‫الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية‬

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

Ministère de l’enseignement supérieur ‫وزارة التعليم العالي و البحث العلمي‬

et de la recherche scientifique
‫جامعة مولود معمري‬
Université Mouloud MAMMERI ‫كلية الطب‬
Faculté de médecine ‫تيزي وزو‬
Tizi-Ouzou

Xⴰⵙⴷⴰⵡⵉⵜ ⵍⵎⵓⵍⵓⴷ ⴰX ⵎⴰⴻⵎⴰⵔ

Département de pharmacie

Mémoire de fin d’études

Numéro d’ordre : 02/DP/FM/2016

Présenté et soutenu publiquement

Le 23 juin 2016

En vue de l’obtention du diplôme de Docteur en Pharmacie

Thème :

Validation analytique d’une méthode de dosage du diclofénac de

sodium dans les suppositoires à 100 mg par HPLC. Application de la
démarche harmonisée.

Réalisé par :

MIMOUN Nacéra
SARAOUI Nawel

Encadrées par :

Dr M.MAMOU

Composition du jury :

- Dr KESSAL Fetta MAHU UMMTO Président du jury

- Dr MAMOU Marzouk MAHU UMMTO Encadreur

- Dr BOURKAIB Amina MAHU UMMTO Examinatrice

PROMOTION 2015-2016
DEDICACES
 Dédicaces
C’est à cœur ouvert, avec un énorme plaisir, une immense joie que je dédie ce
mémoire de fin d’études à tous ceux qui me sont chers
Tout les mots ne sauraient exprimer la gratitude,l’amour,le respect, la
reconnaissance que j’ai pour vous mes très chers parents.
Ma tendre maman HAMTOUCHE BAHDJA ;je te remercie pour ton amour
inconditionnel,mon cher papa BELKACEM ;je te remercie pour tes précieux
conseils.
Je vous remercie pour tout les sacrifices que vous avez consenti pour mon
instruction,ma réussite et mon bien-être.
Que ce modeste travail soit l’exaucement de vos vœux tant formulés, le fruit de
vos innombrables sacrifices.
Puisse DIEU, le très haut, vous accorder santé, bonheur et longue vie .
Mon adorable mari GADA Lyes : tes sacrifices, ton soutien moral, ta gentillesse
sans égal,ton profond attachement m’ont permis de réussir mes études.
Que dieu réunisse nos chemins pour un long commun serein et que ce travail soit
témoignage de ma reconnaissance et de mon amour sincère et fidèle.
A mes sœurs ZAZIE et SAMIA, à mes frères YANIS
et AGHILES : je vous dédie ce travail avec tout mes vœux de bonheur ,de santé
et de réussite en témoignage de l’affection, de l’attachement et de l’amour que je
porte pour vous.
A ma très chère binome NAWEL ,tu es pour moi plus qu’une amie ;une
confidente ,une sœur…je te souhaite tout le bonheur du monde et Merci de
toujours être là pour moi.
A la mémoire de mes grands parents,puisse DIEU vous accuellir dans son vaste
paradis
A ma belle famille, à ma très chère amie Sabrina AMZIANE, trouvez ici
l’expression de mon profond attachement.

MIMOUN Nacéra
 Dédicaces
C’est avec grand amour et profonde gratitude que je dédie ce mémoire de fin
d’études à mes chers parents, si je suis cette personne aujourd’hui, je sais que c’est
à vous que je le dois. Ce travail est le fruit de vos sacrifices, votre soutien
inconditionnel et vos précieux conseils. Merci maman merci papa je prie le bon
DIEU de veiller sur vous en espérant que vous serez toujours fiers de moi.
A mes beaux parents, Vous m’avez accueilli à bras ouverts dans votre famille.
En témoignage de l’attachement et de l’affection que je porte pour vous, je vous
dédie ce travail avec tous mes vœux de bonheur et santé.
A mon cher mari, mon âme sœur KAMEL, sans ton aide, tes conseils et tes
encouragements ce travail n'aurait vu le jour. Merci d’exister et merci d’exister
pour moi.Tu es la lumière de mon chemin.
A la mémoire de mes grands parents que j’aurais tant aimé qu’ils soient là et me
féliciter. Puisse DIEU les accuillir dans son infinie miséricorde.
A mon adorable sœur NASSIMA et son mari AHMED, à mes fréres NABIL
RAMDANE NASSIM et sa femme LYNDA, TAHAR et sa femme HAKIMA.
A ma belle sœur LILA et à mon beau frère YANIS qu’ils trouvent ici
l’expression de mes sentiments de respect et de reconnaissance.
A ma chère binôme NACERA une deuxième sœur pour moi, merci pour tout ce
que t’as fait pour moi à titre personnel et à titre professionnel. Que DIEU te
préserve bonne santé et longue vie.
Je dédie particulièrement ce modeste travail à Mme LAMROUS je vous remercie
pour tout le temps que vous m’avez consacré, vos directives précieuses et pour la
qualité de votre suivi durant toute la période de mon stage. Merci à toute
l’équipe.
A ma douce DEHBIA et ma chère SABRINA, merci pour tout.

SARAOUI Nawel
REMERCIEMENTS
 REMERCIEMENTS
Nous remercions DIEU le tout puissant de nous avoir procuré courage
santé et volonté d’avancer dans la vie et briller dans les études.
Nous tenons à exprimer nos remerciements les plus vifs à notre
encadreur Dr M.MAMOU
Nous avons eu le privilège de travailler parmi votre
équipe et d’apprécier vos qualités et vos valeurs.
Votre sérieux, votre compétence et votre sens du devoir
nous ont énormément marqués.
Veuillez trouver ici l’expression de notre respectueuse
considération et notre profonde admiration pour toutes vos
qualités scientifiques et humaines.
Ce travail est pour nous l’occasion de vous témoigner
notre profonde gratitude.
Nous tenons également à remercier Dr F. KESSAL et Dr
A.BOURKAIB pour nous avoir fait l’honneur d’accepter de faire
partie de notre jury.
 TABLE DES MATIERES

Introduction générale.………………………………………………………………………...01
Objectifs……………………………………………………………………………………....02
Partie théorique
Chapitre I : Diclofénac de sodium
Introduction
1. Définition ………………………………………………………………………………….03
2. Propriétés …………………………………………...…………………….……………….03
2.1. Physicochimiques…………..………………..………………………….….…………....03
2.2. Pharmacologiques…………………..……………………..……………..……………....04
2.2.1. Pharmacocinétiques……………...……………………………………..…..………….04
2.2.1.1. Absorption……………………………..………………………………………….....04
2.2.1.2. Distribution………………...…………………………………………………….…..04
2.2.1.3. Métabolisme……………………...…………………………………………………..04
2.2.1.4. Excrétion...………………...…………………………………………………..……..05
2.2.2. Pharmacodynamiques……...…………………………………………….………….....05
3. Mécanisme d’action……………………………………………………………..………....05
4. Posologie et indications thérapeutiques……………………………………………………06
4.1. Posologie……………..…………………………………………...………………….......06
4.2. Indications………………..……..………………………………………………………..06
5. Effets indésirables…………………………………………………………...……………..07
6. Contre indications…………………………………………………………………....…….07
7. Interactions médicamenteuses………………………………………………………..…….07
8. Toxicité…………………………………………………………………………………….08
8.1. Surdosage………………….…………………………………………………………..…08
8.1.1. Symptômes…...……………………………………………….......................................08
8.1.2. Conduite à tenir…………..………………………………………………….………...08
Chapitre II : Les suppositoires
Introduction……………………………………………………………………………..….....09
1. Historique……………………...…………………………………………………...…....…09
2. Définition…………………………………………………………………………………..09
3. Excipients utilisés pour la fabrication des suppositoires… ……………..………………...10
3.1. Propriétés………………….……………………………………………..………….…...10
3.2. Classification……………….………………………………………………...……….….10
3.2.1. Excipients lipophiles………...…………..……………………………………………..10
3.2.1.1. Beurre de cacao…………………………………………............................................10
3.2.1.2. Huiles hydrogénées …………………...…………..…………………………..……..11
3.2.1.3. Glycérides hémi synthétiques solides….……………………………………….……11
3.2.1.4. Macrogols glycérides saturés………….………………….……………..………......11
3.2.2. Excipients hydrosolubles …………………………………………………………..….11

i
 TABLE DES MATIERES

4. Production des suppositoires……………………………………………….………….......11

4.1. Traitement des principes actifs ………………...…….……………………….……...….12
4.2. Traitement de l’excipient …………….………………...……………………………..…12
4.3. Préparation de la masse…………………………………………..…………………...….12
4.4. Moulage des suppositoires……………………..……………………………………..….13
4.4.1. Moules emballages ………….……………...…………………………………….....…13
5. Avantages et inconvénients des suppositoires………..........………………………….......13
6. Mode d’action des suppositoires……………………………………...……………............14
Chapitre III : Validation analytique
1. Définition…………………………………………………………………………………..15
2. But de la validation analytique…………………………….……………………………....15
3. Aspect réglementaire et normatif………………………………..………………………....15
4. Critères de validation…………………………………..………………………………......16
4.1. Spécificité-sélectivité……………………………………………………….………........17
4.2. Exactitude……………………………………………………………………………......17
4.3. Linéarité……………………………………………………………………………........17
4.4. Fidélité…………………………………………………………….……………………..17
4.5. Sensibilité…………………………………………………………………………….......18
4.6. Limite de détection………………………………………………………………….........18
4.7. Limite de quantification…………………………..………………………………...........18
4.8. Robustesse…………………………………………………………………………….….18
5. Etude statistique de la validation analytique………………………...……………………..18
5.1. Spécificité…………………………………………..……………………………….……19
5.1.1. Protocole………………………………...…………………………………………......19
5.1.2. Etude statistique………………………………………………..…………………..…..19
5.2. Fonction de réponse……………………………….………………………………..……22
5.3. Alignement des observations………………….……………………………………..…..23
5.4. Prédictions inverses…………………………………….……………………..………....24
5.5. Calcul de la justesse et de la fidélité…………………………………………...………...25
5.5.1. Modèle…………………………………………………………………………………25
5.5.2. Justesse………………………………...…………………………………………….…26
5.5.3. Fidélité…………………………………………………………………………………27
5.6. Calcul de l’exactitude………….………………………………………………………....27
5.6.1. Erreur totale et profil de l’erreur totale…………………..………………………….....27
5.7. Calcul de l’intervalle de tolérance………………...………………………………….......28
5.8. Profil d’exactitude……………………………….…………………………………….....30
5.8.1. Calcul…………………………………………………………………………………..30
5.8.2. Choix de la fonction de réponse………………………….…………………………....30
6. Linéarité……………………………………………………………………...…………….31
7. Limites de quantification………..……………………………………………………..…..31
8. Robustesse……………………….….…………………………………….………………..32
8.1. Protocole ……………..………………………………………………………………….32
8.2. Etude statistique………...………………………………………………………..…..…..32

ii
 TABLE DES MATIERES

8.2.1. Méthode des plans factoriels……………………………………………………….......32

Partie pratique
Introduction………………………………………………………………………….……......34
1. Matériels et méthodes………………………………………………………….…...……...34
1.1. Matériels………………………………………...……………………….………..……...34
1.1.1. Matières premières et réactifs…………..……………………….…………....………..34
1.1.2. Appareillage et équipement……………..…………….…………………………...…..34
1.1.3. Verrerie…………………..………………………………….…………………...…….35
1.1.4. Autres…………………………………….……………………………………….……35
1.2. Méthodes……………………………………….…………………………………….…..35
1.2.1. Préparation des solutions………………………………………………………...........35
1.2.2. Conditions chromatographiques………………………...……………………………..36
2. Résultats …………………………………………………………………………...….…...36
2.1. Spécificité…………………………………………………..……………………….……37
2.2. Fonction de réponse……………………………………………………………………...39
2.3. Critères de choix de la fonction de réponse………………..…………………………….42
2.4. Alignement des observations………………………………………………………..…...44
2.5. Prédictions inverses…………………………………………………………………..…..46
2.6. Justesse…………………………………….………………………………………….….46
2.7. Fidélité……………………………….…………………………………………………..47
2.8. Exactitude……………………………………………………………………………......47
2.9. Erreur totale et profil d’erreur totale…………….……………………………...……......48
2.10. Intervalle de tolérance…………………….……………………………………......…...48
2.11. Profil d’exactitude…………………………………….....……………………..……….49
2.12. Linéarité………………………………...……………..………………………………..49
2.13. Limites de quantification et intervalle de dosage……………………….....……….......50
2.14. Robustesse…………………………...…………………...…………………….……….50
3. Discussions ……………...………………………………………………………….……...53
3.1. Spécificité……………………………….………………………………………….…….53
3.2. Choix de la fonction de réponse………………...………………………………...……...53
3.3. Profil d’exactitude…………………………………………………………………......…53
3.4. Limites de quantification et intervalle de dosage…………….…………………………..54
3.5. Linéarité…...………………….……………………………………………………….…54
3.6. Robustesse……………………………………………….………………………….……54
Conclusion……………………………………………………………………………………55
Conclusion générale……………..…………………………………………………..……......56
Références bibliographiques
Annexes
Résumé

iii
 LISTE DES ABREVIATIONS

AINS : Anti Inflammatoire Non Stéroïdien

ARA II : Antagoniste des Récepteurs de l’Angiotensine II
COX : Cyclo oxygénase
CV : Coefficient de Variation
DCI : Dénomination Commune Internationale
DDL : Degré De Liberté
FDA : Food and Drug Administration
FI : Fidélité Intermédiaire
FR : Forme Reconstituée
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
ICH : International Conference on Harmonization
IEC : Inhibiteurs de l’Enzyme de Conversion
IM : Intra Musculaire
ISO : International Standard Organization
IT: Intervalle de Tolérance
IV : Intra Veineuse
ND : Non Déterminé
NS : Non Significatif
Ord : Ordonnée
PA : Principe Actif
PE : Pharmacopée Européenne
PEG : Poly Ethylène Glycol
S : Significatif
SE: Standard d’Etalonnage
SV: Standard de Validation
SFSTP : Société Française des Sciences Techniques et Pharmaceutiques
UV : Ultra-Violet

iv
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 01 : Propriétés physicochimiques du diclofénac de sodium……………..………...03

Tableau 02 : Interactions médicamenteuses…………………………………….……….…..08
Tableau 03 : Avantages et inconvénients des suppositoires………...……………………….13
Tableau 04 : Résumé des critères de validation en fonction du type d’analyse………..……16
Tableau 05 : Choix du nombre de standards d’étalonnage et de standards de validation en
fonction du protocole choisi…………………………………………………………………. 21
Tableau 06 : Exemples de fonctions de réponse……………...……………………………...22
Tableau 07 : Règles d’alignement pour différentes fonctions de réponse………...…………23
Tableau 08 : Calcul des prédictions inverses pour différentes fonctions de réponse……..…24
Tableau 09 : Calcul des prédictions inverses pour la droite ayant subi une transformation
logarithmique ou racine carrée………………………………………………………………..25
Tableau 10 : Critères de choix de la fonction de réponse…………...……………………….30
Tableau 11 : Ensemble d’étapes combinatoires permettant l’étude de la robustesse……......33
Tableau 12 : Matériels du laboratoire de chimie analytique utilisés dans le présent
travail........................................................................................................................................35
Tableau 13 : Résultats des tests de comparaison des deux pentes de régression (gamme
standard et gamme matrice)
Tableau 13.1 : Résultats obtenus sur la gamme standard…………………………….……...38
Tableau 13.2 : Résultats obtenus sur la gamme placebo chargé……..………………………38
Tableau 13.3 : Comparaison des pentes……………………….…………………………….39
Tableau 14 : Résultats obtenus pour la fonction y = ax + b………………………………....39
Tableau 15 : Résultats obtenus pour la fonction Ln Y = f(Ln X)……………………………40
Tableau 16 : Résultats obtenus pour la fonction √𝑌 = 𝑓(√𝑋)……………………………...41
Tableau 17 : Modèles d’étalonnage triés par indices d’exactitude…………………………..43
Tableau 18 : Alignement des réponses observées avec les trois séries des standards de
validation
Tableau 18.1 : Alignement des réponses observées avec la série 1…………………………44
Tableau 18 .2 : Alignement des réponses observées avec la série 2………………………....45
Tableau 18 .3 : Alignement des réponses observées avec la série 3………………………....45
Tableau 19 : Prédictions inverses obtenues pour les standards de validation……………….46
Tableau 20 : Justesse calculée pour chaque niveau de concentration des standards de
validation……………………………………………………………………………………...46
Tableau 21 : Fidélité calculée pour chaque niveau de concentration des standards de
validation…………………………………………………………………………………….. 47
v
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 22 : Résultats de calcul de l’exactitude………………………………………...…...47

Tableau 23 : Calcul de l’erreur totale pour chaque niveau de concentration des standards de
validation ……………………………………………………………………………………48
Tableau 24 : Calcul des limites de tolérance pour chaque niveau de concentration j……….49
Tableau 25 : Matrice des effets d’un plan factoriel 23.…………………………………...….51
Tableau 26 : Plan d’expérience à trois facteurs et calcul de l’écart type ………………...….52
Tableau 27 : Calcul des limites de confiance pour les effets des paramètres………...……...53

vi
 LISTE DES FIGURES

Figure 01 : Mécanismes d’action du diclofénac de sodium………………………..……......06

Figure 02 : Conception générale d’un fondoir…………………………………………........12

Figure 03 : Logigramme permettant de sélectionner un protocole de validation……………21

Figure 04 : Chromatogramme d’un standard d’étalonnage niveau 100%.............................. 37

Figure 05 : Chromatogramme d’un standard de validation niveau 100%...............................37

Figure 06 : Courbes d’étalonnage obtenues avec les trois séries des standards
d’étalonnage…………………………………………………………………………………..40

Figure 07 : Courbes d’étalonnages LnY=f(LnX) obtenues sur les trois séries des
SE…………………………………………………………………………………...………...41

Figure 08 : Courbes d’étalonnages √Y = f(√X) obtenues avec les trois séries des
SE…………………………………………………………………………………….…….....42

Figure 09 : Profil de l’erreur relative totale………………………………………………….48

Figure 10 : Tracé du profil d’exactitude…………………………………………………......49

Figure 11 : Profil de linéarité entre les concentrations trouvées et les concentrations

introduites……………………………………………………………………………...….….50

vii
 INTRODUCTION GENERALE

Le diclofénac de sodium est un anti-inflammatoire non stéroïdien appartenant à la famille

chimique des arylcarboxyliques. Il est utilisé pour ses propriétés antalgiques et anti-
inflammatoires.

