REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE DJILLALI LIABES DE SIDI BEL ABBES

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE MOLECULAIRE PROTEOMICS ET SANTE

THESE Présentée par

Mme BENMAMMAR née KHODJA Badra

EN VUE DE L’OBTENTION
ème
DU DIPLOME DE DOCTORAT 3 CYCLE
Spécialité : Sciences Biologiques
Option : Microbiologie Moléculaire et Protéomics
Thème

Caractérisation phénotypique et moléculaire des souches de

bactéries lactiques productrice de bactériocine.

Soutenu le : Devant le Jury composé de :

Président :
Mr. BENALI Mohammed (Professeur, Université de Sidi Bel Abbès).
Examinateurs :
Mr. ABBOUNI Bouziane (Professeur, Université de Sidi Bel Abbès).
Mr. BELABID Lakhdar (Professeur, Université de Mascara).
Directeur de thèse :
Mr. BENINE Mohamed El Amine (MCA, Université de Sidi Bel Abbès).

Année universitaire 2017/2018

 Dédicaces
Je dédie ce modeste travail à tous ceux que j'aime :

A celui a qui je dois mon amour pour la science, mon très cher père Kada Farid. Tu as
toujours su me motiver, Tu es un pilier solide et incontournable pour ma personne et mon
parcours, que Dieu te donne santé et longue vie.

A la prunelle de mes yeux, celle qui a les clefs du paradis, a toi tendre Maman que ce
travail soit pour toi le témoignage de mon infinie reconnaissance pour ton aide précieuse et
toutes ces années de compréhension. Sans toi que serais- je ?

A mon beau père et ma belle mère

A mes très chères frères :Abdelkader, Abdelhadi, Mohamed et Ahmed

A mes belle soeurs: Samia, Hafida, Chaima , Mariem et Tinhinen

A mes beaux freres: Brahim, et Dahim

A tous mes amis, et surtouts : Fatima, Wafae, Amina et Aicha.

Le plus Grand merci Dédicace à une personne Chére à mon cœur mon marie ″ Hamza″
qui m’a supporté et d’avoir été très compréhensible

La cerise sur le gateau C’est la personne qui a donné un sens à ma vie et qui illumine de
tous sont éclat ma vie ma petite et très chére fille Ritadj

A tout ceux que j'apprécie énormément, et qui contribuent à Nous rendre la vie plus agréable.

Merci à tous.
 Remerciements
Avant tout je remercie tout d’abord Allah de m'avoir donné le courage, la force, la santé, et la
patience pour pouvoir accomplir ce travail.

Toutes les expressions de l’estime et de gratitude du monde sont insuffisantes pour exprimer
mes remerciements à mes parents qui m’ont accompagné durant tout mon cursus d’étude.

Je tiens à exprimer toute mes gratitudes et remerciements à mon encadreur Dr BENINE

Mohamed Lamine. Qu’il trouve ici l’expression de ma profonde reconnaissance pour m’avoir
accordé sa confiance et guidé dans mon travail, ces précieux conseils, sa disponibilité et sa
gentillesse à notre égard ont contribué au bon déroulement de ce travail de recherche, mais
aussi et surtout pour sa qualité humaine.

Je tiens à exprimer ma très grande considération et ma vive reconnaissance au

Pr ABBOUNI Bouziane, pour son aide, ces compétences et ces conseils judicieux.

Mes vifs remercîments sont adressés aux membres du jury Messieurs le président
Pr. BENALI Mohamed. (Université Djillali Liabes, SBA), Pr .ABBOUNI Bouziane.
(Université Djillali Liabès, SBA) et. Pr. BELABID Lakhdar (Université de Mascara) qui me
font un grand honneur d’évaluer ce travail.

Un grand merci à, Mr. Dr. KERKOUD Mohamed pour leur précieuse aide et ses conseils pour
la réalisation de la partie moléculaire.

Je n’oublie pas de remercier particulièrement Mme SAFER Khadija Professeur à l’université

d’Oran qui m’a beaucoup aidé, encouragé, dans des moments très délicats.

J’adresse mes remerciements à tous les ingénieurs du laboratoire de microbiologie et

biotoxicologie et en particulier Monsieur : SELIOUNI Mostapha, Mme MERASI Ferdous et
MmeHaddad Fatima de leurs aides précieuse.

Un grand merci pour toutes les mamans qui ont accepté de contribuer à cette étude, en me
permettant les prélèvements échantillonnales de leur lait maternel.
Résumé

L’intégration de nouvelles souches lactiques provenant de différents écosystèmes est

actuellement utilisée pour l’augmentation de la durée de bioconservation des aliments. Outre,
l’activité probiotique de certaines bactéries lactiques est exploitée dans la production des
aliments à caractères préventif et thérapeutiques.
L’objectif de ce présent travail est l’isolement et caractérisation de bactéries lactiques
productrices de bactériocine du lait maternel, l’optimisation de certain facteurs tels que le pH,
la température d’incubation impliquées dans la production de la bactériocine. L’isolement des
bactéries lactiques productrices de bactériocine est effectué à partir d’échantillons prélevés du
lait maternel. Le criblage primaire des souches lactiques à partir de lait maternel, sur un
milieu de culture gélosé a permis l’isolement de 28 souche lactique. Le criblage secondaire
des bactéries isolées du lait maternel a permis la sélection de 13 souches lactique antagoniste
ont été identifiées sur les plans physiologique et biochimique.
L’étude des interactions a révélé un pouvoir inhibiteur de quatre souches sélectionnées
fortement inhibitrices vis-à-vis de Staphylococcus aureus UT 602, [Link] CECT 86T,
[Link] ATCC 25923, [Link] ATCC 43300 et E. coli ATCC 25922. L’effet antagonique a
été évalué par des techniques de diffusion sur gélose (méthode de double gélose, méthodes
des puits). L’amplification du fragment d’ADN codant la régions 16S ARN des quatre
souches lactiques, sélectionnés hautement antagoniste et leur séquencage ont révélé leur
appartenance aux espèces suivants : LbL15 :Enterococcus faecium, LbC11 : Enterococcus
faecium, LbC3 : Lactobacillus brevis, LbL4 : Lactobacillus sakei. En soustrayant l’effet du
pH, du H2O2 l’inhibition reviendrait à des facteurs antimicrobiens de nature protéique
(bactériocine) comme il a été révélé avec Lactobacillus brevis (LbC3). L’optimisation de la
production de la bactériocine sur milieu MRS est rendue meilleure à un pH de 6 et à une
température de 30°C. La cinétique de croissance d’[Link] ATCC25922 en présence et en
absence de la bactériocine produite par [Link] (LbC3) a montré que la biomasse bactérienne
a diminué progressivement après l’ajout des bactériocines. Les résultats des tests
technologiques de cette souche sont satisfaisants pour une utilisation industrielle car elle
possède une activité protéolytique et un bon pouvoir acidifiant. L’antibiotype de la souche
LbC3 montre 50% de sensibilité vis-à-vis des antibiotiques tests.
L’étude des interactions inhibitrices de la souche LbC3 à l’égard de bactéries pathogènes
envisagera leur utilisation à des fins technologiques.
Mots-clefs : Isolement, lait maternel, bactéries lactiques, bactériocine, optimisation.
Abstract

The integration of new lactic acid bacteria strains isolated from diverse ecosystems is now
used to increase the biopreservation of dairy products. Moreover, probiotic activity of lactic
acid bacteria is exploiting in the fact to produce functional foods.
The aim of this study is the isolation and identification of lactic bacteria strains that produce
bactériocin from breast milk, optimization of bactériocin and bactériocin production.
The primary screening of lactic acid strains from breast milk on an agar culture medium
allowed to isolate 28 lactic strain. The secondary screening of bacteria isolated from breast
milk allowed the selection of 13 antagonistic lactic acid bacteria were identified by
physiological and biochemical methods. The study of the interactions revealed that four
selected highly inhibitory strains capable of inhibiting the growth of Staphylococcus aureus
UT 602, S. aureus CECT 86T, S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 43300 and E. coli
ATCC 25922. The Antagonistic effect was evaluated by diffusion techniques on agar (double
agar method, well methods).
The amplification and sequencing of the fragment DNA coding 16S RNA regions of the 4
isolates selected highly antagonist was performed and revealed their belonging to the strains:
LbL15 :Enterococcus faecium, LbC11 : Enterococcus faecium, LbC3 : Lactobacillus brevis,
LbL4 : Lactobacillus sakei. By eliminating the effect of pH, H2O2 from the antimicrobial
factors, the inhibiting agent of Lactobacillus brevis (LbC3) was determined as a substance of
proteinous nature (bactériocin). The optimization bactériocin LbC3 production was made in a
MRS différent concentration de pH. The best diffusion of this bacteriocin in an agar at pH
equal to 6 and a temperature of 30°C, allowed a better evaluation of its inhibitory effect. The
study of bacterial growth of [Link] ATCC 25922 in the absence and in the presence of the
supernatant [Link] (LbC3) indicated a considerable biomass reduction accompanied with
unbalanced growth after adding of the supernatant. The results of technological tests of the
strain are satisfactory for industrial use: possesses proteolytic activity and showed a good
acidifying power. LbC3 strain behavior was evaluated with 10 antibiotics and had shown
sensitivity to 50% of them.
The study of the inhibitory interactions of the LbC3 strain with regard to pathogenic bacteria
will consider their use for technological purposes.

Keywords: Isolation, human breast milk, bactériocin, optimization.

 ‫ﻣﻠﺨﺺ‬

‫اﻷﺻﻨﺎف اﻟﺠﺪﯾﺪة ﻣﻦ ﺑﻜﺘﯿﺮﯾﺎ اﻟﺤﻠﯿﺐ اﻟﻨﺎﺟﻤﺔ ﻋﻦ أوﺳﺎط ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ ﺗﺴﺘﻌﻤﻞ ﻹﻏﺮاض وﻗﺎﺋﯿﺔ ﻛﻤﺎ ﺗﺴﺘﻐﻞ ﻟﻺطﺎﻟﺔ ﻣﻦ ﻣﺪة‬

‫ﺻﻼﺣﯿﺔ اﻟﻤﻮاد اﻟﻐﺬاﺋﯿﺔ‪.‬‬

‫اﻟﮭﺪف ﻣﻦ ھﺬا اﻟﻌﻤﻞ ھﻮ ﻋﺰل وﺗﺤﺪﯾﺪ ﺑﻜﺘﯿﺮﯾﺎ ﺣﻤﺾ اﻟﻠﺒﻦ اﻟﻤﻨﺘﺠﺔ ﻟﻠﺒﻜﺘﯿﺮﯾﻮﺳﯿﻦ ﻣﻦ ﺣﻠﯿﺐ اﻻم‪ ,‬دراﺳﺔ اﻟﻌﻮاﻣﻞ اﻟﻔﯿﺰﯾﺎﺋﯨﺔ‬
‫اﻟﻤﺆﺛﺮة ﻓﻲ اﻧﺘﺎج اﻟﺒﻜﺘﺮﯾﻮﺳﯿﻦ ) درﺟﺔ اﻟﺤﺮارة‪ ,‬اﻟﺮﻗﻢ اﻟﮭﯿﺪروﺟﯿﻨﻰ ‪(.‬‬
‫ﺗﻢ ﻋﺰل ‪ 28‬ﺑﻜﺘﯿﺮﯾﺎ ﺣﻤﺾ اﻟﻠﺒﻦ ﻣﻦ ﺣﻠﯿﺐ اﻻم‪ .‬وﻗﺪ ﺗﻢ اﺧﺘﺒﺎر ﻗﺪرﺗﮭﺎ ﻋﻠﻰ اﻟﺘﻀﺎد اﻟﺒﻜﺘﯿﺮي واﻟﺘﻲ اﺳﻔﺮت ﻋﻦ ﺗﺤﺪﯾﺪ‪13‬‬
‫ﺳﻼﻟﺔ ﺣﻤﺾ اﻟﻠﺒﻦ وﺗﻢ اﺧﺘﺒﺎر ﺗﺤﻠﯿﻞ ھﻮﯾﺎﺗﮭﺎ ﻣﻦ ﺧﻼل اﻟﻄﺮق اﻟﻔﺴﯿﻮﻟﻮﺟﯿﺔ واﻟﺒﯿﻮ ﻛﯿﻤﯿﺎﺋﯿﺔ‪.‬‬
‫دراﺳﺔ اﻟﺘﻔﺎﻋﻼت ﺗﻜﺸﻒ أن أرﺑﻊ ﺳﻼﻻت ﻣﺨﺘﺎرة ﻣﺜﺒﻄﺎت ﻗﻮﯾﺔ ﻗﺎدرة ﻋﻠﻰ ﻣﻨﻊ ﻧﻤﻮ ‪.86T CECT aureus S‬‬
‫‪.S. aureus UT 602, , S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 43300 et E. coli ATCC 25922‬‬
‫ھﺬه اﻟﺴﻼﻻت ﺗﻢ اﻟﺘﺄﻛﺪ ﻣﻦ ھﻮﯾﺘﮭﺎ ﻣﺮة أﺧﺮى ﻣﻦ ﺧﻼل اﻷﺳﺎﻟﯿﺐ اﻟﺠﺰﺋﯿﺔ ﻟﻠﺤﻤﺾ اﻟﻨﻮوي اﻟﺮﺑﻮزوﻣﻰ‪ 16S‬ﻛﺎﻟﺘﺎﻟﻲ‪:‬‬
‫‪faecium, Enterococcus : LbC11 faecium, :Enterococcus LbL15‬‬

‫‪LbC3 : Lactobacillus brevis, LbL4 : Lactobacillus sakei‬‬

‫ﻣﻦ ﺧﻼل إﺑﻌﺎد ﺗﺄﺛﯿﺮ اﻟﺤﻤﻮﺿﺔ و ‪ H2O2‬ﻋﻦ اﻟﻌﻮاﻣﻞ اﻟﻤﻀﺎدة ﻟﻠﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ ﺗﻢ ﺗﺤﺪﯾﺪ ﻋﺎﻣﻞ اﻻﺑﺎدة )‪(LbC3‬‬

‫ﻓﻲ اﻟﻮﺳﻂ‬
‫‪brevis Lactobacillus‬ﻛﻤﺎدة طﺒﯿﻌﯿﺔ ﺑﺮوﺗﯿﻨﮫ )اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﻮﺳﯿﻦ‪ (.‬ﺗﻢ ﺗﺤﺴﯿﻦ اﻧﺘﺎج اﻟﺒﻜﺘﺮﯾﻮﺳﯿﻦ ل ‪LbC3‬‬
‫اﻟﻐﺬاﺋﻲ ‪ MRS‬ﺑﺘﻐﯿﯿﺮ درﺟﺔ اﻟﺤﻤﻮﺿﺔ‪ .‬ھﺬا اﻹﻧﺘﺎج ﻓﻲ وﺳﻂ ﻟﮫ ‪ pH‬ﯾﺴﺎوي ‪ 6‬ودرﺟﺔ اﻟﺤﺮارة ‪ 30‬درﺟﺔ ﻣﺌﻮﯾﺔ ﺳﻤﺢ ﺑﺘﻘﯿﯿﻢ‬
‫أﻓﻀﻞ ﻟﻤﻔﻌﻮﻟﮭﺎ‪ .‬ﺣﺮﻛﯿﺔ اﻟﻨﻤﻮ ‪ ATCC25922 [Link]‬ﻓﻲ وﺟﻮد أو ﻋﺪم وﺟﻮد اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﻮﺳﯿﻦ اﻟﺘﻰ ﺗﻨﺘﺠﮭﺎ ‪، [Link]‬‬
‫أظﮭﺮت أن اﻟﻜﺘﻠﺔ اﻟﺤﯿﻮﯾﺔ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺔ اﻧﺨﻔﻀﺖ ﺗﺪرﯾﺠﯿﺎ ﺑﻌﺪ إﺿﺎﻓﺔ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﻮﺳﯿﻦ‪ .‬ﻧﺘﺎﺋﺞ اﻻﺧﺘﺒﺎرات اﻟﺘﻜﻨﻮﻟﻮﺟﯿﺔ ﻟﮭﺬه اﻟﺴﻼﻟﺔ‬
‫ھﻲ ﻣﺮﺿﯿﺔ ﻟﻼﺳﺘﺨﺪام اﻟﺼﻨﺎﻋﻲ‪ :‬ﻟﺪﯾﮫ ﺧﺎﺻﯿﺔ ﻧﺸﯿﻄﺔ ﻓﻲ اﻟﺘﺤﻠﯿﻞ اﻟﺒﺮوﺗﯿﻨﻰ واﻟﺤﻤﻀﻲ‪ .‬ﻛﻤﺎ أن اﻟﺴﻼﻟﺔ ‪ LbC3‬ﻟﮭﺎ ﺳﻠﻮك‬
‫ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺿﺪ ‪ 10‬ﻣﻀﺎد ﺣﯿﻮي وھﻲ ﺣﺴﺎﺳﺔ ل ‪ 50%‬ﻣﻦ اﻟﻤﻀﺎدات اﻟﺤﯿﻮﯾﺔ اﻟﻤﺴﺘﻌﻤﻠﺔ‪.‬‬
‫دراﺳﺔ اﻟﺘﻔﺎﻋﻼت اﻟﻤﺜﺒﻄﺔ ﻟﺴﻼﻟﺔ ‪ LbC3‬ﻓﯿﻤﺎ ﯾﺘﻌﻠﻖ ﺑﺎﻟﺒﻜﺘﺮﯾﺎ اﻟﻤﺴﺒﺒﺔ ﻟﻸﻣﺮاض ﺳﻮف ﺗﻨﻈﺮ ﻓﻲ اﺳﺘﺨﺪاﻣﮭﺎ ﻷﻏﺮاض‬
‫ﺗﻜﻨﻮﻟﻮﺟﯿﺔ‪.‬‬

‫اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﯿﺔ‪ :‬ﻋﺰل‪ ،‬ﺣﻠﯿﺐ اﻻم‪ ،‬ﺑﻜﺘﯿﺮﯾﺎ ﺣﻤﺾ اﻟﻠﺒﻦ‪ ،‬اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﻮﺳﯿﻦ‪.‬‬

 Sommaire

Liste des tableaux

Liste des figures
Liste des abréviations

Introduction générale............................................................................................01

