez les animaux:

Définition

Réactivation du « développement » chez l’organisme post-embryonnaire,

destinée à remplacer les tissus manquants.

Deux questions principales :

A- La régénération utilise-t-elle les mêmes mécanismes cellulaires

et moléculaires que ceux requis au cours du développement embryonnaire ?

B- Pourquoi certaines espèces se régénèrent-elles quand d'autres,

comme la nôtre, se contentent de cicatriser ?
LA REGENERATION CHEZ L’AMPHIBIEN /

I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I-3. Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I-4. Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
I-5. Spécification de l’axe dorso-ventral du membre

II- La régénération d’un membre de Vertébré

est un phénomène épimorphique
II-1. Les 4 grands types de régénération
II-2. Régénération du membre de salamandre (épimorphose)
II- La régénération chez l’Amphibien
II.2- Régénération du membre de salamandre (épimorphose)

Parmi les vertébrés, seules certaines espèces d’amphibiens peuvent régénérer leurs
membres après amputation: (+ nageoire/coeur des poissons et autotomie lézards dans une
moindre mesure)
- les têtards anoures peuvent souvent régénérer leurs membres, mais cette capacité est perdue
au cours de la métamorphose
- De nombreuses espèces d’urodèles peuvent régénérer leurs membres tout au long de leur vie
larvaire et adulte. Les tritons et les axolotls (salamandre néoténique) sont communément
utilisés comme modèles expérimentaux pour la régénération.

LA REGENERATION CHEZ
L’AMPHIBIEN
Un phénomène épimorphique

Mécanismes cellulaires et moléculaires?

II- La régénération chez l’Amphibien
II.2- Régénération du membre de salamandre (épimorphose)

Mécanismes cellulaires et moléculaires?

II- La régénération chez l’Amphibien
II.2- Régénération du membre de salamandre (épimorphose)

Les différentes étapes de la régénération d’un

membre

Chez Mammifs, après amputation-> cicatrice:

Recouvrement du site d’amputation avec
derme + épiderme

Contrairement à la cicatrisation chez les

mammifères, une cicatrice ne se forme pas et
le derme ne se déplace pas avec l’épiderme
pour recouvrir le site de l’amputation
(Chernoff and Stocum 1995).

Formation de la « coiffe
épidermique apicale » et du « blastème de
régénération »
II- La régénération chez l’Amphibien
II.2- Régénération du membre de salamandre (épimorphose)
Les différentes étapes de la régénération d’un membre
Le blastème de régénération

La prolifération des cellules du blastème de régénération dépend de la présence de nerfs

- Glial growth factor (wang et al., 2000)
- FGF2 (Mullen et al., 1996)
- Membre dénervé Pas de régénération.
- Membre dénervé + bille FGF2 Régénération normale
II- La régénération chez l’Amphibien
II.2- Régénération du membre de salamandre (épimorphose)
Les différentes étapes de la régénération d’un membre
Le blastème de régénération

• Expression de FGF10 dans le mésenchyme Activation de FGF8 dans l’épiderme / Activation

de la régénération (Yokoyama, 2001)

• Restauration de la capacité à régénérer du membre de xénope par le FGF10

Bille contrôle Bille FGF10

La prolifération des cellules du blastème de

régénération dépend de la présence de FGF10
II- La régénération chez l’Amphibien
II.2- Régénération du membre de salamandre (épimorphose)
Les différentes étapes de la régénération d’un membre
Le blastème de régénération

Le blastème régénère des structures ayant des valeurs de position

distales par rapport au site d’amputation
II- La régénération chez l’Amphibien
II.2- Régénération du membre de salamandre (épimorphose)
Les différentes étapes de la régénération d’un membre
Le blastème de régénération

Le blastème régénère des structures ayant des valeurs de position

distales par rapport au site d’amputation
LA REGENERATION CHEZ L’AMPHIBIEN /

I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I-3. Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I-4. Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
I-5. Spécification de l’axe dorso-ventral du membre

II- La régénération d’un membre de Vertébré

est un phénomène épimorphique
II-1. Les 4 grands types de régénération
II-2. Régénération du membre de salamandre (épimorphose)
II-3. Formation du patron du blastème et acide rétinoïque
II- La régénération chez l’Amphibien
II.3- Formation du patron dans le blastème et effet de l’acide rétinoïque
Formation du patron dans le blastème de régénération