Vu son importante utilisation, plusieurs techniques analytiques comme la spectrophotométrie,

la chromatographie sur couche mince, la chromatographie liquide de haute performance et la
potentiomètrie directe par des électrodes sélectives ont été utilisées pour son dosage dans les
formulations pharmaceutiques.

Toute nouvelle méthode mise au point doit faire l’objet d’une validation, exigence
réglementaire, avant sa mise en routine, cette dernière est basée sur un ensemble de mesures
expérimentales et des tests statistiques qui permettent de prouver qu’une procédure est
suffisamment exacte et fiable et de garantir aux laboratoires et aux autorités compétentes les
résultats fournis. Actuellement, de nouvelles tendances et de nouveaux concepts scientifiques
apparaissent afin de faire évoluer la validation des méthodes analytiques, avec notamment
l’apparition de l’utilisation du profil d’exactitude comme outil de décision.

Le contenu de notre mémoire élaboré est réparti en deux grandes parties, lesquelles sont
scindées en chapitres :
La première partie comprend une synthèse bibliographique composée de trois chapitres :
Chapitre I : diclofénac de sodium
Chapitre II : suppositoires
Chapitre III : validation analytique
La deuxième partie est consacrée à la pratique qui comprend la mise au point et la validation
d’une méthode de dosage du diclofénac de sodium dans les suppositoires à 100 mg par HPLC.

1
 OBJECTIFS

L’objectif de notre étude est de mettre au point et de valider une technique analytique de
dosage du diclofénac de sodium dans les suppositoires à 100 mg par Chromatographie
Liquide Haute Performance (HPLC) en vue d’être appliquée en routine, en utilisant le profil
d’exactitude comme outil de décision. Approche harmonisée décrite dans le guide de
validation élaboré par une commission de la Société Française des Sciences Techniques et
Pharmaceutiques (SFSTP) publié dans la revue STP Pharma Pratique en janvier 2006.
La partie pratique de ce travail s’étale sur une période de deux mois.

2
PARTIE THEORIQUE
 CHAPITRE I

DICLOFENAC DE SODIUM
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE I : DICLOFENAC DE SODIUM

Introduction
Le diclofénac de sodium appartient à la famille des AINS (Anti Inflammatoires Non
Stéroïdiens) : ce sont des médicaments symptomatiques s’opposant au processus
inflammatoire quelle qu’en soit la cause (mécanique, chimique, infectieuse, immunologique).
Ils possèdent des propriétés anti-inflammatoires, antalgiques et antipyrétiques [1].

1. Définition
Les AINS sont regroupés en plusieurs familles chimiques qui possèdent certaines
particularités. On distingue ainsi :
- Les salicylés ;
- Les indoliques ;
- Les oxicams ;
- Les fénamates ;
- Les coxibs (inhibiteurs sélectifs de la cyclo-oxygénase2) ;
- Les pyrazolés ;
- les arylcarboxyliques [1].

Le diclofénac est un arylcarboxylique de formule brute C14H11Cl2NO2, médicament inscrit

dans les pharmacopées mondiales sous diverses appellations [2]. Il est disponible sous
plusieurs formes : orale, injectable (IM, IV), rectale, cutanée, collyre et à différentes doses :
25 mg, 50 mg, 75 mg et 100 mg [3].

Les AINS agissent sur les signes locaux de l’inflammation : rougeur, chaleur, douleur et
œdème. En outre, tous les AINS possèdent, à coté de leur action anti-inflammatoire, une
action antalgique et antipyrétique [1].

2. Propriétés
2.1. Physicochimiques
Les propriétés physicochimiques du diclofénac de sodium sont résumées dans le tableau 01
suivant :

3
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE I : DICLOFENAC DE SODIUM

Tableau 01: Propriétés physicochimiques du diclofénac de sodium [4].

DCI diclofénac de sodium
Nom chimique [2-[2,6-dichlophényl) amino] phényl] acétate de sodium
Formule chimique C14H11Cl2NO2
brute
Pka 4.0 ± 0.2 à 25°C dans l’eau
Formule chimique
développée

Masse molaire 318.1 g/mole

Point de fusion environ 280°C, avec décomposition
Solubilité assez soluble dans l’eau, faiblement soluble dans le méthanol,
soluble dans l’éthanol à 96%, peu soluble dans l’acétone.
Aspect poudre cristalline blanche, ou faiblement jaunâtre, faiblement
hygroscopique.

2.2. Pharmacologiques
2.2.1. Pharmacocinétique
2.2.1.1. Absorption
Sous forme de suppositoire, le diclofénac de sodium est rapidement absorbé. Sa
biodisponibilité est de l'ordre de 50%. Après administration d'un suppositoire à 100 mg, le pic
de concentration plasmatique est atteint en 1 heure et se situe vers 2 mg/l.

2.2.1.2. Distribution
Le diclofénac de sodium est fortement lié aux protéines plasmatiques (taux de liaison > 99
%).
Dans le plasma, la décroissance des concentrations du diclofénac est bi-phasique. Elle
correspond à une phase rapide de distribution tissulaire et une phase plus lente d'élimination.

Le diclofénac diffuse dans le liquide synovial où les concentrations maximales sont mesurées
2 à 4 heures après le pic plasmatique. Sa demi-vie apparente d'élimination du liquide synovial
est de 3 à 6 heures. Le diclofénac passe en faible quantité dans le lait maternel.

2.2.1.3. Métabolisme
Le diclofénac de sodium est métabolisé rapidement. Ce métabolisme est pratiquement total. Il
est essentiellement hépatique.

4
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE I : DICLOFENAC DE SODIUM

Les principales voies de métabolisation sont l'hydroxylation et la glucuroconjugaison. Les

métabolites obtenus sont dénués d'activité pharmacologique.

2.2.1.4. Excrétion
L'excrétion est à la fois urinaire et fécale. Moins de 1% du principe actif est éliminé inchangé
dans les urines. Environ 60% de la quantité administrée est éliminée sous forme de
métabolites dans les urines, le reste est éliminé dans les fécès.

La demi-vie d'élimination plasmatique du diclofénac inchangé se situe autour de 1 à 2 heures.

La clairance plasmatique totale est d'environ 263 ml/minute [5].

2.2.2. Pharmacodynamiques
- Action antipyrétique : les AINS diminuent la fièvre d'origine infectieuse, inflammatoire ou
néoplasique, en s'opposant à la synthèse des prostaglandines PGE2 induites par les cytokines
dans le centre de la thermorégulation qui est l'hypothalamus.

- Action antalgique : cette action est surtout marquée pour les douleurs de l'appareil
locomoteur : (ostéoarticulaires, musculaires, tendino-ligamentaires), les douleurs
postopératoires, dentaires, les céphalées, les dysménorrhées, les coliques hépatiques ou
néphrétiques.

- Action anti- inflammatoire : cette action, très intriquée avec les deux précédentes, requiert
des posologies plus élevées notamment avec l'aspirine et les dérivés propioniques [1].

3. Mécanisme d’action
Le mécanisme d’action commun de tous les AINS est la diminution de la production des
prostaglandines, directement impliquées dans l’inflammation, la douleur et l’hyperthermie, du
fait de l’inhibition de la cyclo-oxygénase (COX) [1]. La plupart des AINS sont des acides
organiques qui agissent comme des inhibiteurs réversibles de la COX. Il y aura compétition
entre le substrat naturel (acide arachidonique) et l’AINS sur le site actif de l’enzyme. Les
AINS se fixent sur le même site hydrophobe que l’acide arachidonique sur l’enzyme [6,7].

La figure 01 ci-dessous illustre le mécanisme d’action du diclofénac de sodium :

5
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE I : DICLOFENAC DE SODIUM

Acide linoléique
Métabolisme
Acide arachidonique
Diclofénac Estérification
Phospholipides membranaires
Inhibe

Phospholipase A2(PLA2)
Acide arachidonique
Cyclo-oxygénase(COX) Lipo-oxygénase(LOX)

Prostaglandines (PGE2) et thromboxanes leucotriènes(LTB4)

Figure 01 : Mécanisme d’action du diclofénac de sodium.

4. Posologies et indications thérapeutiques

4.1. Posologie
Diclofénac sodique 100 mg, suppositoire :
- Traitement d’attaque : 150 mg en 2 prises, soit 1 suppositoire à 100 mg, à compléter avec
une forme orale à 50 mg.
- Traitement d’entretien (ou d’emblée chez certains malades) : 1 suppositoire à 100 mg par
jour, le soir au coucher.

Durée d’administration : L’utilisation de la voie rectale doit être la plus courte possible en
raison du risque de toxicité locale surajoutée aux risques par voie orale [8].

4.2. Indications
Elles découlent de l'activité anti-inflammatoire du diclofénac, de l'importance des
manifestations d'intolérance auxquelles le médicament donne lieu et de sa place dans
l'éventail des produits anti-inflammatoires actuellement disponibles.

Chez l’adulte et à partir de 15 ans, elles sont limitées au :

 Traitement symptomatique au long terme de :

6
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE I : DICLOFENAC DE SODIUM

-Rhumatismes inflammatoires chroniques, notamment polyarthrite rhumatoïde,

spondylarthrite ankylosante ou syndromes apparentés tels que le syndrome de Fiessinger -
Leroy-Reiter et rhumatisme psoriasique ;
- Certaines arthroses douloureuses et invalidantes.

 Traitement symptomatique de courte durée des poussées aiguës de:

- Rhumatismes abarticulaires (épaules douloureuses aiguës, tendinites, bursites) ;
- Arthrites microcristallines ;
- Arthroses ;
- Lombalgies, radiculalgies sévères [5].

5. Effets indésirables
Des études cliniques et des données épidémiologiques suggèrent que l'utilisation du
diclofénac de sodium, surtout lorsqu'il est utilisé à dose élevée (150 mg par jour) et sur une
longue durée de traitement, peut être associée à une légère augmentation du risque
d'évènement thrombotique artériel (par exemple, infarctus du myocarde ou accident
vasculaire cérébral). Les effets indésirables les plus fréquemment observés sont de nature
gastro-intestinale. Des ulcères peptiques, perforations ou hémorragies gastro-intestinales,
parfois fatales, peuvent survenir, en particulier chez le sujet âgé.

Des nausées, vomissements, diarrhées, flatulences, constipation, dyspepsie, stomatite

ulcérative, douleur abdominale, melæna, hématémèse, exacerbation d'une recto-colite ou
d'une maladie de Crohn ont été rapportées à la suite de l'administration d'AINS. Moins
fréquemment, des gastrites ont été observées [5].

6. Contre-indications
- Au-delà de 24 semaines d’aménorrhée (5 mois de grossesse) toute prise ponctuelle du
diclofénac est contre indiquée ;
- Les AINS passent dans le lait maternel par mesure de précaution il convient d’éviter de les
administrer chez la femme qui allaite ;
- Antécédents d’allergie ou d’asthme déclenché par la prise du diclofénac ou de substance
d’activité proche, tel qu’autres AINS, aspirine ;
- Hypersensibilité à l’un des excipients ;
- Ulcère gastroduodénal en évolution ;
- Insuffisance hépatocellulaire sévère ;
- Insuffisance rénale sévère ;
- Insuffisance cardiaque sévère non contrôlée ;
- Enfants de moins de 15 ans ;
- Antécédents récents de rectites ou de rectorragies [2].

7. Interactions médicamenteuses
Les principales interactions médicamenteuses du diclofénac sont résumées dans le tableau 02
suivant :

7
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE I : DICLOFENAC DE SODIUM

Tableau 02 : Interactions médicamenteuses [9].

Médicaments Effets
Sels de potassium, diurétiques Risque d’hyperkaliémie
hyperkaliémiants, IEC, ARA II.
Autres AINS Majoration du risque ulcérogène et
hémorragique digestif
Anticoagulants oraux et héparines non Augmentation du risque hémorragique de
fractionnées l’anticoagulant
Lithium Hyperlithémie par diminution de l’excrétion
rénale du lithium
Méthotrexate Toxicité hématologique majorée

8. Toxicité
Les études de toxicité aiguë, de toxicité en administration répétée, de génotoxicité et de
carcinogenèse n'ont pas révélé de risque lié à l'utilisation du diclofénac aux doses
thérapeutiques chez l'Homme. Il n'a pas été décelé de potentiel tératogène au diclofénac chez
la souris, le rat ou le lapin. Le diclofénac n'a pas eu d'effet sur la fertilité chez le rat; le
développement prénatal, périnatal et postnatal de la descendance n'a pas été affecté.

8.1. Surdosage
8.1.1. Symptômes
- Céphalées, agitation motrice, secousses musculaires, irritabilité accrue, ataxie, vertiges;
- Convulsions surtout chez l'enfant en bas âge;
- Douleurs épigastriques, nausées, vomissements, hématémèse, diarrhée, ulcère
gastroduodénal;
- Troubles de la fonction hépatique;
- Oligurie.

8.1.2. Conduite à tenir

- Transfert immédiat en milieu hospitalier spécialisé;
- Traitement symptomatique: accélération d'élimination, dialyse en cas d'intoxication grave
s'accompagnant d'insuffisance rénale, diazépam ou phénobarbital en cas de convulsions [5].

8
 CHAPITRE II

SUPPOSITOIRES
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE II : LES SUPPOSITOIRES

Introduction
L’industrie pharmaceutique moderne dispose de différentes voies d’administration et formes
pharmaceutiques dans le but de délivrer les principes actifs au site d’action. Parmi ces voies,
la voie orale est la plus employée avec en particulier l’usage des formes comprimé et gélule.
À ses côtés, on trouve les voies topique, parentérale, et rectale. Cette dernière est l’une des
plus anciennes voies d’administration avec comme principales formes pharmaceutiques, les
lavements et les suppositoires [10].

1. Historique
Les formes rectales sont parmi les plus anciennes formes pharmaceutiques puisque leur usage
remonte à l’Antiquité avec des mentions dans l’Ancien Testament ou les textes d’Hippocrate.
La première forme rectale fut le lavement puis le suppositoire dont le nom vient du latin
supponere qui veut dire « à la place du » lavement. Les premiers suppositoires étaient
constitués de formes solides (corne, miel cuit, gland, etc.) imprégnés dans des préparations
médicamenteuses. Cependant, il faut attendre le 19ième siècle pour que la forme suppositoire
devienne une véritable forme pharmaceutique moderne par l’utilisation du beurre de cacao
comme vecteur puis par l’introduction de la substance active dans la préparation fondue
avant moulage [10].

2. Définition
La Pharmacopée Européenne (PE) définit le suppositoire comme étant « une préparation
unitaire solide dont la forme, le volume et la consistance sont adaptés à l’administration
rectale. Les suppositoires peuvent contenir une ou plusieurs substances actives dispersées ou
dissoutes dans la masse suppositoire. Ces masses sont soit hydrophiles et se dissolvent ou se
dispersent au contact de l’eau de l’ampoule rectale, soit lipophiles et fondent à la température
rectale ». Les masses pour suppositoire référencées dans la PE sont les macrogols et les
mélanges gélatineux, pour les masses hydrophiles, et les glycérides hémi synthétiques et le
beurre de cacao, pour les masses lipophiles [10].

3. Excipients utilisées pour la fabrication des suppositoires

Les suppositoires peuvent contenir un ou plusieurs principes actifs dispersés ou dissous dans
un excipient simple ou composé qui est, suivant le cas, soluble ou dispersible dans l’eau ou
qui fond à la température du corps. D’autres excipients tels que des agents diluants,
absorbants, tensioactifs, lubrifiants, des conservateurs antimicrobiens et des matières
colorantes autorisées peuvent éventuellement être utilisés [11].

9
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE II : LES SUPPOSITOIRES

3.1. Propriétés
Les caractéristiques requises d’un excipient pour la fabrication des suppositoires doivent être
adaptées aux caractéristiques de l’ampoule rectale :
- Température de fusion proche de 37 °C et la capacité de se dissoudre ou se disperser dans
les fluides de l’ampoule rectale pour une libération rapide et totale du principe actif dans le
rectum.
- Innocuité et bonne tolérance vis-à-vis de la muqueuse rectale ;
- Inertie vis-à-vis des médicaments incorporés. Certaines incompatibilités avec les principes
actifs peuvent être dues aux impuretés des excipients ;
- Consistance convenable : il ne doit être ni trop mou, ni trop cassant. Pour la fabrication, la
zone de solidification doit être aussi réduite que possible pour assurer une prise en masse
rapide et il doit se rétracter au refroidissement pour faciliter le démoulage ;
- Capacité d’étalement sur la muqueuse pour favoriser l’absorption du principe actif ;
- Bonne conservation [10,11].
Les excipients correspondants à ces caractéristiques techniques sont limités en nature et en
nombre et doivent également répondre à des critères économiques, industriels et
réglementaires. Ainsi, ils doivent être facilement disponibles et avoir un prix raisonnable
[10].

3.2. Classification des excipients

Les excipients utilisés pour la fabrication des suppositoires peuvent être classés en deux
catégories principales :

3.2.1 Excipients lipophiles

Ce sont les excipients les plus utilisés, ils fondent dans le rectum à une température qui
avoisine 37°C.

3.2.1.1.Beurre de cacao
De moins en moins utilisé, le beurre de cacao est solide et suffisamment dur à température
ordinaire pour permettre une manipulation facile. La zone de ramollissement est assez courte
puisqu’elle est d’environ 3°C. La présence d’une proportion importante d’acide oléique dans
sa composition explique que sa conservation ne soit pas parfaite.