Synthèse bibliographique
1- Lait maternel............................................................................................................03
1-1 Généralité............................................................................................................03
1-2 La composition du lait maternel.........................................................................03
1-2-1 Les protéines......................................................................................................04
1-2-2 Les caséines........................................................................................................04
1-2-3 Les protéines solubles........................................................................................04
1-2-4 Les lipides..........................................................................................................04
1-2-5 Les glucides........................................................................................................05
1-2-6 Azotes et sels minéraux......................................................................................05
1-3 Microbiote du lait maternel................................................................................05
1-4 Les bactéries lactiques........................................................................................06
1-4-1 Définition........................................................................................................06
1-4-2 Propriété générales..........................................................................................06
1-4-3 Classification...................................................................................................07
1-4-4 Principaux genre des bactéries lactique...........................................................09
1-4-4-1 Lactobacillus............................................................................................09
1-4-4-2 Lactococcus..............................................................................................10
1-4-4-3 Enterococcus............................................................................................11
1-4-4-4 Pediococcus.............................................................................................11
1-4-4-5 Streptococcus...........................................................................................11
1-4-4-6 Bifidobacterium........................................................................................12
1-5 Effet probiotique et propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques..............12
1-5-1 Les acides organique…....................................................................................12
1-5-2 Le peroxyde d’hydrogéne….............................................................................12
1-5-3 Le dioxyde de carbone….................................................................................13
1-5-4 Le diacétyl …………………………. ……………………………............. 13
1-5-5 La reutérine……………………………………………………………….. 13
1-5-6 Les bactériocines………………………………………………….……… 13
1-6 Bactériocines des bactéries lactiques………………………………………… 14
1-6-1 Historiques et définition……………...…………………………………... 14
1-6-2 Classification …………………………………………………………….. 14
1-6-2-1 Classe I : Les Lantibiotiques …………………………………….. 14
1-6-2-2 Classe II : Non-Lantibiotiques ….………………………………… 16
1-6-2-3 Classe III : Les Bactériolysines….………………………………… 16
1-6-2-4 Classe IV …………………………………………………….…… 16
1-6-3 Production des bactériocines…………………………………….……...... 16
1-6-4 Mécanismes d’action des bactériocines…………………………………... 16
1-6-5 Spectre d’activité du bactériocines..……………………………………… 17
1-6-6 Le conditionnement des bactériocines……………………………………. 19
1-6-7 Domaine d’application des bactériocines………………………………… 19
1-6-7-1 Domaine alimentaire………………………………………………... 20
1-6-7-2 Domaines de la médecine humain……………………………..…… 20
1-6-7-3 Domaines agricoles………………………………………………..... 20
1-7 identification des bactéries par la biologie moléculaire……………………... 21
1-7-1 Méthode basées sur la PCR…………………………………………… 21
1-7-2 Amplification de régions consensus et séquençages………………….. 22
1-7-2-1 Principe ……………………………………………………………… 22
1-7-2-2 Protocole générale…………………………………………………... 22
Matériels et méthodes
2-1 Prélèvement du lait maternel ………………………………………………… 23
2-2 Isolement et purification des isolats…………………………………………... 23
2-3 Purification des isolats de bactéries lactiques………………………………… 23
2-4 Conservation des isolats………………………………………………………. 23
2-5 Caractérisation morphologique……………………………………………….. 24
2-5-1 Examen macroscopique des colonies………………...………………… ... 24
2-5-2 Examen microscopique ………………………………………………….. 24
2-5-2-1 Observation à l’état frais………………………………………… 24
2-5-2-2 Coloration de Gram……………………………………………… 25
2-5-3 Test biochimique et physiologiques…………………………………..…… 25
2-5-3-1 Test de la catalase…………………………………..……………… 25
2-5-3-2 Croissance à différente température……………….………………… 25
2-5-3-3 Croissance à différent pH……………………..……………..…….. 25
2-5-3-4 Culture sur milieu hypersalé……………………………………….... 25
2-5-3-5 Recherche de type fermentaire……………….……………………… 25
2-5-3-6 Test d’hémolyse …………………………………………………….. 26
2-5-4 Identification de l’espèce par galerie API50 CH…………………………… 26
2-6 Etude des interactions bactériennes………………………………………... 26
2-6-1 La méthode directe (spot agar test)………………………………………… 26
2-6-2 La méthode indirecte (well diffusion assay)……………………………….. 26
2-6-3 Localisation de la substance inhibitrice……………………………………. 27
2-6-4 Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur……………………….. 27
2-6-4-1 Inhibition due au peroxyde d’hydrogène……………………………. 27
2-6-4-2 Inhibition due à la production d’acide organique……………………. 27
2-6-4-3 Recherche de substance inhibitrice de nature protéique…………….. 27
2-6-5 Optimisation de la production de bactériocine…………………………….. 27
2-6-5-1 Effet de la température d’incubation………………………………… 27
2-6-5-2 Effet du pH…………………..……………………………………… 28
2-7 Mode d’action des bactériocines…………………………………………….. 28
2-8 Caractérisation technologique …..……………….………………………….. 28
2-8-1 Pouvoir acidifiant ……………………………….…………………………. 28
2-8-2 Pouvoir protéolytique………………..……………………………………... 28
2-8-3 Pouvoir lipolytique………………………………………………………… 38
2-8-4 Etude de l’antibiorésistance………………………………………………… 29
2-8-5 Cinétique de la croissance (production de biomasse)……………………… 29
2-9 Identification génotypique…………………………………………...………. 29
2-9-1 Extractions de L’ADN……………………………………………………... 29
2-9-2 Amplification de L’ADN par PCR………………………………………… 30
2-9-3 Electrophorèse sur gel d’agarose……………………………….………….. 31
2-9-3-1 Préparation du gel …………………………………………………... 31
2-9-3-2 Dépôt des échantillons (produits d’amplification)………………….. 31
2-9-3-3 Migration …………………………………………………………… 31
 2-9-3-4 Visualisation.............................................................................................31
2-9-7 Séquençage d’ADN............................................................................................32

Résultats et discutions
3-1 Échantillonnage.....................................................................................................33
3-1-1 Chois des isolats.................................................................................................35
3-2 Caractérisation phénotypique des isolats…...........................................................35
3-2-1 Caractérisation macroscopique...........................................................................35
3-2-2 Caractérisation microscopique...........................................................................35
3-2-3- Test biochimique et physiologique…...............................................................38
3-2-4 Le type fermentaire…........................................................................................39
3-3 Identification par galerie api 50CH.......................................................................40
3-4 Criblage des souches antagonistiques....................................................................42
3-4-1 Localisation de la substance inhibitrice…..........................................................45
3-4-2 Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur...........................................46
3-4-2-1 Inhibition due à la production d’acide organique…................................47
3-4-2-2 Inhibition due au peroxyde d’hydrogène.................................................47
3-4-3 Recherche de la substance inhibitrice de nature protéique…..........................48
3-4-4 Optimisation de la production de bactériocine…...............................................48
3-4-4-1 Effet de la température d’incubation…........................................................49
3-4-4-2 L’effet du pH.................................................................................................50
3-5 Mode d’action des bactériocines...........................................................................51
3-6 Caractérisation technologique des isolats de bactéries..........................................52
3-6-1 Pouvoir acidifiant...............................................................................................52
3-6-2 Pouvoir proteolytique….....................................................................................54
3-6-3 Pouvoir lipolytique….........................................................................................56
3-7 Détermination des profils de sensibilité aux antibiotiques....................................57
3-8 Cinétique de la croissance (Production de biomasse)............................................60
3-9- Identification genotypique....................................................................................60
Conclusion et perspective..........................................................................................66
Référence bibliographique........................................................................................68
Annexe
Annexe1 : Composition de milieu de culture et tampon...........................................81
Annexe 2 : Antibiotique utilisée...............................................................................83
Annexe 3 : Questionnaire...........................................................................................84
 Liste des tableaux

Tableau 1 : Composition moyenne du colostrum (en gpour100ml) (Rotten, 1991). 3

Tableau 2 : Composition moyenne du lait maternel (%). 4

Tableau 3 : Taxonomie et les clés de différentiation des bactéries lactiques (Holzapfel et 8

al., 2001).

Tableau 4 : Classification des bactériocines (papagianni, 2003). 15

Tableau 5 : Bactériocine produite par des bactéries probiotiques (Gillor, 2008). 18

Tableau 6 Volumes des composants de la solution mixte utilisée pour l’amplification 31

d’ADNr 16s.

Tableau 7 : Origine des prélèvements du lait maternel. 34

Tableau 8 : Illustration des critères morphologique et microscopique des bactéries 37

lactiques isolées du lait maternel.

Tableau 9 : Présentation des caractères physiologiques des souches lactiques isolées, 38

sélectionnées antagonistes.

Tableau 10 : Type fermentaire des souches lactiques isolées, sélectionnées antagonistes. 39

Tableau 11 : Présentation des caractéristiques biochimiques des souches isolées 41

sélectionnées antagonistes, lors de l’utilisation de la galerie Api 50CHL.

Tableau 12 : L’étude de l’activité antibactérienne des souches lactiques par la méthode 44

directe.

Tableau 13 : L’étude de l’activité antibactérienne du culot des bactéries lactiques par 45

mesure du diamètre de la zone d’inhibition (mm).

Tableau 14 : L’étude de l’activité antibactériennes de surnageant des bactéries lactiques 46

par mesure de la moyenne des diamètres de la zone d’inhibition (mm).

Tableau 15 : Activité protéolytique et lipolytiques des bactéries lactiques étudiées. 55

Tableau 16 : Résultats de la résistance et la sensibilité aux antibiotiques des bactéries 57

lactiques étudiées.
Tableau 17 : Présentation d’un complet génome de la souche sélectionné antagoniste 62
LbL15.

Tableau 18 : Présentation d’un complet génome de la souche sélectionné antagoniste 63

LbC11.

Tableau 19 : Présentation d’une séquence partielle d’ADN de la souche productrice de 64

la bactériocine LbC3.

Tableau20 : Présentation d’une séquence partielle d’ADN de la souche sélectionné 65

antagoniste LbL4.
 Liste des figures

Figure 1 : Arbre phylogénétique des bactéries lactiques (Holzapfel et al., 2001). 9

Figure 2 : Mécanisme d’action des bactériocines. 17

Figure 3 : Vue d’ensemble des applications potentielles des bactériocines (De Vuyst et 19
Leroy, 2007).
Figure 4 : Conservation de longue durée des bactéries lactiques purifiées (Saidi et al., 24
2002).
Figure 5 : Les types de lait maternel. 33

Figure 6 : Illustration des modes d’accouchement des femmes allaitante. 33

Figure 7 : Répartition d’âge des femmes Allaitant. 34

Figure 8 : Aspect macroscopique des bactéries lactiques, isolées du lait maternel, 36

inoculées sur milieu MRS incubée à une température de 37°C pendant 48h.
Figure 9 : Coloration de Gram et l’observation microscopique des souches isolées, 36
sélectionnés lactiques (Gx100).
Figure 10 : Test d’hémolyse négatif des souches lactiques isolées du lait maternel. 39

Figure 11 : Photo illustrative du test de recherche du type fermentaire des bactéries 40

lactiques, (milieu de culture de MRS glucosé, mini d’une cloche de Durham).
Figure 12 : L’activité antagoniste des souches isolées, sélectionnées lactiques vis-à-vis 42
certaines souches pathogènes.
Figure 13 : Pourcentage des bactéries lactiques, isolées a partir de lait maternel inoculées 43
sur milieu de culture MRS, présentant une activité antagoniste vis-à-vis de
Staphylococcus aureus UT 602.
Figure 14 : Pourcentage des bactéries lactiques, isolées a partir de lait maternel inoculées 43
sur milieu de culture MRS, présentant une activité antagoniste vis-à-vis
Staphylococcus aureus ATCC 43300.
Figure 15 : Pourcentage des bactéries lactiques, isolées a partir de lait maternel inoculées 44
sur milieu de culture MRS, présentant une activité antagoniste vis-à-vis E.
coli ATCC 25922.
Figure 16 : Les diamètres de la zone d’inhibition de S aureus CECT86T et d’E coli 45
25922 en présence des bactéries isolées, sélectionnées antagonistes.
Figure 17 : Prévalence de la substance inhibitrice produite par les bactéries lactiques 47
isolées du lait maternel.
Figure 18 : Zones d'inhibitions formées par le surnageant de LbC3 quel que soit le temps 48
thermique à1 00°C.
Figure 19 : L’effet de la température d’incubation sur la production de la bactériocine. 49

Figure 20 : Effet du pH sur l’activité antagoniste de [Link] (LbC3) vis-à-vis [Link] 50

ATCC25922.
Figure 21 : Cinétique de croissance d’Escherichia coli ATCC25922 en présence et en 51
absence de surnagent de L. brevis (LbC3).
Figure 22 : Variation de pH des souches isolées faiblement acidifiées. 52

Figure 23 : Variation de pH des souches isolées moyennement acidifiées. 53

Figure 24 : Variation de pH des souches isolées fortement acidifiées. 54

Figure 25 : Recherche d’activité proteolytique des bactéries lactiques isolées 54

sélectionnés antagonistes sur milieu PCA.
Figure 26 : Teste d’activité lipolytique des bactéries lactiques isolées séléctionnées 56
antagonistes.
Figure 27 : Quelques résultats du test de l’étude de la sensibilité des souches isolées 56
sélectionnés antagonistes aux antibiotiques.
Figure 28 : Pourcentage de la résistance de chaque souche isolée sélectionné antagoniste 58
vis à vis les dix antibiotiques.
Figure 29 : Comportement des souches isolées sélectionnés antagoniste vis-à-vis de 59
chaque antibiotique testé.
Figure 30 : Cinétique de croissance par les souches sélectionnés antagonistes A : LbC3 ; 60
B : LbL4.
Figure 31 : Cinétique de croissance par les souches sélectionnés antagonistes C : 60
LbL15 ; D :LbL11.
Figure 32 : Electrophorèse sur gel d’Agarose à 1.2% : d’un fragment de 1500pb amplifié 61
par les amorces universelles.
Figure 33 : Aspect morphologique des isolats les plus intéressants. 61
 Liste des Abréviations

E Escherichia
En Enterococcus Faecuim
L Lactobacillus
LbC Bactérie lactique du colostrum
LbL Bactérie lactique du lait maternel
Lc Lactococcus
S Staphylococcus
Sp Especes non précise
Ssp Sous espèce
ADN Acide Désoxyribonucléique
ARNr Acide Ribonucléique Ribosomique
ATCC Americain Type Culture Collection
dNTP Desoxynucléotides
DO Densité Optique
EDTA Acide Ethylene Diamine Tetra Acétique
G+C Guanine+Cytosine
GRAS Generally Regarded As Safe
MRS Man Rogosa et sharp
Pb Paire de base
PCR Polymerase Chain Réaction
TBE Tris borate- EDTA
TES Tris EDTA-Saccharose
UFC Unité formant Colonie
UV Ultra- Violet
 Introduction Générale

INTRODUCTION

Les bactéries lactiques ont été, depuis longtemps, un outil de conservation et de

transformation des aliments, en dépit de l’ignorance de ces potentiels technologiques. Elles
étaient présentes dans de nombreux écosystèmes microbiens, car elles ont la particularité
de prédominer dans des environnements assez riches tels que le lait et ces dérivés, les
végétaux et dans les cavités humaines et les cavités animales.

Les aliments constituent un environnement, dans lequel plusieurs bactéries peuvent

cohabiter. Certains de ces microorganismes provoquent seulement des altérations des
produits alimentaires alors que d’autres, comme listeria, causent des maladies aux
consommateurs. D’où l’importance de les éliminer. Les antibiotiques présentent depuis
quelques décennies un excellent moyen pour faire barrage à tous ces microorganismes
nocifs. Cependant, ils présentent le grand danger de l’apparition de multirésistances chez
ces derniers (Benmouna, 2012).

La présence des bactéries lactiques dans différents écosystèmes, peut assurer, d’une
part, le bon déroulement des étapes de production d’un aliment fermenté, ses qualités
organoleptiques, et d’autres part, sa conservation naturelle (ou bioconservation), en
réduisant ou éliminant l’addition des conservateurs chimiques et en les remplaçant par
d’autres qui sont naturels (O’Sulvan, 2003).

La bioconservation des aliments, est due aux pouvoirs antagonistes des bactéries
lactiques. En effet, elles ont la particularité de synthétiser des substances inhibitrices,
principalement les acides organiques (acide lactique et acide acétique), le peroxyde
d’hydrogéne (H2O2) et les bactériocines. Ces dernières ont fait l’objet de nombreuses
études (Deegan et al., 2006).

Ces dernières années, l’intérêt de l’emploi de la bactériocine et ou tout autre bactéries

lactiques productrices de substances inhibitrices pour des applications de bio-conservation
a suscité beaucoup de recherches (Schillinger et Lucke, 1989 ; Budde et al., 2003 ;
Jacobsen et al., 2003 ; Vermeiren et al., 2004 ; Guessas, 2007).

A notre connaissance, les bactéries lactiques trouvées dans le lait maternel restent peut
décrite dans la littérature (jara et al., 2011); à cet effet, elles peuvent constituer une niche
écologique riche et importante pour le criblage des souches lactiques productrice de
bactériocine avec de nouvelles propriétés technologiques. Parmi les principales
caractéristiques souhaitées pour l’utilisation industrielle d’une souche dans la
bioconservation sa capacité de produire des substances inhibitrices. Cependant d’autres
propriétés peuvent affecter les critères technologiques ou présenter des risques pour les
consommateurs tels l’antibiorésistance (Guiraud et Rosec, 2004). C’est pourquoi le critère
« antibiorésistance » est l’un des critères d’évaluation de l’innocuité des souches d’intérêt
technologique utilisées comme ferment.

1
 Introduction Générale

Les objectifs tracés pour la réalisation de ce présent travail sont :

 L’isolement d’une large gamme de souches de bactéries lactiques productrice de

bactériocines à partir du lait maternel de la région ouest Algérien.
 La mise en évidence de l’activité antagoniste des souches de bactéries lactiques vis
- à- vis de certain souche pathogène.
 L’optimisation de certain facteurs tels que le pH, la température d’incubation
impliquées dans la production de la bactériocine.
 L’identification des souches isolées sélectionnés antagoniste par l’utilisation de la
galerie Api 50CH et l’amplification du fragment d’ADN codant la région conservée
de ARN 16S.
 Evaluation de l’antibiorésistance des souches sélectionnées antagonistes.

2
 Synthèse Bibliographique

1 Lait maternel

1.1 Généralité
Le lait maternel est produit par les cellules sécrétrices des glandes mammaires des
mammifères. Il est riche en protéine et en glucides (Vilain, 2010). Il agit comme un moyen
de transport de nombreuses substances essentielles de la mère à l'enfant. Chez l’être
humain, C'est une émulsion complexe qui fournitures non seulement les nutriments et
l'énergie nécessaires pour les facteurs de croissance et de développement de l'enfant, mais
aussi qui aident à la protection microbiologique, en réglementant le mécanismes de
défense, et accélérer la maturation postnatale du système digestif (Jara et al., 2011).

1.2 La composition du lait maternel

La composition du lait maternel varie selon le nombre de jours post-partum, le moment
de la journée, la phase de la tétée et l’état nutritionnel de la mère. Des variations
interindividuelles sont également enregistrées. Les trois types de lait que l’on retrouve en
post-partum sont le colostrum (1 à 7 jours), le lait de transition (7 à 13 jours) et le lait
mature (14 jours et plus) (Lawrence et Lawrence, 1999).

Tableau 1 : Composition moyenne du colostrum (en g pour 100ml) (Rotten, 1991).

Durée Eau Glucide Protéine Lipide Sels minéraux

J1 84,5 2,8 9,8 2,6 0,4
J2 86,5 3,5 7,5 2,2 0,4
J3 87,3 5,4 3,3 3,8 0,3

Le Tableau 1 présente les variations dans la composition du lait (colostrum) durant les
trois jours du post partum relativement à la concentration en glucides, en lipides et en
protéines ; en fonction du nombre de jours post-partum. Pendant les premiers jours de vie
de l’enfant, le lait maternel (colostrum) est en moyenne plus enrichie en protéines, plus
faible en lipides et plus glucidique que les autres types de lait (lait de transition, lait
mature).

Dans les jours qui suivent, la concentration en protéines diminue progressivement alors
que la concentration en lipide et en lactose augmente graduellement. Le volume de lait
excrété de même que la concentration en lipides peuvent varier d’un sein à l’autre et d’un
moment de la journée à l’autre).

Parmi les autres facteurs associés aux changements dans la teneur en lipides totaux du
lait humain, on retrouve : l’âge gestationnel de l’enfant à la naissance, la diète, les
infections et les désordres métaboliques, la parité, l’adiposité maternelle, le stade de la
tétée et le sevrage La composition du lait est corrélée à la quantité de lait consommée par
l’enfant et de la régularité des tétées (Lawrence et Lawrence, 1999).

3
 Synthèse Bibliographique

La composition du lait maternel varie au cours de la période totale d’allaitement, du

colostrum au lait mature.

Tableau 2 : Composition moyenne du lait maternel (%).

Eau Glucide Protéine Lipide Na K Cl Ca

Lait
88 gr 6.8 gr 1,2 gr 3.8 gr 15 mg 55 mg 43 mg 33 mg
maternel

1.2.1 Les protéines

La teneur en protéines du lait de femme, comprise entre 0.8 et 1.2 gr pour 100ml, est
nettement inférieure à celle des autres mammifères. Néanmoins, elle est parfaitement
adaptée aux besoins du nourrisson en raison d'une excellente absorption et d'une parfaite
adéquation du profil de ses acides aminés. Les protéines sont constituées essentiellement
par les caséines et les protéines solubles. (Hamosh, 2000).

1.2.2 Les caséines

Elles sont présentes à un faible taux dans le lait maternel (40%, contre 80 % pour le lait
de vache), de ce fait la coagulation du lait de femme est plus fine, ce qui permet une
vidange gastrique plus rapide.

La dégradation des caséines libère des peptides à activité biologique (type opioïde ou
anti-infectieuse) ou encore des fractions glycopeptidiques stimulant la croissance des
bifidobactéries dans le tube digestif du nourrisson (Ricour et al., 1993).

1.2.3 Les protéines solubles

Ce sont les protéines qui ne précipitent pas avec les caséines, elles se composent
essentiellement :

o Des immunoglobulines et des lysozymes, intervenants majoritairement dans les

défenses immunitaires du nourrisson.
o De la lactotransferrine, qui est une protéine de transport spécifique pour le fer,
pour lequel elle possède une très forte avidité. Ainsi le fer maternel présent à un
taux plus faible que dans les préparations industrielles est grâce à cette protéine,
capté de manière optimale par le nourrisson. La lactotransferrine, chélatant le fer
indispensable a l’expréssion de la virulence des souches pathogenes (Jia et al.,
2001).

