PLAN DU RAPPORT

INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
RESULTATS ET DISCUSSION
CONCLUSION

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 INTRODUCTION
L’eau est indispensable dans la vie quotidienne des êtres vivants. L’une des importances est de
l’utiliser comme boisson. Mais il arrive que cette eau soit attaquée par les agents biologique
(microorganismes) pathogène pour l’homme pouvant aller d’une simple maladie, et si ce n’est pas
bien traitée, jusqu’à la mort.
De ce fait le contrôle de la qualité de l’eau devient une préoccupation majeure pour les
microbiologistes et les personnes s’occupant de la sante publique.
Pour faire un bon contrôle de qualité un ensemble d’activité est mené au laboratoire. Ces activités
peuvent aussi permettre de détecter la cause d’une maladie.
Nous en tant qu’étudiant en microbiologie, avons fait ces différents travaux pratiques pour nous
familiariser avec les techniques utiliser pour faire le contrôle de la qualité de l’eau.
Objectif général : Notre objectif était de faire l’analyse microbiologie de l’eau
Objectifs spécifiques :
 Préparer des milieux de culture
 Ensemencer des milieux
 Observer des colonies
 Faire le dénombrement
 Faire la coloration gram
MATERIELS ET METHODE
 MATERIELS

Figure 1 : hotte Figure 2 : Boite de Petri Figure 3 : Balance

Figure 4 : plaque chauffante Figure 5 : Stérilisateur Figure 6 : Bain Marie

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Figure 11 : Figure 12 :
Figure 13 :
DESOXYCHOLATE KF STREPTOCCOCCAL
SABOURAUD AGAR
AGAR AGAR

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Figure 14 : bec benzène Figure 15 : Echantillon d’eau

 METHODES

ETAPE 1 : préparation de milieux de culture

Calculer les quantités des produits nécessaires pour 20ml d’eau distillée de préparation comme
suit :

 Streptoccocal AGAR : 74.7 g pour 1000ml donc x= (74.4 *20) /1000 = 1.488g
 Sabouraud : 65.5g pour 1000ml donc x= (65.5*20) /1000=1.310g
 Salmonella Shigela AGAR : 76g pour 1000ml donc x= (76*20) /1000=1.52g
 Desoxycholate : 46g pour 1000ml donc x= (46*40) /1000= 1.84g

 Peser les quantités : Nous avons placé sur la balance un papier aluminium puis tarer à zéro ;
puis verser le produit jusqu’à la quantité calculé
 Mesurer les 20ml d’eau distillée : à l’aide d’une éprouvette nous mesurâmes les 20ml d’eau
distillée
 Mélanger le produit : dans un bécher de 250ml nous avons mis 20ml d’eau distillée, et
renverser la masse du produit et homogénéiser jusqu’à l’ébullition et a la dissolution complète
du produit. Après le mélange, nous avons laissé refroidit puis mis les milieux dans des flacons
respectifs pendant quelques secondes.
 La stérilisation des milieux : les milieux tels que Streptoccoccal AGAR, Sabouraud et
Maconkey ont été porté dans le stérilisateur à 121°c pendant 1 heure.
 Pour éviter tout doute sur la solidification des milieux, nous avons ajouté à chaque milieu une
cuillerée de pastule de la poudre d’Agar.
 Nous avons porté des milieux (Samonella Shigela AGAR et Desoxycholate AGAR) dans un
bain-Marie à 57°C. Ces milieux étaient non stérilisables.
 La solidification des milieux : après avoir retiré les flacons du stérilisateur et du bain-marie,
nous les avons apportés sous la hotte où ils se trouvaient les boites de Petri déjà stériliser.
Ensuite, nous ouvrîmes les boites de Petri et verser les 20ml respectif de chaque milieu.
ETAPE 2 : Ensemencement des milieux et incubation
Apres la phase de la préparation, nous avons procédé à l’ensemencement. Nous avons d’abord
vortex l’échantillon, puis prélevé 1ml et versé sur les différents milieux de culture. Et enfin, nous
les avons amenés dans l’incubateur a la température 44°C pour les Coliformes Fécaux et 37°C
pour les, MaConkey AGAR, Streptoccoccal AGAR et 25°C pour le Sabouraud.
ETAPE 3 : observation macroscopique