Il ne permet pas l’incorporation de solutions aqueuses sans recours à des adjuvants et présente
de façon marquée la possibilité de transformation en plusieurs variétés allotropiques à
propriétés physiques différentes, d’où la nécessité de précautions particulières dans la
préparation par fusion des suppositoires. Des trois formes α, β et βII, seule la forme β est
stable et fond à 32-35°C ; les autres fondent à des températures plus basses ce qui les rond
inutilisables [11].

10
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE II : LES SUPPOSITOIRES

3.2.1.2. Huiles hydrogénées

En mélangeant des huiles naturelles et en réglant le degré d’hydrogénation, on obtient des
produits cireux ressemblant au beurre de cacao et fondant aux environs de 33 à 37°C.
Convenablement choisis, ils possèdent les avantages cités pour le beurre de cacao.

Ils présentent de plus l’avantage de s’oxyder moins facilement. Comme dans le cas du beurre
de cacao, on ne peut y incorporer directement des solutions aqueuses [11].

3.2.1.3. Glycérides hémi-synthétiques solides

Ces excipients sont aussi des huiles hydrogénées mais contiennent une certaine quantité de
mono et de di-glycérides qui permettent l’incorporation de petites quantités de solutions
aqueuses de médicaments. Ils sont très employés en milieu industriel, sur le marché on trouve
les marques suivantes : witepsol ®, suppocire®, estarinum® [11].

3.2.1.4. Macrogols glycérides saturés

Ces excipients encore plus hydrophiles facilitent dans certains cas le passage des principes
actifs à travers la muqueuse rectale [11].

3.2.2. Excipients hydrosolubles

Le mélange gélatine-glycérine est bien hydrosoluble mais ne peut être considéré comme un
excipient du fait de l’action laxative de la glycérine.

Dans cette catégorie d’excipients, on y retrouve les macrogols ou les polyoxyéthyléne-glycols

(PEG) qui ont une consistance suffisante pour être mis sous forme de suppositoires. La
dispersion des principes actifs est due à la dissolution et non à la fusion de l’excipient qui
fond au-dessus de 40°C.

Ils ont l’avantage d’avoir une bonne stabilité thermique comme les glycérides mais ils
présentent deux inconvénients : d’une part celui d’être incompatibles avec un certain nombre
de principes actifs (barbituriques, pénicilline…) et d’autre part celui d’avoir une action
irritante sur la muqueuse rectale. Ils sont peu utilisés [11].

4. Production des suppositoires

La fabrication des suppositoires fait appel au procédé par fusion et coulée. Il existe un autre
procédé par compression qui n’est plus utilisé [11].

11
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE II : LES SUPPOSITOIRES

Le principe consiste à rendre le mélange principe actif et excipient suffisamment fluide par
action de la chaleur et coulée dans les alvéoles appropriés, ensuite la solidification du
suppositoire par refroidissement [11].

4.1. Traitement des principes actifs

- Si le PA est soluble dans l’excipient, il n’y a pas de traitements particuliers à lui faire subir.
- Si le PA est insoluble, il faut l’amener à un degré de ténuité convenable, d’une part pour
qu’il ne se produise pas de sédimentation pendant la coulée dans les moules et, d’autre part,
pour que la dissolution se fasse facilement dans le liquide aqueux du rectum.
- Si le PA est insoluble dans l’excipient mais très soluble dans l’eau, il peut être mis en
solution aqueuse. Celle-ci sera ensuite émulsionnée dans l’excipient fondu [11].

4.2. Traitement de l’excipient

La méthode courante consiste à faire fondre l’excipient à la température la plus basse possible
et à incorporer ensuite les principes actifs.

Industriellement on a recours à des fondoirs. Le fondoir, comme illustré dans la figure 02, est
une cuve en acier inoxydable à doubles parois entre lesquelles circule un fluide à température
parfaitement réglée. La masse liquéfiée traverse une grille ou tamis, qui retient les morceaux
d’excipients non fondus, avant d’être dirigée vers le mélangeur [11].

Figure 02 : Conception générale d’un fondoir.

4.3. Préparation de la masse

Excipient fondu et principe actif sont introduits dans un mélangeur en acier inoxydable dont
la température est parfaitement réglée à 1°C près. Le mélange est assuré par un appareil
mélangeur adapté aux constituants de la masse (agitateur rapide à hélice ou à turbine). La

12
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE II : LES SUPPOSITOIRES

dispersion faite, une agitation lente de toute la masse doit être assurée pendant toute la durée
de la répartition dans les moules pour éviter toute sédimentation. Lorsque les principes actifs
sont très volatils, il faut envisager l’emploi de cuves hermétiques [11].

4.4. Moulage des suppositoires

Deux procédés sont utilisés :
- Le moulage dans des moules métalliques (procédé officinal).
- Le moulage dans des moules-emballages en matière plastique à l’aide d’une pompe doseuse
(procédé industriel) [11].

4.4.1. Moules – emballages :

Les suppositoires sont coulés à l’aide de pompes doseuses dans les moules qui leur serviront
ensuite d’emballage. On évite ainsi l’opération délicate du démoulage. Les moules peuvent
alors être en acétate de cellulose, en chlorure de polyvinyle non plastifié, en polyéthylène ou
toute autre matière plastique thermoformable.

Les alvéoles, formés par soudure ou collage de deux feuilles de matière plastique
convenablement moulées, sont remplis par injection. Après refroidissement, l’orifice
supérieur est obturé à l’aide d’une bande adhésive.

Les formes les plus courantes de suppositoires sont la forme conique et la forme torpille. Il
existe pour les enfants des suppositoires sécables et, pour éviter les incompatibilités, des
suppositoires multicouches [11].

5. Avantages et inconvénients des suppositoires

Les avantages et les inconvénients des suppositoires sont cités dans le tableau 03 suivant :
Tableau 03 : Avantages et inconvénients des suppositoires [12].
Avantages Inconvénients
- Permet l’administration de - De très nombreux principes actifs
médicaments irritants pour le tube sont peu résorbés au niveau du
digestif ou altérés par les sucs rectum car la muqueuse est épaisse, la
digestifs ; surface de contact est faible et
- Facilité d’utilisation par les contient peu de liquides ;
nourrissons ; - C’est une forme qui plait peu ;
- Résorption rapide du principe actif - Conservation au frais ;
car le rectum est très vascularisé ; - Transport et prise difficiles dans la
- Libération lente du principe actif et journée.
action durable.

13
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE II : LES SUPPOSITOIRES

6. Mode d’action des suppositoires

Un suppositoire peut avoir une action mécanique, locale ou systémique.
L’action mécanique : est due à l’éveil d’un réflexe de défécation provoqué par la présence
d’un corps étranger dans le rectum. Dans le cas des suppositoires à la glycérine, celle-ci par
son hydrophilie attire de l’eau dans l’ampoule rectale et déclenche les mouvements
péristaltiques et, ainsi, l’effet laxatif recherché.

L’action locale : peut être une action antihémorroïdale ou encore une action antiparasitaire,
contre les oxyures par exemple.

L’action systémique : est la plus recherchée, le principe actif doit alors passer dans la
circulation générale.

La muqueuse rectale a un pouvoir d’absorption semblable à celui de la muqueuse de l’intestin

grêle mais la surface absorbante est limitée. Les principes actifs administrés par cette voie
passent très rapidement dans la circulation sanguine par les veines hémorroïdales et aussi,
mais en plus faible proportion dans la circulation lymphatique [11].

14
 CHAPITRE III

VALIDATION ANALYTIQUE
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

Introduction
La validation analytique des méthodes employées en industrie pharmaceutique constitue une
exigence réglementaire. Son champ d’application s’étend à toute procédure d’analyse utilisée
dans le contrôle de la matière première, le développement galénique, le contrôle en cours de
fabrication, le contrôle des produits intermédiaires et finis et les essais de stabilité de tous les
produits pharmaceutiques.

1. Définition
La validation analytique est la procédure par laquelle on démontre, preuve expérimentale à
l’appui, que les performances de la méthode permettent de répondre aux exigences de l’usage
auquel elle est destinée. Elle est fondée sur une analyse statistique basée sur un certain
nombre de critères [13].

2. But de la validation analytique

La validation analytique a pour principal objectif de fournir, aux laboratoires ainsi qu’aux
autorités compétentes, les garanties qu’une méthode analytique donnée fournit des résultats
suffisamment fiables et reproductibles, compte tenu du but de l’analyse. Il faut donc définir
correctement, à la fois, les conditions dans lesquelles la méthode sera utilisée et le but dans
lequel elle sera employée.

Ces principes s’appliquent à toutes les méthodes utilisées en industrie pharmaceutiques,

qu’elles soient ou non décrites dans une pharmacopée, afin de minimiser le risque tant au
niveau du producteur que du futur consommateur [14].

3. Aspect réglementaire et normatif

Les principaux référentiels qui décrivent les procédures de validation analytique sont les
suivants :
- Les documents : ISO 17025 « Exigences générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnages et d’essais ». Et ISO 5725 « Exactitude (justesse et fidélité) des
résultats et méthodes de mesures.
- Les documents ICH:
- ICH Q2A : Text on validation of analytical procedures “definitions and
terminology” (1995);
- ICH Q2B : Text on validation of analytical procedures “methodology”
(1997);
- ICH Q2 (R1) : Validation of analytical procedures: text and methodology
(2005).

15
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

- Les documents FDA (Guidance for industry): validation of bioanalytical method (2001).
- Le guide de validation analytique-rapport d’une commission SFSTP :
- Méthodologie 1992
- Exemples d’application 1992
- la validation des procédures analytiques quantitatives : Harmonisation des démarches-Guide
SFSTP :
- Partie I : Généralités (2003)
- Partie II : Statistiques (2006)
- Partie III: Exemples d’application (2006)

4. Critères de validation
Les principaux critères de validation sont ceux couramment utilisés dans les laboratoires
d’analyse et dont la nécessité de l’étude a fait l’objet d’un large consensus. Ces critères sont
les suivants :
- Spécificité-sélectivité ;
- Exactitude ;
- Linéarité ;
- Fidélité ;
- Sensibilité ;
- Limite de détection ;
- Limite de quantification ;
- Robustesse.

Tous ces critères ne sont pas applicables à toutes les méthodes d’analyse (tableau 04). Cela
dépend en grande partie du but de l’analyse [14].

Tableau 04 : Résumé des critères de validation en fonction du type d’analyse [13].

16
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

4.1. Spécificité-sélectivité
La spécificité d’une procédure analytique est sa capacité à établir de manière univoque
l’existence de la substance à analyser en présence d’autres composants potentiellement
présents.

Une procédure d’analyse est dite spécifique lorsqu’elle permet de garantir que le signal
mesuré provient seulement de la substance à analyser ou qu’elle permet de mesurer
quantitativement un paramètre physicochimique ou un groupement fonctionnel d’une ou de
plusieurs substance(s) dans l’échantillon.

En pratique, une procédure d’analyse de convenir exclusivement à la caractéristique ou

l’analyte, avec la garantie que le résultat de l’analyse ne provient que de l’analyte [14].

4.2. Exactitude
L’exactitude exprime l’étroitesse de l’accord entre le résultat d’essai et la valeur de référence
acceptée, aussi appelée « valeur conventionnellement vraie ». L’étroitesse de l’accord ainsi
observée est la résultante de la somme des erreurs systématique et aléatoire, en d’autres
termes l’erreur totale liée au résultat. Par conséquent, l’exactitude est l’expression de la
somme de la justesse et de la fidélité [14].

4.3. Linéarité
La linéarité d’une procédure d’analyse est sa capacité à l’intérieur d’un certain intervalle de
dosage d’obtenir des résultats directement proportionnels à la quantité (exemple :
concentration) en analyte dans l’échantillon [14].

4.4. Fidélité
La fidélité exprime l’étroitesse de l’accord (degré de dispersion, coefficient de variation) entre
une série de mesures provenant de multiples prises d’un même échantillon homogène
(résultats d’essais indépendants) dans des conditions prescrites. La fidélité fournit une
indication sur les erreurs liées au hasard.

La fidélité peut être évaluée à trois niveaux : la répétabilité, la fidélité intermédiaire (intra
laboratoire) et la reproductibilité (inter laboratoire).

Les mesures quantitatives de la fidélité dépendent de façon critique des conditions stipulées.
Peuvent ainsi être distinguées les conditions de :

17
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

- Répétabilité : conditions où les résultats d’essais indépendants sont obtenus par la même
méthode sur des échantillons d’essais identiques dans le même laboratoire, par le même
opérateur, utilisant le même équipement et pendant un court intervalle de temps ;

- Fidélité intermédiaire : conditions où les résultats d’essais indépendants sont obtenus par la
même méthode sur des échantillons d’essais identiques dans le même laboratoire, avec
différents opérateurs et utilisant des équipements différents et pendant un intervalle de temps
donné ;

- Reproductibilité : conditions où les résultats d’essais sont obtenus par la même méthode sur
des échantillons d’essais identiques dans différents laboratoires, avec différents opérateurs et
utilisant des équipements différents [14].

4.5. Sensibilité
La sensibilité d’une procédure d’analyse peut être définie comme étant le rapport de la
variation de la réponse de la méthode d’analyse à la variation de la quantité d’analyte.

Une procédure est dite sensible si une faible variation de la concentration ou de la quantité
d’analyte entraîne une variation significative de la réponse [14].

4.6. Limite de détection

La limite de détection d’une procédure d’analyse est la plus petite quantité de l’analyte dans
un échantillon pouvant être détectée, mais non quantifiée comme une valeur exacte dans les
conditions expérimentales décrites de la procédure [14].

4.7. Limite de quantification

La limite de quantification est la plus petite quantité de l’analyte dans un échantillon pouvant
être dosée dans les conditions expérimentales décrites avec une exactitude définie [14].

4.8. Robustesse
La robustesse d’une méthode est sa capacité à maintenir ses performances lorsqu’elle est
soumise à de petites variations fortuites des conditions expérimentales, telles celles
susceptibles de se produire lors de sa mise en œuvre par un autre opérateur, sur un autre
matériel ou dans un autre laboratoire [13].

5. Etude statistique de la validation analytique

La validation de techniques d’analyses en chimie analytique passe par l’étude et la validation
de plusieurs critères qui sont : spécificité, linéarité, exactitude, fidélité, limite de

18
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

quantification et de détection. Cette méthodologie est basée à la fois sur les critères décrits
dans le guide élaboré par la SFSTP et ICH Q2(R1).

Le protocole SFSTP 2006 repose sur l’utilisation du profil d’exactitude, basé sur la notion
d’erreur totale (erreur systématique + erreur aléatoire), permettant de simplifier l’approche de
la validation d’une procédure analytique tout en contrôlant le risque associé à son utilisation
[15].

5.1. Spécificité
5.1.1. Protocole
L’étude de la spécificité nécessite la préparation et l’analyse des solutions suivantes :
- Le diluant ;
- Une solution placebo ;
- Une solution standard à 100% (par rapport à la concentration théorique) ;
- Une solution échantillon (ou forme reconstituée ou placebo chargé) à 100% (par rapport à la
concentration théorique) [16].

5.1.2. Etude statistique

La spécificité peut être démontrée de deux façons :
- Soit en comparant les chromatogrammes obtenus à partir des quatre solutions précédemment
préparées : les chromatogrammes obtenus à partir de la solution standard 100% et
l’échantillon 100% doivent renfermer des pics au même temps de rétention et avec des
surfaces comparables et les chromatogrammes obtenus à partir du diluant et de la solution
placebo ne doivent pas présenter un pic au même temps de rétention que le diclofénac de
sodium.
- Soit par la comparaison de la droite obtenue avec la matrice (forme reconstituée) avec celle
obtenue à partir de la gamme standard. Ceci tend à démontrer l’absence d’effet matrice
(absence d’interactions entre le milieu et la substance à quantifier) [16].

Test t de Student
Si les pentes sur standard et sur la forme reconstituée sont comparables, leur différence ne
doit pas être différente de zéro.

Ceci revient donc à comparer une valeur observée (a1 – a2) à une valeur théorique (zéro)
connaissant l’erreur totale (l’écart type) faite sur a1 et a2.

19
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

|𝑎1 –𝑎2 |
t calculé =
2 +𝜎 2
√𝜎𝑎1 𝑎2

Le tcalculé est comparé à la valeur t° (α ; n1+n2-4) lue sur la table de Student.

Si tcalculé < t°, les pentes sont comparables donc absence d’effet matrice : la méthode est
spécifique [16].

Avec :
- a1 et a2 : pentes respectives des droites de régression D1 (obtenue à partir de la gamme
standard) et D2 (obtenue à partir de la gamme placebo chargé).
- σa12 et σa22 : variances respectives des pentes a1 et a2.
- α: risque d’erreur accepté (5%).
- n1 et n2 : nombre d’échantillon réalisé pour la forme standard et la forme placebo chargé.
- n1+n2-4 : degré de liberté (ddl).

Après avoir vérifié la spécificité de la méthode d’analyse on opère sur deux ensembles
d’échantillons :

- Standards d’étalonnage (SE) : peuvent être réalisés sans la matrice (si on a démontré
l’absence d’effet matrice) ou avec la matrice, utilisés pour évaluer les différentes fonctions de
réponse y = f(x) afin d’effectuer les prédictions inverses.

- Standards de validation (SV) : doivent toujours être réalisés avec la matrice, utilisés dans le
but de déterminer l’erreur totale à chaque niveau de concentration, calculer l’intervalle de
tolérance et tracer le profil d’exactitude et déterminer les limites inférieure et supérieure de
quantification (intervalle de dosage).

En ce qui concerne la préparation des SE et SV, celle-ci dépend du protocole de validation

choisi. Le logigramme de la figure 03 suivante, présente la démarche proposée dans le guide
SFSTP 2003 pour sélectionner un protocole expérimental de validation en fonction des
contraintes ou des spécificités liées à la procédure de dosage sous épreuve.

20
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

Figure 03 : Logigramme permettant de sélectionner un protocole de validation [14].

SE : standard d’étalonnage. SV : standard de validation.

Le tableau 05 suivant présente selon le protocole choisi, le nombre total d’essai à réaliser pour
valider la procédure analytique concernée :
Tableau 05 : Choix du nombre de standards d’étalonnage et de validation en fonction du
protocole choisi [14].