1.2.4 Les lipides

La teneur en lipides du lait maternel est proche du lait de vache (3.5gr pour 100 ml). La
supériorité du lait maternel réside encore dans une meilleure adaptation pour le nourrisson.

Le coefficient d'absorption des lipides issus du lait maternel dans le tube digestif du
nourrisson est de 80 % les 1ers jours contre 60 % avec le lait de vache et, à 3 mois il est de

4
 Synthèse Bibliographique

95 % contre 80 % avec le lait de vache. Ceci est dû à la présence d'une lipase spécifique
aux capacités physiologiques du nourrisson. Elle est mise en activité par interaction avec
les sels biliaires du tube digestif du nouveau-né et elle est spécifique à la structure des
triglycérides du lait maternel.

Le lait maternel apporte par ailleurs des acides gras essentiels intervenant dans la
maturation cérébrale et rétinienne du nouveau-né, ainsi que du cholestérol intervenant dans
la structure des membranes et comme précurseur hormonal notamment (Owen et al.,
2002).

1.2.5 Les glucides

Le lait de femme est plus riche en glucides que le lait de vache (7.5gr contre 4.5gr pour
100 ml). Alors que le lait de vache ne comporte que du lactose, chez celui de la femme 15
% des glucides sont des oligosaccharides. Ces derniers sont formés de cinq sucres
élémentaires (glucose, galactose, N-acétylglucosamine,fucose, acide sialique), de structure
ramifiée, ils sont au nombres de plus de 130 (Gnoth et al., 2000).

Ces sucres ont démontré leur rôle dans la mise en place de l’écosystème bactérien
colique et dans la protection des infections digestives et extra digestives en intervenant sur
le système immunitaire (Kunz et al., 2000).

1.2.6 Azote et sels minéraux

Le lait maternel a une teneur faible en azote et en sels minéraux par rapport au lait de
vache ce qui permet une moindre charge osmolaire rénale (80 mg par litre contre 230 mg
dans le lait de vache ou 170mg dans une préparation pour nourrisson). En découle une
meilleure adaptation en cas de pertes hydriques excessives chez le nourrisson, comme c'est
là en cas de fièvre ou de diarrhées. (Benhammadi, 2009).

1.3 Microbiote du lait maternel

Le lait maternel demeure spécial par sa richesse par plusieurs groupes bactériens
(103 -105 ufc/ml) prédominés par les Staphylococcus, les Streptococcus, les Micrococcus,
les Lactobacillus, les Enterococcus, les Lactococcus et les Bifidobacterium. Son apport
favorise la prédominance de bifidobactéries et de lactobacilles dans la flore intestinale de
l’enfant (Jara et al., 2011) et des groupe des bactéries lactiques. L’origine de ces bactéries
est probiotiques (Perez et al., 2007).

Les espèces les plus souvent isolées dans le lait maternel sont Staph. epidermidis, Staph.
aureus, Strep. mitis, Strep. salivarius, [Link], L. fermentum, L. gasseri, L. rhamnosus,
B. breve et B. bifidum. Des études récentes sont parvenues à mettre en lumière jusqu’à 700
espèces différentes de bactéries. (Cabrera et al., 2012).

Tout ne peut pas se résumer à cela, il existe aussi des différences considérables entre la
composition du microbiote de la peau et celle du lait maternel « Dans les échantillons de
lait de la mère, nous avons trouvé des espèces de bactéries qui ne sont pas présentes sur le
sein de la mère (Fernández, 2013). De plus, les bifidobactéries qui font partie du
microbiote du lait sont anaérobies. Ce facteur, à lui seul, fait de la peau ou de la bouche un
5
 Synthèse Bibliographique
environnement

6
 Synthèse Bibliographique

peu favorable pour ce type de bactéries. Ces découvertes désignent plutôt les intestins
maternels comme la source d'au moins certaines bactéries du lait maternel.

Le mécanisme exact par lequel les bactéries traversent l’épithélium intestinal,

contournent le système immunitaire pour atteindre les glandes mammaires, reste encore
mal défini à ce jour (Martin, 2004).

Le lait maternel contient plusieurs types de bactéries qui peuvent être considérées
comme des probiotiques, ce qui signifie que ces bactéries exercent des effets anti-
infectieux, anti- inflammatoires et métaboliques sur le bébé. Des chercheurs ont porté une
attention particulière sur l'asthme et la dermatite atopique. Les bactéries du lait maternel
pourraient améliorer voire même empêcher ces troubles. « Ce qui rend ces microbes
particulièrement attirants comparés aux autres bactéries, c'est qu'ils sont d'origine humaine
et qu'ils sont bien tolérés même par des organismes particulièrement sensibles comme ceux
des bébés. Les bactéries du lait maternel sont adaptées de manière unique pour résider dans
les intestins humains et pour avec une interaction avec nous dès notre naissance, et d'autres
scientifiques s’intéressent à une autre maladie, la mastite. Ce trouble affecte jusqu'à un
tiers des mères qui allaitent. Il est souvent résistant à une thérapie par antibiotiques et
constitue la raison principale pour laquelle les mères arrêtent d'allaiter.

Certaines souches bactériennes du lait maternel (des lactobacilles comme [Link],

L. gasseri et L. fermentum) peuvent agir comme des probiotiques pour la mastite. Les
études ont montré que les troubles des femmes qui ont ingéré ces bactéries pendant une
période d'au moins trois semaines se sont beaucoup améliorés, Les bactéries probiotiques
ingérées colonisent la glande mammaire par le chemin entéro-mammaire et une fois
qu'elles ont atteint leur destination, elles réduisent les bactéries causant la mastite
(staphylococci et streptococci) (Jiménez et al., 2013).

1.4 Les bactéries lactiques

1.4.1 Définition
Le groupe des bactéries lactiques défini pour la 1ère fois par Orla Jensen (1919),
présente un groupe hétérogène de microorganismes produisant de l’acide lactique comme
produit principal du métabolisme. Elles colonisent de nombreux produits alimentaires
comme les produits laitiers, les viandes, les végétaux et les céréales et font parties de la
flore gastro- intestinale et vaginale humaine ou animale. Elles sont impliquées dans un
grand nombre de fermentations spontanées de produits alimentaires (Pfeiler et
Klaenhammer, 2007). Les bactéries lactiques sont bien tolérées par les animaux et
l'homme ayant le statut GRAS ‘Generally Recognized As Safe’ (Adams., 1988).

1.4.2 Propriété générales

Les bactéries lactiques sont des bactéries a Gram positif, immobiles, asporulées,
catalase et oxydase négative, nitrate réductase négative, anaérobies ou aérotolérantes, se
présentant sous formes de coques ou de bacilles qui ont moins de 55 mol % du contenu G+
C dans leur

7
 Synthèse Bibliographique

ADN (à l'exception de Bifidobacterium). En outre, elles ne liquéfient pas la gélatine, ne

produisent pas d'indole, ni d’hydrogène sulfureux (Caplice et Fitzgerald, 1999).

Les bactéries lactiques sont généralement mésophiles ; certaines sont psychrotolérantes

ou thermotolérantes elles se développent majoritairement à pH 4,0-4,5 et certaines sont
encore actives à pH 9,6 ou pH 3,2. Elles ont des tolérances très variables vis à vis du sel.
Enfin, les bactéries lactiques possèdent de faibles activités protéolytiques et lipolytiques et
ont une exigence marquée en acide aminés, dérivés de base puriques et pyrimidiques et
vitamines B (Caplice et Fitzgerald, 1999).

Toutes les bactéries lactiques ont un métabolisme fermentaire strictement

saccharolytique qui, en utilisant les glucides, elles peuvent produire soit de l‘acide lactique
exclusivement (bactéries homolactiques strictes), soit de l‘acide lactique et de l‘acide
acétique (bactéries hétérolactiques facultatives), soit de l‘acide lactique, de l‘acide acétique
ou de l‘éthanol et du CO2 (bactéries hétérolactiques strictes) (Vandamme et al., 1996).

1.4.3 Classification
La systématique est en évolution permanente. Il n'y a jamais eu de règles unanimement
reconnue sur la façon dont deux bactéries différentes devraient être phénotypiquement
classées. La littérature scientifique suit généralement les recommandations des comités de
taxonomie qui opèrent sous les auspices de l'union internationale de sociétés
microbiologiques (Sneath, 2001).

La première classification des bactéries lactiques a été établie en 1919 par

Orla- Jensen. Elle est basée sur les caractéristiques observables telles que les propriétés
morphologiques, biochimiques et physiologiques. Les marqueurs chimiotaxonomiques,
comme la composition des acides gras et les constituants de la membrane cellulaire, ont été
également utilisés pour la classification (Tableau 3).

Les bactéries lactiques appartiennent à la lignée des firmicutes, à la classe des bacilli, et
à l'ordre des lactobacilles. D’après Ludwig et al. (2008), les bactéries lactiques sont
divisées en trois familles :

Famille des Lactobacillaceae comportant les Lactobacillus, Paralactobacillus et

Pediococcus.

Famille des Leuconostocaceae contenant les Leuconostoc, Oenococcus et Weissella.

Famille des Streptococcaceae comprenant les Streptococcus, Lactococcus et Lactovum.

8
 Synthèse Bibliographique

Tableau 3 : Taxonomie et les clés de différentiation des bactéries lactiques

(Holzapfel et al., 2001).

Réduction
Genre Forme Catalase Fermentation Genre types
nitrate
Betabacteruim bacille - - Hétérofermentaire Lactobacillus
Thermobacterium bacille - - Homofermentaire Lactobacillus
Homo et Lactobacillus
Streptobacteruim bacille - -
hétérofermentaire Carnobacterium
Streptococcus
Enterococcus
Streptococcus coque - - Homofermentaire
Lactococcus
Vagococcus
Leuconostoc
Betacoccus coque - - Hétérofermetaire Oenococcus
Weissell
Micobacteruim bacille + + Homofermentaire Brochothrix
Pediococcu
Tetracoccus coque 1 + homofermentaire
+ Tetragenococcus

La classification actuelle des bactéries lactiques fait apparaitre douze genres :

Aerococcus, Carnobacteruim, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus, Oenococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella.
(Stiles et Holzapfel, 1997).

Sur la base des données de séquençage de 16S et 23S de l‘ADNr, les bactéries Gram
positives forment deux embranchements. Un embranchement composé de bactéries Gram
positives avec un pourcentage G + C inférieur à 50% (Clostridium) et un autre formé de
bactéries ayant une teneur en G + C supérieure à 50% (Actinomycétes) (Holzapfel et al.,
2001 et Gevers, 2002). Les bactéries lactiques typiques ont une teneur en G + C inférieure
à 50% alors que le genre Bifidobacterium qui, d'un point de vue physiologique, fait partie
des bactéries lactiques, appartient à la branche des Actinomycètes qui comprend aussi
Propionibacterium et Brevibacterium (Vandamme et al., 1996) (Figure 1).

1
sont généralement catalase négative mais quelque souches produisent une pseudo-catalase qui résulte des
réactions faussement positives

9
 Synthèse Bibliographique

Figure 1 : Arbre phylogénétique des bactéries lactiques (Holzapfel et al.,

2001).

La barre indique une divergence de séquence estimée de 10%. Les bactéries à base G+C
(en haut) sont phylogénétiquement éloignées des bactéries à haut G+C sqs(en bas). Sont
soulignés en rouge les genres pour lesquels la séquence d’au moins un génome est
disponible, en vert ceux pour lesquels au moins un génome est en cours de séquençage.

1.4.4 Principaux genres des bactéries lactiques

[Link] Lactobacillus
Les lactobacilles sont des bactéries à Gram positif, microaérophiles se trouvant
couramment dans une grande diversité environnementale, y compris les environnements
laitiers riches en éléments nutritifs, les habitats microbiennes d’hôtes tels que les
muqueuses humaines, ainsi que les niches écologiques naturels tels que les plantes et le sol.
Le genre Lactobacillus appartient au phylum Firmicutes, la classe des Bacilli, et l’ordre
des Lactobacillales (Barrangou et al., 2012).

La multiplicité des niches écologiques de lactobacilles se refléte dans la diversité et

phylogénie hétérogène du genre. Le genre comprend plus de cent espèces différentes,
parmi d’autres beaucoup d’entre eux sont caractérisé biologiquement, technologiquement
et commercialement tels que : L. acidophilus, L. casei, L delbruekii susp. Bulgaricus, L.
plantrum, L. rhamnosus et [Link] (Kleerebezem et Vaughan, 2009).

10
 Synthèse Bibliographique

Les lactobacilles forment une partie de la microflore naturelle des animaux hôtes et
occupent diverses niches à l’intérieur de l’hôte, tels que le tractus gastro-intestinale, le
tractus urogénitale, la cavité buccale, et de la peau. Les lactobacilles sont présents dans les
produits laitiers et sont particulièrement abondants dans les produits laitiers fermentés. En
outre, les lactobacilles sont naturellement présents dans les plantes et le sol. L. plantarum a
été signalée à être naturellement dominante survenant espèces bactériennes dans les
légumes comme le chou et la laitue (Yang et al., 2010). Sa température optimale de
croissance est le plus souvent comprise entre 30 et 40°C. L’écart de pH pour la croissance
se situe entre 3 et 8. En générale, elles tolèrent l’oxygène mais se développent bien dans
des conditions anaérobies. Elles produisent de l’acide lactique en tant que principale
produit de fermentation à partir de sucre.

Les lactobacilles ont des propriétés assez importantes, commençant par l’activité
protéolytique pour couvrir ces besoins de croissance. Les systèmes protéolytiques
contribuent aux changement biochimiques se produisant au cours de la maturation des
divers produits alimentaires laitiers et non laitiers fermentés, conduisant à la production de
peptides bioactifs avec des effets immunologiques et sur la santé (Matar et al., 2001). Ils
sont également responsables des propriétés organoleptiques des produits finis. Les
propriétés fonctionnelles (corps, texture, fondre et extensibles). L’activité protéolytique des
souches de [Link] peut avoir un rôle dans la préservation de la formation de toxine
de Clostridium botulinum dans aliments réfrigérés (Skinner et al.,1999). La lipolyse aussi
est éventuellement essentielle dans l’affinage du fromage, des acides gras libres sont en
outre convertis en cétones méthyliques, des lactones, des thioesters… etc., contribuent, en
plus des acides gras libres, de flaveur du produit fini. Les lipases / estérases des bactéries
lactiques semblent être exclusivement intracellulaires (Castillo et al., 1999 ; Chich et al.,
1997), avec l’activité remarquable la plus élevée chez L. delberckii subsplactis et L.
acidophilus (El- Soda et al., 1986). Il se trouve qu’un large éventail de souches de
Lactobacillus est couramment utilisé comme probiotiques en raison de leur fonction
favorables à la santé inhérentes ont été proposées (Barrangou et al., 2012).

[Link] Lactococcus
Le genre Lactococcus comprent sept espéces (Batt, 2000). Morphologiquement les
lactoquoques sont des coques à Gram positif de 0,5-1,5 µm, formant des chaines courtes.
Elles sont mésophiles, capables de fermenter les hexoses par voie homofermentaire,
produisant de l’acide lactique L (+), et ont des exigences complexes pour sa croissance
(Kim, 2014 ; Wright, 2012).

Les Lactocoques ont été isolés à partir des végétaux (Cai et al., 2010 ; Carr et al 2002),
du lait, ou à partir d’autre sources animales, y compris l’intestin humain (Kubota et al.,
2010).

La bactériocine découverte en 1927, nommée «Nisine» produite par Lc. Lactis est
utilisée de Facon courante comme additif alimentaire (E234) pour la conservation de
certain aliment, dont celle de la viande. Elle est par ailleurs la seul bactériocine pouvant
légalement être utilisée comme agent de conservation.

11
 Synthèse Bibliographique

[Link] Enterococcus
Les entérocoques sont des cocci ovoïdes à Gram positif se présentant isolées, en paires,
en chaines courtes ou elles peuvent être disposées en groupes en particulier si la
morphologie des cellules est étudiée à partir des cultures cultivées sur un support solide.
Les cellules sont souvent allongées dans la direction de la chaine.

Les entérocoques peuvent jouer un rôle bénéfique dans la maturation et le

développement de l’arôme de certains produits alimentaires traditionnellement fermentés
tels que les fromages et la charcuterie. Elles sont également utilisés comme probiotiques
humains, pour traiter les maladies diarrhéiques causées par des pathogènes d’origine
alimentaire (Svec et Franz, 2014).

[Link] Pediococcus
Les pédiocoques sont des bactéries à Gram positif, oxydase-négatives et catalase
négative. Elles sont immobiles, se révèlent autant que cellules sphériques d’une taille
uniforme et se disposent comme tétrades par autre division perpendiculaire en deux
directions (Gunther et Blanc, 1961).

Les espèces P. acidilactici, P. pentosaceus, P. parvulus et P. inopinatus sont des

cultures starters importants dans la production de plusieurs produits à travers le monde
(Franz et al., 2014). P. pentasaceus peut jouer un rôle dans la fermentation et la
maturation du fromage (Callon et al., 2004). Un certain nombre de bactériocines
(pediocines) a été décrit pour P. acidilactici, P. pentosaceus (Todorov et Dichs, 2005).

[Link] Streptococcus
Les membres du genre Streptococcus sont Gram positif, catalase négative, anaérobie
facultatif ont la forme sphérique ou ovoïde, moins de 2µm de diamètre et un faible contenu
en G +C. Les streptocoques ne sont pas mobiles et ne forment pas de spores. La
température optimale de croissance est habituellement d’environ 37°C, mais des
températures de croissance minimale et maximale peuvent varier entre les espèces.
Beaucoup d’entre elles sont commensales de l’homme et les animaux, et certaines sont
hautement pathogènes (Whiley et Hardie, 2009).

[Link] Bifidobacterium
Les bifidobactéries sont des bacilles à gram positif, non mobiles, ne produisent pas du
gaz et ne forme pas de spores. Elles sont des anaérobies mais quelques espèces tolérant
l’O2 dans la présence ou non du CO2. Ces dernières sont dépourvues de la catalase, le
contenu en G +C est de 61% (Mattarelli et Biavati, 2014).

Les bifodobactéries sont des bactéries commensales de l’homme, elles sont également
retrouvées chez les animaux (Biavati et al., 2000). Les conditions optimales de croissance
des bifidobactéries d’origines humaine se situent à des températures comprises entre 37°C
et 41°C, et des valeurs de pH entre 6,5 et 7 (Hadadji, 2007). A l’heure actuelle les

12
 Synthèse Bibliographique

bifidobactéries sont les fameuses bactéries utilisées autant que probiotiques, à travers divers
produits comme par exemple : les laits fermentés, des fromages….etc.

1.5 Effet probiotiques et propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques

Les probiotiques ont été définis comme des organismes vivants qui, après ingestion en
certaines qualités, exercent des effets bénéfiques pour la santé (Crittenden et al., 2005) ;
allant au-delà des vertus nutritives inhérentes de base (Schaafma, 1996). Ils doivent
remplir les conditions suivantes : être non pathogène et non toxiques bien entendu, exercer
un « effet bénéfique » sur l’hôte, contenir un nombre élevé de cellules viables, posséder
une survie élevée dans le tractus gastro-intestinal, exercer un effet métabolique pendant le
transit intestinal, rester viable pendant le stockage et l’utilisation, en fin avoir de bonnes
propriétés gustatives (Tamime et al., 1995). Les propriétés antimicrobiennes des bactéries
lactiques peuvent être associées à de nombreux éléments. Elles résultent de l'effet combiné
de différents facteurs biologiques provenant de leurs activités métaboliques.

Selon Ishibashi et Yamazaki (2001), les bactéries lactiques sont de plus en plus
utilisées en alimentation humaine et animale pour leurs effets probiotiques. Parmi ces
effets on peut citer :

Les bactéries lactiques exercent un effet inhibiteur sur le développement et la synthèse

de toxines par autres microorganismes pathogènes ;

Les bactéries lactiques possèdent des propriétés antitumorales qui pourraient être due à
l’inactivation ou l’inhibition des composés carcinogènes dans le tractus gastro-intestinal ;
la réduction des activités enzymatiques des bactéries intestinales telle que la β-
glucuronidase, l’azoréductase et la nitroréductase ;

La prévention et traitement des diarrhées dues aux infections gastro-intestinales.

Les probiotiques sont encore impliqué dans la réduction du cholestérol (Saavedra, 2001).

En effet, les bactéries lactiques produisent de nombreux métabolites aux propriétés

antimicrobiennes classé en deux catégories : composée a petite masse moléculaire (LMM=
low molécular compound) tels que les acides organiques, le peroxyde d'hydrogène,
diacétyl, le dioxyde de carbone, et des composées a grand masse moléculaire (HMM : high
masse molécular compound) tel que les bactériocines (ammor et al., 2006).