Hybridation in situ
sur des membres en
régénération
deXénopes 5 jours
après l’amputation
avec les sondes
FGF8 et FGF10
(Yokoyama, 2007)

FGF10 /FGF8
Boucle de régulation positive entre
-FGF10 dans le mésenchyme et
-FGF8 dans l’AER

Le blastème de régénération ressemble à la PZ

du bourgeon de membre
II- La régénération chez l’Amphibien
II.3- Formation du patron dans le blastème et effet de l’acide rétinoïque
Formation du patron dans le blastème de régénération

Hybridation in situ
sur des membres en
régénération
De Xénopes 5 jours
après l’amputation
avec les sondes Lmx-1
Hoxa13 et msx2 (coupes)
et Shh.
(Yokoyama, 2007, 2001)

Le patron d’expression de nombreux gènes est identique à celui du bourgeon de membre

II- La régénération chez l’Amphibien
II.3- Formation du patron dans le blastème et effet de l’acide rétinoïque
Effet de l’acide rétinoïque

Effet de la vitamine A (RA) sur la régénération d’un membre de la Salamendre

Ctrle

+ RA

L’acide rétinoïque contrôle l’identité proximo-distale des membres en régénération

II- La régénération chez l’Amphibien
II.3- Formation du patron dans le blastème et effet de l’acide rétinoïque
Effet de l’acide rétinoïque

Effet de la vitamine A (RA) sur la régénération d’un membre d’axolotl

L’acide rétinoïque contrôle l’identité proximo-distale des membres en régénération

II- La régénération chez l’Amphibien
II.3- Formation du patron dans le blastème et effet de l’acide rétinoïque
Effet de l’acide rétinoïque

Effet de la vitamine A (RA) sur la régénération d’un membre d’axolotl

L’acide rétinoïque contrôle l’identité proximo-distale des membres en régénération

II- La régénération chez l’Amphibien
II.3- Formation du patron dans le blastème et effet de l’acide rétinoïque
Effet de l’acide rétinoïque

Effet de la vitamine A (RA) sur la régénération d’un membre d’axolotl

L’acide rétinoïque contrôle l’identité proximo-distale des membres en régénération

Nature de cette information ?
LA REGENERATION CHEZ L’AMPHIBIEN /

I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I-3. Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I-4. Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
I-5. Spécification de l’axe dorso-ventral du membre

II- La régénération d’un membre de Vertébré

est un phénomène épimorphique
II-1. Les 4 grands types de régénération
II-2. Régénération du membre de salamandre (épimorphose)
II-3. Formation du patron du blastème et acide rétinoïque
II-4. Nature de la valeur de position proximo-distale
II- La régénération chez l’Amphibien
II.4- Nature de l’information proximo-distale

Molécule de surface ?
II- La régénération chez l’Amphibien
II.4- Nature de l’information proximo-distale

Prod1 est distribué en gradient le long de l’axe PD

(Kumar et al., 2007).

L’information de position le long de l’axe proximo-distal est donnée par la molécule

de surface Prod1
Source des cellules ?
LA REGENERATION CHEZ L’AMPHIBIEN /

I – Le développement embryonnaire du membre de Vertébrés

I-1. La spécification cellulaire
I-2. Spécification des bourgeons des membres
I-3. Spécification de l’axe proximo-distal du membre
I-4. Spécification de l’axe antéro-postérieur du membre
I-5. Spécification de l’axe dorso-ventral du membre

II- La régénération d’un membre de Vertébré

est un phénomène épimorphique
II-1. Les 4 grands types de régénération
II-2. Régénération du membre de salamandre (épimorphose)
II-3. Formation du patron du blastème et acide rétinoïque
II-4. Nature de la valeur de position proximo-distale
II-5. Source des cellules pour la régénération
II- La régénération chez l’Amphibien
II.5- Source des cellules pour la régénération

1) Les cellules précurseurs sont-elles d’origine locale ou distante?

2) Sont elles formée par dédifférenciation de cellules fonctionnelles ou à

partir de cellules « de réserve » indifférenciées?

3) Sont elles uni-, multi- ou pluripotentes?