21
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

Le protocole adopté dans notre étude est le V2 modifié : en utilisant cinq niveaux de
concentrations au lieu de trois pour les SE et les SV.

5.2. Fonction de réponse

Une fois les expériences réalisées et les données collectées, il convient tout d’abord de
déterminer, sur la base des standards d’étalonnage (SE), la relation entre la réponse (signal ou
réponse de l’instrument) Y et la quantité (concentration) X. Cette relation se caractérise à
l’aide d’une fonction f qui doit être strictement monotone (strictement croissante ou
décroissante) sur l’intervalle de dosage envisagé:

Y = f (X) + ε

Où ε est l’erreur associée à la fonction de réponse f appelée communément erreur résiduelle.

Il faut donc ajuster la fonction de réponse, c’est-à- dire évaluer les paramètres du modèle, de
manière à ce que l’erreur résiduelle soit minimisée.

Différentes fonctions de réponse peuvent être envisagées lors de la validation de la méthode,

comme illustré au tableau 06. Le choix dépend du type de méthode (méthode
physicochimique, bioanalytique, immunodosage) [15].

Tableau 06 : Exemples de fonctions de réponses [15].

Très vraisemblablement, la plupart des méthodes physicochimiques auront recours à la droite

(passant par 0 ou non). Pour les méthodes bioanalytiques, la fonction quadratique pourra être
envisagée dans certains cas. Dans le cas d’un immunodosage, le choix se portera sur les
fonctions logistiques à 4 ou 5 paramètres.

22
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

Des transformations mathématiques sont également envisageables. Par exemple, le logarithme

népérien ou la racine carrée pourrait être appliqué à la concentration X ainsi qu’à la réponse
Y. Il est cependant recommandé de n’appliquer ce type de transformation qu’avec les modèles
linéaires du tableau 06 [15].

5.3. Alignement des observations

Si, pour un niveau de concentration, les quantités introduites ne sont pas identiques pour
toutes les séries (souvent pour de raisons de pesées qui doivent être indépendantes), il est
indispensable de procéder à un alignement sur la concentration moyenne dès lors qu’un calcul
de variance doit être effectué (estimation de la répétabilité et de la fidélité intermédiaire).

Cela consiste à transformer les réponses observées (yijk → yijk,c) afin de les aligner sur cette
concentration moyenne. Cet alignement s’effectue par interpolation en ajoutant à la réponse
observée la différence entre la valeur de la fonction de réponse considérée à la concentration
moyenne et la valeur de cette fonction à la concentration introduite.

En validation, l’alignement s’applique aux réponses obtenues avec les échantillons de

validation en utilisant les équations ou fonction de réponses obtenues avec les standards
d’étalonnage. Ainsi l’alignement des nij répétitions du niveau de concentration j de la série i
s’effectue comme suit :
𝑦𝑖𝑗𝑘,𝑐 = 𝑦𝑖𝑗𝑘 + 𝑓(𝑥̅𝑖𝑗 ) − 𝑓(𝑥𝑖𝑗𝑘 )

Où : 𝑥̅𝑖𝑗 : Moyenne des concentrations introduites du niveau j de la série i.

𝑥𝑖𝑗𝑘 : Concentration introduite du niveau j de la série i répétition k.

En résumé, pour les différentes fonctions de réponse (tableau 07) :

Tableau 07 : Règles d’alignement pour différentes fonctions de réponses [15].

23
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

5.4. Prédictions inverses

Après avoir choisi le modèle mathématique adéquat des concentrations en retour avec la
fonction de réponse sont calculées.

Les prédictions inverses pour les différents modèles de régression s’obtiennent comme
suit (tableau 08).

Tableau 08 : Calcul des prédictions inverses pour différentes fonctions de réponses [15].

24
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

Si les observations ont été alignées, il faut remplacer les yijk par yijk,c dans le tableau
précédent.

Si une transformation a été utilisée il ne faut pas oublier d’effectuer la transformation inverse
après ce calcul en retour (tableau 09). Par exemple, après une transformation logarithmique ou
racine carrée de la droite les concentrations calculées se font de la manière suivante :

Tableau 09 : Calcul des prédictions inverses pour la droite ayant subi une transformation
logarithmique ou racine carrée [15].

5.5. Calcul de la justesse et de la fidélité

5.5.1. Modèle
La justesse d’une méthode analytique exprime l’étroitesse de l’accord entre la moyenne des
résultats d’essai avec la méthode et la valeur de référence acceptée, aussi appelée valeur
conventionnellement vraie.

L’estimation de la justesse et de la fidélité de la méthode s’effectue avec les concentrations

calculées provenant des standards de validation en phase de validation. Cette estimation est
réalisée à chacun des j niveaux de concentration considérés à l’aide du modèle statistique
suivant :
𝑋𝑖𝑗𝑘 = 𝜇𝑗 + 𝛼𝑖𝑗 + 𝜀𝑖𝑗𝑘
Où
- Xijk est la k-ième concentration calculée du niveau j de la i-ème série.
- μj est la moyenne des concentrations calculées du niveau de concentration j.
- αij est au niveau j l’écart entre la moyenne de la i-ème série et la moyenne μj ; αij est
considéré comme une variable aléatoire ayant une distribution normale de moyenne 0 et de
variance σ2B,j .
- εijk est l’erreur expérimentale, considérée comme une variable aléatoire ayant une
distribution normale de moyenne 0 et de variance σ2W,j. .
L’erreur expérimentale est supposée indépendante de la série.

Les variances σ2B,j et σ2W,j représentent les variances inter-série et intra-série respectivement.

25
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

La méthode du maximum de vraisemblance restreint est utilisée pour estimer à chaque niveau
de concentration j les paramètres μj, σ2B,j et σ2W,j du modèle.

𝑝 𝑛𝑖𝑗
1
𝜇̂ 𝑗 = ∑ ∑ 𝑥𝑖𝑗𝑘,𝑐𝑎𝑙𝑐
∑𝑝𝑖=1 𝑛𝑖𝑗
𝑖=1 𝑘=1
𝑝
1
𝑀𝑆𝑀𝑗 = ∑ 𝑛𝑖𝑗 (𝑥̅𝑖𝑗,𝑐𝑎𝑙 − 𝑥̅𝑗,𝑐𝑎𝑙𝑐 ) 2
𝑝1 − 1
𝑖=1
𝑝 𝑛𝑖𝑗
1
𝑀𝑆𝐸𝑗 = ∑ ∑(𝑥𝑖𝑗𝑘,𝑐𝑎𝑙𝑐 − 𝑥̅𝑖𝑗,𝑐𝑎𝑙𝑐 )2
∑𝑝𝑖=1 𝑛𝑖𝑗 _𝑝
𝑖=1 𝑘=1

Où : MSMj et MSEj : maximum des vraisemblances pour chaque niveau de concentration j.

𝑥̅𝑖𝑗,𝑐𝑎𝑙𝑐 : moyenne des concentrations calculées du niveau j de la série i.

𝑥̅𝑗,𝑐𝑎𝑙𝑐 : moyenne des concentrations calculées du niveau j.

𝑥̅𝑖𝑗𝑘,𝑐𝑎𝑙𝑐 : concentration calculée du niveau j de la série i répétition k.

n : nombre de répétitions.
p : nombre de série.

Dans le cas d’un schéma équilibré (le nombre de répétitions est identique pour tout niveau de
concentration dans chaque série), les composantes de la variance du niveau sont estimées
comme suit (n étant le nombre de répétition dans chaque série) [15].
Si MSEj < MSMj alors :
2
𝜎̂𝑤𝑗 = 𝑀𝑆𝐸𝑗

2
𝑀𝑆𝑀𝑗 _𝑀𝑆𝐸𝑗
𝜎̂𝐵,𝑗 =
𝑛
Sinon :
𝑝 𝑘
2
1
𝜎̂𝑊.𝑗 = ∑ ∑(𝑥𝑖𝑗𝑘,𝑐𝑎𝑙𝑐 − 𝑥̅𝑗 𝑐𝑎𝑙𝑐 ) 2
𝑝𝑛 − 1
𝑖=1 𝑗=1
2
𝜎̂𝐵,𝑗 =0

5.5.2. Justesse
La justesse (ou le biais) de la méthode au niveau de concentration est obtenue en calculant la
différence entre la moyenne arithmétique des concentrations introduites et la moyenne des
concentrations calculées.

26
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

Le biais peut s’exprimer en termes absolu, relatif ou de recouvrement par rapport aux
quantités introduites, comme suit:
𝑏𝑖𝑎𝑖𝑠𝑗 = 𝜇̂ ̅𝑗 − 𝑥̅𝑗
̅
̂ 𝑗 −𝑥̅ 𝑗
𝜇
𝑏𝑖𝑎𝑖𝑠 (%)𝑗 = 𝑥̅ 𝑗
× 100

𝜇̂ ̅𝑗
𝑟𝑒𝑐𝑜𝑢𝑣𝑟𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡 (%)𝑗 = × 100
𝑥̅𝑗

Où : 𝜇̂ ̅𝑗 : moyenne des concentrations calculées du niveau j.

𝑥̅𝑗 : moyenne des concentrations introduites du niveau j.

5.5.3. Fidélité
L’estimation de la variance intra-série donne une estimation de la variance de répétabilité
tandis que la somme des estimations des variances intra et inter-série donne une estimation de
la variance de fidélité intermédiaire :

Répétabilité : 𝜎̂2Re,j = 𝜎̂2w,j

Fidélité intermédiaire : 𝜎̂2IP,j = 𝜎̂2w,j + 𝜎̂2B,j [15].

5.6. Calcul de l’exactitude

L’exactitude d’un résultat exprime l’étroitesse de l’accord entre le résultat d’essai et la valeur
de référence acceptée, aussi appelée valeur conventionnellement vraie, à savoir pour chaque
mesure:
𝐸𝑥𝑎𝑐𝑡𝑖𝑡𝑢𝑑𝑒 = 𝑥 − 𝜇
Avec => 𝑥 : concentration prédite
µ : concentration introduite

Pour chaque modèle et chaque observation l’exactitude de la mesure en valeur relative est
donnée comme suit :
𝑥−𝜇
𝐸𝑥𝑎𝑐𝑡𝑖𝑡𝑢𝑑𝑒 (%) = × 100
𝜇
L’erreur maximale relative observée pour chaque modèle sur l’ensemble des séries montre
déjà l’impact du choix de la fonction de réponse sur l’exactitude des résultats [15].

5.6.1. Erreur totale et profil d’erreur totale

Chaque mesure obtenue est le reflet de la vraie valeur, du biais de la méthode et de sa fidélité,
ce qui s’exprime comme suit :

27
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

𝑥 = 𝜇 + |𝑏𝑖𝑎𝑖𝑠|𝑝𝑟𝑜𝑐é𝑑𝑢𝑟𝑒 + 𝑓𝑖𝑑é𝑙𝑖𝑡é 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚é𝑑𝑖𝑎𝑖𝑟𝑒𝑝𝑟𝑜𝑐é𝑑𝑢𝑟𝑒

𝑥 − 𝜇 = |𝑏𝑖𝑎𝑖𝑠|𝑝𝑟𝑜𝑐é𝑑𝑢𝑟𝑒 + 𝑓𝑖𝑑é𝑙𝑖𝑡é 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚é𝑑𝑖𝑎𝑖𝑟𝑒𝑝𝑟𝑜𝑐é𝑑𝑢𝑟𝑒

𝑥 − 𝜇 = 𝑒𝑟𝑟𝑒𝑢𝑟 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑝𝑟𝑜𝑐é𝑑𝑢𝑟𝑒

L’erreur totale d’une procédure analytique évalue son aptitude à produire des résultats exacts.
Donc l’estimation de l’erreur totale d’une procédure est fondamentale pour juger de la validité
d’une méthode.

Cette erreur totale, comme indiqué ci-dessus, est la somme de la justesse (biais) et de la
fidélité. L’erreur totale observée avec chaque modèle et pour chaque niveau de concentration
est étroitement liée avec les erreurs maximales observées correspondantes. Il est normal que
l’erreur maximale observée sur un grand nombre d’observations soit sensiblement plus grande
que l’erreur totale vu que ces erreurs maximales représentent des évènements rares tandis que
l’erreur totale reflète plutôt les plus grandes erreurs auxquelles on peut s’attendre dans la
plupart des cas.

Si l’on considère la seconde erreur la plus grande, on voit alors que les points se répartissent
bien autour de la bissectrice y=x, ce qui démontre bien que l’estimation de l’erreur totale rend
compte des erreurs les plus grandes que la méthode produit. L’erreur totale d’une procédure
analytique est donc bien un bon indicateur de l’exactitude des résultats qu’elle produit.

C’est la raison pour laquelle nous proposons ce critère pour une première évaluation simple
de la procédure analytique [15].

5.7. Calcul de l’intervalle de tolérance

L’important dans une validation analytique ce n’est pas la validité des résultats obtenus avec
l’erreur totale, mais plutôt la garantie ou une représentation de ce que la même procédure
analytique pourra donner comme résultats dans le futur. C’est le rôle de l’intervalle de
tolérance et du profil d’exactitude.

28
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

L’estimation des paramètres de justesse et fidélité μj, σ2B,j et σ2W,j, et à chaque niveau de
concentration j, n’est pas une fin en soi, mais une étape indispensable pour calculer la
proportion attendue de résultats qui se situent dans les limites d’acceptation.

L’intervalle de tolérance sera calculé pour chaque niveau de concentration envisagé avec les
standards de validation et pour chaque modèle mathématique.

Pratiquement, l’intervalle de tolérance se calcule comme suit en valeur absolue:

𝐸𝜇̂𝑀 𝜎̂𝑀 {𝑃𝑥 [𝜇̂ 𝑀 − 𝑘𝜎̂𝑀 < 𝑋 < 𝜇̂ 𝑀 + 𝑘𝜎̂𝑀 |𝜇̂ 𝑀 , 𝜎̂𝑀 ]} = 𝛽

Où :
2 2 2
𝜎̂𝐹𝐼,𝑗 = 𝜎̂𝑊,𝑗 + 𝜎̂𝐵,𝑗
2
𝜎̂𝐵,𝑗
𝑅𝑗 = 2
𝜎̂𝑊,𝑗

𝑅𝑗 + 1
𝐵𝑗 = √
𝑛𝑅𝑗 + 1

(𝑅 + 1) 2
𝑣=
(𝑅 + 1/𝑛) 2 1 − 1/𝑛
+ 𝑝𝑛
𝑝−1
1+𝛽
𝑄𝑡 (𝑣; )
2
n : nombre de répétitions
p : nombre de séries
Le même intervalle en échelle relative devient :

1+𝛽 1 1+𝛽 1
[𝑏𝑖𝑎𝑖𝑠(%)𝑗 − 𝑄𝑡 (𝑣; ) √1 + 𝑝𝑛𝐵2 𝐶𝑉𝐹𝐼,𝑗 ; 𝑏𝑖𝑎𝑖𝑠(%)𝑗 + 𝑄𝑡 (𝑣; ) √1 + 𝑝𝑛𝐵2 𝐶𝑉𝐹𝐼,𝑗 ]
2 𝑗 2 𝑗

Deux termes sont contenus dans l’intervalle de tolérance : l’un étant la justesse et l’autre
étant, à un facteur près, le coefficient de variation de fidélité intermédiaire. C’est la raison
pour laquelle cet intervalle peut ainsi être considéré comme une expression de l’exactitude des
résultats. Mais l’intervalle de tolérance intègre une dimension supplémentaire, celle de chance
(ou risque) pour des résultats futurs, conditionnellement à des résultats passés.

La méthode peut dès lors être considérée comme exacte au niveau de chance β pour le niveau
de concentration en question, si l’intervalle de tolérance est inclus dans les limites [-λ, +λ]
définies à priori en fonction des objectifs de la méthode [15].
29
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

5.8. Profil d’exactitude

5.8.1. Calcul
Le profil d’exactitude s’obtient en reliant entre elles les bornes supérieures puis les bornes
inférieures de l’intervalle de tolérance :

1+𝛽 1
𝐿𝑗 = 𝑏𝑖𝑎𝑖𝑠(%)𝑗 − 𝑄𝑡 (𝑣; ) √1 + 𝐶𝑉
2 𝑝𝑛𝐵𝑗2 𝐹𝐼,𝑗

1+𝛽 1
𝑈𝑗 = 𝑏𝑖𝑎𝑖𝑠(%)𝑗 + 𝑄𝑡 (𝑣; ) √1 + 𝐶𝑉
2 𝑝𝑛𝐵𝑗2 𝐹𝐼,𝑗

Si le profil d’exactitude est entièrement inclus dans les limites d’acceptations [-λ, +λ] alors on
peut affirmer que, en routine, le pourcentage de résultats dont la différence entre la valeur
déterminée X et la valeur vraie V est inférieure, en valeur absolue à λ sera au moins égale à
β [15].
𝑃𝑟𝑜𝑏 (|𝑋 − 𝑉 | < 𝜆 ) ≥ 𝛽

5.8.2. Choix de la fonction de réponse

L’utilisation de certaines fonctions ne permet pas à la procédure analytique d’atteindre ses
objectifs vu que pour certaines concentrations, les limites de tolérances sortent des limites
d’acceptation retenues. Par ailleurs, parmi les fonctions de réponses acceptables, on pourra
remarquer que certaines fournissent des résultats meilleurs que d’autres (exemple tableau 10).
Ce seront ces dernières qui devront être retenues.

Nous attirons également l’attention sur le fait, que pour l’ensemble de ces modèles, le
coefficient de détermination R2 est toujours supérieur à 0.99 et pas en rapport ici avec la
qualité des résultats. Une fois de plus nous tenons à souligner ici que ce coefficient n’est pas
une indication fiable de la qualité des résultats que la procédure rendra [15].

Tableau 10 : Critères de choix de la fonction de réponse.