1.5.1 Les acides organiques

Les acides organiques sont produits par les bactéries lactiques au cours de processus de
fermentation alimentaires. Leur effets antimicrobiens sont bien connus à l’heure actuelle
(Tou et al., 2006). Ces acides, sous leur forme dissociée ou non dissocié, agissent au
niveau de la membrane et en inhibant les systèmes membranaires de transport actif
(Annan Prah et Agyeman, 1997). L’activité antimicrobienne d’un acide organique
dépend de sa nature (acide fort, acide faible). L’acide acétique, par exemple, est plus
inhibiteur que l’acide lactique ; il inhibe les levures, les moisissures et les bactéries (Blom
et Mortvedt, 1991).

13
 Synthèse Bibliographique

1.5.2 Le peroxyde d’hydrogène

Les bactéries lactiques sont dépourvues de catalases catalysant la décomposition du
peroxyde d'hydrogène (H2O2) en eau et en oxygène (Condon, 1987). Le peroxyde
d’oxygène peut s’accumuler et être inhibiteur de différents microorganismes par
l’oxydation des lipides membranaires et la destruction des structures des protéines
cellulaires (Zalan et al., 2005).

1.5.3 Le dioxyde de carbone

Les bactéries lactiques hétérofermentaire synthétisent du dioxyde de carbone (CO 2)
Comme métabolite secondaire. Son accumulation dans le milieu extérieur crée une
anaérobiose qui peut être toxique pour les microorganismes aérobies présents dans
l’aliment. Toutefois, le dioxyde de carbones peut aussi, à faible concentration, stimuler la
croissance de certaines bactéries (Dobrogosz, 1990).

1.5.4 Le diacétyl
Le diacétyl est un produit du métabolisme du citrate qui est responsable de l’arôme
« beure » des produits laitiers. Le diacétyl a des propriétés antimicrobiennes qui sont
dirigées contre les levures, les bactéries Gram-négatif et les bactéries Gram-positif non
lactiques, ces dernières y sont néanmoins moins sensibles (El Ziney et al., 1998).

1.5.5 La reutérine
La reutérine (ou 3-hydroxypropionaldehyde) est une substance antimicrobienne qui est
produite comme métabolite intermédiaire pendant la fermentation anaérobie du glycérol
par certaines espèces de Lactobacillus ainsi que par d’autres genres bactériens non
lactiques tels que Bacillus, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter et Clostridium (El-Ziney
et al., 1998). Elle a un large spectre d’activité. Elle a une action contre les bactéries (Gram-
positif ou Gram-négatif), les champignons et les protozoaires. Elle interfère avec la
réplication de l’ADN. Elle a des applications aussi bien dans le domaine médical que dans
le domaine alimentaire (Vollenweider, 2000).

1.5.6 Les bactériocines

Certains ferments sont capables de produire des bactériocines ; ces molécules sont
particulièrement intéressantes pour l’élaboration de produits à partir de lait cru donc
susceptibles de contenir des micro-organismes indésirables voire pathogènes (Cintas et al.,
2001). Les consommateurs sont directement concernés par la présence d’additifs chimiques
dans leurs aliments. En conséquence, ils sont attirés par des produits alimentaires frais et
sans ajout d’agents de conservation chimiques. Les bactériocines produites par les
bactéries lactiques, peuvent être considéré comme des conservateurs naturels ou
biopréservateurs qui accomplissent ces exigences. La conservation bio fait référence à
l’usage de microorganismes antagonistes ou leurs produits métaboliques inhibent ou
détruisent des microorganismes indésirables dans les aliments, afin d’augmenter la sécurité
alimentaire et prolonger la durée de vie de conservation (Schillinger et al., 1996).
14
 Synthèse Bibliographique

1.6 Bactériocines des bactéries lactiques

1.6.1 Historique et définition
En 1925, Gratia appelait «colicines", des substances antimicrobiennes sécrétées par E.
coli et actives contre E. coli V. En 1928, Rogers a rapporté pour la première fois une
substance antimicrobienne produite par Lactococcus lactis ssp. lactis autre que les acides
organiques et le peroxyde d'hydrogène. Cette substance a été identifiée plus tard par
Hirsch (1951), qui a démontré sa nature protéique et l'a nommée "nisine". En 1953, Jacob
et ces collaborateurs proposèrent le terme plus général de ‹‹ bactériocine ›› à ces
substances.

Différentes définitions des bactériocines a été données au cour du temps La définition

qui reste la plus largement acceptée est celle de (Klaenhammer, 1988) qui définit les
bactériocines comme des protéines, ou complexes de protéines, avec une activité
bactéricide contre des espèces proches de la souche productrice.

Les bactériocines sont des peptides extracellulaires, thermostables, synthétisés par voie
ribosomique doués d’une activité bactéricide ou bactériostatique contre les espèces proches
(spectre étroit) ou d’autre genres (spectre large) et à laquelle la cellule productrice dispose
d’un mécanisme d’immunité spécifique (Cotter et al., 2005).

1.6.2 Classification
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont réparties en quatre classes,
comme proposé par (Klaenhammer, 1993). Nous donnons en Tableau 4 la classification
proposée par (Papagianni ,2003).

[Link] Classe I : les lantibiotiques

Les lantibiotiques sont des peptides de taille inférieure à 5 kDa, stables à la chaleur et
qui contiennent des acides aminés inhabituels soufrés formés post-traductionnellement,
comme la lanthionine, la β-méthyl lanthionine, la déhydrobutyrine et la déhydroalanine.
Les lantibiotiques peuvent être divisés en deux type ; sous classe Ia : qui comprend des
peptides cationiques hydrophobes allongés contenant jusqu'à 34 acides aminés ; sous
classe Ib : qui comprend les peptides globulaires chargés négativement ou sans charge
nette et contenant jusqu'à 19 acides aminés (McAuliffe et al., 2001).

15
 Synthèse Bibliographique

Tableau 4 : Classification des bactériocines (Papagianni, 2003).

Classe Caractéristiques
Peptides ribosomiquement synthétisés, post
traductionnellement modifies contiennes des
acides aminées inhabituels : lanthionines et β-
Classe I méthyle lanthionine.
Lantibiotique Masse moléculaire : 2-5KDa
Sous classe A: molécules allongées , flexibles.
Sous classe B :molecules globulaires sans charge
nette ou chargées negative.
Peptide stable à la chaleur, formés exclusivement
avec des acides aminés non modifies.
Synthétisés sous forme d’un pré peptide inactive
clivé a la partie N-terminale pour donnés la forme
active.
Classe II
Masse moléculaire :<10KDa.
Non lantibiotique
Sous classe IIa : pediocine like peptide, peptide
simple contient la séquence YGNGVN terminal
nommé aussi (Listeria active peptide).
Sous classe IIb : bactériocines a deux peptides.
Sous classe IIc : autre bactériocines.
Classe III Protéines thermolabiles
Bactériolysines Masse moléculaire > 30KDa
Complexe bactériocines et parties lipidiques ou
Classe IV
glucidiques

[Link] Classe II : non-lantibiotiques

Ce sont des peptides de taille inférieure à 10 kDa, stables à la chaleur, ne contenant pas
d'acides aminés modifiés. Leur point isolélectrique varie entre 8 et 10. Cette dernière est
subdivisée en trois sous-classes ; sous-classe IIa Ces bactériocines contiennent entre 27 et
48 acides aminés et ont toutes une partie N-terminale hydrophobe contenant la séquence
consensus YGNGV ainsi qu'un pont disulfure et une partie C-terminale moins conservée,
hydrophobe ou amphiphile qui détermine la spécificité d'action. Elles ont toutes une
activité contre Listeria monocytogenes. Certaines bactériocines de cette sous-classe
contiennent également un deuxième pont disulfure dans leur domaine C-terminale qui
semble être important dans la stabilisation de la structure tertiaire. Il semble par ailleurs
qu'il leur conférerait une meilleure activité antimicrobienne, une meilleure résistance à
l'exposition à des hautes températures et un spectre d'action plus large (Richard et al.,
2006); sous-classe IIb: Elle comprend les bactériocines ayant besoin de deux peptides
pour avoir une activité. Deux types de bactériocines de classe IIb peuvent être distingués :
le type E (Enhancing) où la fonction d'un des deux peptides est d'augmenter l'activité
de l'autre et le type S

16
 Synthèse Bibliographique

(Synergy) où les deux peptides sont complémentaires ; sous-classe IIc: Toutes les autres
bactériocines de classe II ne pouvant pas être classées dans les sous-classes a et b.

[Link] Classe III : les bactériolysines

Les bactériolysines sont des protéines de taille supérieure à 30 kDa et sensibles à la
chaleur. Cette classe ne contient que quatre bactériocines : l'helveticin J produite par
Lactobacillus helveticus l'enterolysin A produite par Enterococcus faecium, la zoocin A
produite par Spreptococcus zooepidemicus et la millericin B produite par Streptococcus
milleri (Papagianni, 2003).

[Link] Classe IV
Une quatrième classe se compose des bactériocines qui forment de grands complexes
avec d’autres macromolécules (Kalenhammer, 1993), requérant une partie glucidique ou
lipidique (Papagianni, 2003). Cependant, actuellement aucune bactériocine n’a été purifiée
ou décrite et il ya a bonne raison de croire que ce type de bactériocine est un objet façonné
dû aux propriétés cationiques et hydrophobes des bactériocines qui ont comme
conséquence complexant avec d’autres macromolécules dans l’extrait brut (Cleveland et
al., 2001).

1.6.3 Production des bactériocines

Les bactériocines sont produites à la fin de la phase exponentielle et au début de la
phase stationnaire de croissance (Dortu et Thonart., 2009). Différentes protéines sont
impliquées dans la production des bactériocines et sa régulation. Les bactériocines sont
produites sous forme d’un prépeptide non-biologiquement actif qui subira des
modifications post- traductionnelles pour aboutir au peptide actif. Cette production est
souvent régulée par un système de Quorum Sensing, un mécanisme permettant à certains
gènes d’être exprimés en fonction de la densité de la population bactérienne, L'expression
de gènes localisés soit sur le chromosome, comme c'est le cas de la mersacidine (Altena et
al., 2000), soit sur un plasmide, comme c'est le cas de la sakacine A (Axelsson et al.,
1995), ou sur un transposon, comme c'est le cas de la nisine (Rauch et al., 1992).

Les facteurs influençant la production de bactériocines sont principalement la souche

productrice, la température, le pH, la composition du milieu et la technologie de
fermentation employée (Dortu, 2008).

1.6.4 Mécanismes d’action des bactériocines

Le siège d’activité des bactériocines est la membrane cellulaire, Cependant, les modes
d’action des bactériocines sur la membrane sont variés.

Certains lantibiotiques, comme par exemple la nisine, montre un mode d’action double
: d’une par elles s’attachent au lipide II. le principale transporteur des unités de
peptidoglycane du cytoplasme a la paroi cellulaire, ce qui empêche la synthèse correcte de
la paroi cellulaire causant la mort de la cellules: d’autre part elles utilisent le lipide II
comme point d’ancrage pour initier le processus d’insertion dans la membrane et la
formation de pore provoquant la mort rapide de la cellule. Les bactériocine a deux
17
 Synthèse Bibliographique
peptides comme par

18
 Synthèse Bibliographique

exemple la lacticine 3147, peuvent avoir cette activité double partagée entre les deux peptide
(Wiedemann et al., 2001).

D’un autre côté, le mécanisme d’action supposé des bactériocines de classe IIa est
l’interaction de la bactériocine avec la membrane ou un récepteur, la mannose perméase,
pour ensuite former un pore dans la membrane de la cellule ce qui induit la
perméabilisation de la membrane et la mort de la cellule (Dalet et al., 2000). Le
mécanisme de formation des pores n’est pas connu même si l’hypothèse la plus courante
est l’assemblage de différentes molécules de la bactériocine (Diep et al., 2007). Les pores
formés par les bactériocines de classe IIa causent la perte d’ion potassium ainsi que
d’acides aminés et d’autres molécules de faible poids moléculaire ce qui dissipe les deux
composantes de la force proton motrice (Bauer et al., 2005). Une exception au mode
d’action membranaire est représentée par les bactériocines de la classe III (bactériolysine)
tel que la lysostaphine, dont l’action bactéricide consiste à cliver la partie peptidique du
peptidoglycane des cellules cibles (Nilsen et al., 2003) (Figure 2).

Figure 2 : Mécanismes d’action des bactériocines (Nilsen et al.,2003).

1.6.5 Spectre d'activité bactériocinique

Les bactériocines des bactéries lactiques exercent leur activité létale uniquement sur les
bactéries Gram positif en provoquant ou non leur lyse cellulaire. Le spectre d’activité est
généralement plus large que celui des colicines produites principalement par des souches
d’Escherichia coli (Tableau 5).

19
 Synthèse Bibliographique

Le spectre d’activité des bactériocines de la sous classe IIa est variable. Il est plus ou
moins large mais touche essentiellement des bactéries phylogénétiquement proches de la
souche productrice. Dans tous les cas, le genre Listeria est inhibé. Il comprend également
des bactéries lactiques et d’autre bactéries a Gram positif, en particulier des espèces
pathogènes ou indésirables comme Staphylococcus aureus, Clostriduim sp, Bacillus sp, et
Micrococcus sp. Les bactériocines des autre classes sont généralement connues pour
posséder un spectre d’activité étroit, limité a la même espèce ou à des bactéries
phylogénétiquement proches de la souche productrice (Cascales et al., 2007).

Tableau 5 : Bactériocine produite par des bactéries probiotiques (Gillor,2008).

Souche(s) inhibée (s) Souches productrice Bactériocine

Bactériocine de la classe I
Listeria monocytogenes Lactobacilhus UCC188 ABP-118
Lactobacillus acidophilus
[Link] O157:H7 Propionibacterium BovamineTM
freudenreichii
L acidophilus Lacticine B
Vibrio anguillarum Bacilhus subtilis Bacillocine 22
Clostridim butyricium Butyricyne 7423
Streptococcus pygenes Salivaricine
Streptocccus sobrims
Salivaricine A &B
Satreptococcus mutans Streptococcus salivarium
Micrococcus luteus K12
Streptococcus anginosis Sarivaricine B
Eubacteriuan saburreum
Enterococcus spp;
S. salivarius CRL1328 Salivaricine
Neisseria gonorrhoeae
E. coli O111,
Lactobacilhus casei L26 UNa
Listeria monocytogenes
Carnobacterium
Aermonos salmonicida
Maltaromaticum B26 et Carnocine
ruckeri
B33
Helicobacter pylori Lactobacilhus johnsonii UN
H . pylori ; Helicobacter L . acidophilus UN
felis
Bactériococines de la classe II
Enterococcus ,Listéria
Monocytogenes ; klebsiella Pediococcus acidilactici Pediocine
Pseudomonas ; Shigella
Salamonella dusseldorf
SA13 Enterococcus faecium EK13
E . coli Entérocine
Salmonella pullorum E . faecium

20
 Synthèse Bibliographique

1.6.6 Le Conditionnement des bactériocines

Il est très difficile de conditionner les bactériocines sous une forme purifiée. La
purification des bactériocines est une procédure longue et coûteuse qui nécessite la mise en
œuvre de nombreuses techniques à savoir une précipitation des protéines au sulfate
d’ammonium, différentes combinaisons de chromatographies sur colonne telles que des
échanges d’ions ou des interactions hydrophobes et une étape finale de chromatographie
liquide à haute performance en phase inverse. Ces traitements ne sont pas applicables à
l’échelle industrielle.

La stratégie souvent mise en œuvre consiste dès lors en l’adsorption de la bactériocine

sur la cellule productrice suivie d’une centrifugation ou d’une ultrafiltration de la culture et
de la désorption de la bactériocine par abaissement du pH à 2 et augmentation de la
concentration en chlorure de sodium. Les bactériocines semi-purifiées peuvent alors être
conditionnées sous forme sèche par atomisation ou lyophilisation par exemple (Parente et
al., 1997). La nisine, la seule bactériocine légalement approuvée comme additif
alimentaire, est commercialisée sous une forme semi-purifiée.

1.6.7 Domaines d’applications des bactériocines

Les bactériocines peuvent être appliquées sous un forme purifiée, semi-purifiée., Les
bactéries productrices peuvent également être appliquées dans les produits alimentaires, la
bactériocine sera alors produite in situ. (Figure 3).

Figure 3 : Vue d’ensemble des applications potentielles des bactériocines

(DeVuyst et Leroy, 2007).

21
 Synthèse Bibliographique

[Link] Domaine alimentaire

L’utilisation des bactériocines dans le domaine alimentaire est avantageuse non
seulement à cause de leur large spectre d’activité, mais aussi parce qu’elles sont non
toxiques, facilement dégradables par les enzymes digestives et ne compromettent pas la
prise des médicaments (Ryan et al., 1998). Du fait qu’elles sont des substances naturelles,
l’emploi des bactériocines permettrait d’avoir des produits plus sains et réduirait
l’utilisation des agents chimiques de conservation (Harlander, 1993). Ces dernières
années, l’application des bactériocines dans la technologie a gagné une grande attention.

Malgré le fait que la majorité des bactériocines soit des substances naturelles non
toxiques, seule la nisine est reconnue jusqu’à maintenant comme « GRAS » (Generally
Recognized As Safe) (Delves-Broughton, 1990). Ainsi, la nisine est utilisée comme
additif dans les aliments en conserves, notamment dans les produits laitiers, les soupes et
les poudings à base de céréales (Smaoui, 2010).

[Link] Domaines de la médecine humaine

L’utilisation des bactériocines n’est pas restreinte au domaine alimentaire, plusieurs
études ont démontré que l’utilisation répandue des antibiotiques pour traiter et prévenir les
infections, engendrait de sérieux problèmes de toxicité et de résistance. Par leurs
caractéristiques mentionnées précédemment, les bactériocines ont été énormément
appréciées comme étant des agents de thérapie naturelle, alternative aux antibiotiques,
puisque l’effet inhibiteur des bactériocines pourrait réduire les effets nocifs engendrés par
l’antibiothérapie.

Quelques lantibiotiques sont utilisables dans les applications médicales pour l’espèce
humaine et animale. L’épidermine produite par Staphylococcus epidermidis est active
contre Propionibacterium acnes, qui cause l’acné. Ce lantibiotique est utilisé dans la
thérapie pour remplacer l’usage habituel de l’érythromycine et de la vitamine A. Cette
application montre plusieurs avantages tels que l’absence de résistance aux lantibiotiques
et leur faible coût de production par rapport aux antibiotiques. La nisine, quant à elle, peut
être utilisée dans le traitement des ulcères gastriques vu sa stabilité aux pHs acides et son
activité contre Helicobacter pylori (De Vuyst et Vandamme, 1994). Trois autres
bactériocines produites par Lactobacillus johnsonii LA1, Lactobacillus casei YIT 9029 et
Lactobacillus amylovorus DCE 471 montrent une activité inhibitrice contre l’agent
pathogène gastrique humain Helicobacter pylori qui cause des ulcères gastriques (Avonts
et De Vuyst, 2001).

[Link] Domaine agricole

La protection des plantes contre les microorganismes phytopathogènes ainsi que la
préservation des semences, sont les objets de l’exploitation des bactériocines en
agriculture. Dans ce cas, les substances antibactériennes et substances antifongiques seront
associées afin de lutter contre les ravageurs phytopathogènes (Paik et al., 1997).

22
 Synthèse Bibliographique

1.7 Identification des bactéries par la biologie moléculaire

L’identification des bactéries, isolées à partir de prélèvement biologiques, pendant des
années, a été basée uniquement sur des critères morphologiques et biochimiques. Le
développement des techniques de biologie moléculaire à partir des années 1990 a permis
d’introduire ces approches au sein des laboratoires d’analyse biologique. Leur intérêt dans
identification des bactéries s’est accru au fil des années. Elles permettent d’obtenir un
résultat en quelques heures dans les situations d’urgence (identification et typage du germe,
et détection des résistances antibiotiques) ou d’identifier un microorganisme si les
systèmes utilisées en routine (approche biochimique) sont pris en défaut. De plus, dans des
prélèvements biologiques, elles rendent possible la caractérisation des bactéries si la
culture est restée négative, si les bactéries intracellulaires strictes (pour lesquelles la culture
est réservée à des laboratoires spécialisés) ou des bactéries encore incultivables à ce jour.