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 L’observation macroscopique qui consistait à regarder l’aspect, la couleur, la forme et le diamètre
de la colonie et le nombre de colonie. Pour cela nous avons observé les cultures pendant 24h,48h
et 72h. Le comptage de colonie se faisait à l’aide d’un dispositif appelé compteur de colonie. Sur
lequel on plaçait les cultures et comptait les colonies.
ETAPE 4 : Observation microscopique
Elle permettait de faire la coloration Gram pour voir si les bactéries étaient de Gram positif ou
négatif.
La double coloration se faisait comme suit :
 Récupérer la culture puis allumer le bec benzène. Stériliser une anse en la chauffant sur la
flamme du bec benzène. Racler une colonie puis la mettre sur une lame sur laquelle on a
mis une goutte d’eau. Laisser sécher puis passer à la flamme pour la fixation.
 Appliquer le cristal de violet sur la lame et la maintenir pendant 60 secondes. Laver la
lame avec l’eau de robinet
 Appliquer l’iode sur la lame et la maintenir pendant 60 secondes puis la rincer avec l’eau
de robinet
 Appliquer de l’alcool 95% sur la lame et laisser 5 à 10 secondes puis la laver.
 Enfin appliquer la fusine et la laisser agir pendant 45 secondes et la laver avec l’eau de
robinet.
 Après cette double coloration, nous étions passés au microscope.

RESULTATS
Tableau 1 : les milieux de culture et leur image

NOMS Sabouraud Desoxycholate McConkey AGAR Streptoccoca Salmonella

DES AGAR l AGAR Sighela AGAR
MILIEU
X
IMAGES

Tableau 2 : Nombre de colonie et le temps d’observation

24h 48h 72h

McCONKEY Colonie fusionnée Colonie fusionnée Colonie fusionnée
SABOURAUD 00 colonie 00 colonie 00 colonie
STREPTOCCOCCAL 00 colonie 01 colonie 1 colonie
DESOXYCHOLATE 00 colonie pour cf. 1872 colonies pour Colonies supérieure
00 colonie pour ct cf à 1000 pour cf
72 colonies pour ct 83 colonies pour ct
SALMONELLA 00 colonie 00 colonie 01 colonie
SHIGELA
cf : coliformes fécaux

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 ct : coliformes totaux

L'évolution du nombre des colonies en fonction du temps

2500

2000 1967
1872
1500

1000

500

0 100
0 72
1
0 83
1
0
24h 48h 72h

McCONKEY SABOURAUD STREPTOCCOCAL

DESOXY CF DESOXY CT SALMONELLA SHIGELA

Tableau 3 : diamètre des colonies

24h 48h 72h

McCONKEY D<1mm D<1mm D<1mm
SABOURAUD D<1mm D<1mm D<1mm
STREPTOCCOCCAL D<1mm D<1mm D<1mm
DESOXYCHOLATE D<1mm D<1mm D<1mm
SALMONELLA SHIGELA D<1mm D<1mm D<1mm

L'évolution de la taille de diamètre des colonies en fonction du

temps
1
Diamètre de colonies

0.8
0.6
0.4
0.2
0
24h 48h 72h
Temps

McCONKEY SABOURAUD STREPTOCCOCAL

DESOXY CF DESOXY CT SALMONELLA SHIGELA

Tableau 4 : image, gram et formes des bactéries

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 Bactéries image gram formes
Samonella Shigela négatif bacille

E.coli négatif coque

Streptocoques positif Coque

en
chainette
Coliforme fécaux négatif coque

Coliformes totaux positif coque

DISCUSSION
Comme le montre les images des résultats, nous avons fait un bon travail vu que les milieux
ont été bien solidifié. Cela nous a permis de comparer nos résultats aux autres groupes. Mais
on avait tous pratiquement les mêmes résultats. Nous étions tous satisfaits.

CONCLUSION
Nous pouvons retenir que la préparation des milieux de culture et la stérilisation sont des
étapes cruciales dans le contrôle de qualités. Il faut des travaux minutieux pour éviter toutes
contaminations. Au cours de ces travaux pratiques, nous avons appris des connaissances
pratiques qui ont renforcé nos prérequis.