30
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

Modèle Indice Limite inférieure Indice Indice de Indice de

d’exactitu- et supérieure de d’intervalle fidélité justesse
de quantification de dosage
(unit)

Régression linéaire 0.9329 [80.39, 120.2] 1.0000 0.8281 0.9805

Régression linéaire 0.9326 [80.39, 120.2] 1.0000 0.8274 0.9805

après
transformation
racine carrée

Régression linéaire 0.9323 [80.39, 120.2] 1.0000 0.8267 0.9803

pondérée (1/X)

Régression linéaire 0.9322 [80.39, 120.2] 1.0000 0.8263 0.9805

après
transformation
logarithmique

Régression linéaire 0.9317 [80.39, 120.2] 1.0000 0.8251 0.9802

pondérée (1/X2)

Régression 0.9248 [80.39, 120.2] 1.0000 0.8080 0.9787

quadratique
pondérée (1/X)

Régression 0.9250 [80.39, 120.2] 1.0000 0.8082 0.9791

quadratique
pondérée (1/X2)

Régression 0.9242 [80.39, 120.2] 1.0000 0.8069 0.9781

quadratique

6. Linéarité
La linéarité d’une procédure d’analyse est sa capacité à l’intérieur d’un certain intervalle de
dosage d’obtenir des résultats directement proportionnels à la quantité (ex : concentration) en
analyte dans l’échantillon. Rappelons que l’exigence de linéarité s’applique aux résultats
(concentrations calculées = f (concentrations introduites)), pas aux réponses (signal = f
(concentrations introduites)). C’est un pré-requis à l’estimation de la justesse. A l’inverse,
l’existence d’une relation linéaire entre la concentration estimée et la concentration introduite
n’implique pas que la méthode soit juste [15].

7. Limites de quantification

31
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

Le profil d’exactitude, construit à partir des intervalles des mesures attendues, permet donc de
décider des niveaux de concentration pour lesquels une procédure est apte à fournir des
résultats dans les limites d’acceptation. Ainsi, par définition, quand elle se produit,
l’intersection entre le profil d’exactitude et les limites d’acceptation définissent les limites de
quantification basse (LLOQ) et haute (ULOQ) de la procédure.

Entre ces deux limites, il y a bien sûr l’intervalle de dosage. De la sorte, les limites de
quantification sont bien les valeurs extrêmes qui peuvent être quantifiées avec une exactitude
définie [15].

8. Robustesse
8.1. Protocole
L’étude de robustesse est réalisée en préparant et en analysant deux solutions échantillons
(forme reconstituée) à 95% et à 105% et une solution standard de quantification à 100% par
rapport à la concentration théorique.

Chacune des deux solutions est analysée à deux débits différents et la détection sera faite à
deux longueurs d’onde différentes [16].

8.2. Etude statistique

L’étude statistique consiste en premier lieu au calcul des effets et interactions à partir des
réponses mesurées et de la matrice d’expérience, qui sera suivi de la recherche de la
significativité des effets.

Pour étudier l’influence de chaque paramètre et leurs interactions on utilise la méthode de

plan factoriel qui permet de faire varier plusieurs facteurs en même temps et de minimiser le
nombre d’essais à effectuer [16].

8.2.1. Méthode des plans factoriels

Pour chaque facteur on aura deux valeurs ou deux niveaux (un niveau bas 95% représenté par
un – et un niveau haut 105% représenté par un +).

Pour l’HPLC les paramètres à faire varier sont : la teneur en substance à analyser (A), le débit
(B) et la longueur d’onde (C).

Le premier paramètre étudié est la teneur en substance à analyser, noté A (PA), en faisant des
variations autour de deux niveaux de concentrations (niveau - = 95%, niveau + = 105%).

32
PARTIE THEORIQUE CHAPITRE III : VALIDATION ANALYTIQUE

Et c’est pareil pour les deux autres paramètres.

Les combinaisons réalisées sont représentées dans le tableau 11 suivant :

Tableau 11 : Ensemble d’étapes combinatoires permettant l’étude de la robustesse [16].

N° essai A (Teneur en PA) B (Débit) C (Longueur
d’onde)
1 Echantillon - - -
Standard / - -
2 Echantillon + - -
Standard / - -
3 Echantillon - + -
Standard / + -
4 Echantillon + + -
Standard / + -
5 Echantillon - - +
Standard / - +
6 Echantillon + - +
Standard / - +
7 Echantillon - + +
Standard / + +
8 Echantillon + + +
Standard / + +

Donc : le nombre d’essais à effectuer est de 2n, n : représente le nombre de facteurs.

L’usage du plan factoriel 23 a permis l’étude des trois paramètres A, B et C au même temps
ainsi que leurs interactions de 2ème ordre (AB, AC, BC) et l’unique interaction de 3ème ordre
(ABC).

Par exemple, le calcul de l’effet B sera :

B = 1/8 (-y1-y2+y3+y4-y5-y6+y7+y8)

Puis sa limite de confiance est ensuite établie :

𝜎𝑒𝑥𝑝
𝐵±𝑡( )
√8
𝜎𝑒𝑥𝑝 est l’écart type expérimental des mesures, t est le coefficient de Student.

Si l’intervalle de confiance de l’effet d’un paramètre d’une interaction contient le zéro, l’effet
de ce paramètre ou de cette interaction est considéré comme nul, si zéro est à l’extérieur de
l’intervalle de mesure, le résultat de mesure est influencé par la variation des paramètres en
cause [16].

33
PARTIE PRATIQUE
 PARTIE PRATIQUE

Introduction
Le dosage du diclofénac de sodium dans les suppositoires peut s’effectuer selon plusieurs
méthodes analytiques.

L’objectif du présent travail est de mettre au point et de valider une nouvelle méthode de
dosage du diclofénac sodique dans les suppositoires par Chromatographie Liquide Haute
Performance (HPLC).

Cette étude a été réalisée au sein du laboratoire de Chimie Analytique du Département de

Pharmacie de Tizi-Ouzou, et cela conformément au protocole de validation analytique décrit
dans le guide de validation élaboré par une commission de la Société Française des Sciences
et Techniques Pharmaceutiques (SFSTP) publié dans la revue STP Pharma Pratique en janvier
2006.

1. Matériels et méthodes
1.1. Matériels
1.1.1. Matières premières et réactifs
- Diclofénac de sodium : principe actif fourni gracieusement par le laboratoire
pharmaceutique BIOPHARM ;
- Glycéride hémi synthétique solide : suppocire, excipient fourni gracieusement par le
laboratoire pharmaceutique BIOPHARM ;
- Hydroxyde de sodium ;
- n- hexane ;
- Acide phosphorique ;
- Acétonitrile grade HPLC ;
- Méthanol grade HPLC ;
- Eau purifiée.

1.1.2. Appareillage et équipement

34
 PARTIE PRATIQUE

Tableau 12 : Matériels du laboratoire de chimie analytique utilisés dans le présent travail.

Désignation Spécifications Usage
Pompe LC 20 AT
Injecteur automatique SIL 20 A
Contrôleur CBM- 20
Appareil Compartiment de la CTO-20 A Analyse des
HPLC colonne solutions et obtention
(SHIMADZU Colonne C 18 des
LC20) Détecteur Détecteur chromatogrammes
spectrophotométrique
UV visible
Logiciel d’exploitation LC-solution
Purificateur de l’eau Human power I Purification de l’eau
Pompe à vide Fisher bioblok Filtration de la phase
scientific mobile
Pmax = 4 bar
Bain ultrasons : sonicateur Advantage-LAB Dissolution
Agitateur magnétique STUART Homogénéisation des
solutions
Balance de précision KERN Pesée
Etuve MEMMERT Séchage

1.1.3. Verrerie
- Béchers ;
- Fioles jaugées de 50 ml, 100 ml, 1000 ml et 2000 ml ;
- Pipette jaugée de 5 ml ;
- Eprouvettes graduées ;
- Erlenmeyer ;
- Ampoules à décanter.

1.1.4. Autres
- Spatule ;
- Pissettes à eau.

1.2. Méthodes
1.2.1. Préparation des solutions
1.2.1.1. Préparation du diluant (NaOH 0,1 N)
Dans une fiole jaugée de 1 L, peser 40g de NaOH, dissoudre dans un volume suffisant d’eau
purifiée. Agiter et mettre dans l’ultrason pour une dissolution complète puis compléter au trait
de jauge. Effectuer une dilution au 1/10 dans l’eau purifiée (100 ml de NaOH 1N dans 1 L
d’eau purifiée).

1.2.1.2. Préparation du standard 100%

35
 PARTIE PRATIQUE

Dans une fiole de 100 ml, peser 100 mg de diclofénac de sodium, ajouter 50 ml du diluant et
mettre dans l’ultrason pour une dissolution complète. Compléter au trait de jauge avec le
même diluant. Effectuer une dilution au 1/10 avec le même diluant (5 ml de la préparation
dans 50 ml de NaOH 0,1N).

1.2.1.3. Préparation du placébo

Solution A : dans un Erlenmeyer, peser 28,53 g (poids moyen de cinq suppositoires – masse
de principe actif 100 mg) de suppocire puis ajouter 150 ml de n-hexane, agiter jusqu’à
dissolution complète.

Solution placebo : dans une fiole jaugée de 100 ml, verser 10 ml de la solution A et compléter
jusqu’au trait de jauge avec le diluant (NaOH 0,1N), laisser reposer dans une ampoule à
décanter et soutirer la phase aqueuse, puis effectuer une dilution au 1/10 (5 ml de la
préparation dans 50 ml de NaOH 0,1N).

1.2.1.4. Préparation du placébo chargé à 100%

Dans une fiole jaugée de 100 ml, peser 100 mg de diclofénac de sodium, ajouter 50 ml du
diluant et mettre dans l’ultrason jusqu’à dissolution complète. Compléter au trait de jauge
avec le même diluant. Dans une ampoule à décanter, verser cette solution, ajouter 10 ml de la
solution A, agiter puis laisser le mélange reposer et soutirer la phase aqueuse. Effectuer une
dilution au 1/10 (5 ml de la préparation dans 50 ml de NaOH 0,1N).

1.2.1.5. Préparation de la phase mobile

Dans une éprouvette graduée de 1000 ml, mélangez 500 ml de méthanol grade HPLC, 280 ml
d’acétonitrile grade HPLC, 219 ml d’eau purifiée et 1 ml d’acide phosphorique. Filtrer puis
verser dans le réservoir de la phase mobile.

1.2.2. Conditions chromatographies

- Colonne : longueur 15 cm, diamètre 4.6 mm, taille des particules 5 µm, phase
stationnaire : gel de silice octadecylsilyle pour chromatographie (C18) ;
- Détection : longueur d’onde λ=263 nm ;
- Volume injecté : 20 µl ;
- Débit : 1.2 ml/min ;
- Température : ambiante.

2. Résultats
La technique de dosage utilisée dans notre méthode est l’HPLC (annexe I).
2.1. Spécificité

36
 PARTIE PRATIQUE

- Comparaison des chromatogrammes : illustrée dans les figures 04 et 05 ci-dessous :

Figure 04 : Chromatogramme du standard d’étalonnage niveau 100%.

Figure 05 : Chromatogramme du standard de validation niveau 100%.

- Comparaison des deux pentes des deux droites de régression : les résultats de test de
comparaison sont évalués dans le tableau 13 suivant :

Tableau 13 : Résultats de test de comparaison des deux pentes des deux droites de
régression (gamme standard et gamme placébo chargé)

37
 PARTIE PRATIQUE

Tableau 13.1 : Résultats obtenus sur la gamme standard.

Gamme standard

% théorique Masse introduite Aire du pic (yi-y*) ² (xi-x') ²

80,4 2604377 17908166,13 406,103104
80 80,09 2669243 6271378423 418,693444
80,42 2614538 188830565,1 405,297424
90,61 2920193 154022430,2 98,843364
90 89,69 2870479 1034748364 117,983044
90,97 2897903 2155086582 91,814724
101,26 3187301 8480246598 0,501264
100 100,01 3272334 1132140115 0,293764
100,64 3271005 139339315,9 0,007744
110,02 3630891 4390164368 89,643024
110 110,98 3561840 1159554948 108,743184
111,42 3525232 7222880953 118,113424
120,04 3962713 5156492371 379,782144
120 120,46 3960340 3109140336 396,328464
121,27 3896641 1177490595 429,235524
Pente droite standard: a1 = 32562,0354
SCE/n-2 3214571087
Erreur pente σa1 = 1024,713927

Tableau 13.2 : Résultats obtenus sur la gamme placebo chargé.

Gamme placebo chargé

% théorique Masse introduite Aire du pic (yi-y*) ² (xi-x') ²

79,81 2503041,000 1393432772 427,1111
80 80,94 2606467,000 879289401,6 381,6813
80,19 2583874,000 976476503,5 411,5488
90,61 2948892,000 3624452852 97,3511
90 89,69 2857363,000 2735598,951 116,3522
91,36 2850344,000 3910423705 83,1136
101,26 3203869,000 800927799,9 0,6136
100 101,04 3242346,000 298312184,7 0,3173
99,51 3159339,000 268635772,5 0,9344
110,41 3558475,000 973555735,7 98,6711
110 110,98 3502680,000 1846991640 110,3200
110,96 3521974,000 530731276,9 109,9003
119,92 3904232,000 4934324703 378,0432
120 120,91 3857303,000 74192039,96 417,5211
119,56 3803388,000 360567795,7 364,1736
Pente droite validation: a2 32251,74617
SCE/n-2 1605773060
Erreur pente σa2 = 731,8994305

38
 PARTIE PRATIQUE

Tableau 13.3 : Comparaison des pentes

Comparaison des deux t calculé 0,246
pentes a1 et a2 des deux t° (0,05, 26) 2,056
droites de régression Condition t calculé < t° (0,05, 26)

A partir de ce tableau on déduit que :

La pente a1 de la droite de régression D1 de la gamme standard = 32562,0354.
La pente a2 de la droite de régression D2 de la gamme placébo chargé = 32251,74617
tcalculé = 0,246
t° (0,05 ; 26) = 2.056 : lu sur la table de Student (annexe II)

2.2. Fonction de réponse

La relation existante entre la réponse (signal) et la concentration du diclofénac de sodium
introduite dans l’échantillon, obtenue avec les trois (03) séries des SE, est représentée pour
trois modèles mathématiques comme suit :

1er modèle : régression linéaire 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏

Tableau 14 : Résultats obtenus pour la fonction 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏.

Standard d'étalonnage sans la matrice

Série 1 Série 2 Série 3

concentration signal concentration signal concentration signal

µg/ml µg/ml µg/ml
80,40 2604377 80,18 2487215 80,44 2549489
80,09 2669243 80,75 2535637 80,50 2552563
89,69 2870479 90,88 2908746 90,23 2866991
90,97 2897903 90,23 2900678 90,90 2896226
100,01 3272334 100,50 3268568 100,43 3241557
100,64 3271005 100,07 3231994 100,88 3220818
110,98 3561840 110,43 3539867 110,07 3344305
111,42 3525232 110,11 3532189 110,50 3453029
120,04 3962713 120,25 3989742 119,82 3823730
120,46 3960340 120,10 3900299 120,49 3848235
Pente 32712,6276 Pente 35298,8463 Pente 31174,2041
Ord. l'origine -27091,097 Ord. l’origine -312745,728 Ord. l’origine 48993,6809

A partir des données de ce tableau, on trace les courbes d’étalonnage des trois séries de SE :

39
 PARTIE PRATIQUE

Figure 06 : Courbes d’étalonnages obtenues avec les trois séries des SE.

2ème modèle : logarithme népérien 𝐿𝑛 𝑌 = 𝑓(𝐿𝑛 𝑋)

Tableau 15 : Résultats obtenus pour la fonction 𝐿𝑛 𝑌 = 𝑓(𝐿𝑛 𝑋)

Standard d'étalonnage sans la matrice

Série 1 Série 2 Série 3

concentration signal concentration signal concentration signal
µg/ml µg/ml µg/ml
4,387 14,773 4,384 14,727 4,388 14,751
4,383 14,797 4,391 14,746 4,388 14,753
4,496 14,870 4,510 14,883 4,502 14,869
4,511 14,879 4,502 14,880 4,510 14,879
4,605 15,001 4,610 15,000 4,609 14,992
4,612 15,001 4,606 14,989 4,614 14,985
4,709 15,086 4,704 15,080 4,701 15,023
4,713 15,075 4,701 15,077 4,705 15,055
4,788 15,192 4,790 15,199 4,786 15,157
4,791 15,192 4,788 15,177 4,792 15,163
Pente 0,997041709 Pente 1,102291331 Pente 0,98223638
Ord. l'origine 10,40070381 Ord. l’origine 9,906619337 Ord. l’origine 10,44478733

A partir des données de ce tableau, on trace les courbes d’étalonnage des trois séries :

40
 PARTIE PRATIQUE

Figure 07 : Courbes d’étalonnages 𝐿𝑛𝑌 = 𝑓(𝐿𝑛𝑋) obtenues sur les trois séries des SE.

3ème modèle : racine carrée √𝑌 = 𝑓 (√𝑋)

Tableau 16 : Résultats obtenus pour la fonction √𝑌 = 𝑓(√𝑋).

Standard d'étalonnage sans la matrice

Série 1 Série 2 Série 3

concentration signal concentration signal concentration signal

µg/ml µg/ml µg/ml
8,967 1613,808 8,954 1577,091 8,969 1596,712
8,949 1633,782 8,986 1592,368 8,972 1597,674
9,470 1694,249 9,533 1705,505 9,499 1693,219
9,538 1702,323 9,499 1703,138 9,534 1701,830
10,000 1808,959 10,025 1807,918 10,021 1800,432
10,032 1808,592 10,003 1797,775 10,044 1794,664
10,535 1887,284 10,509 1881,453 10,491 1828,744
10,556 1877,560 10,493 1879,412 10,512 1858,233
10,956 1990,656 10,966 1997,434 10,946 1955,436
10,975 1990,060 10,959 1974,917 10,977 1961,692
Pente 180,5932314 Pente 197,1396671 Pente 174,9556091
Ord. l'origine -4,81903796 Ord. l’origine -178,2705525 Ord. l’origine 29,90519941

41
 PARTIE PRATIQUE

A partir des données de ce tableau, on trace les courbes d’étalonnage correspondantes :

Figure 08 : Courbes d’étalonnages √𝑌 = 𝑓(√𝑋) obtenues avec les trois séries des SE.