Le gène ciblé est en fonction des informations disponibles sur l’isolat bactérien. Le gène
codant l’acide ribonucléique ribosomique (ARNr) 16S est l’outil de choix si les tests
précédemment réalisés n’ont pas permis de définir le genre ou l’espèce auxquels appartient
l’isolats bactérien. Un système d’identification mettant en jeu un gène plus variable est
préférable si des critères d’orientation sont disponibles.

La plupart des techniques mises en œuvre sont basées sur l’utilisation de l’amplification
génique (polymerase chain reaction « PCR ») couplée à une réaction de séquençage du
fragment obtenu par la technique de Sanger ou de la PCR en temps réel. Pour cette
dernière méthode, la spécificité et la sensibilité sont meilleures, la durée de réalisation de
l’analyse est plus courte et c’est le germe recherché ou le groupe de bactéries à caractériser
qui commandent le système utilisé.

Dans les années à venir, le développement des techniques de séquençage des génomes
entiers va ouvrir des possibilités considérables en ce qui concerne l’identification des
bactéries, leur épidémiologie, l’étude de leur sensibilité aux molécules antibiotiques et la
caractérisation de leurs facteurs de virulence (Roux et Rolain, 2014).

1.7.1 Méthodes basées sur la PCR (réaction en polymérisation en chaine)

L’identification au rang de l’espèce des bactéries lactiques préalablement isolées de
mouts et vins par culture sur plaque. De là, la méthode PCR peut être adaptée à plusieurs
niveaux d’identification (genre, espèce ou souche) en fonction du choix des amorces
(courte séquence oligonucléotidique). Le principe est le suivant : l’amorce recherche la
région complémentaire pour s’apparier sur la matrice d’ADN qui est analysé. C’est à partir
de l’extrémité de l’amorce que la polymérisation s’opère recopiant le brin d’ADN matrice
un très grand nombre de fois ce qui conduit à l’amplification (Castellucci, 2012).

23
 Synthèse Bibliographique

1.7.2 Amplification de régions consensus et séquençage : sous-unité de l’ARN

ribosomique 16S
[Link] Principe
Le séquençage de l’amplification du gène codant pour l’ARNr 16S constitue la méthode
de base. Cette approche s’appuie sur la présence obligatoire de l’ARNr dans les bactéries.
La séquence nucléotidique de ce gène permet la classification phylogénétique et
l’identification d’isolats inconnus. Car la base de données existante pour ce gène est la plus
étendue des gènes bactériens. La séquence nucléotidique de la région entre les gènes
codant pour les ARNr 16S et 23S, appelée ITS, peut être utilisée pour l’identification, mais
sa séquence est moins conservée. Dans ce cas, la PCR utilise des amorces correspondantes
aux régions conservées universelles dans les gènes codant l’ARNr 16S et 23S, de part et
d’autre de l’ITS (Castellucci, 2012).

[Link] Protocole générale

Cette méthode nécessite l’extraction de l’ADN de la culture pure à identifier. L’ADN
extrait sert de matrice dans la réaction PCR. Après séparation par électrophorèse, les
amplifiants sont purifiés avec les kits appropriés, puis ils sont séquencés. Les séquences
obtenues des gènes codant l’ARNr 16S sont comparées à celles figurant dans les bases de
données disponibles (Chentouf, 2014).

24
 Matériels et Méthodes

2 Matériels et méthodes

2.1 Prélèvement du lait maternel

24 échantillons de lait maternel (immature ou Mature) ont été prélevés durant des
périodes d’allaitement allant de 1jour à 1 mois après l’accouchement. Les prélèvements
sont réalisés dans des conditions aseptiques après lavage du sein à l’eau puis au savon, puis
à 70% à l’alcool. Les premières gouttes sont jetées, pour éviter toute contamination
(Martin et al., 2005). Les échantillons de lait maternel ont été placés dans des flacons
stériles, transportés dans des glacières réfrigérées, puis conservés à 4°C jusqu'à leur
utilisation.

2.2 Isolement et purification des isolats

L’isolement des bactéries lactiques est réalisé sur les milieux MRS (Man-Rogosa-
Sharp) et M17. Le milieu MRS à pH=6.8 a été utilisé pour la croissance de la microflore
lactique totale, les lactobacilles sont énumérés sur milieu MRS acidifié à pH=5.4
additionné de 0.05% de cystéine (composition des milieux en annexe 1). 1ml de
l’échantillon de lait maternel est pipeté aseptiquement dans 9ml d’eau physiologique et des
dilutions décimales sont réalisées (10-1 à 10-7). Les dilutions ainsi préparées, 0.1 ml de la
dilution appropriée est étalé sur le milieu (MRS, M17) et incubés à 37°C en condition
d’anaérobiose (pendant 48- 72 heures).

2.3 Purification des isolats de bactéries lactiques

La purification consiste à réaliser des repiquages successifs sur gélose et bouillon MRS
ou sur M17. Les bactéries à Gram+, catalase- et non sporulées sont retenues et repiquées sur
bouillon (MRS, M17). jusqu'à l’obtention d’une culture pure dont la pureté est estimée par
observation microscopique après coloration de Gram (Balows et al., 1992; Curk et al.,
1996 et Heleni et al., 2006).

2.4 Conservation des isolats

Il existe deux types de conservation

 Conservation à court terme

Les souches sont ensemencées sur gélose MRS incliné en tube. Après incubation à 37°C
pendant 18 heures, ces culture sont gardées à + 4°C. Les repiquages des cultures se fait
tous les trois semaines (Saidi et al., 2002).

 Conservation à long terme

A partir des cultures jeunes de 18h sur milieu liquide, les cellules sont récupérées par
centrifugation à 4000t/min pendant 10 min. Une fois le surnageant éliminé, on ajoute le
milieu de culture de conservation sur le culot, qui contient 70 % de lait écrémé (enrichi par
0.05% d’extrait de levure) et 30% de glycérol. Les cultures sont conservées en suspension
dense et en tubes Eppendorfs à-20°C. En cas de besoin, les cultures sont repiquées dans

25
 Matériels et Méthodes

résistent mieux à la congélation. En cas de besoin, les cultures sont repiquées dans le lait
écrémé à 0.5% d’extrait de levure, deux fois avant utilisation (Badis et al., 2005).

Figure 4: Conservation de longue durée des bactéries lactiques purifiées (Saidi

et al., 2002).

2.5 Caractérisation morphologique

2.5.1 Examen macroscopique des colonies
Pour déterminer les caractères morphologiques, les colonies obtenues sur boite de Pétrie
contenant du milieu MRS agar ou M17 agar après incubation à 37 °C en anaérobiose
incubées pendant 24 h à 48 heures, sont observées à la loupe binoculaire. Chaque colonie
est examinée pour sa taille, sa couleur, ses contours, sa texture et sa forme et son relief.

2.5.2 Examen microscopique

[Link] Observation à l’état frais
Une préparation à l’état frais permet d’examiner la mobilité. Déposer une goutte d’eau
stérile sur la lame. Prélever une fraction de colonies sur gélose, faire une suspension

26
 Matériels et Méthodes

homogène dans la goutte d’eau, ensuite, recouvrir d’une lamelle en évitant la formation des
bulles d’air. Ensuite, les cellules sont examinées au microscope optique (G x40 et x100).

[Link] Coloration de Gram

Ce test a été réalisé sur des cultures jeunes de moins de 24 heures. Un frottis de cellules
a été réalisé sur une lame. Une coloration de Gram a été effectuée. Ensuite, le frottis a été
observé au microscope sous immersion au grossissement X 100. Les isolats ayant une
coloration violette sont Gram positif (+) tandis que ceux présentant une coloration rose
sont Gram-négatifs (-)

2.5.3 Tests biochimiques et physiologiques

[Link] Test de la catalase
Cette activité a été réalisée selon le protocole expérimental décrit par Prescott et al.,
(2003). La recherche de l’enzyme catalase est le deuxième test de pré-identification.

Elle a été mise en évidence par contact de la colonie avec une solution fraiche d’eau
oxygéné à 10 volumes, un dégagement gazeux abondant (du dioxygéne) sous forme de
mousse traduit la présence de la catalase.

[Link] Croissance à différente température

La croissance à différent température a permis une différenciation entre les
thermophiles ou les mésophiles. Des cultures jeunes ont été ensemencés dans le bouillon
MRS en les incubant 48h à différents températures : 15°C, 30°C, 37°C, et 45°C
(Schillinger et Luck., 1987).

[Link] Croissance à différent pH

Ce test a permis de différencier entre les souches qui croissent dans un milieu acide ou
neutre. On a préparé un bouillon MRS avec différent pH : 3, 3.5, 4.5, 5.4 et 6.5 comme
témoin. On a introduit une préculture des souches dans les bouillons préparés puis on a
incubé à 37°C pendant 72 heures (Carr et al., 2002).

[Link] Culture sur milieu hypersalés

La croissance en présence de différentes concentrations de chlorure de sodium (NaCl)
donne des renseignements précieux pour l’identification. Les cultures à tester ont été
ensemencées sur des bouillons MRS hypersalés à 3.5 % et 6.5 % de NaCl. Après une
incubation à 30°C pendant 24h à 72h. Le développement des cultures a été apprécié par
comparaison avec un tube témoin non ensemencé, incubé dans les mêmes conditions
(Carr et al., 2002).

[Link] Recherche de type fermentaire

La mise en évidence de la production du CO 2 à partir du glucose sur milieu MRS
contenant la cloche de Durham. Le milieu est réparti dans des tubes à essais a raison de 10
ml, stérilisés à 120 °C durant 15 min. Après inoculation avec 1% de la souche étudiée, le

27
 Matériels et Méthodes

développement d’une souche hétérofermentaire se traduit par l’apparition du gaz dans la

cloche du Durham, qui est absent chez les homofermentaires (Gibson et abd el Malek.,
1945).

[Link] Test d’hémolyse

Le caractère hémolytique a été recherché par ensemencement en stries de la gélose au
sang de cheval. Après incubation pendant une période de 24h à30°C, le type d’hémolyse a
été examiné (α hémolytiques : couleur verte autour des colonies ; βhémolytique :
éclaircissement autour des colonies ou γ hémolytique : le milieu n’est pas modifié).
(Maragkoudakis et al., 2006).

2.5.4 Identification de l’espèce par galerie API 50 CH

L’utilisation des galeries biochimiques API 50 CH (biomérieux, France) permet
d’établir le profile fermentaire des bactéries lactiques. Elle permet l’étude rapide de la
fermentation de 49 sucres. Le catabolisme des glucides conduit à des acides organiques qui
provoquent le virage d’un indicateur de pH. Les résultats obtenus constituent le profil
fermentaire de la souche. Les bactéries lactiques sont repiquées sur milieu MRS. Les
cultures sont centrifugées (6000tr/5min). Le culot est remis en suspension dans 4 ml d’eau
distillée stérile, puis on refait une deuxième centrifugation a une vitesse de 3000 tours
pendant 3min. ensuite, on ajoute au culot 4ml de MRS BCP (milieu de culture sans sucre
avec un indicateur de pH ; le poupre de bromocrésol) de manière que la capacité du
mélange corresponde à l’étalon n°2 dans l’échelle de Mac Farland. Cette suspension est
réparti dans les 50 microtubes de la galerie qui sont recouvertes ensuite d’huile de vaseline
stérile afin d’obtenir les conditions d’anaérobiose. Les galeries sont incubées à 37°C et des
lectures sont faites à 24h et 48h (Saidi., 1997).

2.6 Etude des interactions bactériennes

La recherche d’éventuelle production de substance inhibitrice par les bactéries isolées
est réalisée selon deux méthodes :

2.6.1 Méthode Directe (Spot agar test)

L’activité antimicrobienne de nos souches a été évaluée sur milieu solide selon la
méthode (Fleming et al., 1975). Le milieu MRS est ensemencé en touche par nos isolats
(souches inhibitrices). Après 24heures d’incubation une couche du milieu Mueller-Hinton
(0.7%) est ensemencée par la souche indicatrice (Staphylococcus aureus UT 602, [Link]
CECT 86T, [Link] ATCC 25923, [Link] ATCC 43300 et E. coli ATCC 25922) est
coulée à la surface puis ré incubée pour 24 à 48 heures supplémentaire. Les souches
présentant une zone claire tout autour sont considérées comme productrices de substances
antimicrobiennes.

2.6.2 Méthode indirecte (well diffusion assays)

Décrite par (Barefoot et al., 1983), cette méthode permet de mettre en contact le
surnageant de la souche lactique productrice de substance antimicrobienne avec la souche

28
 Matériels et Méthodes

test. Les souches précédemment sélectionnées pour leur production de substance

antimicrobienne sont concernées par ce test. Les souches sont cultivées dans du milieu
MRS liquide et incubées pendant 18heures. Après incubation, le milieu est centrifugé
(8000tr/10min) et le surnagent est conservé. Dans une boite de pétri contenant du MRS
solide et ensemencé par la souche indicatrice, des puits sont réalisées avec un emporte-
pièce et celés par 10µl de gélose MRS. Les recevront 100µl du surnageant de la souche à
tester et les boites sont incubée pendant 24à 48heures. Les colonies entourées d’une zone
claire dans la nappe de culture de la souche test et ayant un diamètre supérieur à 2mm sont
considérées comme positive.

2.6.3 Localisation de la substance inhibitrice

A partir des cultures des souches testées en milieu MRS liquide, incubées 24heures à
30°C, un volume de 50 ml de culture est centrifugé dix minutes à 10 000 tours/ min. Les
tests d’inhibition sont réalisés comme précédent à la fois sur le surnageant, représentant la
fraction extracellulaire, et sur le culot, correspondant à la fraction cellulaire.

2.6.4 Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur

Les inhibitions de la croissance de la souche indicatrice peuvent être dues à
l’acidification du milieu" production des acides orgabique" (Liu, 2003), à la production de
peroxyde d’hydrogène (Strus et al., 2006), ou à la synthèse de bactériocines
(Klaenhammer, 1988).

[Link] Inhibition due au peroxyde d’hydrogène

Pour écarter l’effet du peroxyde d’hydrogène dans l’inhibition des souches indicatrices
pathogènes, les surnageant des cultures des bactéries lactiques sont traités par 1mg/ml de
catalase puis incubées à 37°C pendant 1h. Le surnageant est stérilisé par filtration et testé
par la méthode des puits sur les souches pathogènes (Cogan et al., 1981 et Julliard et al.,
1987).

[Link] Inhibition due à la production d’acides organiques

Pour éliminer l’effet des acides organiques, notamment des acides lactique et acétique,
le surnageant a été neutralisé à pH 6,5 par une solution de NaOH 0,1N et seule la substance
antimicrobienne si elle produite exprime son action sur les souches pathogènes (Fleming et
al., 1975).

[Link] Recherche de substances inhibitrices de nature protéique

Les bactériocines étant connues pour être des protéines résistant à des températures
élevées, la thermostabilité des substances inhibitrices a été testée par chauffage à 100°C
pendant 0,15, 20 et 30 min des surnageant des souches testées. Comme précédemment, on
utilise la méthode de diffusion en puits, le surnageant a été neutralisé à pH 6,5 par une
solution de NaOH 0,1N pour éliminer l’effet des acides organiques. Afin d’éliminer le
peroxyde d’hydrogène accumulé dans le milieu de culture, le surnageant a aussi été traité
deux heures par une catalase à 30°C avant de procéder au test d’inhibition. (Labioui et al.,
2005).
29
 Matériels et Méthodes

2.6.5 Optimisation de la production de bactériocine

[Link] Effet de la température d’incubation
Dans le but d’explorer l’effet de la température sur la production de bactériocine,
des tubes à essai contenant le milieu de culture liquide de MRS sont ensemencés avec la
souche test antagoniste [Link] (LbC3), incubés à différentes températures 25°C, 30°C,
35°C, 40°C et 45°C. La production de bactériocines est évaluée par mesure de la zone
inhibitrice.

[Link] Effet du pH
Dans le but de tester effet de la valeur du pH sur la production du bactériocine, des
tubes à essai contenant le milieu de culture liquide de MRS à différentes valeur de
potentiel d’hydrogène (pH) (4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7 et 7.5) sont inoculés avec la souche
productrice de bactériocine L. brevis (LbC3).

2.7 Mode d’action des bactériocines

Dans le but d’explorer l’effet de la production des bactériocines sur la croissance du
germe témoin de l’activité antagoniste [Link] ATCC 25922, deux cultures de la souche
témoin de l’activité antagoniste sont inoculées sur bouillon nutritif, incubées à une
température de 30°C.

Le volume de 1ml du surnageant des souches de bactéries lactiques sélectionnées

antagonistes est ajouté aux cultures des germes témoins de l’activité antagoniste [Link]
ATCC 25922, inoculée dans un milieu de culture, au début de la phase exponentielle. Des
prélèvements stériles à des intervalles de temps réguliers sont effectués afin d’évaluer la
croissance bactérienne.

2.8 Caractérisation technologiques

2.8.1 Pouvoir acidifiant
A partir des cultures des souches testées en milieu MRS ou M17 liquide, incubées
24heures à 30°C, Un volume de 10 ml de lait écrémé stérile a été mis dans un tube à essai.
Le tube a été inoculé par 100 µl d’une culture de l’isolat en phase exponentielle sur milieu
MRS ou M17 selon le milieu d’origine de l’isolat et incubées à 37°C. Un intervalle de 3, 6,
15, 24h heurs, des échantillons ont été prélevés de façon aseptique pour déterminer le pH.

 Capacité a coagulé le lait

Ce test permis de repérer les isolats qui ont été capables de coaguler le lait à 30°C après
une incubation en aérobiose de 24 et 48h (Bendimerad, 2013).

2.8.2 Pouvoir proteolytique

Pour déterminer l’activité protéolytique des bactéries lactiques, le milieu a été utilisé : la
gélose PCA additionnée du lait écrémé à 10%. Chaque boite par la suite a été ensemencée
par la méthode de multipoint. Après une incubation à 30°C pendant 24h, la protéolyse est
révélée par des zones claires autour des colonies (Veuillemard, 1986).
30
 Matériels et Méthodes

2.8.3 Pouvoir lipolytique

L’activité lipolytique est recherchée sur milieu MRS tamponné à pH 7 et additionné de
1% de Tween 80 (source lipidiques artificielles) ou de beurre ou d’huile d’olive (source
lipidiques naturelles). Les boites ont été ensemencées à l’aide d’un inoculateur multipoint.
Après une incubation à 30°C pendant 24 à 48h, la lipolyse est révélée par une zone
d’éclaircissement entourée des souches ensemencées (Guiraud et Galzy, 1980; Karam,
2012).

2.8.4 Etude de l’antibiorésistance

Des pré-cultures ont été préparées dans du bouillon MRS et incubées à 37°C pendant
18heures. Un volume de 200 µl des pré-cultures (108 ufc/ml) est inoculé dans 8 ml de
milieu de culture de gélose molle à une concentration de (0.7%). Ensuite, le mélange est
homogénéisé à l’aide d’un Vortex coulé sur une couche de milieu MRS solide. Après
séchage la gélose. Des disques d’antibiotiques (Annexe 2) sont déposés stérilement, à la
surface du milieu (5 antibiotique par boite). Afin d’éviter le chevauchement des zones
d’inhibition on a respecté une distance de 15mm entre le bord de la boite et les disques
périphériques puis une distance de 25mm entre deux disques. Après incubation à 37°C
pendant 24h, le diamètre des zones d’inhibition observées autour des disques était mesuré.
Les résultats ont été exprimés comme sensible (S), intermediaires (I) et résistantes (R)
selon les applications des recommandations du comité de l’antibiogramme (2012)
(Benabou, 2012; Karam et Karam, 1994 ).

2.8.5 Cinétique de la croissance (Production de biomasse)

L’étude de la cinétique de la croissance bactérienne permet d’optimiser les conditions
de production de métabolites. La croissance bactérienne a été mesurée par
spectrophotométrie ( = 600 nm). La variation de la cinétique bactérienne a été mesurée
après chaque trois heur et après 24 h d’incubation à 37 °C.

