La Polymérase Chain Réaction (PCR)
1. Introduction :
En 1983, Karry Mullis met au point une technique d’amplification de l’ADN appelée
Polymerase Chain Reaction ou Réaction de Polymérisation en Chaîne. Aujourd’hui, cette
technique est incontournable et couramment utilisée en routine dans les laboratoires de
biologie moléculaire. La PCR est une réaction enzymatique qui permet de sélectionner puis
d’amplifier en une très grande quantité un fragment d’ADN bien déterminé présent en très
faible quantité parmi des millions d’autres fragments.
2. Principe général :
La réaction PCR permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné
afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier. C’est une suite de cycles
qui se répètent en boucle comportant chacun trois paliers de température. Chacun de ces
paliers est caractérisé pas une réaction chimique distincte. En moyenne une PCR comporte
entre 20 à 40 cycles.
Les acteurs de la PCR sont:
1. L’ADN : Avant la réaction de PCR, l’ADN est extrait à partir de l’échantillon que l’on veut
analyser (salive, cheveux, cellules, fossile…). Puis, cet extrait purifié en ADN, contenant le
fragment d’ADN que l’on souhaite amplifier, peut être utilisé en PCR.
2. Les deux amorces Forward et Reverse : Ce sont des courts fragments d’ADN capables de
s’hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases sur l’un des deux brins
d’ADN à amplifier.
Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d’ADN à amplifier. La taille de ces
amorces est généralement d’une vingtaine de désoxyribonucléotides. De plus, les amorces
sont en très forte concentration par rapport à celle de l’ADN à amplifier.
Pour faciliter le choix des séquences des deux amorces, des logiciels d’analyse de séquences
permettent de vérifier les points suivants :
• Des Tm comparables : Les amorces doivent s’hybrider à l'ADN matrice dans les mêmes
conditions de température
• des séquences qui ne soient pas complémentaires entre elles (en particulier dans la région 3’)
des séquences qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées (pas de repliement
intramoléculaire).
3. Les Désoxyribo Nucléotides-Tri-Phosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) :
Les dNTPs (Désoxyribonucléotides-Tri-Phosphates) sont les molécules de base qui
constituent l’ADN. Ces dNTPs sont utilisés par la Taq polymérase pour la synthèse du
nouveau brin d’ADN complémentaire.
4. L’enzyme Taq polymérase : L’enzyme utilisée est une polymérase, c'est-à-dire qu’elle
peut synthétiser un nouveau brin d’ADN à partir du brin d’ADN matrice après d’être fixée à
une amorce. Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie
thermophile (résistante à des températures très élevées), comme par exemple Thermus
aquaticus (Taq polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce
qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées
pour les rendre plus efficaces et plus fidèles.
5. Le milieu réactionnel : Le milieu réactionnel de la PCR comporte l’ADN à amplifier, les
dNTPs, les deux amorces, la Taq polymérase, un tampon et des ions magnésium (MgCl2).
Ces deux derniers composants définissent un milieu avec un pH et une concentration saline
optimaux pour le bon fonctionnement de l’enzyme. La présence dans le milieu réactionnel des
cations bivalents Mg2+ et de cations monovalents (K+ ou NH4 + ) vont neutraliser les
charges négatives des groupements phosphates au niveau de l’ADN et ainsi stabiliser les
hybrides ADN/ADN.
3. La réaction d’amplification :
La PCR est une technique automatisée qui réalise dans un thermocycleur. L’appareil contient
un bloc chauffant où l’on insère les tubes contenant le mélange réactionnel pour la réaction de
PCR et où la température peut varier rapidement et très précisément de 0°C à 100°C.
Le thermocycleur est programmé pour effectuer les différents cycles de la PCR. Ainsi, chaque
cycle est composé d’une succession de paliers de température prédéterminée, et d’une durée
bien définie. Ces deux paramètres, température et temps, dépendent de la taille de la séquence
à amplifier de la taille et de la composition en désoxyribonucléotides des amorces.
Chaque cycle est constitué de trois étapes différentes:
La dénaturation : La température dans le tube est réglée à 95°C. A ce moment là,
l’ADN se dénature. En effet, l’ADN perd sa structure caractéristique en double hélice,
les liaisons hydrogène reliant les bases de chaque brin d’ADN étant instables à cette
température. L’ADN double-brin (2 brins) est dénaturé en ADN simple brin (1 brin).
L’hybridation : Au cours de cette étape, la température est descendue à la
température dite d’hybridation. Cette dernière est généralement comprise entre 50°C
et 60°C et elle est fonction de la composition en désoxyribonucléotides (dATP, dTTP,
dGTP, et dCTP) des amorces. Les amorces reconnaissent et se fixent à leurs séquences
complémentaires en reformant des liaisons hydrogène. On dit que les amorces
s’hybrident au brin d’ADN.
L’élongation : la température est ensuite réglée à 72°C, température idéale pour
l’activité de la Taq polymérase, une enzyme thermorésistante capable de résister à des
températures allant jusqu’à 100°C. Cette Taq polymérase est extraite d’une bactérie
extrêmophile, Thermus aquaticus, qui ne vit que dans les sources chaudes.
Cette étape permet à la Taq polymérase de synthétiser le brin complémentaire à l’ADN
matrice, grâce aux dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel. Au cycle suivant, les
nouveaux fragments synthétisés servent à leur tour de matrice pour la synthèse de
nouveaux fragments d’ADN. En théorie, à la fin de chaque cycle la quantité d’ADN cible
est doublée. A la fin de tous les cycles de la PCR, à partir d’une copie d’ADN cible on
pourra obtenir 1 milliard de copie d’ADN cible.