2.3. Critères de choix de la fonction de réponse

Le tableau 17 reprend les modèles de régression sélectionnés. Ces modèles ont été triés en
fonction de leur indice d’exactitude :

42
 PARTIE PRATIQUE

Tableau 17 : Modèles d’étalonnages triés par indice d’exactitude.

Modèle Indice Limite inférieure Indice Indice de Indice

d’exactitu- et supérieure de d’intervalle fidélité de
de quantification de dosage justesse
(unit)

Régression linéaire 0.7597 [89.96, 120.2] 0.7592 0.7007 0.8244

Régression linéaire 0.7581 [90.04, 120.2] 0.7573 0.6982 0.8241

après
transformation
racine carrée

Régression linéaire 0.7574 [90.08, 120.2] 0.7564 0.6982 0.8226

pondérée (1/X)

Régression linéaire 0.7564 [90.11, 120.2] 0.7555 0.6947 0.8245

après
transformation
logarithmique

Régression linéaire 0.7551 [90.15, 120.2] 0.7545 0.6942 0.8218

pondérée (1/X2)

Régression 0.7393 [89.98, 120.2] 0.7587 0.6585 0.8087

quadratique
pondérée (1/X)

Régression 0.7391 [90.07, 120.2] 0.7566 0.6572 0.8121

quadratique
pondérée (1/X2)

Régression 0.7383 [89.94, 120.2] 0.7599 0.6594 0.8033

quadratique

Régression linéaire 0.4322 [112.9, 120.2] 0.1823 0.9391 0.4714

passant par zéro
ajustée en utilisant
uniquement le
niveau 5

Régression linéaire 0 ND 0 0 0
passant par zéro
ajustée en utilisant
uniquement le
niveau 1.0

Voir dans l’annexe IV le calcul des indices pour le tri des modèles d’étalonnages.

43
 PARTIE PRATIQUE

La suite de notre travail est basée sur le modèle mathématique choisi pour la fonction de
réponse. Nous présenterons brièvement la fonction de réponse adéquate et nous détaillerons
dans la partie discussion les autres modèles.

2.4. Alignement des observations

Comme pour chaque niveau de concentrations, les quantités introduites ne sont pas
identiques : l’alignement des réponses sur la moyenne des concentrations introduites est
exigé.

L’alignement des réponses obtenues avec les échantillons de validation est résumé dans le
tableau 18 suivant :

Tableau 18 : Alignement des réponses observées avec les trois séries des SV.

Tableau 18.1 : Alignement des réponses observées avec la série 1.

Série 1

Concentration µg/ml Signal Alignement

79,81 2503041 2519506,356

80,94 2606467 2585967,087
80,19 2583874 2587908,557
90,61 2948892 2947038,284
89,69 2857363 2885604,902
91,36 2850344 2823955,814
101,26 3203869 3182387,708
101,04 3242346 3228061,486
99,51 3159339 3195104,806
110,41 3558475 3570687,714
110,98 3502680 3496246,517
110,96 3521974 3516194,769
119,92 3904232 3911101,652
120,91 3857303 3831787,15
119,56 3803388 3822034,198

44
 PARTIE PRATIQUE

Tableau 18.2 : Alignement des réponses observées de la série 2.

Série 2
Concentration µg/ml Signal Alignement
80,19 2477863 2484334,455
80,18 2571864 2578688,444
80,75 2493100 2479804,101
90,88 2889012 2875127,787
90,35 2848478 2853302,176
90,23 2790166 2799226,037
100,5 3142061 3144296,594
100,07 3174860 3192274,098
101,12 3192768 3173118,309
110,43 3452205 3443733,277
110,11 3445688 3448511,908
110,03 3525607 3531254,815
120,25 3787093 3783210,127
120,07 3858862 3861332,919
120,1 3783315 3784726,954

Tableau 18.3 : Alignement des réponses observées de la série 3.

Série 3

Concentration µg/ml Signal Alignement

80,44 2432195 2433441,968

80,5 2342211 2341587,516
80,5 2517710 2517086,516
90,23 2814684 2829128,048
90,9 2776338 2769895,331
90,95 2772103 2764101,621
100,43 3055173 3062239,153
100,66 3113836 3113732,086
100,88 3189936 3182973,761
110,07 3394716 3402717,379
110,41 3444940 3442342,15
110,5 3432195 3426791,471
119,82 3690071 3702332,854
120,33 3742966 3739329,01
120,49 3703876 3695251,137

45
 PARTIE PRATIQUE

2.5. Prédictions inverses

Les concentrations en retour avec la fonction de réponse choisie : 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 calculées sont
présentées dans le tableau 19 ci-dessous:

Tableau 19 : Prédictions inverses obtenues avec les SV.

Prédictions inverses Xijk,
Série 1 Série 2 Série 3 µj,
calc
calc=1/n
Concent Concent Concent
∑∑
ration Signal ration Signal ration Signal Série1 Série2 Série3
Xijk,cal
µg/ml µg/ml µg/ml
79,81 2503041 80,19 2477863 80,44 2432195 77,848 79,240 76,488
80,94 2606467 80,18 2571864 80,50 2342211 79,879 81,913 73,541 78,570
80,19 2583874 80,75 2493100 80,50 2517710 79,939 79,112 79,171
90,61 2948892 90,88 2889012 90,23 2814684 90,917 90,311 89,181
89,69 2857363 90,35 2848478 90,90 2776338 89,039 89,693 87,281 88,759
91,36 2850344 90,23 2790166 90,95 2772103 87,154 88,161 87,095
101,26 3203869 100,50 3142061 100,43 3055173 98,111 97,936 96,658
101,04 3242346 100,07 3174860 100,66 3113836 99,508 99,296 98,310 98,623
99,51 3159339 101,12 3192768 100,88 3189936 98,500 98,753 100,531
110,41 3558475 110,43 3452205 110,07 3394716 109,981 106,419 107,580
110,98 3502680 110,11 3445688 110,41 3444940 107,706 106,555 108,851 108,073
110,96 3521974 110,03 3525607 110,50 3432195 108,316 108,899 108,352
119,92 3904232 120,25 3787093 119,82 3690071 120,388 116,037 117,191
120,91 3857303 120,07 3858862 120,33 3742966 117,963 118,250 118,378 117,657
119,56 3803388 120,10 3783315 120,49 3703876 117,665 116,080 116,964

2.6. Justesse
Comme indiqué dans le tableau 20 ci-dessous, la justesse est exprimée en termes de biais
absolu, de biais relatif (%) ou de taux de recouvrement (%) pour chaque niveau de
concentration des standards de validation.

Tableau 20 : Justesse calculée pour chaque niveau de concentration des standards de

validation.
Niveau de Moyenne des Moyenne des Biais absolu Biais relatif Taux de
concentration concentrations concentrations (unit) (%) recouvrement
(ratio) introduites calculées (%)
(unit) (unit)
1.0 80.39 78.57 -1.819 -2.263 97.74
2.0 90.58 88.76 -1.819 -2.008 97.99
3.0 100.60 98.62 -1.985 -1.973 98.03
4.0 110.40 108.10 -2.360 -2.137 97.86
5.0 120.20 117.70 -2.504 -2.084 97.92

46
 PARTIE PRATIQUE

2.7. Fidélité
La fidélité de notre méthode est évaluée dans des conditions de répétabilité et de fidélité
intermédiaire (tableau 21). Elle est calculée pour chaque niveau de concentration, exprimée en
écart type et en terme de coefficient de variation est résumée dans le tableau 21 suivant :

Tableau 21 : Fidélité calculée pour chaque niveau de concentration des standards de

validation.
Niveau de Ecart type Ecart
Ecart type CV CV fidélité
concentrat MSM MSE1 MSE2 de type
intersérie répétabilité intermédiaire
ion (ratio) répétabilité de FI

1.0 11,157 3,949 5,751 1,987 1,550 2,520 2,472 3,135

2.0 1,943 2,032 2,010 1,418 0,000 1,418 1,565 1,565
3.0 0,035 1,588 1,200 1,095 0,000 1,095 1,089 1,089
4.0 1,501 1,247 1,310 1,117 0,291 1,154 1,011 1,045
5.0 2,708 1,469 1,779 1,212 0,642 1,372 1,009 1,142

2.8. Exactitude
Le tableau 22 ci-dessous représente l’exactitude relative calculée pour chaque concentration
des standards de validation :

Tableau 22 : Résultats de calcul de l’exactitude.

Exactitude relative ijk Moyenne de
Série 1 Série 2 Série 3 l'exactitude relative ij
-2,459 -1,185 -4,913 -2,852
-1,311 2,161 -8,644 -2,598
-0,314 -2,029 -1,651 -1,331
0,339 -0,626 -1,163 -0,483
-0,726 -0,728 -3,982 -1,812
-4,603 -2,293 -4,239 -3,712
-3,110 -2,551 -3,756 -3,139
-1,517 -0,774 -2,335 -1,542
-1,015 -2,341 -0,346 -1,234
-0,388 -3,632 -2,262 -2,094
-2,950 -3,229 -1,412 -2,530
-2,383 -1,028 -1,944 -1,785
0,390 -3,504 -2,194 -1,769
-2,437 -1,516 -1,622 -1,859
-1,585 -3,348 -2,926 -2,620

47
 PARTIE PRATIQUE

2.9. Erreur totale et profil d’erreur totale

L’erreur totale et l’erreur totale relative calculées pour chaque niveau de concentration est
présentée dans le tableau 23 suivant :

Tableau 23 : Calcul de l’erreur totale pour chaque niveau de concentration des standards de
validation.

Niveau de concentration Erreur maximale

Erreur totale absolue Erreur totale relative
(ratio) observée

1.0 4,339 5,398 14,760

2.0 3,237 3,573 3,390
3.0 3,081 3,062 6,920
4.0 3,514 3,182 3,870
5.0 3,876 3,226 2,620

Le profil de l’erreur totale relative est illustré dans la figure 09 suivante :

Figure 09 : Profil de l’erreur relative totale.

2.10. Intervalle de tolérance

Les limites de tolérance sont calculées pour chaque niveau de concentration ; les résultats
obtenus sont résumés dans le tableau 24 ci-dessous :

48
 PARTIE PRATIQUE

Tableau 24 : Calcul des limites de tolérance pour chaque niveau de concentration j.

Niveau de Limite de Limite de
concentration Rj Bj V Qt tolérance tolérance
(ratio) inférieure supérieure
1.0 0,608 0,755 4,999 1,778 -8,357 3,831
2.0 0,000 1,000 7,714 1,617 -4,676 0,660
3.0 0,000 1,000 7,714 1,617 -3,829 -0,117
4.0 0,068 0,942 7,378 1,617 -3,929 -0,345
5.0 0,281 0,834 6,245 1,650 -4,113 -0,055

2.11. Profil d’exactitude

Le profil d'exactitude comme l’indique la figure 10 ; est obtenu en reliant entre elles d'une
part les bornes inférieures et d'autre part les bornes supérieures de l'intervalle de tolérance
calculées pour chaque niveau de concentration.

Limites d’acceptations [-5% ; +5%]

Erreur relative totale
Limite supérieure de l’intervalle de tolérance
Limite inférieure de l’intervalle de tolérance
Figure 10 : Tracé du profil d’exactitude.

2.12. Linéarité
Un modèle de régression linéaire (Figure 11) a été ajusté sur les concentrations calculées en
fonction des concentrations introduites dans le but d'obtenir l'équation suivante:
𝑦 = 0.98082𝑥 − 0.17061

49
 PARTIE PRATIQUE

Figure 11 : Profil de linéarité entre les concentrations trouvées et les concentrations

introduites.

2.13. Limites de quantification et intervalle de dosage

Les limites de quantification sont obtenues en calculant la plus petite et la plus grande
concentration pour lesquelles les limites d'exactitude, c'est à dire les limites de l'intervalle de
tolérance attendu au niveau β sortent des limites d'acceptation.

L'intervalle de dosage est l'intervalle compris entre les limites inférieure et supérieure de
quantification où la procédure analytique atteint l'exactitude souhaitée.

Limite inférieure de quantification (LQInf) (Unit) = 89.96 % soit 89.96 µg/ml.

Limite supérieure de quantification (LQSup) (Unit) = 120.2 % soit 120.2 µg/ml.

2.14. Robustesse

Le plan factoriel réalisé est représenté dans le tableau 25 suivant :

50
 PARTIE PRATIQUE

Tableau 25 : Matrice des effets d’un plan factoriel 23

Facteurs Interactions
C (longueur
B
Essai d'onde
A (teneur) (Débit AB AC BC ABC
d'excitation
ml/min)
nm)
1 -1 -1 -1 1 1 1 -1
2 1 -1 -1 -1 -1 1 1
3 -1 1 -1 -1 -1 -1 1
4 1 1 -1 1 1 -1 -1
5 -1 -1 1 1 1 -1 1
6 1 -1 1 -1 -1 -1 -1
7 -1 1 1 -1 -1 1 -1
8 1 1 1 1 1 1 1
Niveau bas 95% 1,00 261
Niveau haut 105% 1,40 265

Le tableau 26 suivant résume l'analyse faite :

51
 Tableau 26 : Plan d’expérience à trois facteurs et calcul de l’écart type.

Masse
(concentration)
100 mg
pour une teneur
théorique de 100%
Facteur Facteur C Masse
Facteur Masse Teneur Aire Aire Masse Réponse
N° de A (longueur introduite
B (concentration) introduite (absorbance) (absorbance) (Concentration) (Teneur
l'essai (teneur d'onde (concentration)
(Débit) Standard (%) échantillon standard estimée en %)
en %) d'excitation) Echantillon
1 95% 1 261 95,02 107,26 95,02 2599081 3097033 90,01 90,01
2 105% 1 261 105,22 107,26 105,22 3010585 3097033 104,27 104,27
3 95% 1,4 261 95,02 107,26 95,02 1896495 2227793 91,31 91,31
4 105% 1,4 261 105,22 107,26 105,22 2185896 2227793 105,24 105,24
5 95% 1 265 95,02 107,26 95,02 3229198 3784628 91,52 91,52
6 105% 1 265 105,22 107,26 105,22 3718833 3784628 105,40 105,40
7 95% 1,4 265 95,02 107,26 95,02 2309360 2764169 89,61 89,61
8 105% 1,4 265 105,22 107,26 105,22 2722640 2764169 105,65 105,65
Ecartype 7,80
t°(0,05,7) 2,36

Nous calculerons par la suite l’effet et l’intervalle de confiance pour chaque paramètre, les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 27
suivant :

52
 PARTIE PRATIQUE

Tableau 27 : Calcul des limites de confiance pour les effets des paramètres.
Facteurs Interactions
Essai
A B C AB AC BC ABC
1 -84,14 -84,14 -84,14 84,14 84,14 84,14 -84,14
2 97,46 -97,46 -97,46 -97,46 -97,46 97,46 97,46
3 -85,35 85,35 -85,35 -85,35 -85,35 -85,35 85,35
4 98,37 98,37 -98,37 98,37 98,37 -98,37 -98,37
5 -85,55 -85,55 85,55 85,55 85,55 -85,55 85,55
6 98,52 -98,52 98,52 -98,52 -98,52 -98,52 -98,52
7 -83,76 83,76 83,76 -83,76 -83,76 83,76 -83,76
8 98,75 98,75 98,75 98,75 98,75 98,75 98,75
Somme 54,31 0,58 1,25 1,72 1,72 -3,67 2,32
Effet 6,79 0,07 0,16 0,22 0,22 -0,46 0,29
Intervalle Limite inférieure 0,69 -6,02 -5,94 -5,88 -5,88 -6,55 -5,80
de
confiance Limite supérieure 12,88 6,17 6,25 6,31 6,31 5,64 6,38
Facteur significatif (S) ou
S NS NS NS NS NS NS
Non significatif (NS)

1. Discussion
1.1. Spécificité
tcalculé = 0,246

t° (0,05, 26) lu sur la table de Student = 2,056

tcalculé < t° (0,05, 26) les deux pentes ne sont pas significativement différentes au risque
α = 0,05 considéré donc absence d’effet matrice : la méthode est spécifique.

1.2. Choix de la fonction de réponse

D’après les indices d’exactitude indiqués au tableau 17 précédent, le modèle d’étalonnage
sélectionné est: régression linéaire avec une équation 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 .

Les données et les courbes d’étalonnage obtenues pour ce modèle de régression ont été
respectivement présentées dans le tableau 14 et la figure 06.

1.3. Profil d’exactitude

- La limite inférieure de l’intervalle de tolérance intercepte la limite d’acceptabilité vers
le niveau de concentration 90%. Cela signifie que pour une concentration inférieure à
ce niveau, l’analyste ne peut plus garantir que la méthode est capable, en routine, de
produire en moyenne une probabilité β de résultats acceptables.

53
 PARTIE PRATIQUE

- La méthode est considérée comme valide pour l'intervalle de dosage où le profil

d'exactitude est compris dans les limites d'acceptation fixées à priori. Cette approche
garantit que seules maximum 15% des futures mesures d'échantillons inconnus
peuvent être en dehors de ces limites.
- Le domaine de validité de la méthode est donc compris entre les niveaux de
concentration 90% et 120%.
1.4. Limites de quantification et intervalle de dosage
La méthode est considérée comme valide dans l’intervalle [89,96 µg/ml; 120,2 µg/ml] pour
lequel le profil d’exactitude est inclus dans les limites d’acceptation choisies : [-5% ; +5%]
avec un risque d’avoir au maximum 15% des mesures en dehors des limites d’acceptation.

1.5. Linéarité
La linéarité de la droite 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑝𝑟é𝑑𝑖𝑡𝑒𝑠 = 𝑓(𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛𝑠 𝑖𝑛𝑡𝑟𝑜𝑑𝑢𝑖𝑡𝑒𝑠) est
confirmée par :

- Un coefficient de détermination acceptable R2 = 0.99998 ;

- Une pente significativement différente de zéro donc il existe une relation linéaire. De
plus elle est comparable à 1 au risque 5% (a = 0.9882) ;
- Une ordonnée à l’origine comparable à zéro au risque 5% (b = - 0.17061).