2.9 Identification génotypique

Les étapes principales de l’identification moléculaire a été réalisées sur les différents
isolats sélectionnés antagoniste sont :

a) Extraction de l’ADN génomique à partir des isolats bactériens.

b) Amplification d’ADN par PCR
c) Électrophorèse sur gel d’agarose
d) Séquençage d’ADN

2.9.1 Extraction de l’ADN

L’ADN total bactérien de nos isolats sélectionnés antagoniste (LbL3, LbL4, LbC11,
LbL15) extrait selon la méthode d’extraction de Gevers et al, (2001) et qui consiste aux
étapes suivantes :

31
 Matériels et Méthodes

o Les cellules à partir d’une colonie sont resuspendue dans 1ml d’eau distillée
stérile ensuite centrifuger à 3000 tours pendant 10 minutes, le culot est stocker à
-20°C pendant 1h.
o Le culot est ensuite lavé dans 1ml de tampon TES et resuspendu dans 300 µl de
tampon STET.
o 75µl de tampon de lyse sont ajoutés à la suspension et incubés à 37°C pendant 1h.
o Après préchauffage de 37°C, ajouter 40µl de SDS 20% dans du tampon TE
(10mM Tris-HCL, 1mMEDTA, pH8.0)
o Agiter aux vortex pendant 60 secondes et incuber à 37°C pendant 10min
o Continuer l’incubation à 65°C pendant 10min encore.
o Ajouter 100 µl du tampon TE et le lysat est extrait avec 1 volume de
Phénol/chloroforme/ isoamylalcohol.
o Les phases sont séparées par centrifugation à 3000 tour pendant 20min. la phase
aqueuse est mixée avec 70µl de NaCL 5M et 1 ml d’isopropanol, l’ADN est
précipité dans la glace pendant 15min.
o L’extrait d’ADN est collecté par centrifugation 3000 tours/pendant 20min et le
culot est lavé dans de l’éthanol froid à 70%.
o Centrifugation pendant 10 min afin de collecter l’ADN purifié en culot
o Le culot d’ADN pure est dissout finalement dans l’eau distillée stérile pour des
fin analytique ou bien est conservé à -20°C jusqu’à son utilisation.

2.9.2 Amplification de L’ADN par PCR

L’amplification des fragments d’ADN par la technique de la PCR est réalisée dans un
cycler de Biorad (Biorad, USA), par l’utilisation des amorces universelles qui permette
d’amplifier le fragment d’ADN codant la région 16SrDNA

fD: 5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

rD1: 5´AAGGAGGTGATCCAGCC-3´

Cette technique consiste à introduire un volume de 4µl de l’ADN génomique, obtenu

par extraction dans un Eppendorf, ensuite un volume de 25µl de mixture réactionnelle est
ajouté.

Pour diminuer les risques d’erreurs et de contamination nous avons préparé une solution
mixte contenant tous les composants de la PCR (Tableau 6).

32
 Matériels et Méthodes

Tableau 6 : Volumes des composants de la solution mixte utilisée pour

l’amplification d’ADNr 16s.

Composant de la Concentration finale pour volume

solution mixte finale de 25µl pour un seul échantillon
Solution Tampon 2.5µl
DNTP 2 µl
Amorce 0.5 µl
Amorce 0.5 µl
Taq polymérase 0.25µl
Eau distillé stérile 14.25 µl

Après avoir placé les tubes contenant l’ADN bactérien dans le thermocycleur, un pré
dénaturation à 94°C pendant 15 minutes est entamé.

Ensuite, le programme d’amplification est exécuté selon trois étapes répétées en 35

cycles définis :

o Dénaturation à 94°C pendant 3min.

o Hybridation des amorces à 53°C pendant 1min.
o Elongation (polymérisation) à 72°C pendant 2min.

Enfin, une étape d’extension finale est réalisée à 72°C pour 5minutes. La tailles de
l’amplifia obtenu était de 1500pb pour tous les échantillons amplifiés comparativement
aux marqueurs de tailles utilisés.

2.9.3 Électrophorèse sur gel d’agarose

Afin de visualiser les amplicons Une Electrophorèse, sur gel d’agarose à 1.2% des
produits de PCR a été réalisée.

[Link] Préparation du gel

o Mettre 1.2 g d’agarose déshydraté dans un Erlenmeyer de capacité suffisante
o Ajouter l’agarose à 100ml de TBE
o Mettre le mélange Agarose + TBE en régénération aux micro-ondes pendant
4min.
o Lorsque l’agarose est complètement dissout Laisser refroidir jusqu'à ce qu’il
devienne possible de saisir le flacon à main nue (température environ 45-50°C).
o Ajouter 10µl de Bromure d’Edithium (BET) dans le mélange Agarose-TBE.
o Agiter (sans chauffer) doucement pour éviter la formation de bulles d’air.
o Préparer le moule pour le coulage du gel.
o Placer le moule sur une surface bien horizontale.
o Couler lentement le gel sur 3 à 5mm d’épaisseur et laisser gélifier dans la cuve,
le peigne mis au préalable pour créer des espaces pour les puits.

33
 Matériels et Méthodes

o Laisser refroidir 30 min environ avant d’enlever délicatement le peigne

o Les puits sont placés du côté de la cathode à l’intérieure de la cuve de l’appareil
à électrophorèse.
o Le gel est enfin prêt pour le dépôt des échantillons.

2.9.4 Dépôt des échantillons (produits d’amplification)

o Mélanger (7µl d’ADN amplifié + 5 µl de la solution de charge "bleu de
bromophénol").
o Remplir les puits avec ce mélange en faisant attention à ne pas déchirer le fond
du gel avec la pointe de la pipette.

2.9.5 Migration
o Fermer la cuve, branchée les fils et exercez un voltage de 90v jusqu'à 101v
pendant 40min pour permettre la sortie de l’ADN des puits.
o Laisser migrer jusqu'à ce que le colorant de charge arrive à proximité du bord du
gel.
o Quand le témoin de migration (colorant bleu) atteint l’extrémité du gel, le
courant est coupé.

2.9.6 Visualisation
La visualisation de l’ADN sur le gel d’agarose est réalisée grâce à un colorant
fluorescent le bromure d’Ethidium (BET). Ce composé possède la propriété de s’intercaler
entre les paires de bases des acides nucléiques. Le gel est visualisé dans l’obscurité à l’aide
d’un appareil à UV puis photographié avec un appareil numérique (Kouadri, 2014).

2.9.7 Séquençage d’ADN

Le séquençage des produits de la PCR de l’ADN ribosomale 16s obtenus est purifié et
séquencés par l’utilisation des amorces universelles (fD1 et rD1) selon la technique décrite
par Sanger. Les séquences obtenues sont comparées avec celles de la banque de données
GeneBank par l’utilisation du Programme blast ([Link]
Balast) deNCBI.

34
 Résultats et Discussions

3 Résultats et discussions

3.1 Échantillonnage
Les échantillons de lait maternel ont été volontairement donnés par les mères à différents
endroits en Algérie (Sidi Bel Abbes, Oran, Tlemcen) (Tableau 7).

Les mères ont été informées du caractère expérimental de l'étude et ont donné leur
consentement (annexe 3).

Dans notre étude 65% des échantillons de lait maternel était de type colostrum, 8% de
type lait de transition et 27% de lait mature (Figure 5).

Figure 5 : Les Types de lait maternel.

Les femmes ayant participée à cette étude ont eu un accouchement par voie basse
(normale) (71%), les autres ont accouché par césarienne (29%) (Figure 6).

Figure 6 : Illustration des modes d’accouchement des femmes allaitantes.

35
 Résultats et Discussions

Tableau 7 : Origine des prélèvements du lait maternel.

Région Jour Nombre Type

E1 1 1 normale
E2 1 1 normale
E3 2 1 normale
E4 Oran 2 1 normale
E5 2 1 normale
E6 2 1 normale
E7 15 1 normale
E8 20 2 césarien
E9 7 1 normale
E10 3 1 normale
E11 2 1 normale
E12 3 1 normale
E13 8 1 césarien
SBA
E14 1 1 césarien
E15 7 1 césarien
E16 15 2 césarien
E17 20 2 césarien
E18 30 2 césarien
E19 1 1 normale
E20 7 1 normale
E21 Tlemcen 15 2 normale
E22 20 2 normale
E23 30 1 normale
E24 12 1 normale

La Figure 7 illustre la répartition des femmes allaitante par groupe d’âge de 19 ans à 39
ans. La moyenne d’âge était de 29 ans.

Figure 7 : Répartition d’âge des femmes Allaitantes.

36
 Résultats et Discussions

3.1.1 Choix des isolats

L’isolement de souches bactériennes productrices de substances inhibitrices est effectué
à partir de 24 échantillons de lait maternel prélevés au niveau de différentes régions
d’ouest de l’Algérie (Sidi bel abbés, Oran, Tlemcen).

L’échantillonnage des différents prélèvements effectués ont permis l’isolement de 28

souches bactériennes. Ces isolats sont Gram positif, catalase négative et asporulants, ces
caractères laissent supposer leur probable appartenance au groupe des bactéries lactiques
(Tableau 8).

Les résultats des interactions obtenues ont permis de retenir 13isolats représentatif sur
28 isolats du lait maternels, seulement 4 souches peuvent être considérées comme
hautement productrices de substances inhibant des bactéries pathogènes. Le choix des 04
souches fortement inhibitrices est basé sur les deux critères : l’importance du diamètre de
la zone d’inhibition et le pourcentage des souches inhibées.

3.2 Caractérisation phénotypique des isolats

3.2.1 Caractérisation macroscopique
L’étude des caractères culturaux sur les différents milieux solides, a permis d’identifier
les différentes colonies qui caractérisent les différents Genres bactériens par observation
macroscopique.

L’aspect des colonies isolées sur milieu MRS est de forme ronde, grande ou petite de
couleur blanchâtres ; contrairement sur le milieu M17, elles sont petites, transparentes, à
pourtour régulier (Figure 8).

3.2.2 Caractérisation microscopique

L’observation microscopique après coloration de Gram, a révélé plusieurs formes :
bacillaires ou coccidé, Gram positif. Les bactéries lactiques sont : Gram positif, catalase
négative ; peuvent se présenter comme des bâtonnets ou coccobacilles et sont reconnues
comme lactobacilles, aussi ils peuvent êtres sous forme coccidé et sont reconnues comme
entérocoques, streptocoques ou pédiocoques...selon leur différents modes d’association
(Kandler et Weise, 1986) (Figure 9). Sur bouillant, les souches présentent un trouble
homogène qui caractérise le groupe des bactéries lactiques.

37
 Résultats et Discussions

Figure 8: Aspect macroscopique des bactéries lactiques, isolées du lait

maternel, inoculées sur milieu MRS incubée à une température de
37°C pendant 48h.

Figure 9 : Coloration de Gram et l’observation microscopique des souches

isolées, sélectionnés lactiques (Gx100).

38
 Résultats et Discussions

Tableau 8 : Illustration des critères morphologique et microscopique des

bactéries lactiques isolées du lait maternel.

Gram Cat Morphologie Forme, Type de colonie ID

LbC7
Bacille courte,
isolés, en diplo et Moyenne colonie blanchâtre, ronde
LbL3 en chainette
LbL1 courte
LbC6
LbC4
Colonie moyenne blanchâtre et ronde Lactobacillus
LbC3 Diplobacilles

LbC9 Déplobacille Petite colonie blanchâtre arrondie

LbC8
Colonie moyenne blanchâtre, bombé,
LbL4
ronde
LbL21
LbL18
CbL2
CbL4 Cocci, isolés,
+ - diplo Lactococcus
CbL6 Des petites colonies transparentes
CbL10
LbL15
LbC11
CbL13

CbL7 Des petites colonies transparentes

Enterococcus
Cocci isolée et en arrondies
paire
CbL8
CbL9
CbL5

CbL11
Cocci en Petite Colonies blanches, rondes ou
CbL12 Streptococcus
chaînette lenticulaires
CbL14
CbL15

39
 Résultats et Discussions

3.2.3 Tests biochimiques et physiologiques

Les tests physiologiques et biochimiques permis la caractérisation des 11 souches
apparentées aux lactobacilles et deux souches apparentés aux entérocoques, dénombrées
parmi les vingt-huit isolats. Les résultats de caractérisation physiologiques obtenus sont
réunis dans le Tableau 9.

Tableau 9 : Présentation des caractères physiologiques des souches lactiques isolées,

sélectionnées antagonistes.
Croissance et
Températures de
salinité du pH de croissance Hémolyse
Souches croissance
milieu (NaCl)
3.5 % 6.5% 15°C 30°C 45°C 3 3.5 4.5 5.4 6.5
LbC11 + - + + + - - + + + Y
LbC3 + - + + - - - + + + Y
LbC8 + - + + - - - + + + Y
LbC9 + - + + - - - + + + Y
LbL3 + - + + - - - + + + Y
LbL4 + - + + - - - + + + Y
LbC2 + - + + - - - + + + Y
LbC6 + - + + - - - + + + Y
LbC7 + - + + - - - + + + Y
LbL1 + - + + - - - + + + Y
LbL18 + - + + - - - + + + Y
LbL15 + - - + + - - + + + Y
LbC21 + - + + - - - + + + Y

D’après les résultats, onze souches (LbC3, LbC8, LbC9, LbL3, LbL4, LbC2, LbC6,
LbC7, LbL1, LbL18, LbC21) ont montré une capacité à croitre à 30°C mais pas à 45°C
donc sont classées parmi les souches mésophiles.

Les deux autres souches (LbL15, LbC11) qui ont la capacité de se développer à 45°C
sont classées comme étant des bactéries thermophiles.

Toutes les souches sont pourvues d’un caractère non hémolytique, poussent à une
concentration de 3.5% de NaCl et non pas à 6.5%. L'absence d'activité hémolytique chez
les bactéries lactiques indique que ces bactéries ne sont pas virulentes (Figure 10).

40
 Résultats et Discussions

Figure 10 : Test d’hémolyse négatif des souches lactiques isolées du lait

maternel.

3.2.4 Le type fermentaire

Le type fermentaire réalisé sur milieu de culture glucosé stérile, contenant une cloche de
Durham, permet la différentiation entre deux groupes bactériens, soit homo-fermentaire et
hétéro-fermentaire (Figure 11). Les résultats obtenus ont montré l’absence
(homofermentaire) et présence (hétérofermentaire) de la production du gaz (CO2) à partir
du glucose (Tableau 10).

Tableau 10 : Type fermentaire des souches lactiques isolées, sélectionnées

antagonistes.

Homofermentaire Hétérofermentaire
LbC2 LbL3
LbC6 LbC9
LbC7 LbC3
LbL1 LbC21
LbL18
LbL4
LbC8
LbC11
LbL15

41
 Résultats et Discussions

Figure 11 : Photo illustrative du test de recherche du type fermentaire

des bactéries lactiques, ( milieu de culture de MRS glucosé,
muni d’une cloche de Durham).

3.3 Identification par galerie api 50 CH

Les résultats de la fermentation des hydrates de carbone sur la galerie API50CH, ont
permis l’identification des espèces.

Le Tableau 11, indique les résultats du profil de fermentation des hydrates de carbones,
Après la comparaison des résultats, avec les données de De Roissart H.B (1986), Carr et
al (2002), Axelsson (2004) et Hammes et Hertel (2006). Les souches sont classées dans
les espèces suivantes :

Les souches (LbC8, LbC2, LbC6, LbC7, LbL1, LbL18,) appartiennent à l’espèce
Lactobacillus plantrum, les souches (LbC3, LbC9, LbC21, LbL3) appartiennent à l’espèce
Lactobacillus brevis, et la souche (LbL4) appartiennent à l’espèce Lactobacillus sakei.
Pour (LbC11, LbL15) appartiennent à l’espèce Enterococcus faecium. Ces résultats sont en
accord avec des études antérieures, et renforce la conclusion que le colostrum peut être une
source importante de souche de Lactobacilles, tels rapportés par (Dilek et al.,2011), qui a
isolée 20 souches de lactobacilles de 100 échantillons de colostrum, et (Jiménese et al.,
2008) a isolé 2 Lactobacillus sp à partir de 35 échantillons de colostrum. Autres chercheurs
ont isolés En. faecium du lait maternel humain (Heikkila et al., 2003). La présence d’En.
faecium dans le lait maternel a confirmé l'hypothèse d'un transfert vertical du LAB
intestinal de l'intestin de la mère vers son lait et par le lait vers l'intestin du nourrisson
(Martin et al., 2003).

42
 Résultats et Discussions

Tableau 11 : Présentation des caractéristiques biochimiques des souches isolées

sélectionnées antagonistes, lors de l’utilisation de la galerie
Api 50CHL.
LbC9 LbL3 LbC21 LbC6 LbC8 LbC7 LbC2 LbL18 LbC3 LbL4
Glycérol - - - - - - - - - -
Erythritol - - - - - - - - - -
D-Arabinose - - - - - - - - - -
L-Arabinose + + + + + + + + + +
D-Ribose + + + + + + + + + +
D-Xylose + + + - - - - - - -
L-Xylose - - - - - - - - - -
D-Adonitol - - - - - - - - - -
MDX - - - - - - - - - -
D-Galactose + + + + + + + + + +
D-Glucose + + + + + + + + + +
D-Fructose + + + + + + + + + +
D-Mannose - - - + + + + + + +
L-Sorbose - - - - - - - - - -
L-Rhamnose - - - - - - - - - -
Dulcitol - - - - - - - - - -
Inositol - - - - - - - - - -
D-Manitol - - - + + + + + + -
D-Sorbitol - - - + + + + + + +
MDM - - - + + + + + + -
MDG + + + - - - - - - -
NAG + + + + + + + + + +
Amygdaline - - - + + + + + + +
Arbutine - - - + + + + + + -
ESC + + + + + + + + + +
Salicine - - - + + + + + + +
D-Celiobiose - - - + + + + + + +
D-Maltose + + + + + + + + + +
D-Lactose - - - + + + + + + +
D-Melibiose + + + + + + + + + +
D-Saccharose + + + + + + + + + +
D-Trehalose - - - + + + + + + +
Imuline - - - - - - - - - -
D-Mélézitose - - - + + + + + + -
D-Raffinose + + + + + + + + + -
Amidon - - - - - - - - - -
Glycogéne - - - - - - - - - -
Xylitol - - - - - - - - - -
Gentiobiose - - - + + + + + + +
D-Turanose - - - + + + + + + +
D-Lyxose - - - - - - - - - -
D-Tagatose - - - - - - - - - -
D-Fucose - - - - - - - - - -
L-Fucose - - - - - - - - - -
D-Arabitol - - - - - - - - - -
L-Arabitol - - - - - - - - - -
GNT + + + + + + + + + +
5KG + + + - - - - - - -
2KG - - - - - - - - - -

43
 Résultats et Discussions

3.4 Criblage des souches antagonistes

L’activité antagoniste des 13 souches isolées sélectionnés est mise en évidence vis-à-vis
Staphylococcus aureus UT 602, [Link] CECT 86T, [Link] ATCC 25923, [Link]
ATCC 43300 et E. coli ATCC 25922.

Les prés-cultures de bactéries lactiques isolées sélectionnées et les souches témoins sont
inoculées dans un milieu de culture liquide de BHIB et dans un bouillon nutritif
respectivement. Le test de l’activité antagoniste est effectué sur milieu de culture gélosé de
MRS selon la technique directe (de Fleming et al.,1975) elle se traduit par la formation
d’un halo autour de la souche ensemencée en touche dont il faudrait mesurer le diamètre, la
lecture des résultats consiste à mesurer le rayon de l’halo d’inhibition, et la méthode
indirecte décrite par Barefoot et al, (1983).

Les résultats obtenus ont montrés que 30,76% des souches testées ont manifesté une
excellente activité. A l’opposé, 69.23% des souches testées ont présenté une faible activité
antagoniste vis-à-vis des souches pathogènes testées.

Ces résultats indiquent que nos bactéries lactiques sont capables de synthétiser des
substances inhibitrices ayant une activité antibactérienne. L’ensemble des souches ne
présente pas le même spectre d’action vis-à-vis des bactéries pathogènes (Figure 12,
Figure 13, Figure 14, Figure 15).

Figure 12 : L’activité antagoniste des souches isolées, sélectionnées lactiques

vis- à-vis de certaines souches pathogènes.

44
 Résultats et Discussions

Figure 13 : Pourcentage des bactéries lactiques, isolées à partir de lait maternel

inoculées sur milieu de culture MRS, présentant une activité
antagoniste vis-à-vis de Staphylococcus aureus UT 602.

Figure 14 : Pourcentage des bactéries lactiques, isolées à partir de lait maternel

inoculées sur milieu de culture MRS, présentant une activité
antagoniste vis-à-vis Staphylococcus aureus ATCC 43300.

45
 Résultats et Discussions

Figure 15 : Pourcentage des bactéries lactiques, isolées à partir de lait maternel

inoculées sur milieu de culture MRS, présentant une activité
antagoniste vis-à-vis E. coli ATCC 25922.

Le Tableau 12 montre des activités antimicrobiennes d’inhibition remarquable pour les

souches qui ont été retenues.

