SEPARATION DES ACIDES NUCLEIQUES
PAR ELECTROPHORESE
1. Introduction :
L’électrophorèse en grec pour « électro» : électricité et « phoros » : porter d’un côté à l’autre
est une méthode utilisée en biologie moléculaire pour séparer les acides nucléiques en
fonction de leur poids moléculaire. La technique est basée sur la séparation des acides
nucléiques chargés négativement sous l’effet d’un champ électrique. Cette séparation
s’effectue à travers une matrice du gel, les molécules de petites tailles se déplacent plus
rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures
2. Principe général :
L’électrophorèse est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement à un
pH 7~8 sous l’effet d’un champ électrique vers l’anode (+). Cette séparation s’effectue à
travers la matrice du gel en fonction de la taille des molécules.
Deux sortes de matrice de gel et donc deux support sont utilisées: l’agarose et le
polyacrylamide. Le gel agit comme un tamis moléculaire au travers duquel les molécules
d’ADN en mouvement doivent passer ; les molécules de grande taille ont plus de difficulté
pour passer à travers les mailles crées par le réseau des microfibres du gel et vont donc
migrer plus lentement que les petites molécules.
Figure : Cuves d’électrophorèses. A. Cuve horizontale utilisée pour le gel d’agarose.
B. Cuve verticale utilisée pour le gel de polyacrylamide.
3. Applications de l’électrophorèse :
- Contrôle de qualité des l’ADN après extraction
- Séparation de fragments ADN digérés.
- Estimation du poids moléculaire de fragment d'ADN après une digestion par des enzymes
de restriction.
- Analyse d’ADN après une amplification par PCR.
4. Facteurs affectant la migration :
Les facteurs affectant la migration sont :
- Poids moléculaire de l’ADN : la séparation se fait en fonction du poids moléculaire et
donc de la taille de l’ADN.
- Concentration du gel : L’augmentation de la concentration d’agarose dans un gel
réduit la vitesse de migration et permet la séparation de fragment d’ADN de plus
petite taille (voir tableau 1).
Tableau 1: Taille des fragments à séparer selon la concentration du gel.
% d’agarose Taille de fragments % d’acrylamide Taille de fragments
à séparer en kb à séparer en pb
0.5 1 à 30 4 200 à 800
0.7 0.8 à 12 5 80 à 200
1 0.5 à 10 8 40 à 100
1.2 0.4 à 7 11 10 à 50
1.5 0.2 à 3
- Voltage : plus le voltage est important, plus la vitesse de migration augmente.
Toutefois le voltage est limité en intensité (5Và 10V/cm): un fort voltage induit une
augmentation de température ce qui peut faire fondre le gel
- Conformation de l’ADN : l’ADN non digéré migre à différentes vitesses du plus lent
au plus rapide comme suit : ADN circulaire, ADN linéaire et ADN superenroulé.
5. Electrophorèse sur gel d’agarose :
Utilisée principalement pour la séparation des acides nucléiques dont les fragments varient
entre 0,2 et 50 kb. Elle conjugue entre la mobilité électrophorétique et l’effet de filtration du
gel ce qui facilite la séparation des molécules selon leur ratio charge/masse.
Les avantages de l'électrophorèse sur gel d’agarose sont les suivants:
- Préparation du gel d'agarose aisée, rapide, et peu coûteuse
- l’agarose est plus ferme et moins toxique que le polyacrylamide
- les échantillons peuvent être récupérés en vue d’analyses supplémentaires (Pas de
dénaturation des échantillons)
Cependant, l’acrylamide a un pouvoir séparateur plus important que l'agarose.
Révélation de l'ADN :
Afin de visualiser les fragments d’ADN après électrophorèse, quelques microlitres d’agent
intercalant tel que le bromure d’éthidium sont ajoutés à la solution du gel. Cette molécule
s'intercale entre les bases des acides nucléiques et a la propriété d'émettre une fluorescence
rouge orange lorsqu'elle est excitée par la lumière ultraviolette. Le gel est alors observé sous
une lampe à U.V (à 254 nm) et les molécules d’ADN complexées au bromure d’éthidium
deviennent visibles.
NB : Le bromure d'éthidium est un produit dangereux mutagène et cancérigène qui doit être
manipulé dans des conditions particulières (gants, blouse, déchets recyclés...).
Détermination de la taille des fragments :
Comme la distance de migration est proportionnelle au logarithme du nombre de bases, il est
possible de déterminer la taille des fragments de restriction obtenus en comparant leur
mobilité électrophorétique à celle de fragments d'ADN de taille déterminée (marqueurs de
taille).
La mobilité relative est donc le rapport entre la distance de migration d’une bande et la
distance de migration du front de migration. La droite log (nombre de kb) = f (mobilité
relative), permet de déterminer la taille d’une molécule d’ADN inconnue.