1.6. Robustesse
- Paramètre A : l’intervalle de confiance calculé ne contient pas la valeur zéro, cela
implique que l’effet du paramètre A est significatif. On conclut que la méthode est
sensible aux variations de la teneur en PA.
- Paramètre B et C : l’intervalle de confiance contient la valeur zéro, donc les effets des
paramètres B et C ne sont pas significatifs. On conclut que la procédure d’analyse est
insensible aux variations du débit et de la longueur d’onde.
- Interactions : tous les effets des interactions sont non significatifs, on peut dire que
l’effet de chaque paramètre ne dépend pas du niveau auquel on expérimente avec l’un
ou les autres paramètres.
- La méthode de dosage du diclofénac de sodium est jugée robuste pour les variations
étudiées des deux paramètres débit de la phase mobile et longueur d’onde de
détection.

54
 PARTIE PRATIQUE

Conclusion
La méthode de dosage du diclofénac de sodium dans les suppositoires à 100 mg par HPLC
développée dans le présent travail s’est révélée concluante et valide dans l’intervalle de
dosage [89,96 µg/ml ; 120,2 µg/ml] au risque 5%.

55
 CONCLUSION GENERALE

Le contrôle analytique avant libération d’un médicament sur le marché est une étape
importante et nécessaire pour garantir la qualité du produit qui va être délivré aux patients.

Les laboratoires pharmaceutiques sont tenus de prouver que les méthodes utilisées lors de ce
contrôle sont parfaitement valides et fiables, en procédant à leur validation. Celle-ci est non
seulement une exigence réglementaire, mais également un critère essentiel de l’assurance de
la qualité.

En effet, bien qu’il existe de nombreux documents officiels décrivant les critères de validation
à tester, les sources proposant des solutions pratiques en termes de protocoles expérimentaux
sont rares.

Le présent travail propose une méthode de dosage du diclofénac de sodium dans les
suppositoires à 100 mg par chromatographie liquide à haute performance en utilisant le profil
d’exactitude et l’intervalle de tolérance comme outil de décision de validation ; méthode
développée par la commission SFSTP publiée en 2006 dans le guide STP Pharma Pratique.

Les résultats obtenus ont répondu à toutes les exigences et performances spécifiques élaborées
dans cette approche harmonisée ; ce qui atteste la validité de la méthode utilisée et son
aptitude à être utilisée et appliquée en routine par les laboratoires de contrôle qualité pour le
dosage du diclofénac de sodium dans les suppositoires à 100 mg.

56
 REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1. Talbert, Willoquet, Gervais. Guide Pharmaco Clinique. France. 2013. Anti-

inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ; p. 165-6
2. Dictionnaire Vidal. 8ème édition. Paris. 2004. Diclofénac ; p.1928-9.
3. Dictionnaire Vidal. 84ème édition. France. 2008. Voltarène ; p.2518-20.
4. Pharmacopée Européenne. 6ème édition. Tome 2. Diclofénac sodique ; p. 1820.
5. Résumé des caractéristiques du produit. Base de données publique des
médicaments. [Consulté le dec 2015]. Disponible sur : http://base-donnees-
publique.medicaments.gouv.fr
6. Bekkai S, Abadi I, Allel K. [les anti-inflammatoires non steroïdiens AINS].
Annaba : Université Badj Mokhtar de Annaba ; 2009.
7. Anonyme. Les anti-inflammatoires non steroïdiens. Modalité de prescriptions [en
ligne]. 24 juin 2012. Disponible sur : http://www.rhumato.info.
8. Haute autorité de santé. Commission de la transparence. [Consulté le 01 mars
2006]. Disponible sur : http://www.has-
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10. Jannin V, Rodier JD. Mise en forme des médicaments. Formulation et fabrication
des suppositoires. 2ème édition. Page 77-9. Disponible sur le site : www.techniques-
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11. A. Le Hir. Abrégé de Pharmacie Galénique. Bonnes Pratiques de Fabrication des
Médicaments. 8ème édition. Paris ; 1973-2001.
12. Montagnac E. Galénique-Formes pharmaceutiques-tableaux.
Avantages/inconvénients des suppositoires [en ligne]. 2010-2011. Disponible sur :
www.ifpvps.fr
13. VIAL J. Journée de Formation Scientifique en Spectrométrie Atomique. Définition
de la validation de méthodes et outils associés. Paris. 14 Nov 2006. p. 6.
14. Hubert Ph, Nguyen JJ, Boulanger B, Chapuzet E, Chiap P, Cohen N, et al.
SFSTP .Validation des procédures analytiques quantitatives, harmonisation des
démarches. PARTIE I ; Généralité ; 2003.
15. Hubert Ph, Nguyen JJ, Boulanger B, Chapuzet E, Chiap P, Cohen N, et al. SFSTP.
Validation des procédures analytiques quantitatives, harmonisation des démarches.
PARTIE II ; Statistiques ; 2006.
16. SFSTP. Validation des procédures analytiques quantitatives. Juin 1992.
17. Bentchakal A, Matari A. [validation analytique d’une méthode de dosage du
paracétamol dans les suppositoires par HPLC]. Tizi Ouzou : Université Mouloud
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18. Anonyme. La chromatographie en phase liquide LC/HPLC. LCAP. Laboratoire de
chimie analytique pharmaceutique-Genève.
19. DENAT F. Professeur. Chromatographie. ICMUB UMR 5260. 9, Av. Alain
Savary. BP 47870 21078 Dijon. [email protected].
20. Anonyme. HPLC principe et appareillage. Biochimie et biomoléculaire. 20 jan
2010.
ANNEXES
 ANNEXE I

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE

PERFORMANCE
HPLC
 ANNEXE I : HPLC

Introduction
La chromatographie est une méthode physique de séparation d’un ou de plusieurs composés
d’un mélange en vue de leur identification et de leur quantification. Il existe trois types de
chromatographie : chromatographie en phase gazeuse, chromatographie sur couche mince et
chromatographie en phase liquide.
La chromatographie en phase liquide a permis de réaliser des analyses qui n'étaient
auparavant pas possibles avec les techniques sur couche mince ou en phase gazeuse. Parmi
les techniques chromatographiques liquides les plus utilisées actuellement : la
Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) qualifiée d’un outil analytique
indispensable utilisée dans des domaines variés.
1. Principe
La chromatographie liquide haute performance est une méthode d’analyse physicochimique
qui sépare les constituants d’un mélange par entrainement au moyen d’une phase mobile
liquide le long d’une phase stationnaire, grâce à la répartition sélective des solutés entre ces
deux phases.
Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et
une force de mobilité (due à la phase mobile).
La phase stationnaire est un support plus ou moins poreux recouvert d’un gel (liquide greffé)
qui a les propriétés désirées pour retenir les molécules de solutés, ces dernières parcourent
cette phase avec des temps proportionnels à leur propriétés intrinsèques (taille, structure) ou à
leur affinité (polarité).
La phase mobile ou éluant est un liquide qui entraine les solutés à travers la colonne [17].
2. Appareillage
Une installation HPLC comporte divers modules : un réservoir à solvant contenant la phase
mobile, un système de pompage permettant d’effectuer des élutions graduées, un injecteur,
une colonne, un détecteur et un système d’acquisition des données.
Ces modules sont reliés entre eux par l’intermédiaire de canalisations de très faible diamètre
interne (0.1mm) pour permettre l’écoulement de la phase mobile. Elles peuvent être en acier
inoxydable ou en PEEK (polyether-etherketone) [17].

I
 ANNEXE I : HPLC

Figure 11 : Composition d’une chaine d’HPLC [18].

2.1. Réservoir de la phase mobile (éluant)

C’est un flacon en verre ou acier inoxydable d’un volume de 0.5 à 2L dans lequel plonge un
tube avec une extrémité filtrante (éliminer les poussières), il est parfois muni d’un système de
dégazage (barbotage de gaz inerte) [19].

2.2. Système de pompage

C’est la pièce maîtresse de l’HPLC ; elle permet de produire le débit de phase mobile en mode
isocratique ou gradient d’élution. Son rôle est de provoquer dans la colonne un écoulement
continu de la phase mobile compatible avec la séparation chromatographique [17]. Elle est
définie par la pression qu'elle permet d'atteindre dans la colonne, son débit, et la stabilité du
flux. Actuellement les paramètres d'une pompe sont :
- Débit : 0,01 à 10 ml/min ;
- Stabilité < 1% (<0,2% pour des chromatographies d'exclusion diffusion) ;
- Pression maximale > 350 bars.
Certaines sont pilotées par informatique (bien utile lors de l'utilisation de gradient d'élution)
[20].
2.3. Injecteurs
Le type d'injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à boucle d'échantillonnage
d'une capacité fixe (10, 20, 50 μl). Cette boucle permet d'introduire l'échantillon sans modifier
la pression dans la colonne.
Elle possède 2 positions : la première permet le remplissage (chargement) de la boucle
d'injection de volume fixe, la seconde permet la mise en circulation (injection) de l'échantillon
dans le système chromatographique.

Le remplissage de la boucle d'injection se fait à l'aide d'une seringue [19].

II
 ANNEXE I : HPLC

2.4. Colonnes
Ceux sont des tubes droits souvent en acier inoxydable ou en verre, de 5 à 25 cm de long et de
diamètres différent selon les modèles [17].
La colonne est la partie où se passe la séparation, c’est le cœur du système
chromatographique. Elle est souvent précédée d’une pré-colonne (colonne de garde) courte (1
à 2 cm) remplie de la même phase stationnaire qui fixe les composés dont l’affinité avec la
phase stationnaire est très élevée et qui ne migre pas dans les conditions utilisées [17].

Figure 12 : Colonnes d’appareil d’HPLC

2.5. Détecteurs
Le détecteur permet de visualiser, de suivre en continu la séparation et mesurer la
concentration des solutés [17]. Pour détecter, on utilise différents phénomènes physico-
chimiques. Le signal obtenu est enregistré en fonction du temps.
Généralement, on compare le signal obtenu pour la phase mobile et le soluté à celui de la
phase mobile seule [20].
Il existe différents types de détecteurs utilisés en HPLC :

2.5.1. Détecteur par spectrophotométrie UV visible

C’est le détecteur le plus utilisé en HPLC. Il mesure l’absorption de la lumière par le soluté à
la sortie de la colonne. La réponse est directement proportionnelle à la concentration du soluté
élué selon la loi de Beer-Lambert [18].
𝐴 = 𝜀. 𝑙. 𝐶

La phase mobile ne doit pas absorber à la longueur d’onde choisie par l’opérateur.
2.5.2. Détecteur par fluorimétrie
Ce mode de détection est plus sélectif et plus sensible que l’absorbance UV visible. Il permet
de mesurer l’énergie de fluorescence d’un soluté excité par une radiation ultraviolette.
L’intensité de cette fluorescence mesurée est directement proportionnelle à la concentration
de l’analyte en solution.
Peu de composés sont fluorescents par eux-mêmes, il est donc souvent nécessaire de les
dériver [18].
2.5.3. Détecteur par réfractométrie
Il permet de mesurer de manière continue la différence d’indice de réfraction entre la phase
mobile contenant le soluté et la phase mobile pure correspondant à la référence.

III
 ANNEXE I : HPLC

Ce détecteur permet une mesure universelle mais peu sensible. De plus, il est peu pratique car
il est très sensible aux fluctuations extérieures (température) et intérieures (densité de la phase
mobile) [18].

2.5.4. Détecteur par électrochimie

Ce détecteur permet la détection des substances oxydables ou réductibles (ions métalliques,
anions inorganiques, composés nitrés, acides aminés et alcaloïdes) par la mesure du
changement de courant entre deux électrodes. Ils ont une excellente sensibilité, permettant la
mesure de traces et une gamme étendue de linéarité. En revanche, ils sont sensibles à
différents paramètres, comme le débit de l’éluant chromatographique ou le PH et à certaines
substances, comme l’oxygène dissous, pouvant perturber la mesure selon le potentiel appliqué
[17].
2.6. Intégrateur-enregistreur
Il s’agit d’un petit ordinateur qui récupère les données issues du détecteur, trace les
chromatogrammes et intègre la surface des pics.
Une intégration consiste à mesurer la surface sous un pic mais avant tout chercher à séparer
correctement les pics avant de les intégrer. La détection d’un pic chromatographique par
l’intégrateur dépend de deux paramètres :
- La largeur attendue du pic ;
- Le seuil d’intégration (sensibilité)
La largeur de pic est à peu près prévisible en fonction de la technique d’analyse et des
conditions opératoires. Elle détermine la fréquence d’échantillonnage du signal. Le pic est
alors découpé en tranches. Le seuil d’intégration est la valeur du signal à partir de laquelle le
calculateur repère un début de pic [20].
3. Application de la chromatographie liquide haute performance à l’analyse
Les applications sont innombrables. La méthode permet de séparer des composés de masses
molaires variables (de 100 à 200), de nature chimique différentes et même des isomères.
L’HPLC est un très bon complément de la chromatographie en phase gazeuse pour :
- Les substances peu volatiles : molécules de masse molaire > 300 ;
- Substances thermolabiles : comme le médicament issu de la biotechnologie ou les
composés d’origine biologique ;
- Les substances ionisées.

L’HPLC couvre tous les domaines d’application. Citons dans les domaines de
l’agroalimentaire et de la pharmacie.
3.1. Analyse des chromatogrammes
Un chromatogramme est un diagramme montrant l’évolution du signal du détecteur
(proportionnel à la concentration en soluté) en fonction du temps d’élution (plus rarement du
volume d’élution).

IV
 ANNEXE I : HPLC

Figure 13 : Chromatogramme [20]

- 𝑡0 : est le temps du début de l’injection ;

- 𝑡𝑚 : temps mort ; temps mis par un composé non retenu par la phase stationnaire pour
traverser la colonne (temps passé dans la phase mobile) ;
- 𝑡𝑟 : temps de rétention ; temps mis par un soluté pour traverser la colonne. C’est le
temps passé dans la phase stationnaire et dans le volume mort de la colonne. Ce temps
est caractéristique d’un soluté dans des conditions d’analyse données. La surface du
pic est en fonction de la quantité du constituant dont il est la trace ;
- 𝑡𝑟′ : temps de rétention réduit ; temps passé par un soluté dans la phase stationnaire,
soit :
𝑡𝑟′ = 𝑡𝑟 − 𝑡𝑚
- 𝜔1/2 : la largeur du pic ; mesurée à mi-hauteur : exprimée en unité de temps ;
- La largeur du pic à la base exprimée en unité de temps : déterminée par l’intersection
des tangentes au point d’inflexion à la courbe gaussienne et de la ligne de base ;
- ℎ : la hauteur du pic ;
- Ecart type relatif des aires du pic :

1
𝜎= ∑(𝑦𝑖 − 𝑌 ′ ) 2
16

Avec : yi est l’air du pic pour l’injection i donné par l’intégration du pic.
Y’= 1/16 (y1 + y2 + …+ y6) la moyenne des aires du pic.
On peut calculer l’écart type relatif en pourcentage :
% RSD = 100σ/Y’

3.2. Analyse qualitative

- Coefficient de partage K : (dans le cas de chromatographie de partage)
A un instant donné, le soluté est à la concentration Cm dans la phase mobile et Cs dans la
phase stationnaire. Leur rapport à l’équilibre est appelé coefficient de partage K :

Cs
K=
Cm

V
 ANNEXE I : HPLC

Ce coefficient est en fonction de trois types d’affinité :

- Celle entre le soluté et la phase mobile ;
- Celle entre le soluté et la phase stationnaire ;
- Celle entre les phases mobile et stationnaire.

- Le facteur de capacité 𝐊 ′ (ou facteur de rétention)

C’est le rapport entre la quantité du soluté dans la phase stationnaire et la quantité de soluté
dans la phase mobile.

𝐶𝑠 × 𝑉𝑠 Vs
K′ = =K×
𝐶𝑚 × 𝑉𝑚 Vm
Vs : volume de la phase stationnaire
Vm : volume de la phase mobile ou volume mort
K ′ : est aussi déterminé expérimentalement par le rapport de temps de rétention réduit sur le
temps mort :
tr − tm
K′ =
tm

3.2.1. Notion d’efficacité ou performances d’une colonne

La largeur d’un pic est caractéristique de l’efficacité de la séparation : plus le pic est fin plus
la chromatographie est efficace. L’efficacité est exprimée par :
- Le nombre de plateaux théoriques N : contenus dans la colonne (nombre des
opérations que subit le soluté pour traverser la colonne chromatographique). Plus N est
grand plus la colonne est efficace, elle est traduite par la finesse des pics obtenus. Sa
détermination est réalisée pour chaque composé par la relation suivante :

tr 2
tr 2
Nth = 5.54 ( ) = 16 ( )
ω1/2 ω

ω1/2 : Largeur du pic à mi-hauteur

ω : Largeur de pic à la base
- La hauteur équivalente à un plateau théorique : HEPT, qui est définit comme :
L
HEPT =
N
L : longueur de la colonne
N : nombre de plateau théorique

3.2.2. Qualité de la séparation

Une bonne séparation se traduira par une séparation distincte des pics correspondant à chacun
des produits.

VI
 ANNEXE I : HPLC

- La sélectivité (a) : entre deux pics A et B

Elle mesure la capacité de la colonne à séparer les maximums des pics. Plus elle est
supérieure à 1, plus les temps de rétention sont éloignés.
Elle est définit comme le rapport des temps de rétention réduits.
𝑡𝑟′ 𝐵
𝑎= ′
𝑡𝑟 𝐴
a est toujours supérieur à 1 car on choisit 𝑡𝑟′ 𝐵 > 𝑡𝑟′ 𝐴

- La résolution (R)
Elle quantifie la qualité de la séparation en caractérisant le fait qu’il y ait ou non
chevauchement de deux pics contigus.