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 TP 2 : ANTIBIOGRAMME

 INTRODUCTION
L’antibiogramme est une opération très importante dans plusieurs domaines notamment dans le
domaine médical. Il permet de guider les médecins dans le choix des abiotiques qui doivent être
prescrit aux patients et éviter toutes sélection au hasard d’antibiotique. Pour accomplir cette opération
il faut passer par des étapes.
Objectif de ce TP était de maitriser le processus de l’antibiogramme.
MATERIELS ET METHODE
 MATERIELS

Figure 1 : hotte Figure 2 : Boite de Petri Figure 3 : Balance

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 Figure 5 : Stérilisateur Figure 6 : Bain Marie
Figure 4 : plaque chauffante

 METHODE
Au cours de ces travaux pratiques nous avons procédé comme suit :
ETAPE1 : préparation du milieu de culture
D’abord on a commencé par peser la quantité du milieu MUELLER HINTON nécessaire pour la
préparation de 20ml d’eau distille. Pour la pesée, on a premièrement placé sur la balance un papier
aluminium, puis à l’aide d’une pastule, prélevé de la poudre du milieu et ajusté jusqu’à obtenir la
quantité de 0.42g, et enfin ajouté une quantité de l’agar pour la solidification.
Calcul : 21g pour 1000ml donc x= (21*20) /1000= 0.42g
Après cela, nous avons allumé la plaque chauffante puis placé un bécher de 250ml contenant 20ml
d’eau distillée et de la poudre du milieu. Pendant que l’eau chauffait, nous avons homogénéisé le
mélange en agitant délicatement.
Après avoir bien chauffé jusqu’à l’ébullition et mélangé la préparation on a d’abord laissé refroidit
puis transvasé dans un flacon et mis dans un stérilisateur pendant 1heure à 121°C.
Une fois la stérilisation terminée nous passâmes sous la hotte et versâmes les 20ml dans une boite de
Pétri déjà stérilisée puis laissé jusqu’à la solidification.

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ETAPE 2 : la dilution
Pour faire cette étape, nous avons récupéré les colonies déjà poussées dans les premiers TP et des
tubes à essais. Nous avons mis 5ml de l’eau distillée dans deux (02) tubes à essais pouf respectivement
les Coliformes fécaux et les Salmonella Shigela. Et ensuite, allumé le bec Benzène sous la hotte puis
stérilisé une anse avec laquelle nous avons raclé une colonie et l’introduit dans les 5ml d’eau distillée
et homogénéisé au vortex.
ETAPE 3 : La préparation de l’antibiotique
Comme on n’avait pas des disques d’antibiotique. Mais on disposait quatre (04) antibiotiques. Donc
on a procédé à la fabrication manuelle des disques des quatre (04) antibiotiques.
Sous une hotte, nous avons pris deux (02) comprimés de chaque antibiotique et les dilué dans 10ml
d’eau distillée dans une boite de Petri. L’opération s’était respectivement déroulée ainsi pour la
préparation des quatre (04) antibiotiques. A l’aide d’une micropipette de 1ml, on a prélevé dix (10)
fois l’eau distillée puis les versé dans la boite de Petri puis dissout les comprimés dans cette eau.
Chaque antibiotique avait sa boite de Pétri.
Les concentrations étaient les suivantes :

Noms des antibiotiques Masse en mg dans 10ml d’eau Concentration en mg/ml

distillée
Erythromycine 400 80
Ciprofloxacine 1000 200
Métronidazole 1000 200
Amoxicilline 1000 200

Apres la dilution, nous avons coupé un papier avec une pince appropriée des disques et les imprégner
dans les dilutions d’antibiotiques et les laisser sécher.
ETAPE 4 : la préparation de l’antibiogramme
Sur les milieux de culture préparés, à l’étape 1, nous avons prélevé 1ml de la dilution des colonies et
inondé les milieux de culture en les inclinant dans tous les sens pour que la dilution puisse occupée
toute la surface du milieu de culture. Cette technique est la culture par inondation. L’excès d’eau est
versé dans une poubelle. Après nous avons placé les disques des antibiotiques sur la culture à des
distances éloignées l’une de l’autre.
Enfin nous incubé les milieux de culture dans des incubateurs à des températures différentes : 44°C
pour les Coliformes Fécaux et 37°C pour les Salmonella Shigela.

 RESULTATS
TABLEAU 1 : image de l’antibiogramme

Les antibiogrammes Observation 24h Observation 48h

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 Salmonella Shigela

Coliforme fécaux

 DISCUSSION
Les résultats que nous avons eu n’était pas satisfaisant. Car aucune zone de sensibilité (spectre) n’a été
observé. Cela peut être dû à la péremption des antibiotiques ou à la mauvaise manipulation de notre
part. Contrairement a nos camarades qui ont eu des spectres bien représentés.

 CONCLUSION
Au terme de ces travaux pratiques, nous pouvons retenir que l’antibiogramme est une étape vraiment
importante dans les analyses microbiologiques dans notre alimentation et pour la médecine ainsi que la
recherche scientifique. Nous apprîmes une compétence de plus qui va nous aider notre carrière
professionnelle.

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