II- La régénération chez l’Amphibien
II.5- Source des cellules pour la régénération
1) Les cellules précurseurs sont-elles d’origine locale ou distante?
Mis en évidence par des expériences d’irradiation :

-Si irradiation X globale (qui inhibe la majorité des divisions cellulaires) Pas de régénération.

-Si irradiation du futur site d’amputation (sur une petite surface) Pas de régénération

-Si irradiation des tissus voisins mais pas du site d’amputation Régénération normale

Le blastème doit provenir de cellules situées à moins de quelques millimètres de la surface

d’amputation, plutôt que de cellules sanguines ou d’autres sites distants.

L’origine des cellules précurseurs est locale à la surface d’amputation

Dédifférenciation ou cellules souches ?

II- La régénération chez l’Amphibien
II.5- Source des cellules pour la régénération

2) Sont elles formée par dédifférenciation de cellules fonctionnelles ou à partir de

cellules « de réserve » indifférenciées?

Les cellules des os, du cartilage, les fibroblastes, les myocytes et les cellules neurales
perdent leurs caractéristiques de cellules différenciées et se détachent les unes des
autres et ont une augmentation de l’expression de gène associé au caractère prolifératif
de la PZ des bourgeons de membres .
Par Microscopie et par étude de traceurs colorés:
Mise en évidence que les noyaux des myotubes différenciés entrent
de nouveau dans le cycle cellulaire (Lo et al., 1993)

Dédifférenciation de cellules fonctionnelles pour former le blastème de régénération

-> hypothèse: les cellules du blastème sont des cellules souches….MAIS….

Uni-, pluri- ou totipotentes ?

II- La régénération chez l’Amphibien
II.5- Source des cellules pour la régénération

Régénération des membres de la Salamandre

Sources des cellules pour la régénération ?
Mais…
…(confer TD/Présentation d’article du papier
Kragl et al. 2009)

-> analyse de marqueurs lors de greffes d’un donneur fluorescent sur un receveur normal
 II- La régénération chez l’Amphibien
II.5- Source des cellules pour la régénération
Dermis does not make muscle but makes cartilage and tendons.

a, Schematic of experiment. b, Representative time course. Inset shows cross-section at dashed line
immunostained for MHCI (see Supplementary Fig. 4a, b). c, Longitudinal section of 12-day blastema. GFP+
(arrowhead) and PAX7+ signals did not overlap. d, e, Cross-sections through regenerated limbs. GFP+ cells
(arrowheads) were negative for the indicated muscle markers (red). f–h, Longitudinal sections immunostained for
anti-MHCI. Fluorescent cells contributed to connective tissue (f), tendons (g) and cartilage (h, arrowheads). Blue
shows DAPI in merge panels (d–h). Scale bars: b, 0.5 mm; c–h, 50 m.

M Kragl et al. Nature 460, 60-65 (2009) doi:10.1038/nature08152

 II- La régénération chez l’Amphibien
II.5- Source des cellules pour la régénération

Cartilage cells do not make muscle.

a, Schematic of experiment. b, Time course through regeneration. Inset shows cross-section at dashed line
immunostained for MHCI (see Supplementary Fig. 4c, d). c, Longitudinal section of a 12-day blastema. GFP+ cells
(arrowheads) were negative for PAX7+ signals. d, Longitudinal section of a regenerated limb 30 days post-
amputation immunostained for MHCI (red). The majority of fluorescent cells were found located in the regenerated
skeleton; no signal was found in muscle. Blue shows DAPI in merge panels (b–d). Scale bars: b, 0.5 mm; c,
50 m; d, 100 m.

M Kragl et al. Nature 460, 60-65 (2009) doi:10.1038/nature08152

 II- La régénération chez l’Amphibien
II.5- Source des cellules pour la régénération

Muscle does not make cartilage or epidermis.

a, Schematic of labelling. b, Time course. Inset shows cross-section at dashed line (see Supplementary Fig. 4e).
c, Section of 12-day blastema. GFP+ cells (arrowheads) were positive for PAX7. d, Single-cell PCR showed that
GFP+ muscle-derived blastema cells expressed Myf5 (see also Supplementary Fig. 9a) but GFP+ cells from other
tissues did not. RP4 acted as quality control. Numbers of cells/blastemas/animals/experiments analysed were as
follows for each tissue. Skeleton: 152/8/8/4, Schwann cells: 402/6/6/6, dermis: 230/12/12/6, muscle: 184/6/6/3. e,
Longitudinal section through regenerated limb. No GFP+ cells were found in cartilage or epidermis (above dotted
line). Scale bars: b, 0.5 mm; c, 50 m; e, 100 m.