𝑡𝑟′ 𝐵 − 𝑡𝑟′ 𝐴
𝑅=
𝜔𝐵 + 𝜔𝐴
R<1 : mauvaise résolution ;
1<R<1.4 : résolution acceptable ;
1.4<R<1.6 : résolution optimale ;
R>1.6 : résolution trop bonne car le temps d’analyse est rallongé.
3.3. Analyse quantitative
Cette analyse est basée sur le fait que l’air des pics chromatographiques est proportionnel à la
concentration ou à la quantité de produit analysé.
Dans la pratique on injecte les composés en solution et on préfère utiliser les concentrations
plutôt que les masses. Il y a proportionnalité entre la masse injectée et la concentration du
soluté, à condition de toujours injecter le même volume de solution.
On écrira donc : A=Kc C
A= air du pic
Kc= coefficient de réponse du détecteur
C= concentration du composé injecté [17].
Conclusion
Le succès de l’HPLC est dû à la meilleure exploitation des mécanismes d’interactions, aux
grandes efficacités et au grand choix des phases stationnaires de plus en plus fines (3µm) ainsi
au progrès important effectués dans le domaine de l’appareillage.

VII
 ANNEXE II

TABLE DE STUDENT
ANNEXE II

VIII
 ANNEXE III

DONNEES BRUTES DE LA VALIDATION

ANALYTIQUE
 SE et SV: Série N° 01
Acquired by : Admin
Sample Name : diclo
Sample ID : STD
Tray# : 1l
Vail# : 14
Injection Volume : 20 uL
Data Filename : SE Série 1 120 rep 2.lcd
Method Filename : METHODE12.lcm
Batch Filename : DICL SODIQUE serie 1.lcb
Report Filename : Default.lcr
Date Acquired : 01/05/2016 19:23:16
Data Processed : 01/05/2016 19:30:48
Summary(Concentration)
SE Série 1 80 rep 1.lcd

diclofenac / 5.380
uV Det.A Ch1

150000

100000

50000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SE Série 1 80 rep 2.lcd

diclofenac / 5.651
uV200000 Det.A Ch1

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min
SE série 1 90 rep 1.lcd
diclofenac / 6.312

uV Det.A Ch1

200000

100000
/ 4.871

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

IX
 SE série 1 90 rep 2.lcd

diclofenac / 6.278
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SE Série 1 100 rep 1.lcd

diclofenac / 5.385
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SE Série 1 100 rep 2.lcd

diclofenac / 5.392
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SE série 1 110 rep 1.lcd

diclofenac / 6.012

uV300000 Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

X
 SE série 1 110 rep 2.lcd

diclofenac / 5.990
uV300000 Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SE série 1 120 rep 1.lcd

diclofenac / 5.397
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SE série 1 120 rep 2.lcd

diclofenac / 5.437
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV série 1 80 rep 1.lcd

diclofenac / 6.441

uV Det.A Ch1
200000

100000
/ 4.963

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

XI
 SV série 1 80 rep 2.lcd

diclofenac / 6.398
uV Det.A Ch1
200000

100000

/ 4.933
0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV série 1 80 rep 3.lcd

diclofenac / 5.785
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV Série 1 90 rep 1.lcd

diclofenac / 5.431
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV série 1 90 rep 2.lcd

diclofenac / 6.213

uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

XII
 SV série 1 90 rep 3.lcd

diclofenac / 5.772
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV série 1 100 rep 1.lcd

diclofenac / 6.092
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV série 1 100 rep 2.lcd

diclofenac / 6.068
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV série 1 100 rep 3.lcd

diclofenac / 5.757

uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

XIII
 SV série 1 110 rep 1.lcd

diclofenac / 5.959
uV300000 Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV série 1 110 rep 2.lcd

diclofenac / 5.941
uV300000 Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV série 1 110 rep 3.lcd

diclofenac / 5.744
uV300000 Det.A Ch1

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV série 1 120 rep 1.lcd

diclofenac / 5.870

uV Det.A Ch1
300000

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

XIV
 SV série 1 120 rep 2.lcd

diclofenac / 5.856
uV Det.A Ch1
300000

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

SV série 1 120 rep 3.lcd

diclofenac / 5.732
uV Det.A Ch1
300000

200000

100000

0
0 1 2 3 4 5 6 7
min

<< Detector A >>

Title Sample Name Sample ID diclofenac
SE Série 1 80 rep 1.lcd diclo STD 2604377
SE Série 1 80 rep 2.lcd diclo STD 2669243
SE Série 1 90 rep 1.lcd diclo STD 2870479
SE Série 1 90 rep 2.lcd diclo STD 2897903
SE Série 1 100 rep 1.lcd diclo STD 3272334
SE Série 1 100 rep 2.lcd diclo STD 3271005
SE Série 1 110 rep 1.lc diclo STD 3561840
SE Série 1 110 rep 2.l diclo STD 3525232
SE Série 1 120 rep 1.lcd diclo STD 3962713
SE Série 1 120 rep 2.lcd diclo STD 3960340
SV Série 1 80 rep 1.lcd diclo STD 2503041
SV Série 1 80 rep 2.lcd diclo STD 2606467
SV Série 1 80 rep 3.lcd diclo STD 2583874
SV Série 1 90 rep 1.lcd diclo STD 2948892
SV Série 1 90 rep 2.lcd diclo STD 2857363
SV Série 1 90 rep 3.lcd diclo STD 2850344
SV Série 1 100 rep 1.lcd diclo STD 3203869
SV Série 1 100 rep 2.lcd diclo STD 3242346
SV Série 1 100 rep 3.lcd diclo STD 3159339
SV Série 1 110 rep 1.lcd diclo STD 3558475
SV Série 1 110 rep 2.lcd diclo STD 3502680
SV Série 1 110 rep 3.lcd diclo STD 3521974
SV Série 1 120 rep 1.lcd diclo STD 3904232
SV Série 1 120 rep 2.lcd diclo STD 3857303
SV Série 1 120 rep 3.lcd diclo STD 3803388
Average 3227962
%RSD 14.645
Maximum 3962713
Minimum 2503041
Standard Deviation 472726

XV
 SE et SV: Série N°02
Acquired by : Admin
Sample Name : diclo
Sample ID : SE 2
Tray# : 1l
Vail# : 31
Injection Volume : 20 uL
Data Filename : SE 2 80 rep 1.lcd
Method Filename : METHODE12.lcm
Batch Filename : DICL SODIQUE.lcb
Report Filename : Default.lcr
Date Acquired : 27/04/2016 16:47:46
Data Processed : 01/05/2016 12:41:21
Summary(Concentration)SE
Série 02 80 % rep 1.lcd

diclofenac / 6.680
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 02 80 % rep 2.lcd

uV200000

diclofenac / 5.525
Det.A Ch1

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 02 90 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.519

uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XVI
 SE Série 02 90 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.494
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 02 100 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.482
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 02 100 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.472
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 02 110 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.451

uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XVII
 SE Série 02 110 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.442
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 02 120 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.423
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 02 120 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.418
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 80 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.408

uV Det.A Ch1
150000

100000

50000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XVIII
 SV Série 02 80 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.401
uV Det.A Ch1

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 80 % rep 3.lcd

diclofenac / 5.399
uV Det.A Ch1

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 90 % rep 1.lcd

uV200000

diclofenac / 5.389
Det.A Ch1

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 90 % rep 2.lcd

uV200000
diclofenac / 5.386

Det.A Ch1

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XIX
 SV Série 02 90 % rep 3.lcd

diclofenac / 5.382
uV Det.A Ch1

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 100 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.376
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 100 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.374
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 100 % rep 3.lcd

diclofenac / 5.370

uV200000 Det.A Ch1

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XX
 SV Série 02 110% rep 1.lcd

diclofenac / 5.368
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 110% rep 2.lcd

diclofenac / 5.366
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 110% rep 3.lcd

diclofenac / 5.365
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 120 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.368

uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XXI
 SV Série 02 120 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.369
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 02 120 % rep 3.lcd

diclofenac / 5.376
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

<< Detector A >>

Title Sample Name Sample ID diclofenac
SE Série 02 80 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SE 2487215
SE Série 02 80 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SE 2535637
SE Série 02 90 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SE 2908746
SE Série 02 90 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SE 2900678
SE Série 02 100 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SE 3268568
SE Série 02 100 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SE 3231994
SE Série 02 110 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SE 3539867
SE Série 02 110 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SE 3532189
SE Série 02 120 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SE 3989742
SE Série 02 120 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SE 3900299
SV Série 02 80 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SV 2477863
SV Série 02 80 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SV 2571864
SV Série 02 80 % rep 3.lcd Diclofenac série 02
SV 2493100
SV Série 02 90 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SV 2889012
SV Série 02 90 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SV 2848478
SV Série 02 90 % rep 3.lcd Diclofenac série 02
SV 2790166
SV Série 02 100 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SV 3142061
SV Série 02 100 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SV 3174860
SV Série 02 100 % rep 3.lcd Diclofenac série 02
SV 3192768
SV Série 02 110% rep 1.lcd Diclofenac série 02
SV 3452205
SV Série 02 110% rep 2.lcd Diclofenac série 02
SV 3445688
SV Série 02 110% rep 3.lcd Diclofenac série 02
SV 3525607
SV Série 02 120 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SV 3787093
SV Série 02 120 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SV 3858862
SV Série 02 120 % rep 3.lcd Diclofenac série 02
SV 3783315
Average 3189115
%RSD 15.179
Maximum 3989742
Minimum 2477863
Standard Deviation 484065

XXII
 SE et SV: Série N°03
Acquired by : Admin
Sample Name : diclo
Sample ID : SE 2
Tray# : 1l
Vail# : 31
Injection Volume : 20 uL
Data Filename : SE 2 80 rep 1.lcd
Method Filename : METHODE12.lcm
Batch Filename : DICL SODIQUE.lcb
Report Filename : Default.lcr
Date Acquired : 27/04/2016 16:47:46
Data Processed : 01/05/2016 12:41:21
Summary(Concentration)
SE Série 03 80 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.472
uV Det.A Ch1

100000

50000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 03 80 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.427
uV200000 Det.A Ch1

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 03 90 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.412

uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XXIII
 SE Série 03 90 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.401
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 03 100 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.393
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 03 100 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.376
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 03 110 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.368

uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XXIV
 SE Série 03 110 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.419
uV Det.A Ch1

250000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 03 120 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.347
uV300000 Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SE Série 03 120 % rep 2.lcd

uV300000

diclofenac / 5.334
Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 80 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.327

uV Det.A Ch1
150000

100000

50000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XXV
 SV Série 03 80 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.327
uV Det.A Ch1
150000

100000

50000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 80 % rep 3.lcd

diclofenac / 5.323
uV Det.A Ch1

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 90 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.317
uV Det.A Ch1

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 90 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.320

uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XXVI
 SV Série 03 90 % rep 3.lcd

diclofenac / 5.317
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 100 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.317
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 100 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.312
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 100 % rep 3.lcd

diclofenac / 5.306

uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XXVII
 SV Série 03 110% rep 1.lcd

diclofenac / 5.303
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 110% rep 2.lcd

diclofenac / 5.302
uV Det.A Ch1
200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 110% rep 3.lcd

diclofenac / 5.305
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 120 % rep 1.lcd

diclofenac / 5.300

uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

XXVIII
 SV Série 03 120 % rep 2.lcd

diclofenac / 5.293
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

SV Série 03 120 % rep 3.lcd

diclofenac / 5.293
uV Det.A Ch1

200000

100000

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
min

<< Detector A >>

Title Sample Name Sample ID diclofenac
SE Série 03 80 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SE 2549489
SE Série 03 80 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SE 2552563
SE Série 03 90 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SE 2866991
SE Série 03 90 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SE 2896226
SE Série 03 100 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SE 3241557
SE Série 03 100 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SE 3220818
SE Série 03 110 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SE 3344305
SE Série 03 110 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SE 3453029
SE Série 03 120 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SE 3823730
SE Série 03 120 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SE 3848235
SV Série 03 80 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SV 2432195
SV Série 03 80 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SV 2342211
SV Série 03 80 % rep 3.lcd Diclofenac série 02
SV 2517710
SV Série 03 90 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SV 2814684
SV Série 03 90 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SV 2776338
SV Série 03 90 % rep 3.lcd Diclofenac série 02
SV 2772103
SV Série 03 100 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SV 3055173
SV Série 03 100 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SV 3113836
SV Série 03 100 % rep 3.lcd Diclofenac série 02
SV 3189936
SV Série 03 110% rep 1.lcd Diclofenac série 02
SV 3394716
SV Série 03 110% rep 2.lcd Diclofenac série 02
SV 3444940
SV Série 03 110% rep 3.lcd Diclofenac série 02
SV 3432195
SV Série 03 120 % rep 1.lcd Diclofenac série 02
SV 3690071
SV Série 03 120 % rep 2.lcd Diclofenac série 02
SV 3742966
SV Série 03 120 % rep 3.lcd Diclofenac série 02
SV 3703876
Average 3128796
%RSD 14.713
Maximum 3848235
Minimum 2342211
Standard Deviation 460349

XXIX
 ANNEXE IV

CALCULS DES INDICES POUR LE TRI DES

MODELES D'ETALONNAGE
 ANNEXE IV

1. Indice d’intervalle de dosage

L'intervalle de dosage (ID) est l'intervalle à l'intérieur duquel la méthode est valide. Il est
obtenu en calculant la différence entre la borne supérieure et inférieure des limites de
quantification. L'indice d'intervalle de dosage est un nombre sans dimension variant dans
l'intervalle [0,1]. L'indice prend la valeur 1 si la procédure d'analyse est apte à doser sur la
totalité de l'intervalle envisagé (concentration minimale et maximale introduites). Il est
calculé selon la formule :
𝐼𝐷
D(ID) =
𝐶𝑚𝑎𝑥 − 𝐶𝑚𝑖𝑛

Où Cmax et Cmin sont la plus grande et la plus petite concentration introduite.

Remarque: si un seul niveau de concentration est introduit, l'indice d’intervalle de dosage est
fixé à 0 ou 1.

2. Indice de fidélité
L'aire utilisée pour le calcul de l'indice de fidélité est l'aire, à l'intérieur des limites de
quantification, entre la limite inférieure et supérieure du profil d'exactitude. Cette aire est
calculée par la règle des trapèzes. L’indice de fidélité est sans dimension et varie dans
l'intervalle [0,1]. Plus cet indice est proche de 1, plus la méthode est fidèle. Il est calculé selon
la formule :
2 𝜆 (𝐶𝑚𝑎𝑥 − 𝐶𝑚𝑖𝑛 ) − 𝑎𝑖𝑟𝑒
𝑠𝑖 𝑎𝑖𝑟𝑒 < 2𝜆(𝐶𝑚𝑎𝑥 − 𝐶𝑚𝑖𝑛 )
D(aire) = { 2𝜆(𝐶𝑚𝑎𝑥 − 𝐶𝑚𝑖𝑛 )
0 𝑠𝑖𝑛𝑜𝑛
Où λ est la limite d'acceptation et Cmax and Cmin sont les concentrations maximale et
minimale.

3. Indice de justesse
La somme du carré des biais (SCB) est calculée en sommant le carré des biais estimés à
chaque niveau de concentration. L'indice de justesse est un nombre sans dimension variant
dans l'intervalle [0,1] où 1 est l'optimum et signifie qu'il n'y a pas de biais pour tous les
niveaux de concentrations observés. L'indice est calculé de la façon suivante :
SCB
D(SCB) = {1 − si SCB ≤ mλ2
mλ2
0 sinon
Où λ est la limite d'acceptation de la méthode, et m est le nombre de niveau de concentration.
4. Indice d'exactitude
Ces 3 indices sont compilés dans l'indice d'exactitude qui correspond à la moyenne
géométrique D* des indices respectifs. L'indice d'exactitude varie de 0 à 1. Plus l'indice est
proche de 1 meilleure est la méthode. Ce chiffre sans dimension est seulement utilisé pour
comparer les différents modèles d'étalonnage et non pour comparer les procédures
analytiques.
L'indice est calculé de la façon suivante:
3
D∗ = √D(aire) × D(ID) × D(SCB)

XXX
 RESUME

Le contrôle qualité des produits pharmaceutiques constitue une exigence réglementaire

à laquelle doivent répondre tout les laboratoires pharmaceutiques. Pour ce faire, ces derniers
utilisent des méthodes analytiques qui doivent être valides.

Le but de cette thèse est de mettre au point et de valider une méthode de dosage du
diclofénac de sodium dans les suppositoires à 100 mg par chromatographie liquide à haute
performance en utilisant le profil d’exactitude et l’intervalle de tolérance comme outils de
décision de validation ; démarche harmonisée proposée par une commission SFSTP publiée
en 2006 dans le guide STP Pharma Pratique.

La technique développée s’est avérée spécifique, linéaire, sensible, robuste et exact

dans l’intervalle [89,96 µg/ml ; 120,2 µg/ml] avec un risque d’avoir au maximum 15% des
mesures en dehors des limites d’acceptations fixées à [-5% ; +5%]. Cela atteste la validité de
la méthode utilisée et son aptitude à être appliquée en routine par les laboratoires de contrôle
qualité pour le dosage du diclofénac de sodium dans les suppositoires à 100 mg.

Mots clés : diclofénac de sodium, suppositoire, validation analytique, profil

d’exactitude, HPLC.

ABSTRACT

Quality control of pharmaceutical products is an important and necessary step.

Pharmaceutical laboratories are required to prove that analytical procedures used for this
control are valid.

The purpose of this thesis is to develop and validate an essay method for determining
sodium diclofenac in suppositories of 100 mg by high performance liquid chromatography
using the accuracy profile and tolerance interval as decision tools for validation; harmonized
approach proposed by a SFSTP commission published in 2006 in STP Pharma Pratiques
guides.

The technique developed was specific, linear, sensitive, robust and accurate in the
range [89,96 µg/ml ; 120,2 µg/ml] with risk of having a maximum 15% of the measures
outside the acceptance limits [-5% ; +5%]. Which demonstrates the validity of the method
used and its ability to be used and applied routinely by quality control laboratories for the
determination of sodium diclofenac in suppositories 100 mg.

Key words: sodium diclofenac, suppositories, analytical validation, accuracy profile, HPLC.