Tableau 12 : L’étude de l’activité antibactérienne des souches lactiques par la

méthode directe.
S. aureus [Link] [Link] [Link] [Link]
UT 602 CECT 86T ATCC 25922 ATCC 25923 ATCC 43300
LbC11 + + + + +
LbC3 + + + + +
LbC8 + + - - +
LbC9 + + - - +
LbL3 - + - - +
LbL4 - + - - -
LbC2 + + - - -
LbC6 - + - - -
LbC7 - + - - +
LbL1 + + - - +
LbL18 + + - - +
LbL15 - + + + -
LbC21 - + - - -
+ : reaction positive, - : reaction negative

L’étude de l’activité antagoniste des souches isolées sélectionnées antagonique (LbC3,

LbL4, LbC11, LbL15) est mise en évidence vis à vis certaines souches pathogènes par la
méthode des puits (Figure 16).

46
 Résultats et Discussions

Figure 16 : Les diamètres de la zone d’inhibition de S aureus CECT86T et d’E

coli 25922 en présence des bactéries isolées, sélectionnées
antagonistes.
Les zones d’inhibition formées apparaissent claires avec des bordures bien distinctes
avec des diamètres variables. [Link] (LbC3) a manifesté une excellente activité
antagoniste vis- à-vis de [Link] CECT 86T et [Link] ATCC 25922, avec des diamètres
des zones d’inhibition de 14±0.80mm. Cependant, les diamètres des zones d’inhibition
formées des trois souches ([Link] [LbL4], En. feacium [LbL15, LbC11]) vis-vis de
[Link] CECT 86T sont 12±0.99mm, 10±0.75mm, 9±0.66mm respectivement.

La souche L. sakei (LbL4) n’a manifesté aucune activité antagoniste vis-vis la bactérie
Gram négative Escherichia coli ATCC 25922.

La capacité inhibitrice in vitro des bactéries lactiques vis-à-vis des germes pathogènes
démontre une bonne propriété probiotique, comme dès lors qu’elle peut jouer un rôle dans
la préservation de la qualité hygiénique des denrées alimentaires (Ammor et al., 2006).

3.4.1 Localisation de la substance inhibitrice

A partir des meilleures zones d’inhibition, on a sélectionné quatre souches pour
localiser la ou les substances responsables de l’interaction.

Tableau 13: L’étude de l’activité antibactérienne du culot des bactéries

lactiques par mesure du diamètre de la zone d’inhibition (mm).
S aureus [Link] [Link] [Link] [Link]
Souches
UT 602 CECT 86T ATCC 25922 ATCC 25923 ATCC 43300
L sakei
-
LbL4
L brevis
-
LbC3
LbC11
faeciu
En

-
LbL15
m

47
 Résultats et Discussions

Tableau 14 : L’étude de l’activité antibactériennes de surnageant des bactéries

lactiques par mesure de la moyene des diamètres de la zone
d’inhibition (mm).
S aureus [Link] [Link] [Link] [Link]
Souches UT 602 CECT 86T ATCC 25922 ATCC 25923 ATCC 43300
-
L sakei
LbL4 0 12 0 0 0

L brevis
13 15 14 12 11
LbC3

LbC11 10 10 8 11 5
E faecium

LbL15 0 9 6 6 0

D’après les résultats illustrés dans les deux tableaux ci-dessus, il apparait que l'activité
antibactérienne du culot bactérien vis-à-vis des souches cibles est pratiquement nulle,
montrant que les fractions cellulaires ne présentent aucun effet sur la croissance des
souches pathogènes ; A l’inverse, les fractions extracellulaires (surnageant) des souches
lactiques montrent un pouvoir antibactérien.

Les résultats obtenus se rapprochent de ceux d’autres études quant à la propriété du

culot bactérien et celle relative au surnageant. (Achemchem et Abrini, 1997 ; Labioui et
al., 2005).

3.4.2 Mise en évidence de la nature de l’agent inhibiteur

La présence d’une inhibition n’est pas due uniquement à la production de bactériocines,
cette inhibition peut avoir plusieurs origines parmi lesquelles : la production d’acide
organiques, de peroxyde d’hydrogène, de phages et ou de bactériocines (Moreno et al.,
1999 ; Navarro et al., 2000 ; Rodriguer et al., 2002 ; Maldonado et al ., 2003 ; Todorov
et Dicks., 2005 et Boumhira et al .,2011).

Pour la recherche de la nature de l’agent inhibiteur sur milieu solide, a permis la

sélection des souches hautement productrices de substances inhibitrices qui se répartissent
comme suit : Lactobacillus brevis (LbC3), Lactobacilus sakei (LbL4), Enterococcus
feacium (LbL15, LbC3).

Ce choix est basé sur les travaux de Hosono et al., (1977) qui établit que la sélection
des souches soit établit à partir des mesures des activités inhibitrices sur milieux solides.

48
 Résultats et Discussions

Figure 17 : Prévalence de la substance inhibitrice produite par les bactéries

lactiques isolées du lait maternel.

[Link] Inhibition due à la production d’acides organique

Après élimination de l’effet des acides organiques, par neutralisation avec une solution
NaOH et filtration par filtre millipore 0.22, les surnageant neutre et filtrés ont été testé pour
leur activités inhibitrices contre les germes tests par la méthode des puis citée
précédemment.

Ces résultat montrent une perte de l’activité inhibitrice des surnageant vis-à-vis les
souches pathogènes pour les deux souches En. feacium (LbL15, LbC11). Par contre les
surnageant neutres des souches LbC3, LbL4 ont inhibées différemment la croissance des
souches cibles.

Ces résultats nous laissent supposer que l’inhibiteur majeur pour les souches [Link]
(LbL15, LbC11) sont les acides organiques produit par les souches lactiques, et
l’apparition de l’activité antagoniste, après élimination de l’effet d’acide organique, chez
LbC3, LbL4 confirme l’existence d’autre substances antibactériennes telles que le
peroxyde d’hydrogène, et les bactériocines like.

[Link] Inhibition due au peroxyde d’hydrogéne

La souche (LbL4) produit du peroxyde d’hydrogène. Cette enzyme peut être dégradée
par une enzyme la catalase présente chez certaines espèces bactériennes.

L’intervention du peroxyde d’hydrogène dans les phénomènes d’inhibition par les

bactéries lactiques a été établie. Lorsqu’il est libéré à des concentrations suffisantes, il peut
provoquer l’inhibition de certains contaminants (Bourgeois et Larpent, 1996).

3.4.3 Recherche de la substance inhibitrice de nature protéique (bactériocine)

Après élimination de l’effet des acides organiques, par neutralisation avec une solution
NaOH 1N et filtration par filtre 0.22µn et l’effet de peroxyde d’hydrogène, les surnageant
neutre et filtrés ont été testés pour leur thermorésistante (0, 15, 20 et 30 min à 100°C)
contre les germes pathogènes. Nous avons constaté la présence des zones d’inhibition de
49
 Résultats et Discussions

Lactobacillus brevis (LbC3) quel que soit le temps de traitement thermique 0,15, 20, 30
min à 100°C. Ce qui fait suggérer que la souche étudiée (LbC3) produit une substance de
nature protéique qui permet l’inhibition des autres bactéries indicatrices.

La thermorésistance des bactériocines est recherchée par de nombreux chercheurs

(Parente et al., 1994 ; Labioui et al., 2005). Les mêmes résultats ont étés obtenus
concernant l’activité des bactériocines AMA-K et plantaricine LR/ 14 non affectée par le
traitement thermique (Todorov et al., 2007 ; Kumar Tiwari et Srivastava. 2008).

La production de bactériocine a été observée uniquement par L. brevis (LbC3), tel que
mise en évidence dans une autre précédente, a démontré une capacité limité à produire des
bactériocines par les souches isolées du lait maternel. (Kozak et al., 2015)

La résistance des souches au traitement thermique est une propriété intéressante lors des
procédés de pasteurisation ou de stérilisation utilisables dans les industries alimentaire et
pharmaceutique (Figure 18).

Figure 18 : Zones d'inhibitions formées par le surnageant de L brevis (LbC3)

quel que soit le temps thermique à 100°C.

3.4.4 Optimisation de la production de bactériocine

Les conditions de culture influencent fortement la production de bactériocines. en effet,
l’optimisation de la croissance ne résulte pas nécessairement en l’optimisation de la
production de bactériocines (Parente et al., 1999). Il a même suggéré que des conditions
de croissance défavorables permettent de stimuler leur production (Verluyten et al., 2004).

[Link] Effet de la température d’incubation

La température d’incubation est un paramètre qui doit être maitrisé pour la croissance et
la production de la bactériocine. Ce paramètre a fait l’objet de plusieurs études, qui ont
montré que la température de production des bactériocines est souvent inferieure à la
température optimale de croissance (Krier et al., 1998). A cet effet la souche productrice
de

50
 Résultats et Discussions

bactériocine (LbC3) testés à différentes températures (25, 30, 35, 40 et 45°C), les cultures
ont été réalisées pendant 24h dans le milieu MRS.

L’effet de la température d’incubation sur la croissance de L. brevis (LbC3) et la

production de bactériocine après 24h d’incubation est montré sur la Figure 19.

Sous ces conditions de culture, on enregistre un pouvoir inhibiteur optimal (15 mm) à
une température de 30°C. Ce résultat a été observée par plusieurs chercheurs étudiants
l’effet du paramètre de température d’incubation sur la production de bactériocine, tel
produite par d’autre souche, exemple le cas de Lactobacillus plantarum KC21 motrant une
activité antagoniste très active à 30°C mais n’a détecté aucune activité de la bactériocine
produite par L. plantarum KC21 à 45°C d’incubation (Lim , 2010).

Pour expliquer ce phénomène Messens et al., 2003 ont suggéré qu’a une température
d’incubation élevée, des protéases sont activées en réponse au stress thermique. Aussi,
Juarez Tomas et al., (2002), ont supposé qu’a des températures supérieurs à 44°C, les
cellules de Lactobacillus salivarius CRL1328 ont été incapable de synthétiser ou sécréter
des bactériocines alors que la croissance n’est pas affectée par cette température.

Figure 19 : L’effet de la température d’incubation sur la production de la

bactériocine.

[Link] L’effet du pH
Plusieurs auteurs étudient les facteurs intrinsèques du milieu influençant l’efficacité de
la diffusion de la bactériocines, surtout si elle fait l’objet d’une application agro-
alimentaire (Blom et al., 1997), parmi eux, le pH du milieu.

51
 Résultats et Discussions

Dans le but d’explorer le pH optimum de la souche productrice de bactériocines (LbC3)

vis-à-vis [Link] ATCC25922. La souche inhibitrice est incubée dans différents
concentration de pH (4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5) du milieu MRS et l’activité antagoniste est
évaluée par la mesures des diamètres des zones d’inhibition formés (Figure 20).

Une réduction de l’activité antagoniste de la bactériocine de [Link] (LbC3) vis-à-vis

d’ [Link] ATCC25922 est observée à des valeurs de pH comprise entre 4.5 et 7.5. A noter
qu’un optimum reste observable à un pH égal à 6.

Des résultats similaires ont étés rapportés par Mahrous et al (2013), justifié par le fait
que la production de bactériocine est souvent régulée par le pH et la température de
croissance, comme cela a été corroborer dans plusieurs études impliquant la pédicothérapie
AcH (Biswas et al., 1991).

Figure 20 : Effet du pH sur l’activité antagoniste de [Link] (LbC3) vis-à-vis

d’[Link] ATCC25922.

Les conditions de culture et la composition du milieu de croissance sont très

importantes pour la production de bactériocines (Tagg et al., 1976). Les températures et
pH optimaux de production sont souvent inférieurs à ceux optimaux pour la croissance.
C’est par exemple le cas pour la production de bactériocines par [Link] LTH1174
(Messens et al., 2003), Leuconostoc mesenteroides L124 et [Link] L442 (Mataragas
et al., 2003).

3.5 Mode d’action des bactériocines

L’estimation de la croissance bactérienne en fonction du temps est basée sur deux
critères, la masse cellulaire et le nombre de bactéries qui augmentent dans des proportions
variables au cours de la croissance. L’interprétation des courbes de croissance obtenue par
spectrophotométrie n’est cependant pas immédiate pour deux raisons : la densité optique
permet de mesurer la biomasse de la culture et non directement sa concentration en cellules
52
 Résultats et Discussions

viables et cette densité n’est mesurable que lorsque la concentration de la culture atteint un
certain seuil qui varie de 105 -107 cellules par ml en fonction du microorganisme étudié. La
masse cellulaire est mesurée selon la densité optique du milieu, ceci permet de décrire la
courbe de croissance de la bactérie. Tandis que le nombre de bactéries viables devrait être
estimé d’après le nombre d’unité en séries. La détermination de la cinétique bactérienne est
effectuée sur milieu de culture liquide par mesure de la densité optique d’une suspension
bactérienne, inoculée, incubée à une température de 37°C pendant 18-24h à une longueur
d’onde de 600nm.

Afin d’explorer l’activité de la bactériocine produite par [Link] (LbC3) vis-à-vis de la

souche témoin de l’activité antagoniste, des cultures de [Link] ATCC25922 sont inoculées
dans un bouillon nutritif, incubées avec agitation à une température de 30°C. Un volume de
1ml de surnagent de [Link] (LbC3) est ajouté à la culture de [Link] ATCC25922 après la
6eme heures d’incubation. Des prélèvements stériles sont effectués à des intervalles de temps
réguliers afin d’évaluer la production de la biomasse bactérienne, mesurée à une longueur
d’onde de 600nm.

Figure 21: Cinétique de croissance d’Escherichia coli ATCC25922 en

présence et en absence de surnagent de L. brevis (LbC3).

La Figure 21, illustre la cinétique de croissance d’[Link] ATCC25922 en présence et en

absence de la bactériocine produite par [Link] (LbC3). La courbe de croissance d’E. coli
a montré que la biomasse bactérienne a nettement diminué après l’ajout des bactériocines,
due à la lyse des cellules bactériennes. A l’ opposé, en absence de l’ajout de bactériocine,
l’allure de la courbe de croissance reste inchangée du fait d’une biomasse bactérienne
d’[Link] inaffectée.

53
 Résultats et Discussions

3.6 Caractérisation technologique des isolats de bactérie lactique

3.6.1 Pouvoir acidifiant
L’activité acidifiante est l’une des principales fonctions des bactéries lactiques, elle
demeure l’une de leur propriétés métaboliques les plus recherchées vu son intérêt en
technologie laitière. La production de l’acide lactique est le paramètre majeur pour la
sélection des souches lactiques capables de s’exploiter en industrie alimentaire. Sa
production à partir du lactose du lait, sert à coaguler le lait, ainsi qu’elle provoque un
abaissement du pH, en conséquence de pH bas va rendre le milieu défavorable à la
croissance des pathogènes.

Les résultats obtenus sont illustrés dans les graphiques ci-dessous (Figure 22, Figure
23, Figure 24).

D’après ces résultats, ont remarqué que la moitié des bactéries lactiques identifiées
présentent une production progressive en acide lactique. Cette dernière est accompagnée
d’un abaissement du pH du milieu. Après 24h d’incubation le pH observé se situe entre
6.33(LbC2) et 4.35 (LbC6) chez Lactobacillus plantarum.

Lactobacilus brevis, donnent des valeurs d’acidification moyennes, après 24h

d’incubation, la quantité d’acide lactique la plus élevée a été enregistrée chez la souche
(LbC3) : pH=4.89 et la plus faible est enregistrée chez la souche (LbC21) : pH= 6.25. La
production de l’acide lactique était parallèlement accompagnée avec l’abaissement
progressif en valeurs de pH.

Parmi les entérocoques testés sur leur pouvoir acidifiant, la souche LbL15 se révèle
comme la meilleure souche acidifiante 4.89. ces résultats sont en accord avec de
nombreuses études et rejoignent ceux de (Zadi Karam, 1998 ; Mannu et al ., 2000 ;
Alonso- Calleja et al., 2002 ; Idoui et al., 2009).

Figure 22 : Variation de pH des souches isolées faiblement acidifiés.

54
 Résultats et Discussions

Figure 23 : Variation de pH des souches isolées moyennement acidifiées.

Figure 24 : Variation de pH des souches isolées fortement acidifiées.

55
 Résultats et Discussions

Les résultats obtenus après 24h d’incubation, ont permis de classer presque la totalité
des souche testées dans la catégories des bactéries lactiques moyennement acidifiantes
6.25(LbC21) et 5.08( LbL18), à l’exception des souches qui s’avèrent fortement
acidifiantes 4.89(LbL15) et 4.35 (LbC6), et les souches qui se révèlent faiblement
acidifiantes entre 6.30(LbC2) – 6.41 (LbC8).

3.6.2 Pouvoir protéolytique

L’étude de l’activité protéolytique est effectuée sur milieu PCA additionné de 1% de lait
écrémé. La présence de cette activité est mise en évidence par l’utilisation de la caséine du
lait écrémé comme substrat. Les résultats obtenus ont montré que huit isolats ont manifesté
une activité protéolytique (Figure 25).

Figure 25 : Recherche d’activité protéolytique des bactéries lactiques isolées

sélectionnés antagonistes sur milieu PCA.

Selon Vuillemard (1986), la souche est dite protéolytique si elle présente une zone de
lyse de diamètre compris entre 5 et 15 mm. Par comparaison à cette donnée, il apparait que
l’espèce [Link] (LbC21) est fortement protéolytique comparativement aux autres espèces
avec un diamétre de 15mm. Les souches (LbL18, LbC2, LbC8, LbC3 et LbL3) sont
révélées protéolytiques moyennement, vue que leurs diamètre des zones de protéolyse
étaient compris entre9 et 12 mm, et les 04 autres (LbL4, LbC6, LbC7 et LbL1) sont
reconnues non protéolytiques vue que la zone claire ne dépasse pas les 3mm.

L’activité protéolytique est un caractère très important de la plupart des fromages, car il
affect à la fois la texture et la flaveur (Fox, 1989). Or les levains lactiques, s’ils abaissent le
pH du milieu en transformant le lactose en acide lactique, contribuent également aux
caractères organoleptiques des fromages en libérant des systèmes enzymatiques, en
particulier protéolytiques, qui participent aux principaux phénomènes de l’affinage
(Thomas et Pritchard, 1987).

56
 Résultats et Discussions

3.6.3 Pouvoir lipolytique

Les résultats de l’activité lipolytique des souches lactiques sont reportés dans ci-après
(Tableau 15).

Tableau 15 : Activité protéolytique et lipolytiques des bactéries lactiques

étudiées.

Souches Pouvoir lipolytique Pouvoir protéolytique

LbC11 - +
LbC3 - +
LbC8 - -
LbC9 - -
LbL3 - +
LbL4 - -
LbC2 - +
LbC6 - -
LbC7 - -
LbL1 - +
LbL18 - +
LbL15 - +
LbC21 - +

D’après ces résultats, il apparait que l’ensemble des bactéries lactiques ne présente
aucune activité lipolytique importante en formant des dépôts autour des disques de
croissance. Ces résultats sont en accords avec ceux obtenus par Ammor (2006) et
papamaloni (2003). Cependant, les résultats de Karam (2012) ont montré que les
Lactocoques et les Entérocoque ont une activité lipolytique significative en présence de 1%
d’huile d’olive en comparaison avec les substrats lipidiques artificiels.

57
 Résultats et Discussions

Figure 26 :Teste d’activité lipolytique des bactéries lactiques isolées

séléctionnées antagonistes.

3.7 Détermination des profils de sensibilité aux antibiotiques des bactéries

lactiques étudiés
Les résultats de ce test sont présentés dans la Figure 27et le Tableau 16, ce dernier
montre les diamètres obtenus avec chaque antibiotique et chaque souche. Après
l’application des recommandations du comité d’antibiogramme (2012). Ce dernier
renseigne sur les antibiotypes des souches testées (R, bactérie résistante, S bactérie
sensible et I, intermédiaire.

Figure 27 : Quelques résultats du test de l’étude de la sensibilité des souches

isolées sélectionnés antagonistes aux antibiotiques.

En analysant les résultats du test d’antibiorésistance, ont constaté que :

Toutes les souches ont une résistance aux antibiotiques suivants : oxacilline,
vancomycine, acide nalidixique, nitroxoline, tobramycine. Les Lactobacilles sont
habituellement résistants à la plus part des inhibiteurs de la synthèse d’acide nucléique,
acide nalidixique et métronidazole fluroquinolones. Ces bactéries ont aussi des résistantes

58
 Résultats et Discussions

intrinsèques aux aminoglycosides, glycopeptides (Coppola et al., 2005). Par contre elles
étaient sensibles aux : pénicilline, la pristinamycine.

La sensibilité à l’érythromycine est notée chez les souches LbC8, LbC7, LbL4, LbL18,
LbL1, LbC2, LbC3, LbC21, LbC11. Un phénotype intermédiaire est noté pour les souches
LbC6, LbC11, LbL3, LbL15.