M Kragl et al. Nature 460, 60-65 (2009) doi:10.1038/nature08152

 II- La régénération chez l’Amphibien
Schwann cells give rise to Schwann cells
II.5- Source des cellules pour la régénération
and do not form cartilage even during
nerve-rescue of irradiated limbs.

a, Schematic of labelling. b, Confocal fluorescence image of GFP+ Schwann cells in the hand. c, Time course of
regeneration. Note that Schwann cells did not enter the distal tip until 25 days post amputation. d, Longitudinal
section through a regenerated hand. GFP+ Schwann cells were closely associated to MBP and BIII-tubulin
staining. e, Enlarged part of d shown without DAPI. f–j, Sections of regenerating limbs that had been X-rayed and
rescued by a non-irradiated nerve implant. f–h, A regenerate rescued by nerve with GFP-labelled Schwann cells.
Cartilage was negative for both GFP and nuclear Cherry. i, j, A regenerate rescued by nerve tissue in which all
cells expressed GFP. Cartilage cells were GFP+, indicating that they derived from non-Schwann cells in the nerve.
g, j, Higher magnification of the regions framed in f and i respectively. h, Higher magnification of the frame in g
showing MBP and BIII-tubulin staining. Scale bars: b, 50 m, d, f, i, 0.5 mm.
M Kragl et al. Nature 460, 60-65 (2009) doi:10.1038/nature08152
II- La régénération chez l’Amphibien
II.5- Source des cellules pour la régénération
Schwann cell-derived blastema cells do not possess
proximo-distal positional identity but cartilage-derived cells do.

a, Schematic to show the experimental design. b, c, e, Time course through regeneration of the
indicated graft type. Progeny of distal skeletal cells localize distally while Schwann-cell-derived cells
show no positional preference. n = 14 (b), 20 (c) and 15 (e) limbs. Scale bars: 0.5 mm. d, Percentage of
cartilage-derived progeny originating from upper arm (six limbs) or hand transplants (seven limbs) that
contribute to hand skeleton after regeneration. Error bars are standard deviations; P value is from
Student's t-test (Welch; unpaired).
M Kragl et al. Nature 460, 60-65 (2009) doi:10.1038/nature08152
II- La régénération chez l’Amphibien
II.5- Source des cellules pour la régénération

2) Sont elles formée par dédifférenciation de cellules fonctionnelles ou à partir de

cellules « de réserve » indifférenciées?

Les cellules des os, du cartilage, les fibroblastes, les myocytes et les cellules neurales
perdent leurs caractéristiques de cellules différenciées et se détachent les unes des
autres et ont une augmentation de l’expression de gène associé au caractère prolifératif
de la PZ des bourgeons de membres .
Par Microscopie et par étude de traceurs colorés:
Mise en évidence que les noyaux des myotubes différenciés entrent
de nouveau dans le cycle cellulaire (Lo et al., 1993)

Dédifférenciation de cellules fonctionnelles pour former le blastème de régénération

-> hypothèse: les cellules du blastème sont des cellules souches….MAIS….

Uni-, pluri- ou totipotentes ?

POINTS CLES DE LA REGENERATION D’UN MEMBRE D’AMPHIBIEN
SCHEMA RECAPITULATIF
Amputation d’un membre de triton
Cicatrisation

Dédifférenciation locale des cellules du moignon pour former un blastème

(C souches adultes uni- ou pluri-potentes)

Le blastème se développe pour former des structures distales par épimorphose

(reprise de la croissance, prolifération cellulaire)
à condition que le nerf soit présent

Greffe du blastème distal sur un moignon proximal

Intercalation des valeurs de position manquantes le long de l’axe proximo-distal

À partir de la prolifération des cellules du moignon.
Représentation schématique des processus cellulaires
de la régénération animale

‘ ‘: épith. lésionnel
CM YBST6J - Développement et Régénération

DEVELOPPEMENT ET REGENERATION DU MEMBRE DE VERTEBRE

Epimorphose d’ensembles complexes de tissus différenciés

G. Rivière – UMR BOREA

[Link]@[Link]
Université de Caen Normandie - 2023