Toutes les souches sont sensibles au chloramphénicol sauf LbL1 qui est intermédiaire.

Les souches LbL18, LbC11, LbL3, LbL15 présente un phénotype intermédiaire a la

spiramycine, les autres souches sont sensible à cet antibiotique (Tableau 16).

Tableau 16 : Résultats de la résistance et la sensibilité aux antibiotiques des

bactéries lactiques étudient.
Souches P OX SP E PT TOB VA C NA NI
L plantarum

LbC8 35 S 0 R 30 S 27 S 40 S 9 R 0 R 22 S 0 R 7 R
LbC6 25 S 0 R 30 S 20 I 32 S 9 R 0 R 26 S 0 R 10 R
LbC7 33 S 0 R 33 S 30 S 30 S 12 R 0 R 30 S 0 R 6 R
LbL18 40 S 14 R 20 I 30 S 29 S 0 R 0 R 35 S 0 R 0 R
LbL1 30 S 0 R 30 S 27 S 40 S 9 R 0 R 20 I 0 R 6 R
LbC2 35 S 0 R 30 S 26 S 30 S 0 R 0 R 21 S 0 R 10 R
L brevis

LbC3 30 S 0R 31 S 25 S 33 S 10 R 0R 27 S 0 R 0 R
LbC11 30 S 0 R 20 I 20 I 29 S 0 R 0R 25 S 0 R 6 R
LbL3 35 S 0 R 20 I 20 I 29 S 12 R 0 R 25 0 R 0 R
LbC21 35 S 0R 31 S 26 S 30 S 0 R 0 R 30 S 0 R 7 R
L. sakei
LbL4 30 S 0R 38 S 27 S 35 S 12 R 0R 33 S 0 R 7R
En feacuim

LbC11 30 0 R 35 S 26 S 39 S 8 R 0 R 22 S 0 R 7R
LbL15 30 S 0R 20 I 20 I 32 S 9 R 0 R 26 S 0R 0R
S:sensible; R:resistant; I : intermédiaire ; P: penicilline; OX: oxacilline; SP: spiramicine; E:
erythromycine; PT: pristinamycine; GN: gentamicine; TOB: tobramicine; VA: vancomycine; C:
chloramphenicole; NI: nitroxoline; NA: acide nalidixique

59
 Résultats et Discussions

Figure 28 : Pourcentage de la résistance de chaque souche isolée sélectionné

antagoniste vis à vis les dix antibiotiques.

Selon la Figure 28 ont constaté que les souches LbL3, LbC11, LbC7 sont les souches
les plus résistants aux antibiotique avec un pourcentage de 54.54%, tandis que la souche
LbC7 est la moins résistant avec un pourcentage de 36.36% de résistance.

Nous avons également mis en évidence le comportement de chaque souche isolé vis-à-
vis de chaque antibiotique testé (Figure 29) : une résistance totale de 100% à l’oxacilline,
vancomycine, acide nalidixique, nitroxoline, tobramycine. Aucune résistance n’a été notée
chez les antibiotiques suivans : pénicilline, la pristinamycine, érythromycine,
chloramphénicol.

Les Lactobacilles sont généralement sensibles aux antibiotiques qui inhibent la synthèse
des protéines (érythromycine, chloramphénicol) (Charteris et al, 1998 , Rojo-Bezares et
al
, 2006). En ce qui concerne les inhibiteurs de synthèse de la paroi cellulaire, plusieurs
études indiquent que les espèces de Lactobacilles ont présenté une sensibilité à la quasi-
totalité des pénicilines (Charteris et al., 1998), de sorte que la résistance des souches aux
oxacilline a été décrite dans d’autres études (Coppola et al, 2005 ; Ammor et al, 2007).

60
 Résultats et Discussions

Figure 29 : Comportement des souches isolées sélectionnés antagonistes vis-

à-vis de chaque antibiotique testé.

3.8 Cinétique de la croissance (Production de biomasse)

La Cinétique de croissance de chaque souche a été étudiée pour trouver le meilleur
temps de culture pour la préparation d'un inoculum, c’est-à-dire le temps qu’il faut pour
que chaque bactérie rentre en phase exponentielle. A cette phase toute les cellules se
trouvent dans leur état physiologique maximal et peuvent se multiplier. La vitesse de
production atteint son maximum et reste constant pendant toute cette phase (Sechet, 2000).

Les quatre souches sélectionnés (LbL15, LbC11, LbC3, LbL4) ; les plus performant par
leur activité antagoniste ; ont été suivies pendant 26h par la mesure de leur D.O à 600nm à
température de 37°C, présente un comportement physiologique différent : la phase
exponentiel de souche LbL4, LbL15, LbC11 est atteinte après 6h d’incubation et seulement
après 3 heures chez la souche LbC3. Ce qui reflète que la phase latence de la souche LbC3
est plus courte que celui des souches LbL4, LbC11, LBL15, cela indique que la croissance
de LbC3 est rapide que les autre souches. La phase stationnaire apparait chez les souches
LbC3, LbC11, LbL15, tandis que la souche LbL4 a une phase exponentielle plus lente
dépassant les 26 heures d’incubation (Figure 30, Figure 31).

61
 Résultats et Discussions

Figure 30 : Cinétique de croissance par les souches sélectionnés antagonistes

A : LbC3 ; B : LbL4.

Figure 31 : Cinétique de croissance par les souches sélectionnés antagonistes

C : LbL15 ; D :LbC11.

3.9 Identification génotypique

Après sélection des isolats les plus intéressants qui ont montré une plus grande capacité
antibactérienne, nous avons choisis 04 souches qui sont LbL15, LbC11, LbC3, LbL4.

Après l’extraction, la purification et quantification de l’ADN selon le protocole décrit

dans la section matériel et méthode, l’amplification par PCR correspondant à une région
d’environ 1500 pb, une région du gène de L’ARNr 16S.

62
 Résultats et Discussions

Pour bien sélectionner cette région, les amorces universelles d’amplification ont été
utilisées :

fD1 (5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´)

rD1 (5´-AAGGAGGTGATCCAGCC-3´)

Les amplicons de PCR de chaque échantillon ont été visualisées sur un gel d’agarose.
La Figure 32 montre qu’il existe une bande d’environ 1500pb correspondant à la taille
attendue de la région à amplifier.

Figure 32 : Profile éléctrophorétique d’un fragment de 1500pb.

Figure 33 : Aspect morphologique des isolats les plus intéressants.

Une fois prouvée que l’amplification est correcte pour chaque échantillon, par
l’éctrophorése, les amplicons de PCR ont été séquencés. Les mêmes amorces utilisées pour
la PCR ont été également utilisées pour le séquençage.

63
 Résultats et Discussions

Les résultats des chromatogrammes de séquençage ont été analysés avec le programme
de bioinformatique Chromas Lite 2.0, qui nous a permis de passer l’information à partir du
séquençage de chaque chaine au format FASTA, pour effectuer un alignement avec le
programme Clustal X1.81 de chaque échantillon.

Les séquences de chaque échantillon examiné ont été comparées à d’autres souches de
référence mises dans la base de données NCBI GenBank ([Link]) à l’aide
de l’outil BLAST. Ainsi, confirmer son identité, on a comparé le pourcentage maximum
d’homologie des espèces avec la GenBank (Tableau 17, Tableau 18, Tableau 19,
Tableau 20).

Tableau 17 : Présentation d’un complet génome de la souche sélectionné antagoniste LbL15.

Séquence ID : gi|1112963313|CP018071.1 % d’homologie Souches

CCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAAGGTTACCTCACC
GACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGG
GCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGC
GGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTT
CATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGA
GAGAAGCTTTAAGAGATTAGCTTAGCCTCGCGACT
TCGCAACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTG
TAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGT
CATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCT
TGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACA
ATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAAC
ATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCA
CCTGTCACTTTGCCCCCGAAGGGGAAGCTCTATCTC
TAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGT
TCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCAC
CGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTC
AACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTA 99% E. faecium
ATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCT
CCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTA
CCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTC
GAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCC
TTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTT
CACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGC
ACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGT
TGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTANNAAACC
GCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGAAC
AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGC
CCCGTAGTTAAGCCGTGGTCTTTCTGGTTANNNTAC
CGTCCAGGGAAGTAACAGTTGACNNNNCATCCGTG
TTTCTTCCCCGAACAACCANNNNTTTNACAAATCCG
GAAAACNNTTCTTGCCTTCCGGCCGGCNTTTGCNNN
GAGGGAGACTTTTCGGTCCATTTGTCAAAGAAATG
TCCTAACTGTNTGGCTGCCGGATAG

64
 Résultats et Discussions

La Séquence d’ADN, codant la région ARN 16S de la souche LbL15 a montré une
similarité de 99% avec Enterococcus faecium strain VRE001 (Probiotic).

Tableau 18 : Présentation d’un complet génome de la souche sélectionné antagoniste LbC11.

Séquence ID : gi|1112963313|CP018071.1 % d’homologie Souches

CNNNTNNNTNNCACCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAAGG
TTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTG
TGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCAC
CGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTT
CATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAG
AAGCTTTAAGAGATTAGCTTAGCCTCGCGACTTCGCAAC
TCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGT
CATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCC
TCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACT
GAATGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCG
GGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACA
ACCATGCACCACCTGTCACTTTGCCCCCGAAGGGGAAGC
TCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTA
AGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCA
CCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAAC
CTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTT 99% E. faecium
AGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTA
GCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAA
TCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTT
ACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCA
TATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACT
CTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCC
TCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCATACTTAAAA
AAACCGCCTGCNNCTCGCTTTACGCCCAATNAAATCCGG
ACAACGCTTGCCCCCCTACGTATTACCCGCGGCTGCTGG
CCANTAAGTTAAGCCGNGNCCTTTCTGGTTAAGAATCCG
GCCANGGGATGAACAGTTTCCCCCCATCCCTTGTTCTTC
CCCTAACAACAGAATTTTTACTAAACCGAAAAACCTTNN
TTCCGTACCGGCGGGNNTTGGGTGCGGGGCGGAACTTTA
CGTCCATTTGCCAGAAAAATTCCCTANCTGCTTGCCTCC
CGTNNNGAGAT

La Séquence d’ADN, codant la région ARN 16S de la souche LbL15 a montré une
similarité de 99% avec Enterococcus faecium strain VRE001 (Probiotic).

65
 Résultats et Discussions

Tableau 19 : Présentation d’une séquence partielle d’ADN de la souche productrice de la

bactériocine LbC3.

Séquence ID : KP793167.1 % d’homologie Souches

TACATTATCTTGTCCACCTTAGACGGCTGACTCC
CGAAGGTTATCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACT
CTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGG
GAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTA
CTAGCGATTCCAACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCC
TACAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAG
CTTAGCCTCACGACTTCGCAACTCGTTGTACCGTCC
ATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGC
ATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTT
TGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTGAA
TGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGC
GGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGAC
GACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAG
GGAACGTCTTATCTCTAAGATTGGCAGAAGATGTC
AAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTA
AACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCA
ATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCC 99% L. brevis
AGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGA
AGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGT
TTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTC
GCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAG
ACTAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCAT
ATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCA
CTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCGA
TGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAAGCTTTCACATCA
GACATAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTTACGCCC
AATAAATCCCGACAACGCTTGCCACCTACGTTATTA
ACCGCGGGCTGCTGGGCACGTAGATAAGCCGGCGG
CTTTCTTGGTTAATTACCCGTCAACCCGTTGAACAG
TTACTCCTCAAAGGTGATCTTCTTTGAACAAACAGG
AGTTTTTATCTAGCCGAAGAGCCATCCTTCACTTCA
CGGCAGGCCAGTGCTCCCATCCAGAACTATCATCC
AATCGTGTGAAGGAATATCACTTACTGGCTTGCCCT
CCCGTCTCAGGGAAGTAGGGGCCCGT

La Séquence d’ADN, codant la région ARN 16S de la souche LbL15 a montré une
similarité de 99% avec Lactobacillus brevis Lb2H (Probiotic).

66
 Résultats et Discussions

Tableau 20 : Présentation d’une séquence partielle d’ADN de la souche sélectionné

antagoniste LbL4.

Séquence ID : gi|449084368|KC416999.1 % d’homologie Souches

GGCTGACTCCAGAGGTTATCTCACCGGCTTCTGG
TGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTA
CAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGA
TCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGTAAGCG
AGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTT
AAGGGATTAGCTTAACCTCCCGAGTTTGCAACCCCT
TGTACCCTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTC
ATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCCTCCCCACCTT
CCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAAAGTGCC
CAACTGAATGCTGGCAACTAATAATAAGGGTTGCG
83% [Link]
CTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACAC
GAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCACTTTGT
CCCCGAAAAGAAAAACTTTTCTCCCAAGGGGGCCA
AGATGTGGAAAAGCGGGGAAGGGTTTCTCCGATCC
TTGAAAATAAACCCATGGTCCCCCCCCTGTGGGGG
GCCCCCCCAAATTCTCTTTGATTTTACCCTTGGGGC
CCACCCCCCCCGGGGAGAGATTTAAGTCTTTTATGC
TGCGATGAAAGGTGCAAAACCCCCCACAACCTTCA
CTCCTCTTTTACAGCGTGGA

La Séquence d’ADN, codant la région ARN 16S de la souche LbL15 a montré une
similarité de 83% avec Lactobacillus sakei souche PON10098 (Probiotic).

67
 Conclusion et Perspectives

Conclusion et perspectives

L’un des intérêts de recherche sur les bactéries lactiques est de développer une stratégie
permettant de limiter la croissance des germes indésirables, par l'exploitation des
potentialités des bactéries lactiques qui sont capables d'assurer une qualité hygiénique et
biopréservative désirable inhibant ainsi les germes nuisibles et toxinogénes dans les
produits alimentaires. Elles produisent de nombreux métabolites ayant des propriétés
antagonistes telles que les bactériocine.

L’objectif de ce présent travail est l’isolement, le criblage et la sélection des bactéries

lactiques productrices de bactériocines à partir du lait maternel, ainsi que leurs
identifications phénotypique (galerie Api 50CH) et génotypique par l’amplification du
fragment d’ADN codant la région de l’ARN 16S.

Les résultats ont abouti à la sélection de 4 souches (LbL15, LbC11, LbL4, LbC3) ayant
montré une excellente activité inhibitrice parmi les 28 souches de bactéries lactiques.

Dans le but d’améliorer le processus de production des bactériocines chez les quatre
bactéries sélectionnés antagonistes, les paramètres suivants : la performance des souches,
le pH de milieu de culture, la température d’incubation et l’action de l’effet d’acide
organique et de peroxyde d’hydrogène ont été étudiés.

L’activité antagoniste des quatre bactéries lactiques sélectionnées est mise en évidence
vis-à-vis de S aureus UT 602, [Link] CECT 86T, [Link] ATCC 25923, [Link]
ATCC 43300 et E. coli ATCC 25922.

Les résultats obtenus ont montrés que Staphylococcus aureus étaient sensibles aux
substances produites chez quatre bactéries lactiques. Cependant Escherichia coli a
manifesté une résistance à l’égard de la souche LbL4. En ayant éliminé les effets
inhibiteurs relatives au pH et de H2O2, il est révélé que l’agent inhibiteur de Lactobacillus
brevis (LbC3) a été déterminé comme substance de nature protéique (bactériocine).

De par leur thermorésistante, L’optimisation a permis d’aboutir a une meilleur

production de bactériocines et une meilleur efficacité aux conditions de pH 6 et
température 30°C.

La cinétique de croissance d’[Link] ATCC25922 en présence et en absence de la

bactériocine produite par [Link] (LbC3), a montré que la biomasse bactérienne a diminué
progressivement après l’ajout des bactériocines.

Les résultats des tests technologiques de cette souche sont satisfaisants pour une
utilisation industrielle : possède une activité protéolytique et un bon pouvoir acidifiant.

La sensibilité aux antibiotiques, montre que la souche [Link] (LbC3) est sensible aux
antibiotiques suivants : pénicilline, spiramicine, érythromycine, pristinamycine,
chloramphénicol. Par contre elle est résistantes aux : Tobramicine, oxacilline,
vancomycine, acide nalidixique, nitroxoline.

68
 Conclusion et Perspectives

Le séquencage de l’ARN 16S des souches sélectionnés productrices de substances

antagoniste (LbL15, LbC11, LbC3, LbL4) a permis l’identification de leur appartenance
aux espèces suivantes : Enterococcus faecium, Enterococcus faecium, Lactobacillus
brevis, Lactobacillus sakei, avec des degrés d’homologie de (99, 99, 99, 83%).

En perspective, des études approfondies doivent complémenter ce travail tels que :

 Purification de la bactériocine par méthodes chromatographiques telles que

HPLC, FPLC.
 Caractérisation des gènes impliqués dans la production de bactériocine.
 Le développement d’un levain spécifique contenant [Link] (LbC3), doté d’un
pouvoir biopréservatif permettant d’augmenter la durée de conservation des
produits laitiers et d’assurer une qualité sanitaire (permettant de contrôler et de
limiter la croissance des germes indésirables).

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83
 Annexes

Annexe 1 : Composition de milieu de culture et tampon

Milieu MRS (De Man Rogosa et sharpe, 1960)

Extrait de levure 5 g
Extrait de viande 10 g
Peptone 10 g
Acétate de sodium 5 g
Citrate de sodium 2 g
Glucose 20 g
Kh2po4 2 g
Mgso4 0,25 g
Mnso4 0,05 g
Agar-agar 15 g
Cystéine-Hcl 0,5 g
Eau distillée 1000 ml
PH=6,8
Autoclavage : 120°C pendant 20 minutes
Milieu M17 (terzaghi et sandine, 1975)

Peptone de caséine 10 g
Peotone pepsique de viande 2,5 g
Peptone papaine de soja 5 g
Extrais de levure 2,5 g
Extrais de viande 5 g
B-glycérophosphate 19 g
MgSO4 0,25 g
Lactose 5 g
Acide ascorbique 0,5 g
Agar-agar 20 g
Eau distillée 1000 ml
pH=7.2
Autoclavage :120°C pendant 20 minutes

Milieu Mueller Hinton (Muller et Hinton, 1941)

Infusion de viande de boeuf 300 ml
Peptone de caséine 17,5 g
Amidon de mais 1,5 g
Agar-agar 17 g
pH=7,4

84
 Annexes

Milieu PCA

Peptone 5 g
Extrait de levures 2,5 g
Glucose 1 g
Agar-agar 15 g
pH=7,2

Milieu MRS tamponné (de Man Rogosa et Sharp, 1960)

Extrait de levure 5 g
Extrait de viande 10 g
Peptone 10 g
Acétate de sodium 5 g
Citrate de sodium 2 g
Glucose 20 g
Kh2po4 13,697 g
MgSo4 0,25 g
MnSo4 0,05 g
Na2HPO4 17,814 g
Agar-agar 15 g
Eau distillée 1000 ml
PH=7
Autoclavage : 120°C pendant 20 minutes

Tampon TBE (pH8)

Tris-Hcl 30 mM
Acide Borique 89 mM
EDTA 2 mM

Tampon TES
Sucrose 6,5 %
Trice Hcl 50 mM
EDTA 1 mM

Tampon STET
Sucrose 8 %
TritonX-100 5 %
Trice Hcl 50 mM
EDTA 50 mM

85
 Annexes

Annexe 2 : Antibiotique utilisée

Charge du
Famille Antibiotique Sigle
disque/µg

pénicilline P 6
Beta lactamine
oxaciline OX 5

érythromycine E 15
Macrolide
spiramycine SP 100

Streptogramines pristinamycine PT 15

Phénicolés chloramphénicol C 30

Oxyquinoléines nitroxoline NI 5

Quinolones acide nalidixique AN 30

Glycopeptides vancomycine V 30

Aminosides tobramycine Tob 10

86
 Annexes

Annexe 3 : Questionnaire

Nom :

Prénom :
Age :
Adresse :
Primaire
Moyenne

Niveau d’étude Secondaire

Universitaire
Autres
Profession :
Combien d’enfant avez-vous à part le bébé ?
Avez-vous déjà allaité (oui/non) ?
Combien de temps compter vous allaiter

Avez-vous eu des difficultés à l’allaitement (Oui/Non) ?

Mode d’accouchement Voie basse :

Césarienne :
Date de naissance du bébé
Fille- Garçons ?
Poid du bébé :
Allaitez-vous ce bébé (oui/non) ?
Colostrum
Le type de lait maternel a prélevé Lait de transition
Lait mature
Le jour de prélèvement du lait maternel
Le nombre de prélèvement

87